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Biorremediación de aguas contaminadas con

derivados de hidrocarburos utilizando cepas
bacterianas autóctonas

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Ismenia Araujo
University of Zulia
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 XXVIII Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental
Cancún, México, 27 al 31 de octubre, 2002

BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS CONTAMINADAS CON DERIVADOS DE

HIDROCARBUROS UTILIZANDO CEPAS BACTERIANAS AUTÓCTONAS

Ismenia Araujo Vílchez (*)

Centro de Investigación del Agua (CIA). Coord. del Laboratorio de Microbiología Industrial del CIA de la
Universidad del Zulia (LUZ). Secretaria Ejecutiva de la Fundación para el desarrollo de la Ciencia y la
Tecnología. Asesora de los Proyectos sobre Microbiología de Petróleo en Convenio INTEVEP-LUZ,
INPELUZ, y del Proyecto Lagunas de Estabilización, Convenio Fundación Polar-LUZ. Coordinadora de la
Maestría en Microbiología.
Gustavo Romero
Estudiante
Carmen Cárdenas
Centro de Investigación del Agua
Nancy Angulo
Centro de Investigación del Agua
Gustavo Morillo
Centro de Investigación del Agua
Judith Navarro
Centro de Investigación del Agua
María Méndez
Centro de Investigación del Agua

(*): Av. 21, Calle 67, Edificio Manatara, Apartamento 3B, Sector Indio Mara – Maracaibo - Estado Zulia -
Código Postal : 4005 -Venezuela. Telf.: 02617519022-02617597189 - FAX: 02617597181 - e-mail:
ismenia_araujo@hotmail.com.

RESUMEN

Se tomaron muestras de agua de la ribera del Lago de Maracaibo, sector Capitán Chico, Edo. Zulia y se
lograron aislar 16 cepas bacterianas, las cuales fueron probadas en su capacidad para degradar hidrocarburos,
mediante un ensayo de factibilidad utilizando gasoil como única fuente de carbono. Se seleccionaron 07 de
las cepas que lograron degradar entre 50 a 70% de los hidrocarburos presentes en el gasoil y se realizaron
pruebas de identificación con el propósito de conocer algunas de sus características bioquímicas.
Posteriormente, se preparó un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y se evaluó su
capacidad para degradar hidrocarburos a través de un estudio de biotratabilidad en tanques plásticos de 25 L
conteniendo: 2 L del cultivo mixto (10 % inóculo), un aceite lubricante en una concentración de 7000 mg/L y
agua potable hasta un obtener un volumen de 20 L. En 04 de los tanques se instalaron sistemas de aireación
inducidos desde el fondo y adicionalmente, se evaluó la incidencia del nitrógeno y fósforo (fertilización). Se
determinaron mensualmente los contajes bacterianos, los hidrocarburos totales y el contenido de nitrógeno y
fósforo total y las concentraciones de las fracciones de los hidrocarburos (SARA) se determinaron al inicio y
al final del ensayo. Los resultados indicaron que en los tanques inoculados, fertilizados y aireados se lograron
las mayores remociones, hasta un 89 % de los hidrocarburos totales y la transformación de todas las
fracciones presentes en el aceite, demostrando la eficiencia del cultivo bacteriano en la biorremediación de
agua contaminada con hidrocarburos.

Palabras Claves: cepas bacterianas, hidrocarburos, biorremediación.

INTRODUCCIÓN

A comienzos de los años 90, en Venezuela, importantes investigaciones han sido dirigidas al estudio de los
microorganismos y sus actividades, con el propósito de ampliar su versatilidad metabólica para la degradación
de contaminantes específicos principalmente los provenientes de las actividades petroleras. En tal sentido, se
han desarrollado tecnologías fundamentadas en los procesos biológicos como alternativas viables en la
eliminación parcial o total de diferentes compuestos orgánicos. Estos procesos utilizan principalmente
bacterias que se encuentran en el mismo ambiente que se pretenda remediar, además se adicionan los macro
y micro nutrientes necesarios para el mantenimiento de las cepas bacterianas. La etapa de selección de las
cepas bacterianas es muy importante, ya que cuanto más específica sea su capacidad degradativa ante los
distintos tipos de desechos, mayor será la capacidad de digerirlo y menor será el tiempo de permanencia en el
ambiente. La biorremediación o saneamiento biológico es una tecnología basada en procesos naturales que
utiliza la capacidad de algunos microorganismos, tales como bacterias y hongos, para transformar compuestos
químicos con la finalidad de disminuir o eliminar su condición de peligrosidad (Cook & Westlake, 1972 ). La
transformación es tal, que hay un completo rompimiento de las moléculas orgánicas en sustancias inorgánicas
como dióxido de carbono y agua, proceso que se denomina mineralización (Scherer, 1996). Si ocurre sólo
una degradación parcial de compuestos secundarios, los cuales pueden ser o no menos tóxicos, se dice
entonces, que ocurrió una biotransformación (Eweis et al, 1999 y Levin & Gealt, 1997). La descarga de
petróleo y sus productos derivados a las corrientes naturales de aguas superficiales y subterráneas ha
planteado un problema que, en la mayoría de los casos, han adquirido bastante gravedad. En el caso de aguas
superficiales la adición de nutrientes se realiza sin menor complicación en el área a tratar con el objeto de
aumentar la población nativa para acelerar el proceso de biodegradación, y la adición de oxígeno muchas
veces no es necesaria a menos que sea agua estancada sin movimiento pues el oleaje y el viento se encargan
de proporcionar las condiciones óptimas para que el oxígeno atmosférico penetre en el reservorio (Metcalf &
Hedí, 1996). El objetivo fundamental de esta investigación fue determinar la eficiencia de cepas bacterianas
provenientes de aguas contaminadas con hidrocarburos en la degradación de los mismos.

METODOLOGÍA

El estudio del proceso de biorremediación en esta investigación se realizó en dos fases. La primera fase
permitió aislar y seleccionar las cepas autóctonas de agua contaminada con hidrocarburos más eficientes en la
utilización del gasoil como única fuente de carbono. En la segunda fase se preparó un cultivo mixto con las
cepas previamente seleccionadas y se probó su eficiencia en la degradación de aceites lubricantes a escala
piloto, con la adición de nutrientes y aireación.

ESTUDIO DE FACTIBILIDAD

El agua contaminada con hidrocarburo utilizada en este estudio fue obtenida de la ribera del Lago de
Maracaibo, Sector capitán Chico, Maracaibo, Edo. Zulia, Venezuela. Los envases fueron trasladados al
Laboratorio, donde se realizó el aislamiento de las cepas bacterianas presentes en las muestras de agua,
utilizándose la técnica de siembra en placa por estría (Kerr, 1970; Seeley & Vandemark, 1973 y Pareja, 1993).
Una vez aisladas las colonias, se registraron sus características morfológicas y cada una de las cepas fue
guardada por duplicado en refrigeración en tubos con agar inclinado cerebro corazón (Finegold &
Martin, 1983). Las cepas aisladas preservadas, se activaron por transferencia a un medio nutritivo fresco,
infusión cerebro-corazón y se incubaron a 37 ºC hasta alcanzar un crecimiento superior a 1x108 UFC/ml.
A partir de estos cultivos se prepararon los inóculos para el ensayo (APHA, 2000; Kerr, 1970). Los ensayos
de factibilidad en el laboratorio se prepararon para cada cepa, utilizando medio mínimo mineral,
modificación del propuesto por Jobson et al en 1975, 1ml de gas oil y 5 ml inóculo. Todas las fiolas fueron
incubadas a 37ºC y 120 rpm de agitación en un Incubator Shaker, modelo 625, durante 60 días. Este ensayo
permitió seleccionar las cepas más eficientes en la degradación del gasoil. Cada dos semanas durante dos
meses, se tomaron muestras de cada fiola para la determinación de contajes bacterianos siguiendo la técnica
de contaje en placa vertida, 9215-B (APHA, 2000). Al inicio y al final del ensayo, se realizó la determinación
de hidrocarburos totales en todas las fiolas según el método 5520-F (APHA, 2000). A las cepas seleccionadas
se les realizó una serie de pruebas bioquímicas a saber: Tinción de Gram, Anaerobiosis, Ureasa, Citrato,
Catalasa, Oxidasa, Motilidad y Triple Azúcar Hierro (Kerr, 1970; Seeley & Vandemark, 1973 y Pareja, 1993).

ESTUDIO DE TRATABILIDAD

Se realizó un estudio a escala piloto el cual consistió en diferentes tratamientos que permitieron evaluar la
eficiencia del cultivo mixto conformado por las cepas previamente aisladas y seleccionadas por su eficiencia
en la degradación de gasoil bajo distintos parámetros. Dentro de los tratamientos, se evaluó el proceso de
biodegradación con la adición de nutrientes y la inyección de aire, con el propósito de comparar la eficiencia
en la biodegradación del sustrato hidrocarbonado.
Se seleccionaron las siete cepas más eficientes en la degradación de gasoil para conformar el cultivo mixto.
Cada cepa seleccionada fue activada y posteriormente, transferida a caldo cerebro-corazón, se incubaron a
37 ºC hasta obtener una concentración superior a 1x108 UFC/ml. Para preparar el cultivo mixto se agregaron
al tanque con la mezcla estudio (agua contaminada con aceite) fracciones equivalentes de cada cepa, hasta
alcanzar una concentración de cultivo de 10%. La selección del hidrocarburo que se utilizó en el ensayo se
realizó consultando a las empresas marítimas de la zona objeto de estudio, acerca del producto que se vertía
con mayor frecuencia y cantidad en la zona seleccionada. La mayoría coincidió que se trataba del aceite de
motor empleado como lubricante en las embarcaciones. Así quedó seleccionado el sustrato utilizado como
única fuente de carbono. La mezcla estudio se preparó agregando al agua la cantidad de aceite equivalente al
35% p/v por cada litro de agua en cada tanque.
Para este estudio se utilizaron tanques cilíndricos plásticos con una capacidad de 25 L cada uno. El diámetro
fue de 0,3 m y la altura de 0,36 m. Con el fin de mejorar la eficiencia del proceso de biorremediación se
adicionó un fertilizante compuesto, el fosfato diamónico. Se trabajó con tres concentraciones diferentes de
nutrientes, lo que permitió evaluar y comparar su efecto sobre el crecimiento bacteriano y la degradación del
aceite. Las concentraciones utilizadas fueron: 0,5; 0,75 y 1 gr/L de difosfato diamónico. El aire se suministró
mediante un sistema de inyección en espiral de aire forzado, formado por una tubería plástica acoplada a un
compresor que tuvo como función bombear el aire a través de toda la tubería. El sistema en espiral con
espaciamiento calculado de los puntos de inyección de aire en el fondo, permitió crear zonas alternas de
transferencia y mezclado, evitando así la formación de volúmenes muertos (sin movimiento). Todos los
orificios fueron colocados en el fondo ya que la profundidad mejora el tiempo de contacto (Cookson, 1995;
Baker, 1987; Capone & Bauer, 1988).

Compresor

Tubería Plástica

Puntos de Inyección
de aire (Orificios)

Figura 1. Corte transversal de un tanque con sistema de aireación.

Se prepararon tanques con las condiciones objeto de estudio (cultivo, adición de aire entre otras) y sus
respectivos controles, Tabla 1. El estudio piloto de tratabilidad tuvo una duración de cinco meses y cada mes
se tomó una muestra de cada tanque para la realización de los análisis microbiológicos y fisicoquímicos. Para
los parámetros microbiológicos se utilizó el contaje de Heterótrofos Mesófilos por la técnica de placa vertida
(9215-B). Los parámetros fisicoquímicos fueron realizados utilizando los métodos: SARA (ASTM D2007-75
Gravimétrico), Hidrocarburos Totales, 5520-F-Gravimétrico; Nitrógeno Total, 4500-NH3; Fósforo Total,
4500-C Ácido Ascórbico (APHA, 2000 y Finegold & Martin, 1983).
 Tabla 1. Unidades Experimentales.

CULTIVO NUTRIENTES
TANQUE ACEITE MIXTO 0,5 0,75 1 AIREACIÓN
(g/L)
Control 1 x
Control 2 x x
3 x x
4 x x x
5 x x x
6 x x x
7 x x x
8 x x x x
9 x x x x
10 x x x x

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El aislamiento microbiológico permitió la obtención de 18 tipos de colonias a partir de las muestras de agua
contaminada con hidrocarburos. Las características macromorfológicas de las cepas fueron registradas según
la descripción propuesta por Thomas J. Kerr. (1.981) Los valores de crecimiento de las cepas bacterianas al
inicio del ensayo estuvieron entre 0,069 y 850x106 UFC/ml y al final entre 0,01 y 4.500 UFC/ml. Los
primeros 15 días de incubación, las densidades poblacionales de la mayoría de las cepas disminuyeron y
estuvieron por debajo de las obtenidas al inicio del ensayo. El crecimiento bacteriano de las cepas bacterianas
aisladas mostró diferentes patrones a lo largo del tiempo. Para que un microorganismo sea recomendable
de utilizar en procesos de biorremediación es necesario que sea capaz de degradar al sustrato con un eficiencia
de 30-40% durante 4 a 6 semanas (Eweis et al, 1999 y Flathman et al, 1995). Cada una de las cepas
bacterianas aisladas fue probada en su eficiencia para degradar hidrocarburos en un medio mínimo mineral,
con gasoil como única fuente de carbono (Pareja, 1993 y Young & Gerniglia, 1995). Los resultados obtenidos en
la determinación de los Hidrocarburos Totales, mostraron que al final del ensayo, los valores fueron
inferiores a los valores obtenidos inicialmente, es decir, todas las cepas fueron capaces de degradar el
gasoil. Las cepas MI 9 y MI 15 fueron las más eficientes en la remoción del hidrocarburo, 71,2% y
65,78% respectivamente, a los 60 días de tratamiento. Al comparar los resultados de crecimiento
bacteriano en el medio con gasoil como fuente de carbono, con los valores de hidrocarburos, se pudo
seleccionar las cepas que fueron utilizadas para integrar cultivos mixtos en el ensayo a escala piloto: MI 5,
MI 7, MI 8, MI 9, MI 10, MI 11 Y MI 15.
La micromorfología de las 07 cepas bacterianas seleccionadas se obtuvo por microscopía de frotis con
Tinción de Gram y éstas presentaron las características que se enuncian: MI 5, MI 9, MI 10 y MI 11, bacilos
delgados, aislados y en pares; MI 7, MI 8 y MI 15, cocos, aislados, agrupados o en pares. Todas las cepas
seleccionadas presentaron reacción de Gram negativa. Las pruebas bioquímicas aplicadas a las cepas
bacterianas seleccionadas se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2. Pruebas Bioquímicas de las Cepas Bacterianas

CEPA UREASA CITRATO CATALASA OXIDASA MOTILIDAD TSI ANAEROBIO -: Reacción Negativa
- + + - M K/K - + +: Reacción Positiva
MI 5
K/K: Alcalino/Alcalino,
MI 7 - + + - M A/A - +
sin gas , ni H2S
MI 8 - - + - N K/K - + A/A: Ácido/Ácido, sin gas
MI 9 - - + - M K/K - + ni H2S
MI 10 + + + - N A/A - + N: No Mótil
MI 11 + + + - N A/A - + M: Mótil
MI 15 - - + - M K/K - +
Los microorganismos alcanzaron densidades poblacionales durante los cinco meses del ensayo con diferentes
tendencias. Las densidades poblacionales iniciales presentaron títulos de 1x106 UFC/ml, mientras que los
controles fueron de 1x102 UFC/ml. Los primeros 30 días de estudio, los microorganismos aumentaron su
densidad en todos los tratamientos al igual que los controles. A los 150 días de tratamiento, todos los títulos
de crecimiento fueron superiores a los títulos iniciales. Wrenn (1993), utilizó un cultivo mixto conformado
por cepas degradadoras de hidrocarburos y probaron su eficiencia en la degradación de crudo liviano en
medio acuático, logrando valores de crecimiento hasta de 108 UFC/ml. En los tratamientos control, no
inoculados, la densidad poblacional del control aireado fue ligeramente superior que en el control no aireado y
esa diferencia se mantuvo durante todo el estudio. El crecimiento de microorganismos aerobios y el desarrollo
de sus actividades metabólicas específicas dependen principalmente de la disponibilidad de oxígeno
molecular (Levin y Gealt, 1997), lo que explica el comportamiento obtenido en estos tratamientos, el oxígeno
estimuló las reacciones metabólicas de los organismos presentes (Martin, 1994).
Las curvas de crecimiento para los tanques fertilizados con fosfato diamónico (1,0; 0,75 y 0,5 g/L). La
bioestimulación con fertilizantes se ha utilizado con éxito en la recuperación de sitios contaminados con
petróleo (Eweis et al, 1999), cuando las concentraciones apropiadas de nitrógeno y fósforo no están presentes,
la adición de estos estimula el crecimiento microbiano facilitando la degradación de los sustratos carbonados
(Martin, 1994 y Westlake, 1993). Wrenn (1993) utilizó el nitrógeno en forma de amoníaco y de nitrato y
descubrieron que el proceso de biodegradación se aceleraba cuando el nitrógeno era suplido en forma de
amonio, tal como ocurrió en estos tratamientos. Aggarwal et al (1991) encontraron que concentraciones muy
altas de nitrógeno y fósforo pueden inhibir la actividad metabólica de los microorganismos, por ello, es
importante determinar las concentraciones de estos compuestos que sean más apropiadas para estimular la
actividad microbiana.
A partir de los 30 días, los tratamientos con aireación y fertilizados con nitrógeno, fósforo presentaron los
valores más altos de densidad poblacional (>1x109 UFC/ml).
1 ,E + 1 0
1
1 ,E + 0 9
2

1 ,E + 0 8 3

1 ,E + 0 7 4
UFC/ml

5
1 ,E + 0 6
6
1 ,E + 0 5
7

1 ,E + 0 4 8

9
1 ,E + 0 3
10
1 ,E + 0 2
0 30 60 90 120 150

T IE M P O (D ÍA S )

Figura 2 . Curvas de crecimiento para tratamientos inoculados y controles no inoculados.

A final del estudio los valores de hidrocarburos totales remanentes (HCT) provenientes de los tanques
inoculados resultaron muy por debajo a los obtenidos en los controles no inoculados, los cuales no
presentaron cambios representativos durante todo el estudio. La concentración de los hidrocarburos
disminuyó rápidamente durante los primeros 60 días de tratamiento en los tanques inoculados con el cultivo
mixto y luego el proceso de degradación disminuyó progresivamente en los mismos tanques hasta el final del
estudio como se observa en la Figura 3. Las curvas de pendientes más pronunciadas correspondieron a los
tanques inoculados aireados y fertilizados (8, 9 y 10) con valores de hidrocarburos remanentes finales de
330,5; 935,7 y 490,12 mg/L respectivamente, lo que indicó que el tratamiento aplicado en estos tanques fue
eficiente para la remoción del aceite. En la Figura 3, se puede distinguir que el proceso presentó dos fases
durante la degradación: la primera probablemente correspondió a la degradación de la fracción lábil, fracción
fácilmente degradable, y la segunda, a la degradación de una fracción más resistente al ataque microbiano y
que por consiguiente fue más lenta. Mesa y Lugo (2000) realizaron un estudio de Biorremediación de suelos y
encontraron una disminución rápida de los hidrocarburos presentes durante las primeras nueve semanas, y
luego una disminución lenta de las concentraciones en las nueve semanas siguientes. Jamison y Hudson
(1975), demostraron que el suministro de nutrientes y oxígeno estimuló el metabolismo de los organismos
incrementando la degradación de tal manera que se logró la eliminación de hasta 1000 barriles de gasolina
mediante la actividad microbiana estimulada.

TANQUES
8000 1
7000
2
6000
3
HTC (mg/L)

5000
4000 4
3000 5
2000
6
1000
7
0
0 30 60 90 120 150 8
TIEMPO (DÍAS) 9

Figura 3. Concentración de los HCT durante el estudio para cada tanque.

La remoción de aceite en cada tratamiento se muestra en la Figura 4. Los tanques 8, 9 y 10 que fueron
inoculados, fertilizados y aireados mostraron los porcentajes más altos de remoción de 85,09; 76,24 y 82,75
% respectivamente.

90,00

80,00

70,00

60,00

50,00

40,00

30,00

20,00

10,00

0,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

T A N QU E

Figura 4. Porcentajes de remoción de los hidrocarburos totales.

Los altos porcentajes de remoción de aceite logrados en este estudio concuerdan con lo reportado por
LaDausse et al (1987) quienes demostraron la importante mejora que se producía en la biodegradación de
crudo en recipientes fertilizados, en los cuales lograron remover el 60 % de los hidrocarburos presentes.
Adicionalmente, estos investigadores suministraron oxígeno a algunos recipientes y obtuvieron un incremento
en la remoción superior al 70 % en el medio fertilizado. La Tabla 3 presenta los resultados de las fracciones
de hidrocarburos remanentes. En todos los tratamientos se observó la remoción de hidrocarburos saturados y
resinas, en los tratamientos fertilizados y aireados se encontraron los valores más altos. Con respecto a los
aromáticos y asfaltenos la mayor remoción se observó en los tratamientos fertilizados y aireados. Baker
(1987), demostró que niveles bajos de oxígeno limitaban la degradación de compuestos carbonados saturados,
aromáticos y resinas; la biotratabilidad de hidrocarburos debe contar con la adición de oxígeno, nitrógeno y
fósforo.
Tabla 3. Fracciones de los hidrocarburos Saturados, Aromáticos I y II, Resinas y Asfaltenos al inicio y
al final del estudio.

Tanques Tiempo Saturados Aromáticos I Aromáticos II Resinas Asfaltenos

(Días) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
1 0 6057 93,7 26,3 905 17,1
150 6030 96,4 24,1 816 15,2
2 0 6074 93,7 26,4 907 17,1
150 5447 84,3 23,6 814 15,3
3 0 6083 94,1 26,4 909 17,1
150 3254 132,4 24,5 675 14,2
4 0 6083 94,1 26,4 909 17,1
150 604 88,5 20,1 675 4,4
5 0 6134 94,9 26,6 916 17,2
150 1173 18,1 42,5 785 12,4
6 0 6083 94,1 26,4 909 17,1
150 1250 22,5 36,2 660 10,8
7 0 5997 92,8 26 896 16,9
150 995 21,9 49 572 12
8 0 6096 94,3 26,4 910 17,2
150 104 28,8 14,3 180 2,9
9 0 5997 92,8 26 896 16,9
150 589 41,4 13,5 288 3,2
10 0 6057 93,7 26,3 905 17,1
150 222 32,4 12,5 220 3,4

Durante todo el estudio se observó una disminución de la concentración de nitrógeno y fósforo en cada
tanque. Los primeros 60 días se lograron las mayores disminuciones en los tanques aireados, lo que concuerda
con los resultados de Venosa (1990) quien reportó que las mayores disminuciones de nitrógeno y de fósforo
en medios acuáticos contaminados con hidrocarburos tenían lugar en las primeras semanas de estudio;
disminuyendo de manera secuencial pero en menor grado hasta el final del ensayo. La concentración de
nitrógeno va disminuyendo en mayor proporción que la del fósforo durante los tratamientos, debido a que los
microorganismos, necesitan una proporción 10:1 de estos componentes para la asimilación y la síntesis del
nuevo material celular (Metcalf & Hedí, 1996).

CONCLUSIONES

• El cultivo mixto de las cepas bacterianas seleccionadas logró una remoción eficiente de los
hidrocarburos presentes en el aceite en todos los tratamientos. El proceso fue optimizado al controlar
las variables de aireación y fertilización, lográndose de esta manera la duplicación de la remoción, la
cual alcanzó hasta un 85% en cinco meses de tratamiento.
• La aireación incrementó la remoción del aceite notablemente, lo que se tradujo en una disminución
de todas las fracciones de hidrocarburos aromáticos, asfaltenos y principalmente los saturados y las
resinas, tanto en los tratamientos fertilizados como en los no fertilizados.
• En todos los tratamientos la adición de nitrógeno y fósforo contribuyó a la reducción de las
fracciones de resinas, asfaltenos, saturados y aromáticos I.
• La aplicación de fertilizante con aireación produjo valores más altos de remoción de los
hidrocarburos que sin aireación, lo que se tradujo en una mayor disminución de todas las fracciones
de hidrocarburos.
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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