Control genético del tiempo de floración

Manuel Piñeiro,
Master UPM, 2017
Regulación precisa del tiempo de
floración
Factores endógenos y medioambientales modulan el momento de la floración
 Fotoperiodo: distintas estrategias reproductivas

Petunia (fac.) Dianthus caryophyllus

(oblig.)

Cosmos Helianthus paradoxus

 Brassica Brassica

Distintas respuestas a
vernalización

Hyosciamus niger Triticum aestivum

(beleño) (trigo)
Arabidopsis thaliana
 Respuestas florales de Arabidopsis a condiciones ambientales

+ vern.
día
largo

día corto

- vern.
Control genético del tiempo de floración: análisis genético y molecular de
mutantes

día largo

día corto

Tipo silvestre mutante Tipo silvestre mutante

 Rutas de inducción de la transición floral

Ruta Ruta
Autónoma Vernalización
Ruta
Día Largo Giberelinas

FMIG FOIG
 Integradores florales

Age pathway

Amasino, 2010. Plant J.

CO desempeña un papel central en la inducción fotoperiódica de la floración

B boxes CCT
Ler co CO

Proteína CO estable en luz (azul e

infrarroja), no en oscuridad o luz roja
Modelo de regulación de CO por el reloj circadiano y la luz:
Coincidencia externa
Amasino, 2010. Plant J.
 Regulación epigenética de FLC durante la transición floral

SWR1
PAF1
RNAs largos no codificantes son importantes para el silenciamiento estable de
FLC
RNAs largos no codificantes son importantes para el silenciamiento estable de
FLC
 SOC1

FLC
 La temperatura ambiente modula el tiempo de floración a través de
cambios en la estructura de la cromatina

23ºC 27ºC
Balasubramanian et al., 2006

FT
H2A.Z

cold

Col arp6
MarPn-Trillo et al, 2006
AAAAAA
AAAAAA
AAAAAA
H2A.Z RNA
pol II

FT PIF4
warm
Owen-Hughes and Bruno, 2004
 La conexión entre splicing alternativo y cromatina en la respuesta de
floración a temperatura ambiente

FLM media la sensibilidad a temperatura … a través de splicing alternaPvo

Balasubramanian et al., 2006

 Inducción floral en Arabidopsis

Autonomous Vernalization
pathway pathway

Photoperiod
pathway
FLC
CO
GA pathway

Age pathway FT SOC1

repressors

 Represores florales

Ler ebs L31

L35 L55 L81

 Los mutantes early bolting in short days (ebs) florecen temprano

LD
BAH PHD NLS
224 aa

35S::GFP:EBS

SD
35S::GFP

GFP DAPI
 EBS es necesario para reprimir la expresión de FT

Ler ebs-1 Ler ebs-1

days 4 6 8 10 12 14 19 4 6 8 10 12 14 19
FT

UBQ FT::GUS
20

Ler
FT/UBQ

10
ebs-1

0
ebs-1 ft-1 ebs-1 ft-1
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
SD
EBS es parte de una familia de reguladores transcripcionales específicos de plantas

opulus2

ossypium3
A. thaliana
opulus3

truncatula

opulus4
 SHL actúa como represor floral

shl-2
shl-1

ATG STOP

SHL

Col Ler shl-1 shl-2 Col Ler shl-1 shl-2

SHL SHL

UBQ 18S

SD SD
60

N leaves SD
40

20
Col shl-1 Ler shl-2
0

shl-1
Col

shl-2
Ler
 SHL complementa el fenotipo de floración temprana de los mutantes
shl-2

40
Ler shl-2 pSHL::Myc-SHL Ler
shl-2 30 shl-2

N leaves
pSHL::Myc-SHL
20 shl-2

10

0
LD SD
¿Tiene SHL funciones redundantes con EBS en el control del desarrollo vegetal?

floral bud
flower

stem

root
leaf
SHL

18S

D0 D1 D3 D7 D20

pEBS GUS

pSHL GUS
EBS and SHL tienen funciones parcialmente redundantes en el control del
desarrollo

SD
40

N levaes SD
Ler ebs shl-2
DL DC
20
ebs
shl-2
0

Ler

ebs
shl-2

shl-2
ebs
SD 80

60

N leaves SD
40

20
ebs ebs
Col (Col) shl-1 shl-1 0

Col

shl-1
ebs

shl-1
ebs
ebs ebs ebs
Ler shl-2 ebs Col shl-1
shl-2 (Col) shl-1
 Análisis genético = ruta

≠ ruta
m1
m2
m1 m2
 SHL no interacciona con rutas de inducción de la
floración

shl-2
Ler shl-2 fve-1 fve-1
shl-2
Ler shl-2 co-2 co-2

40
n hojas

20
shl-2
Ler shl-2 ga2-1 ga2-1

0
co-2
Ler
shl-2

gi-3

fve

ga2-1

ga2-1
co-2

fve
gi-3

shl-2
shl-2

shl-2

shl-2 ebs ga1-3 ebs ga1-3

 SHL no controla la expresión de genes representativos de las distintas rutas de
inducción floral
Ler
40 ebs
Ler ebs shl-2

CO/UBQ
shl-2

FLC
20

MAF 1
0
0 4 8 12 16 20 24
MAF 2
Time (h)

MAF 3
T (h) 0 4 8 12 16 20 24
L e s L e s L e s L e s L e s L e s L e s MAF 4

CO MAF 5

UBQ UBQ

Ler ebs shl-2 Ler ebs shl-2 Ler shl-2 fve shl-2 fve
FVE GA5 FLC

18S UBQ10 18S

 SHL es necesario para reprimir la expresión de SOC1

(h) 0 4 8 12 16 20 24

L e s L e s L e s L e s L e s L e s L e s
Ler shl-2 ebs LD
FT
shl-2
ft-1 ebs ft-1 UBQ
ft-1
Ler
16 ebs
12 shl-2

FT/UBQ
8
4
0
0 4 8 12 16 20 24

Time (h)

18 d 20 d 25 d
LD L e s L e s L e s
Ler shl-2
SOC1
soc1-1 shl-2
soc1-1 18S

9 Ler
ebs ebs
ebs
soc1-1
SOC1/18S
6 shl-2

0
18 20 25

Time (days)
 EBS y SHL reprimen los integradores florales FT y SOC1 respectivamente

ebs shl-2 shl-2 SD Ler ebs soc1-1 ebs shl-2 SD

Ler shl-2 ebs soc1-1
ebs ft-1 ebs ebs soc1-1 ebs shl-2
ft-1 shl-2
ft-1 shl-2 shl-2 soc1-1
ft-1

Morning Evening
ebs Morning Evening

ebs

ebs

ebs
ebs

ebs

ebs

ebs

Ler
Ler

Ler
Ler

shl
shl

shl
shl

shl

shl
shl

shl
FT SOC1

CO 18S

UBQ 10
 EBS y SHL reprimen los integradores florales FT y SOC1 respectivamente

Autonomous Vernalization
pathway pathway

Photoperiod
pathway
FLC
CO
GA pathway

Age pathway EBS FT SOC1 SHL

EBS and SHL tienen papeles independientes en el control de la expresión
génica
ebs up shl-2 up
Normed freuency ebs
shl-2

73 68 73

19 18 59

TF NAB TA HA O ebs down shl-2 down

Fold change
shl-2
Fold change
ebs - 4.33 5.7
Photomor.
-2.5 4.36
Photomor.
Develop.
Develop.
TF
TF Abiotic str. Abiotic st.
Biotic str. Biotic st.
Hormone sign. Hormone sign.
Unknown Unknown
¿Cual es la función molecular de EBS y SHL en el control de la expresión
génica?
ChromaPn remodeling Exchange of histone variants

Owen-Hughes and Bruno, 2004

DNA methylaPon

Histone modificaPon
 BAH PHD NLS

BAH
- BromoAdjacent Homology
- en proteínas implicadas en el
silenciamiento de cromaPna
(C5MTasa, ORC1, Sir3...)

EBS y SHL contienen un dominio PHD altamente conservado

* * * *

Zn binding Zn binding

EBS SHL HsBPTF

 EBS y SHL son “lectores” de H3K4me2/3

E-PHD/S-PHD

GST
i 5%
E-PHD

E-PHD

E-PHD

E-PHD
E-PHD*

E-PHD*

GST
i 5%
S-PHD

S-PHD

S-PHD

S-PHD
S-PHD*

S-PHD*
-
-
E-PHD/S-PHD
W Mut
me0 me1 me2 me3 me0 me1 me2 me3
H3K4 H3K4

EBS/SHL
α-H3K4 me3

Hist. + - + - + + + + - + - + + +

i 5%
i 5%
Ext.

E-PHD
EBS

E-PHD*
EBS*

S-PHD

S-PHD*
SHL*
GST

SHL

GST
EBS/SHL
W Mut

S-PHD*+

E-PHD*+
S-PHD*-

E-PHD*-
S-PHD+

E-PHD+
S-PHD-

E-PHD-
GST+

GST+
i 10%
Hist. i 10%
Ext.

α-H3K4me3
E-PHD/S-PHD
α-H3K36me3
E-PHD/S-PHD
W Mut α-H3K9me2

α-H3K27me3
CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION: ChIP

Regiones genómicas gen de interés

AnWcuerpo:
- Proteína o modificación de histona relevante

PCR:
+/- disWntas
condiciones/genoWpos
 EBS y SHL son necesarios para modular los niveles de acetilación de
histonas en la cromatina de FT ySOC1 respectivamente

SOC1 +1
SHL
-2600 +2800
I II III
2 H3 K27 me3 Ler
4 3
H3 K4H3me3 Ler Myc
Ac Ler 2 H3 K27 me3 shl-2
K4H3me3
Ac shl-2
Rel. enrich.

H3 shl-2 Myc-SHL

Rel. enrich.
Rel.enrich.
Rel. enrich.

2
2
1 1 1

0 0
SOC1 I SOC1 II SOC1
SOC1IIII SOC1 II SOC1 III
0 0
SOC1 I SOC1 II SOC1 III SOC1 I SOC1 II SOC1 III

FT +1
EBS
-2000 VII +2425
II
IV
VI

H3 K27 me3 Ler 1.0 H3 K4 me3 Ler

0.4 1.0 4 me3 ebs
H3 K27
H3 Ac Ler H3 K4 me3 ebs
Rel. enrich.
Rel. enrich.

Myc
H3 Ac ebs
Rel. enrich.
Rel. enrich.

Myc-EBS
0.5 2 0.5
0.2

0.0 0
FT II FT IV FT FT
VI II FT FT
VII IV FT VI FT VII
0.0 0.0
FT II FT IV FT VI FT VII FT II FTIV FT VI FT VII
 EBS & SHL interaccionan con HDACs

EBS-GST HDA19-MBP
EBS-GST HDA6-MBP

EBS-GST HDA9-MBP

GST-HDA19-MBP
GST-HDA6-MBP

GST-HDA9-MBP
EBS-GST pMAL
In vitro

EBS-GST 0
Col ebs axe1-5 ebs axe1-5 Col ebs axe1-5 ebs axe1-5 α -GST

In planta EBS-YFP-C
HDA6-YFP-N

Input IP
HA-HDA6

HA-HDA6
HA-HDA6

HA-HDA6
Myc-EBS

Myc-EBS
Myc-EBS

Myc-EBS

EBS-YFP-C
YFP-N

α-Myc

YFP-C
HDA6-YFP-N
 MODELO DE TRABAJO

EBS / SHL
PHD
HDAC
H3K4me2/3

FT
SOC1
Ac Ac
H3K9/14 H3K9/14Ac

EBS / SHL
HDAC
PHD

H3K4me2/3

FT
SOC1
Ac Ac
H3K9/14 H3K9/14Ac
 EBS regula otros aspectos del desarrollo vegetal

-5,75 0,0 9,02

Fold change

•  At3g60520.
•  AGP31.
•  TSO2
•  GASA4
•  WRKY23
•  EMF1
Ler ebs
•  AGL44
•  RGA1
AGL67
•  FLC
•  RGL2
•  RGL3
•  ABI5
•  SOMNUS
•  SCL14
•  PHYE
•  MFT
•  AGL67
•  DREB19
•  RING1A
•  LEA (36600)
•  ATS1
•  GASA2
•  ATS3
 EBS controla el desarrollo reproductivo
Ler WT ebs

LD 22'C SD 22'C
Meristem arrest Meristem arrest
fasciated lateral stems % fasciated lateral stems %
floral reversion
lateral stems no floral reversion
branches no lateral stems no
branches no
floral reversion
branches/mail floral reversion delay in
branches %
branches % development
floral reversion delay in
flowers no development floral reversion cluster-umbrella
flowers no %
floral reversion cluster-umbrella
flowers % % floral reversion cluster-umbrella
phyllotaxy cluster-umbrella flowers % no
deffects no phyllotaxy
deffects
Col WT Col ebs Ler WT Ler ebs 0 Col WT Col ebs Ler WT Ler ebs 0
 Genes candidatos a mediar el efecto de EBS en el control del desarrollo reproductivo

1 AGL24 ATG
AGL24 EBS
-2600

1 2 3 4 35S::AGL24
0
Binding to AGL24
0.5 6
TFL1

% of input
relaPve expression

3
0

0
0.1 1 2 3 4
LFY

0 TFL1 ATG
EBS

0.5 -1000 +3300

FLC 2 TSS E F 6

Binding to TFL1
1
0
% of input

0.5 WT
bud flower bud flower reverting c-myc EBS
bud

WT ebs 0
p2 TSS E F 6
 Aproximaciones transcriptómicas a la función de EBS en el desarrollo de la inforescencia

inflorescence

ebs WT

Gene ↑↓
AGAMOUS-LIKE 19 (AGL19) ↑ binding to SEP3
WT
Rel. expression

20 AGAMOUS-LIKE 24 (AGL24) ↑

% of Input / NC
AGAMOUS-LIKE 42 (AGL42) ↑ 80
ebs
AGAMOUS-LIKE 8 (AGL8) ↑
AGAMOUS-LIKE 44 (AGL44) ↑
10 AGAMOUS-LIKE 71 (AGL71) ↑
40
AGAMOUS-LIKE 72 (AGL72) ↑
EMBRYONIC FLOWER 1 (EMF1) ↑
FLOWERING LOCUS C (FLC) ↑
0 HAPLESS 2 (HAP2) ↑ 0
AP38 (HAP8)
HAPLESS SEP3. ↑ prom 1 prom 2 3' UTR
HECATE 1 (HEC1) ↑
LEAFY (LFY) ↑
SEPALLATA 4 (SEP4) ↑
SEPALLATA3 (SEP3)
binding to AP3 ↑ H3ac in SEP3
SHATTERPROOF 1 (SHP1) ↑
TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) ↑ WT
% of input / H3
6
% of input / NC

20 TCP1 ↑
NUCLEAR FACTOR Y, C7 (NF-YC7) ↑ ebs
LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT3 (LEA3) ↑ 4
10AFFECTING FLOWERING 4 (MAF4)
MADS ↑
SCHNARCHZAPFEN (SNZ) ↑ 2
YUCCA 8 (YUC8) ↑
0
VERNALIZATION INSENSITIVE 3 (VIN3) ↑ 0
FANTASTIC FOUR 2 (FAF2) ↓
prom
FANTASTIC FOUR 4 (FAF4)
3' UTR ↓
prom I TSS 3' UTR
FLOR1 (FLR1) ↓
FLORAL TRANSITION AT THE MERISTEM1 (FTM1) ↓
 EBS regula la arquitectura de la
inflorescencia

WT ebs

Aproximaciones genéPcas Reportadores expresión génica

Dobles mutantes