UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍAS

PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

MODULO DE BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA

AUTORA: Msc FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES

 TABLA DE CONTENIDO

UNIDAD 1 : INTRODUCCIÓN A LOS PRINCIPIO DE BIOTECNOLOGÍA 4

ALIMENTARIA
CAPITULO 1. ASPECTOS GENERALES DE LA BIOTECNOLOGÍA. 4
Lección 1. Definiciones de Biotecnología e Historia de la Biotecnología 4
Lección 2: Divisiones de la Biotecnología y Tipos 7
Lección 3: Impacto de la Biotecnología en Colombia y Tendencias Mundiales 13
CAPITULO 2. BIOTECNOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES 23
Lección 1: Nutrición microbiana. 23
Lección 2 Crecimiento microbiano 29

Lección 3: Principios de Bioingeniería 41

CAPITULO 3 : BIOTECNOLOGIA ENZIMÁTICA 47

Lección 1: Las enzimas, biocatalizadores de naturaleza proteínica 47
Lección 2 : Cinética enzimática 54
Lección 3 : Producción industrial de Enzimas 59
UNIDAD 2 : PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA 70
BIOTECNOLOGÍA
CAPITULO 1: TECNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIÓN GENÉTICA IN VITRO. 71
Lección 1: Tecnología del ADN recombinante 72
Lección 2: La reacción en cadena de polimerasa ( PCR) 78
CAPITULO 2: OTRAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGIA : 81
Lección 1: Mutagénesis 81
Lección 2: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos 81
Lección 3 : Mutagénesis en Casette o interrupción génica 83
CAPITULO 3 : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE 83
Lección 4: Animales transgénicos 83
Lección 5: Plantas Transgénicas 84
Lección 6: Alimentos genéticamente modificados 86
UNIDAD 3 : PRODUCTOS BIOTECNOLÒGICOS DE INTERES ALIMENTARIO 88
CAPITULO 1: APLICACIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA EN LA OBTENCIÓN DE PRODUCTOS 88
DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGÉTICO POR VÍA FERMENTATIVA.
Lección 1: Bebidas alcohólicas 88
Lección 2: Biología de las fermentaciones con levaduras 88
Lección 3: Condiciones de la fermentación 89
Lección 4 : Compuestos organolépticos 91
Lección 5 : Alimentos basados en soja fermentada 92
Lección 6 : Productos cárnicos fermentados 94
Lección 7 : Vinagre 95
lección 8 : acido Láctico 96
lección 9: acido Acético 96
CAPITULO 2: COMPUESTOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA PRODUCCIÓN DEL 97
METABOLISMO SECUNDARIO.
Lección 1 : Producción de acido cítrico 97
CAPITULO 3 ·: PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO SINTÉTICOS 101
Lección 1 : Polisacáridos microbianos y PHAs 101
Lección 2 : Alimentos funcionales 103
ANEXO PRACTICAS DE LABORATORIO 106
BIBLIOGRAFIA 120
 UNIDAD 1: PRINCIPIOS BÁSICOS DE BIOTECNOLOGÍA

CAPITULO 1. GENERALIDADES DE LA BIOTECNOLOGÍA

Lección 1. Definiciones de Biotecnología

Existen diversas definiciones de Biotecnología provenientes de diversos

enfoques y puntos de vista, que van desde conceptos más generales hasta
particulares. Por ejemplo: “La biotecnología, se ha definido como la aplicación de
organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y
servicios”. Sin embargo, se considera que este enunciado es muy amplio y
engloba todas las operaciones de la biología aplicada desde la agricultura hasta la
ciencia culinaria.

En un sentido mucho más estrecho, la palabra biotecnología se refiere a veces,

para definir la utilización de la manipulación genética con el fin de obtener la
expresión correcta a altos niveles de un gen clonado en células huésped. Así
como también la aplicación de la biología molecular en direcciones que se
esperan sean de utilidad como el uso de marcadores moleculares para identificar
microorganismos de importancia agrícola. Este enfoque, supone confundir los
aspectos de moda con los principios de la biotecnología y se debe más a la
filosofía de las agencias de publicidad y medios de comunicación que a la
industria.

Según la OTA-USA (1981), la OECD (1982) y la CEPA-Canadá (1985), la

biotecnología es la aplicación de la ciencia y la ingeniería en el uso directo o
indirecto de organismos vivos o parte de ellos, en sus formas naturales o
modificadas, en una forma innovadora para la producción de bienes y servicios o
para la mejora de procesos industriales existentes. Desde este punto de vista se
evidencia una integración entre las ciencias básicas con las ciencias aplicadas
puesto que se pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes
biológicos sencillos como células vivas o muertas, o componentes celulares en
operaciones técnicamente beneficiosas, bien sea de fabricación de productos o
como operaciones de servicios.
Para responder a los planteamientos de la anterior definición la biotecnología
debe considerarse como un área del conocimiento intensamente interdisciplinar,
caracterizada por la reunión de conceptos y metodologías procedentes de
numerosas ciencias para aplicarlas tanto a la investigación básica como a la
resolución de problemas prácticos y la obtención de bienes y servicios.

Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnología son: La

Microbiología, Embriología, Bioquímica, Genética, Biología celular, Química,
Mecánica, Electrónica, Informática. Entre otras.

En conclusión, la biotecnología surge como un espacio de recombinación de

conocimiento de diversas áreas del conocimiento que pretende dar soluciones a
los problemas relacionados con la medicina, la agronomía, zootecnia, la
agroindustria, la ingeniería de alimentos, problemas ambientales, entre otros
campos. Es así entonces, que el aporte de la biotecnología se produce en dos
etapas, en la primera, la investigación científica básica que se coloca por
delante de la innovación tecnológica, exponiendo todo su valor predictivo y
transformador, además de su capacidad explicativa. No hay desarrollo en esta
rama sin investigación científica. La segunda fase, se caracteriza por el desarrollo
de un sistema estandarizado de métodos secuenciales entre los cuales se
identifican claramente las relaciones y procedimientos operacionales que
condicionan el éxito del proceso.

Lección 2: Historia de la biotecnología

Si bien es cierto, en las primeras etapas de la historia de la humanidad se

utilizaron los seres vivos o productos derivados de ellos para atender las
necesidades del hombre tales como el vino y el pan, entre otros; estos productos
no pueden considerarse como un resultado de procesos biotecnológicos, puesto
que en este estadio de desarrollo las fermentaciones son procesos naturales que
no involucran la manipulación de los sistemas biológicos para modificar o
controlar las propiedades del producto obtenido. Sin embargo, esta es una larga
etapa de preámbulo caracterizada por las ideas vitalistas o animistas que desde
un enfoque dialéctico motivan el desarrollo de métodos experimentales que
buscan predecir, explicar y transformar los fenómenos biológicos para obtención
de bienes y servicios, que finaliza con la consolidación de la moderna
Biotecnología en el siglo XX I.

Para comprender la historia de la Biotecnología es preciso dividirla en cuatro

fases.

Primera época o era precientífica: corresponde a la época anterior a Pasteur

y sus comienzos se confunden con los de la humanidad. En esta época, se
realizan prácticas empíricas de selección de plantas y animales y sus cruzas, y
fermentaciones como un proceso para preservar y enriquecer el contenido
proteínico de los alimentos. Este período se extiende hasta la segunda mitad del
siglo XIX y se caracteriza como la aplicación artesanal de una experiencia
resultante de la práctica diaria. Era tecnología sin ciencia subyacente en su
acepción moderna. Como ejemplos concretos cabe mencionar las aplicaciones en
:

La domesticación de plantas y animales ya comenzó en el período

Neolítico.

Las civilizaciones Sumeria y Babilónica (6000 años a.C.) ya conocían cómo

elaborar cerveza.

Los egipcios ya sabían fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C.

Antes de la escritura del libro del Génesis, se disfrutaba del vino en el Cercano
Oriente: recuérdese que, según la Biblia, Noé "sufrió" (o disfrutó)
accidentalmente los efectos de la fermentación espontánea del mosto de la uva
(primera borrachera con vino)

Se podría afirmar que esta era pre-científica termina en el siglo XVIII cuando
cobra cuerpo la idea de que la materia viva puede ser estudiada como la materia
inanimada, es decir, usando el método experimental, con lo que se inicia el lento
declive de las ideas vitalistas (creencias erróneas de que "la vida depende de un
principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que aún darían sus
últimos estertores casi al final del siglo XIX.

Segunda época
El trabajo preliminar de los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y
Hooke (siglo XVII), facilitó un par de siglos más tarde, la comprensión, de la
verdadera importancia de las células procarióticas y eucarióticas, en procesos
relacionados con la fermentación y en el origen de las enfermedades infecciosas.

Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiológica fue el

establecimiento de la relación que une ciertas transformaciones químicas que se
dan en las infusiones con el crecimiento de los gérmenes en ellas existentes.
Cagniard-Latour en 1836, y Schwann y Kützing en 1837 habían sugerido que las
levaduras eran las causantes de la fermentación alcohólica por la que el azúcar
pasa a alcohol etílico y dióxido de carbono, pero se encontraron con la crítica
adversa de los grandes químicos de la época (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig,
hacia 1840, había realizado importantes confirmaciones a la "teoría mineral"
sobre la nutrición de las plantas, enfrentándose a la "teoría del humus" sostenida
por Thaer, asestando un golpe a las ideas vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto
que se consideraba a las levaduras como plantas microscópicas, se suponía que
los procesos de fermentación y putrefacción se debían a fenómenos químicos de
descomposición y muerte encuadrables en el marco de la teoría mineral de la
fisiología vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se podía explicar
en términos de química y física retrasó por algún tiempo la adscripción de estos
fenómenos a células vivas.
Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades ópticas de
los cristales de tartrato, venía suponiendo que estos compuestos tenían un orígen
orgánico) quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En 1857
demostró que los agentes de la fermentación láctica eran microorganismos,
trabajando sobre un problema que había surgido entre los destiladores de Lille
cuando en sus cubas la fermentación alcohólica se vio sustituida por una
indeseable fermentación láctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios
que habría de durar hasta 1876, en los que Pasteur identificó distintos
microorganismos responsables de diferentes clases de procesos fermentativos.
Así, en 1860 adscribe inequívocamente la fermentación alcohólica a ciertos tipos
de levaduras, y en 1866, en sus “ Études sur le vin” resume sus hallazgos al
respecto, inaugurando la Microbiología Aplicada, una de las primeras derivaciones
prácticas no empíricas emanadas de la Biología. A finales del siglo XIX eminentes
biólogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su
actividad en industrias y destilerías.

Trabajando sobre los agentes de la fermentación butírica, Pasteur descubrió la

presencia de microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxígeno, lo
cual desmentía la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para
crecer. Acuñó los términos aerobiosis y anaerobiosis para denominar,
respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de oxígeno.

Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendió las

distintas implicaciones energéticas subyacentes a la utilización de sustratos
orgánicos en presencia y en ausencia de oxígeno, demostrando que, en el
segundo caso el rendimiento (medido como crecimiento microbiano) era siempre
menor, al no poder realizarse la degradación total de las correspondientes
sustancias.

Una profundización en los fenómenos de fermentación llegó cuando en 1897

Buchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparación enzimática (zimasa) que
era capaz de realizar la misma transformación de "fermentación" que las células
vivas. Este descubrimiento, que evocaba las propuestas de Berzelius y Liebig,
supuso en realidad la confluencia de los enfoques químico y biológico: las
fermentaciones eran procesos químicos catalizados por enzimas presentes dentro
de células vivas, que podían ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la
Bioquímica, nacida como una rama de la química fisiológica, que se venía
especializando en la enzimología, encontró una alianza fructífera y duradera con
la joven Microbiología, estableciendo las bases enzimáticas y metabólicas de
muchos procesos de fermentación. De esta forma se desarrollaron
procedimientos industriales para producir enzimas (invertasa, proteasas,
amilasas, etc.). y el siguiente descubrimiento por parte de Buchner de la
capacidad de las enzimas, extraídas de las levaduras, de convertir azúcares en
alcohol.

Tercera época
En la historia de la biotecnología se caracteriza por desarrollos en cierto sentido
opuestos, ya que por un lado la expansión vertiginosa de la industria
petroquímica tiende a desplazar los procesos biotecnológicos de la fermentación,

pero por otro, el descubrimiento de la penicilina por Fleming en 1928, sentaría

las bases para la producción en gran escala de este antibiótico con el fin de
satisfacer las demandas generadas en la II Guerra Mundial, en esa época, la
producción de penicilina es el resultado de avances importantes en técnicas de
esterilización a gran escala, mejora de las instalaciones de fermentación,
comprensión y control de procesos de fermentación (incluyendo temperatura,
pH, aireación), entre otros. A partir de entonces se diseñaron estrategias para
mejorar genéticamente las cepas microbianas industriales.

Desde esa época, las técnicas de ingeniería química, aliadas a la microbiología y

a la bioquímica, permiten la producción masiva de antibióticos, ácidos orgánicos,
esteroides, polisacáridos y vacunas.

Estos desarrollos dieron un gran impulso a la aplicación de las técnicas de

fermentación en la industria alimenticia y al desarrollo industrial de productos
como las levaduras, los ácidos cítricos y lácticos y, finalmente, al desarrollo de
una industria química para la producción de acetona, "butanol" y glicerol,
mediante el uso de bacterias. Las décadas de los 60 y 70 vieron la mejora de
procesos de obtención de pequeños metabolitos como nucleósidos, aminoácidos y
vitaminas.

Los procesos de fermentación experimentaron mejoras con las técnicas de

inmovilización de células y enzimas en soportes, y con la fermentación continua
para obtener proteína de células sencillas (biomasa microbiana). Así mismo los
polímeros microbianos como xantanos y dextranos se obtuvieron industrialmente,
con aplicaciones en el campo de la alimentación (como aditivos). Y se abrió la
posibilidad de cultivar cada cepa microbiana sin mezclas con otras: cultivos puros
en medios de cultivo de laboratorio
Cuarta época.
Es la actual. Se inicia con el descubrimiento de la doble estructura axial del ácido
"deoxi-ribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953, seguido por los procesos
que permiten la inmovilización de las enzimas, los primeros experimentos de
ingeniería genética realizados por Cohen y Boyer en 1973 y aplicación en 1975
de la técnica del "hibridoma" para la producción de anticuerpos "monoclonales",
gracias a los trabajos de Milstein y Kohler.(1983). Estos importantes
descubrimientos han dado lugar a numerosos trabajos de mejoramiento genético
tanto en plantas como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a
partir de células madre, y el importante acontecimiento de la aparición de la
oveja Dolli en el contexto científico, que dio un vuelco total al concepto de
Biotecnología.

Revisión de conceptos : La Biotecnología evidencia como una

integración entre las ciencias básicas con las ciencias aplicadas puesto
que se pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes
biológicos sencillos como células vivas o muertas, o componentes
celulares en operaciones técnicamente beneficiosas, bien sea de
fabricación de productos o como operaciones de servicios.
Según lo anterior:
Se puede afirmar, qué la fabricación de vino en la época antigua es
Biotecnología?
Cuáles son los ejes teóricos que sustentan la Biotecnología.
La obtención de azúcar a partir de la caña, se podría
considerar un proceso de Biotecnología? Cuáles serían los
puntos a tener en cuenta para considerar esta práctica
como tal.
Lección 3: Divisiones de la Biotecnología

En la historia de la Biotecnología se puede apreciar que las técnicas y

procedimientos utilizados han tenido una aplicación rápida en áreas tan diversas
como la agricultura, la industria alimenticia, la farmacéutica, los procesos de
diagnóstico y tratamiento médico, la industria química, la minería y la
informática, Como se puede apreciar existe una amplia gama de campos de
aplicación y en todos ellos se han generado un amplio numero de productos y
servicios. Sin embargo, es de señalar que todos los procesos de innovación
tecnológica se caracterizan generalmente por presentar tres núcleos científicos
John Smith (1996) :

1. obtención del mejor catalizador biológico para una función o

proceso específico: En la mayoría de los casos, el catalizador
biológico son células vivas, sobre todo microorganismos. Por ello,
uno de los pilares de la biotecnología es precisamente la
microbiología (entendiendo esta en sentido amplio de biología
microbiana). Parte de lo que hemos aprendido sobre el manejo de
microorganismos se puede aplicar, con modificaciones, al manejo
de células de animales y plantas, que cada vez son más
importantes en la biotecnología. Varias son las características que
hacen atractivos a los microorganismos:

2. obtener el mejor ambiente para la función de ese

catalizador biológico, mediante una serie de diseños técnicos en
los que es fundamental la ingeniería química El segundo
componente o núcleo de las biotecnologías estriba en el entorno
industrial en que ponemos a funcionar las células o las enzimas.
Esto nos lleva al concepto de biorreactor, un entorno cerrado y
controlado para que nuestros catalizadores biológicos hagan lo que
queremos con la máxima eficiencia. En esta parte de la
 biotecnología se requiere la colaboración estrecha entre los
biólogos y los ingenieros de bioprocesos, incluyendo los ingenieros
químicos. Se trata de diseñar biorreactores o fermentadores,
especies de cubas cerradas diseñadas para controlar diversos
parámetros que condicionan la buena producción: temperatura,
aireación, pH, etc

3. procesamiento del material, consistente en separar y

eventualmente purificar el material biológico producido: quizás esta
es el área más desconocida y compleja, el procesamiento de la
biomasa o de la sustancia producida: separación de las células
respecto del medio acuoso en que han funcionado, recuperación
eficiente del producto buscado, purificación, entre otros
procedimientos.

Atendiendo a los planteamientos anteriores la biotecnología la podemos clasificar

bajo dos enfoques, el primero, de acuerdo con el nivel de tecnología utilizado en
la obtención de productos, y el segundo, según el campo de aplicación del
producto o servició.

De acuerdo al primer enfoque, las nuevas biotecnologías generalmente se

agrupan en tres categorías básicas:

Técnicas para el cultivo de células y tejidos.

Procesos biotecnológicos, fundamentalmente de fermentación, y que

incluyen la técnica de inmovilización de enzimas. (Osorio M. 2005)

Técnicas para la manipulación, modificación y transferencia de materiales

genéticos (ingeniería genética).

Aunque estos tres grupos se complementan entre sí, existe una diferencia
fundamental entre los dos primeros y el tercero. Los primeros se basan en el
conocimiento de las características y comportamiento de los microorganismos y
en el uso deliberado de estas características (de cada organismo en particular),
para el logro de objetivos específicos como la obtención de nuevos productos o
procesos. La enorme potencialidad del último grupo se deriva de la capacidad de
manipular, las características estructurales y funcionales de los organismos y de
aplicación práctica de esta capacidad para superar ciertos límites naturales en el
desarrollo de nuevos productos o procesos.

A diferencia de la primera clasificación, que señala las técnicas propiamente

tales, la segunda se refiere también a las actividades económicas en las que se
hace uso de dichas tecnologías. La nueva biotecnología crea nuevos procesos y
nuevos productos en diversas áreas de la economía. Como estos procesos se
basan en los mismos principios, ya sea que se apliquen en un sector económico o
en otro, ello introduce cierto grado de flexibilidad, ya que permite la movilidad
entre diferentes sectores. Por ejemplo, los procesos de fermentación pueden
aplicarse para la producción, en gran escala, de alcohol o de antibióticos como la
penicilina, o en escalas menores para la producción de aminoácidos en la
industria farmacéutica. Esto facilita la, movilidad de factores productivos y tiene
impacto sobre la calificación de la mano de obra, la cual, aun cuando deberá
adaptarse a este nuevo perfil tecnológico (tanto en términos, cuantitativos como
cualitativos) posiblemente logre al mismo tiempo una mayor facilidad de
empleo.

Tipos de Biotecnología: Dependiendo del campo de aplicación del servicio o

producto obtenido la biotecnología se ha clasificado en:

Biotecnología Microbiana: La biotecnología microbiana o como se llamaba

anteriormente microbiología industrial se refiere a los procesos donde participan
los microorganismos para la obtención de productos o metabolitos de interés
humano.

La microbiología industrial comenzó con los procesos de fermentación alcohólica

por ej. La fermentación del vino y de la cerveza. Más tarde se desarrollaron los
procesos microbianos para la producción de agentes farmacéuticos como los
antibióticos, la producción de aditivos alimentarios como los amino ácidos, para
la producción de enzimas y sustancias químicas industriales como el butanol, el
acido cítrico, entre otros.
En la actualidad estamos en una nueva era de la tecnología microbiana con el
advenimiento de la tecnología de genes. La tecnología genética permite que un
microorganismo procesado genéticamente fabrique sustancias que normalmente
no sería capaz de producir, es así como utilizando ingeniería genética se ha
podido producir insulina por una bacteria introduciendo el gen de la insulina
humana en la bacteria Escherichia coli.

Podemos dividir a la biotecnología microbiana en dos fases distintas:

1) La tecnología microbiana tradicional, que implica la fabricación a gran escala
de productos que los microorganismo son capaces de fabricar normalmente. En
este caso la tarea del microbiólogo consiste en modificando el organismo o el
proceso para aumentar el rendimiento del producto deseado.
2) La tecnología microbiana con organismos alterados mediante procesos de
ingeniería, es decir microorganismos en los cuales se ha insertado genes
extraños. En esta nueva tecnología el microbiólogo industrial trabaja
estrechamente asociado con el ingeniero genético en el desarrollo de un
organismo adecuado que no solo produzca el producto de interés, sino que
también pueda ser cultivado en la escala necesaria para su explotación
comercial. (Brook y Scaligan 2002)

Biotecnología Agrícola ó vegetal: Con las técnicas de la biotecnología

moderna, es posible producir más rápidamente que antes, nuevas variedades de
plantas con características mejoradas, produciendo en mayores cantidades, con
tolerancia a condiciones adversas, resistencia a herbicidas específicos, control de
plagas, cultivo durante todo el año. Problemas de enfermedades y control de
malezas ahora pueden ser tratados genéticamente en lugar del uso de químicos.
Una planta modificada por ingeniería genética, que contiene ADN de una fuente
externa, es un organismo transgénico. Un ejemplo de planta transgénica es el
tomate que permite mantenerse durante mas tiempo en los almacenes evitando
que se reblandezcan antes de ser transportados

Algunos países desarrollados como Estados Unidos y a sus multinacionales,

defienden el uso de la biotecnología y pone de relieve la importancia de su
industria, que crea nuevos puestos de trabajo y fomenta la innovación
tecnológica y podría acabar con el hambre del mundo. En Europa, los casos de
Soja y Maíz transgénicos resultan de especial relevancia. La soja se utiliza en un
40 a 60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, alimentos dietéticos e
infantiles, cerveza, etc. España importa de EEUU 1´5 millones de toneladas, el
cuarto país importador detrás de Japón, Taiwan y Holanda.

La comercialización del maíz transgénico está autorizada en EEUU, Canadá, Japón

y también en la Unión Europea desde Enero de 1997.

China planea plantar tomates, arroz, pimientos y patatas por lo menos en la

mitad de todas sus tierras de labor (500.000 kilómetros cuadrados) en el plazo
de cinco años. Sus investigadores analizaron el efecto de los pimientos y los
tomates transgénicos en ratas de laboratorio, comparando el peso y el estado de
los mismos con los de otros no alimentados, y no observaron diferencias
significativas.

Para profundizar en este tema haga clic aquí: La biotecnología en la

alimentación y la agricultura

Biotecnología animal: Esta ha experimentado un gran desarrollo en las

últimas décadas. Las aplicaciones iniciales se dirigieron principalmente a sistemas
diagnósticos, nuevas vacunas y drogas, fertilización de embriones in vitro, uso de
hormonas de crecimiento, entre otros procedimientos. Los animales transgénicos
como el "ratón oncogénico" han sido muy útiles en trabajos de laboratorio para
estudios de enfermedades humanas.

Existen tres áreas diferentes en las cuales la biotecnología puede influir sobre la
producción animal:

-El uso de tecnologías reproductivas

-Nuevas vacunas y

-cultivos celulares que producen hormonas.

En animales tenemos ejemplos de modelos desarrollados para evaluar

enfermedades genéticas humanas, el uso de animales para la producción de
drogas y como fuente donante de células y órganos, por ejemplo el uso de
animales para la producción de proteínas sanguíneas humanas o anticuerpos.

Para las enfermedades animales, la biotecnología provee de numerosas

oportunidades para combatirlas, y están siendo desarrolladas vacunas contra
muchas enfermedades bovinas y porcinas, que en los últimos tiempos han hecho
mella en estos animales.

Biotecnología Humana Las técnicas del ADN están siendo utilizadas para
determinar relaciones familiares en litigios de paternidad, para confrontar
donantes de órganos con receptores en programas de trasplante, unir
sospechosos con la evidencia de ADN en la escena del crimen (biotecnología
forense).

El desarrollo de técnicas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas o de

desordenes genéticos es una de las aplicaciones de mayor impacto de la
tecnología de ADN. Al utilizar las técnicas de secuenciación de ADN los científicos
pueden diagnosticar infecciones víricas, bacterianas o mapear la localización
específica de los genes a lo largo de la molécula de ADN en las células.

El primer tratamiento exitoso en terapia génica fue en 1990, cuando se trató una
enfermedad del sistema inmune de niños llamada "Deficiencia de ADA". Células
sanguíneas con los genes correctos de ADA fueron inyectadas al cuerpo del
paciente donde produjeron suficientes células normales que permitieron mejorar
el sistema inmune.

Hoy, la terapia génica esta tratando enfermedades tales como tumores

cerebrales malignos, fibrosis quística y HIV. Con esta técnica se pretende
también reparar órganos, como por ejemplo un hígado cirrótico a partir de las
pocas células sanas que le quedan, un par de ventrículos nuevos para reemplazar
los efectos devastadores de un infarto, la regeneración de una mano amputada o
disponer de una fuente inagotable de neuronas para corregir los efectos de
enfermedades tan graves como el Alzheimer o el mal de Parkinson.

Impacto de la Biotecnología en el contexto colombiano

Su impacto ha alcanzado varios sectores productivos: agricultura, industria de

alimentos, industria farmacéutica, bioindustria, entre otros. Aumentando la
productividad y la competitividad con la generación de nuevos productos, por lo
cual se han convertido en parte clave del crecimiento de la economía en la
mayoría de los países industrializados y algunos países en desarrollo. En general,
el alto valor agregado que se genera con la moderna Biotecnología,
particularmente a nivel farmacéutico, está determinado por su novedad y
especificidad de uso en consumo humano. (Osorio,1995)

En Colombia el avance de la moderna biotecnología en los últimos diez años ha

comenzado a generar algunos productos, particularmente en el sector agrícola.
Existen cerca de 70 instituciones entre estatales y privadas, que involucran
biotecnología en sus procesos de investigación y/o producción.

En el sector agrícola se ha avanzado en técnicas de cultivo de tejidos vegetales in

vitro, en el estudio y uso sostenible de microorganismos con el fin de buscar
alternativas de control biológico de enfermedades y plagas y se están realizando
algunos trabajos en mejoramiento genético de plantas de papas, pasifloras, entre
otros basados en el ADN recombinante. Se observan trabajos escasos a nivel de
estudios de diversidad genética en especies silvestres del país, los cuales se
desarrollan para identificar nuevos genes útiles en el mejoramiento de variedades
comerciales y para aumentar la eficiencia y calidad de los bancos de
germoplasma existentes en el país.

En el sector pecuario, la aplicación de la biología se limita a la producción de

vacunas y a la búsqueda de razas mejoradas mediante la implantación de
embriones. Actualmente se están realizando trabajos de investigación en la
estandarización de kits de diagnóstico de enfermedades serológicas y
moleculares, vacunas sintéticas y aplicación selectiva de microorganismos
relacionados con la nutrición animal mejorada. A nivel de diversidad genética de
especies nativas los trabajos son discontinuos y aislados.

En el sector de la salud humana se desarrollan proyectos de investigación con

producción de kits serológicos y moleculares para el diagnóstico rápido de
enfermedades tropicales y se estudian los espectros de variabilidad existentes
por ejemplo, enfermedad de Chagas.

En el sector agroindustrial y de la alimentación animal, la Biología es aplicada

para generar productos lácteos, bebidas fermentadas, destilación de
fermentaciones etanólicas para la elaboración de licores, producción de levaduras
por fermentación y producción de materias primas como ácido cítrico y solventes
orgánicos. Este sector utiliza fundamentalmente métodos biotecnológicos
tradicionales.

En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel del
tratamiento de aguas residuales industriales como lodos activados y biofiltros,
métodos de descontaminación de los derramamientos de petróleo mediante el
uso de microorganismos nativos o transformados genéticamente. Algunos
trabajos de investigación científica se están realizando sobre biodigestores de
alta calidad. Sin embargo, el desarrollo nacional en este sector es todavía
discreto.

La diversidad biológica de Colombia es una ventaja comparativa que al ser usada

sosteniblemente puede apoyar el desarrollo del sector productivo. Así mismo
constituye una respuesta a problemas de seguridad alimentaria, sostenibilidad de
aguas, suelos y aire, así como un elemento de negociación política internacional y
fortalecimiento de la soberanía. Por estas razones, su conocimiento, conservación
y uso sostenible es prioritario. Sin embargo, como se observa con el estado de la
biotecnología en Colombia, los avances en estos campos son muy pequeños
comparativamente con otros países de América Latina como Costa Rica, Brasil y
otros del mundo.

Con relación a los bio-recursos, Colombia es un país privilegiado ya que se

encuentra entre uno de los países de mayor diversidad biológica del planeta por
área . Sin embargo, para aprovechar ese potencial, el país debe desarrollar la
capacidad científica y técnica que le permita explorar, conocer, estudiar,
investigar, valorar, conservar y desarrollar esos biorrecursos como un patrimonio
altamente productivo y no simplemente como una diversidad ecológica, social y
económicamente improductiva.

Tendencias de la Biotecnología a nivel mundial

A nivel mundial el interés por la biotecnología es indudable, como se ve a través

del, frecuente abordaje de tales temas en los periódicos, libros y medios de
comunicación.

Algunos descubrimientos útiles serán una consecuencia directa del uso de las
técnicas de ingeniería genética que logren transferir determinados genes (a veces
incluso genes humanos) a un determinado microorganismo apropiado, para hacer
el producto que es precisamente requerido en el mercado. Determinadas
proteínas humanas y algunos enzimas requeridos en Medicina se conseguirán de
esta forma, en el futuro. Otros muchos beneficios, serán el resultado de la
fabricación mediante técnicas de fermentación, de anticuerpos específicos para,
fines analíticos y terapéuticos. Estos anticuerpos monoclonales se producirán
mediante el uso de microorganismos en grandes fermentadores, como por
ejemplo la producción de antibióticos como la penicilina.

Se están desarrollando en la actualidad, importantes descubrimiento y

aplicaciones comerciales en cada uno de los campos de la Biotecnología,
incluyendo las que tienen lugar en las industrias de fermentación, la
biotecnología de los enzimas y células inmovilizadas, el tratamiento de residuos y
la utilización de subproductos. Aquellos procesos que resulten productivos serán
útiles a la sociedad, atractivos para la industria por motivos comerciales y en
algunos casos recibirán el apoyo de los respectivos gobiernos.

Una gran potencialidad de la biotecnología se da en el campo de la investigación

y el desarrollo científico, ya que proporciona herramientas que permiten una
mejor comprensión de los procesos fisiológicos, por ejemplo, del sistema inmuno-
defensivo, o que reducen, en forma considerable, los plazos de la I y D,
facilitando así los procesos de innovación tecnológica. A su vez, con el
advenimiento de nuevas técnicas en el campo biológico, la actividad de la I y D
en este campo tiende a hacerse cada vez más científica y menos empírica,
acentuándose así las características de intensidad científica propias de la
biotecnología.

Resulta claro que siendo la biotecnología un sistema de diversas innovaciones

científico-tecnológicas interrelacionadas, no todas ellas evolucionan al mismo
ritmo. Las condiciones de mercado, las expectativas de beneficios, aspectos
organizativos y de gestión, entre otros, favorecen la rápida puesta en marcha y
difusión de algunas de estas tecnologías, relegando a otras. La literatura sobre la
innovación tecnológica acostumbra distinguir entre aquellas innovaciones que
surgen como respuesta a una situación de mercado, y a expectativas de
beneficios económicos, de aquéllas que se originan en el área de I y D como
resultado de un proceso continuo y acumulativo de desarrollo científico-
tecnológico. En el primer caso se habla de "demand or market-pull" y en el
segundo, de "technological-push". Ha sido frecuente, en los últimos tiempos,
señalar el láser y la biotecnología como ejemplos del segundo tipo de innovación.
Es decir, descubrimientos científicos a los que se arriba sin una aplicación
específica predeterminada en mente, pero que luego encuentran una gama
considerable de aplicaciones prácticas.

Sin embargo, pareciera más correcto considerar ambos actores, el inherente

proceso científico-tecnológico y aquél que corresponde a incentivos eonómicos,
como complementarios. Así, en el caso de la biotecnología, aun cuando ésta nace
e el ámbito de la I y D, de las muchas aplicaciones posibles, las que se
desarrollan primero son aquellas que ofrecen expectativas de importantes
beneficios económicos en un plazo más ó menos breve.

En la agricultura, la biotecnología se orienta a la superación de los factores

limitantes de la reducción agrícola a través de la obtención de variedades de
plantas tolerantes a condiciones ambientales negativas (sequías, suelos ácidos),
resistentes a enfermedades y pestes, que permitan aumentar el proceso
fotosintético, la fijación de nitrógeno o la captación de elementos nutritivos.
También se apunta al logro de plantas más productivas y/ o más nutritivas,
mediante la mejora de su contenido proteínico o aminoácido.

Un desarrollo paralelo es la producción de pesticidas (insecticidas, herbicidas y

fungicidas) microbianos. Las técnicas que ya se emplean, o que están
desarrollándose, van desde los cultivos de tejidos, la fusión protoplasmática, el
cultivo in vitro de "meristemas", la producción de nódulos de "rhizobium" y
"micorizas", hasta la ingeniería genética para la obtención de plantas de mayor
capacidad fotosintética, que puedan fijar directamente nitrógeno, resistentes a
plagas y pestes, etc. El cultivo de tejidos consiste en la regeneración de plantas
completas a partir de una masa amorfa, de células, que se denomina "callo".
En su forma más general, se aplica a todo tipo de cultivo "in vitro", desde simples
unidades indiferenciadas hasta complejos multicelulares y órganos. El proceso
consiste en la incubación, en condiciones controladas y asépticas, de una célula o
parte de un tejido vegetal (hoja, tallo, raíz, embrión, semilla, "meristema", polen,
etc.) en un medio que contiene elementos nutritivos, vitaminas y factores de
crecimiento (Osorio, 2005)

La magnitud del mercado potencial agrícola para la biotecnología es, en gran

medida materia de especulación debido precisamente a la falta de un
conocimiento detallado de muchas de estas condiciones locales. En este campo,
la biotecnología está orientada a la utilización en gran escala de "biomasa" para
la producción de materias primas orgánicas, que actualmente se obtienen
mediante procesos químicos convencionales. Las ventajas son que la "biomasa"
es un recurso altamente subutilizado y relativamente barato., ya que en gran
parte esta constituidos por residuos y desechos de plantaciones forestales y de
cultivos en gran escala. Es además un recurso renovable. Las principales fuentes
potencialmente disponibles para la producción tanto de etanol como de otros
productos químicos a granel son (aparte de las melazas de la caña) cultivos como
la yuca, el sorgo, las papas y el maíz; los sueros de la industria de la leche; los
residuos de las plantaciones de café y, en general, todo tipo de residuo celuloso.

Actualmente la biotecnología está siendo aplicada en gran escala en la producción

de alcohol (etanol), como combustible sustituto del petróleo, fundamentalmente
en el Brasil y en menor medida en Estados Unidos y la India. En el Brasil, la
producción se logra a partir de melazas de la caña de azúcar, mientras que en
Estados Unidos se usa el maíz. Otro producto importante es el ácido cítrico. Los
principales productores son los Estados Unidos, Italia, Bélgica y Francia que
utilizan como materia prima melazas de remolacha. La importancia que tiene
cada una de las aplicaciones mencionadas es incuestionable desde el punto de
vista económico.

A pesar que en el siglo XX, cuando la Genética había resuelto el misterio de la

naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que había para actuar
sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y animales de la misma
especie (o de especies similares), selección de los individuos con rasgos
deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con agentes
físicos (rayos UV, rayos X) o químicos, con ulterior búsqueda (selección o rastreo
-screening) de alguna variante de interés (algo tedioso y frecuentemente
infructuoso), etc.

Debimos esperar a la década de los 70 para que surja un conjunto de técnicas de

laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo
racional el sancta sanctorum de la vida. Son técnicas y herramientas con las que
se puede modificar el ADN de acuerdo a diseños previos y objetivos concretos
(de ahí el nombre popular de Ingeniería Genética).

La Ingeniería Genética (I.G.), mejor llamada tecnología del ADN recombinante in

vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos
de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en
la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una
variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho.

Teniendo en cuenta lo anterior se puede inferir que las tendencias científicas

mundiales a todos los niveles y clasificación de la Biotecnología, se han
concentrado en seis aspectos:

- Cultivos de tejidos y células para: la rápida micropropagación "in vitro" de

plantas, la obtención de cultivos sanos, el mejoramiento genético por
cruza amplia, la preservación e intercambio de "germoplasma", la
"biosíntesis" de "metabolitos" secundarios de interés económico y la
investigación básica.

- Metabolomica La manipulación del metabolismo para inhibir unas rutas

biosinteticas o favorecer otras sin afectar la economía celular con el
propósito de obtener una mayor producción del producto de interés.

- El uso de enzimas o fermentación microbiana, para la conservación de

materia primas definidas como sustratos en determinados productos, la
recuperación de estos productos, su separación de los caldos de
fermentación y su purificación final.

- Tecnología del "hibridoma", que se refiere a la producción, a partir de

"clones", de anticuerpos de acción muy específica que reciben el nombre
de anticuerpos "monoclonales".

- Ingeniería de proteínas ó Proteomica, que implica la modificación de la

estructura de las proteínas para mejorar su funcionamiento o para la
producción de proteínas totalmente nuevas.

- Ingeniería genética o tecnología del "ADN", que consiste en la introducción

de un "ADN" híbrido, que contiene los genes de interés para determinados
propósitos, para capacitar a ciertos organismos en la elaboración de
 productos específicos, ya sean estos enzimas, hormonas o cualquier otro
tipo de proteína u organismo.

- Bioinformática, que se refiere a la técnica basada en la utilización de

proteínas en aparatos electrónicos, particularmente sensores biológicos y
"bioships"; es decir, "microchips" biológicos, capaces de lógica y memoria.

A todo esto tenemos que añadir que un factor importantísimo en el desarrollo de

la biotecnología es la evaluación de la seguridad del producto, sometida a
controles rigurosos según normativas nacionales e internacionales. De hecho este
factor es tan importante que se puede convertir en limitante, de modo que las
regulaciones estrictas desincentivan ciertos desarrollos biotecnológicos. Por todo
ello, es importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan más de lo
que la evidencia científica sugiere, manteniendo en todo momento la
preservación de la salud y el medio ambiente. A su vez, las regulaciones reflejan
la percepción pública de los riesgos y promesas de la biotecnología. Por ejemplo,
hoy en Europa la percepción pública ha logrado prácticamente una parada en las
plantas transgénicas, a pesar de los informes científicos que dicen que en la
mayor parte de los casos, sus riesgos son similares a las plantas convencionales.
La creación o elaboración de este tipo de alimentos depende del nivel de
desarrollo del país, de los intereses políticos del mismo y del grado de presión
que ejerzan las grandes industrias privadas del sector. Hay un gran debate en
torno a la conveniencia o no de este tipo de organismos.

Habrá que llegar a un diálogo racional entre los diversos actores (científicos,
empresas, consumidores, ecologistas, entre otros) para asegurar el correcto
empleo de estas tecnologías, que por un lado no impida aplicaciones benéficas
sin riesgos, y por otro regule adecuadamente aquellos ámbitos donde las dudas
razonables hagan recomendables más restricciones. El ideal sería permitir todo
aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de
prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en
buena parte imaginaciones y tergiversasiones de grupos de presión que pueden
esconder agendas políticas ocultas.
CAPITULO 2 BIOTECNOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES

Lección 1: Nutrición microbiana.

Las células contienen grandes cantidades de pequeñas moléculas así como de
macromoléculas. La célula puede obtener la mayoría de las pequeñas moléculas
que necesita del exterior o sintetizarlas a partir de moléculas más simples. Las
macromoléculas, por el contrario, son siempre sintetizadas en la célula.

Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son utilizadas con
fines energéticos o plásticos se denominan como nutrientes, en cualquier caso,
los nutrientes deben suministrase en los diferentes medios de cultivo.

Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes, los que
son requeridos en grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3) factores de
crecimiento que lo son solamente en pequeñas cantidades. Empezaremos por los
macronutrientes mayoritarios: carbono y nitrógeno.

1.1 Macronutrientes:
Prácticamente la totalidad de la masa celular está formada por sustancias con
cuatro tipos de átomos: Carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. Estos cuatro
elementos constituyen el esqueleto de las macromoléculas así como las
moléculas orgánicas pequeñas.

La mayoría de los procariotas requieren un compuesto orgánico de algún tipo

como fuente de carbono. Estudios nutricionales han demostrado que muchas
bacterias pueden asimilar varios compuestos de carbono orgánico y utilizarlos
para fabricar material celular. Un incontable número de compuestos tales como
animoácidos, ácidos grasos, y compuestos aromáticos pueden ser usados por una
bacteria u otra. En peso seco, una célula típica consta de aproximadamente 50%
de carbono y a su vez este es el elemento mayoritario de las macromoléculas.

Después del carbono, el siguiente elemento más abundante en la célula es el

nitrógeno. Una bacteria típica contiene aproximadamente el 12% de nitrógeno
(peso seco) y a su vez el nitrógeno es un componente mayoritario de proteínas,
ácidos nucleicos y otros constituyentes celulares. El nitrógeno se encuentra en la
naturaleza tanto en forma orgánica como inorgánica. Sin embargo, la globalidad
del nitrógeno utilizable está en forma inorgánica, bien como amoníaco (NH3),
nitrato (NH3-)
ó N2. La mayoría de las bacterias pueden utilizar amoníaco y muchas además
nitrato. El nitrógeno molecular (gas), sin embargo, puede ser fuente de nitrógeno
para un reducido grupo de bacterias (bacterias fijadoras de nitrógeno).

1.2 Otros macronutrientes: P,S,K,Mg,Ca,Na,Fe

El fósforo acontece en la naturaleza en forma de fosfatos orgánicos o
inorgánicos y es requerido por la célula para la síntesis de ácidos nucleicos y
fosfolípidos. El azufre es fundamental por ser un elemento estructural en los
aminoácidos cisteina y metionina y porque está presente en vitaminas tales como
la tiamina, biotina, ácido lipoico así como coenzima A. El potasio es necesario en
todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas, incluyendo varias
implicadas en la síntesis de proteínas, lo requiere específicamente. El magnesio
estabiliza los ribosomas, las membranas celulares, los ácidos nucleicos y se
requiere también para la actividad de muchas enzimas. El calcio (que no es
nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos), ayuda a
estabilizar la pared celular bacteriana y juega un papel fundamental en la
termorresistencia de la endospora bacteriana. El sodio es requerido por algunos,
pero no todos, microorganismos y cuando lo es, es debido a la naturaleza
química de su hábitat. El hierro es requerido por las células en mayores
cantidades que otros metales traza y por ellos debe ser considerado como un
macronutriente. El hierro juega un papel fundamental en la respiración celular,
siendo un componente clave de los citocromos, y de las proteínas que contiene
hierro y azufre implicadas en el transporte de electrones. Debido a que la mayor
parte de las sales inorgánicas son altamente insolubles, muchos microorganismos
producen agentes que unen el hierro de una manera muy específica,
denominados sideróforos, que solubilizan las sales de hierro trasportándolo al
interior celular.
1.3 Micronutrientes (elementos traza)
Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeñas cantidades son, sin
embargo, tan importantes como los macronutrientes para la función celular. Los
micronutrientes son metales, muchos de los cuales forman parte de enzimas que
son los catalizadores celulares. Entre los micronutrientes más importantes de
sistemas vivos, que son necesarios para el funcionamiento de enzimas están:
Cromo, Cobalto, Cobre, Manganeso, Molibdeno, Níquel, Selenio, Tungsteno,
Vanadio, Zinc, Hierro.

1.4 Factores de crecimiento

Estos son compuestos orgánicos que, como los micronutrientes, son requeridos
en muy pequeñas cantidades y sólo por algunas células. Los factores de
crecimiento incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Aunque la
mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos,
otros microorganismos requieren tomar uno o más compuestos preformados del
medio ambiente.
1.5. Medios de cultivo
En microbiología industrial se usan dos grandes grupos de medios de cultivo: Los
químicamente definidos y los indefinidos (complejos). Los medios
químicamente definidos se preparan añadiendo al agua destilada cantidades
precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados. Por ellos
se conoce la composición química exacta .En muchos casos, sin embargo, el
conocimiento exacto de la composición química no es crítico. En estas ocasiones
los medios complejos pueden ser suficientes, e incluso presentar ventajas sobre
los definidos. Los medios complejos emplean lisados de caseína (proteína de la
leche), de carne, de soja, de levadura o cualquier otra sustancia altamente
nutritiva (químicamente indefinida): Tales lisados están disponibles
comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados rápidamente y disueltos
en agua destilada para dar lugar a un medio. Sin embargo, cuando se utilizan
medio complejos hay que tener en cuenta que no se conoce la composición de
nutrientes.
El metabolismo es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el
interior de la célula y que da lugar a la síntesis de material celular a partir de
sustancias nutritivas.

El metabolismo puede dividirse, para su mejor estudio, en tres aspectos

diferentes pero íntimamente ligados (figura 1) : el catabolismo (Metabolismos
energético) que es la suma de reacciones exergónicas que permiten liberar la
energía contenida en los nutrientes o estratos y ser acumulada en forma de ATP
u otros compuestos, el anfibolismo o metabolismo intermediario, que es el
conjunto de reacciones en que los productos de hidrólisis del catabolismo y
algunos nutrientes son transformados en ácidos orgánicos , ésteres fosfóricos y
otros compuestos como aminoácidos; el anabolismo o metabolismo biosintético
que es la parte del metabolismo implicado en la síntesis de macromoléculas-
ácidos nucleicos, proteínas sustancias de reserva y otros.

Figura 1: Diferentes fases del metabolismo microbiano:

1.2 Metabolismo energético

Es tradicional agrupar a los microorganismos en clases metabólicas dependiendo

de la fuente de energía que utilicen. Todos los términos utilizados para describir
estas clases emplean la terminación trofo que deriva del griego y significa
“alimentarse”. Así, lo organismos que utiliza luz como fuente de energía se
llaman fototrofos (foto es luz en griego) y los organismos que utilizan productos
químicos como fuente de energía se denominan quimiotrófos. La mayor parte de
los organismos que estudia la microbiología utilizan compuestos orgánicos como
fuente de energía; pertenecen por tanto a los quimiotrófos y se denominan
quimiorganotrofos. Los organismos capaces de utilizar compuestos inorgánicos
como fuente de energía se denominan quimiolitotrofos

Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de reacciones de
oxidación – reducción que implican compuestos orgánicos, pueden contemplarse
en dos grandes grupos: (1) Fermentación, en que los procesos de oxido –
reducción ocurren en ausencia de aceptores terminales de electrones añadidos; y
(2) respiración, en que el oxígeno molecular u otros oxidantes sirven como
aceptores terminales de electrones.

1.2.1 Naturaleza de la fermentación:

La fermentación es el mecanismo más simple y quizás el más antiguo desde el

punto de vista evolutivo, de los procesos de obtención de energía. Se suponen
que en las condiciones del mundo primitivo, donde no existía oxígeno libre, ni los
rayos del sol llegaban a su superficie, los primero organismos solo podían
obtener la energía a partir de la contenida en los compuestos orgánicos.

Se puede definir entonces, la fermentación como el proceso metabólico de

generación de ATP, en el cual los donantes y los aceptores de electrones son
moléculas orgánicas. (Martinez, J; 1995) Los compuestos que llevan acabo estas
dos funciones son usualmente dos metabolitos diferentes derivados de un
sustrato fermentable simple (como azúcar, por ejemplo). En la fermentación el
sustrato da lugar a una serie de compuestos, unos más oxidados y otros más
reducidos; en el proceso fermentativo mantiene un estricto balance O-R. El nivel
de oxidación promedio de los productos finales es muy cercano al del sustrato.
De ahí que la generación de ATP asociada a la fermentación se denomina
fosforilación a nivel de sustrato. la fermentación posee tres características:
1. En la fermentación, tanto donantes como aceptores de electrones son
moléculas orgánicas; en ocasiones es la misma molécula la que se oxida y
se reduce.
2. El proceso ocurre en ausencia de oxigeno
3. Existe un riguroso balance de C, O e H entre los sustratos y los productos

Un ejemplo de fermentación es el catabolismo de la glucosa por una bacteria del

ácido láctico:

Glucosa
2 lactatos +2 H+

( CcH12O6 2C3H4O3- + 2CO2)

Nótese que ésta es una reacción balanceada y que los productos, lactato más
protones, tienen la misma proporción de átomos de hidrógeno y oxígeno que la
glucosa. Esta reacción puede analizarse desde tres puntos de vista:
Termodinámicamente, por la energía de enlace y por el metabolismo
intermediario.

Desde el punto de vista termodinámico, las fermentaciones se caracterizan por

ser una suma de reacciones, al final de las cuales los productos poseen un
contenido energético menor que el inicial.

Si analizamos la fermentación a través de la energía de enlace, tendremos que

en ella se producen reordenamientos moleculares en los que se pasa de
funciones de mayor contenido a funciones de menor contenido energético. Así, en
la mayoría de las fermentaciones se pasa de grupos carbonilo e hidroxilo a
grupos carboxilo de menor contenido energético.

Existen tres rutas básicas empleadas por los microorganismo para el

aprovechamiento energético de los sustratos.

1. La vía fructosa – difosfato (FDP) también conocida como glicólisis o vía de

Embden-Meyerhof
2. la vía de las pentosas – fosfato (PP) o de Warburg-Dickens Horecker
3. La vía de Entner-Doudorff p KDPG

Cada una de estas vías tiene funciones y unidades específicas para los
microorganismos. Las dos primeras vías son comunes tanto a organismos
respiratorios como fermentativos, procariontes o eucariontes. La tercera se halla
restringida a procariontes. Al existir diferentes vías de fermentación se obtienen
también diferentes productos: Algunos productos derivados de la fermentación se
observan en la siguiente tabla
Tabla 1. Productos derivados de la fermentación

Tipo de fermentación Producto(s)

Fermentación láctica Lactato

Fermentación alcohólica etanol, CO2

Fermentación ácida-mixta etanol, succinato, acetato, formiato,

lactato, CO2, H2

Fermentación butilénglicólica butilénglicol, CO2

Fermentación aceto-butírica acetato, acetona, butirato, butanol,

etanol, CO2, H2

Fuente : J. Martines. Microbiología, La Habana – Cuba 1989

1.2.3 Naturaleza de la respiración

La respiración es un mecanismo metabólico de generación de ATP en el que, a

diferencia de la fermentación, sirven como donantes de electrones tanto
compuestos orgánicos como inorgánicos (oxidándose). Generalmente el aceptor
electrónico final es el oxigeno molecular. A diferencia de la fermentación, los
electrones son transferidos a través de una cadena transportadora de
electrones al final de la cual existe un aceptor exógeno oxidado (A), que se
reduce. Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiración aerobia; Si el
aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia.

En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor

potencial redox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Como
veremos enseguida, esta energía libre se va a traducir en un potencial
electroquímico de protones, cuya disipación a través de ATP-asas de membrana
origina ATP, conociéndose este proceso como fosforilación oxidativa

1.2.4 Aspectos generales de los procesos biosintéticos

Diversas reacciones catabólicas producen unidades para la biosíntesis, pero otras

pueden ser tomadas desde exterior y un tercer grupo de unidades, al igual que
las coenzimas, son el resultado de las vías biosintéticas que han sido
denominadas reacciones metabólicas. Finalmente, en la síntesis de
macromoléculas los productos mayoritarios son proteínas y ácidos nucleicos.
También son importantes, e incluso pueden ser mayoritarios otros tipos de
moléculas de gran tamaño, entre los que se encuentran los polisacáridos y lípidos
complejos. El tipo de estructura de estos dos últimos variar mucho de un
organismo a otro, y tiene especial interés en las bacterias.

La mayor parte de peso seco de la bacteria está constituidos por macromoléculas

de cuatro tipos: ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos y lípidos complejos.
Estas macromoléculas son polímeros formados por unidades estructurales debajo
peso molecular que tiene que formarse como precursores. Ya sabemos que las
subunidades estructurales de los ácidos nucleicos son 8 tipos distinto de
nucleótidos, las de las proteínas 20 aminoácidos diferentes, las de los
polisacáridos, unos 15 azucares diferentes, y que para la formación de los lípidos
se requieren ácidos grasos, polialcoholes, azúcares, aminas y aminoácios que
constituyen también unos 20 tipos diferentes de moléculas orgánicas. Además se
requieren sintetizar unas 20 coenzimas y transportadores de electrones.

Un tipo más interesante y bastante más complejo de proceso microbiano

industrial es aquel en el que el producto deseado no es producido durante la
primera fase de crecimiento, sino poco después que se inicie la fase estacionaria.
Metabolitos producidos durante la fase estacionaria son llamados metabolitos
secundarios y son algunos de los más comunes e importantes metabolitos de
interés industrial. Los mejor conocidos y el más extensamente estudiados
metabolitos secundarios son los antibióticos.

Se han reconocido las siguientes características de los metabolitos secundarios:

1) Cada metabolito secundario se forma únicamente a partir de relativamente
pocos organismos.
2) La formación de metabolitos secundarios es sumamente dependiente de las
condiciones de crecimiento, en particular de la composición del medio. Es
frecuente la represión de la formación de metabolitos secundarios.
3) Los metabolitos secundarios no son indispensables para el crecimiento y la
reproducción.
4) Los metabolitos secundarios se suelen producir como un grupo de sustancias
estrechamente relacionadas. Por ej. una sola cepa de Streptomyces ha llegado ha
producir 32 antibióticos de antraciclina diferentes, pero relacionados.

2.1 Crecimiento Bacteriano

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento

ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un
aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación
celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un
aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen
por fisión o por gemación, lo que ocurre es un aumento de la población. En los
microorganismos cenocíticos (en los que la duplicación del genoma no se
acompaña de división celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamaño
de la “colonia” cenocítica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde
dos puntos de vista: a escala individual y a escala poblacional. Para efectos
prácticos, esta sección nos centraremos al estudio del crecimiento poblacional. El
cual en cultivo cerrado atraviesa por las siguientes fases:
4.1. Fases del crecimiento en un sistema cerrado en medio líquido
En sistema de producción cerrado, en el cual la adición de sustancias y
microorganismos solo se realizan al inicio d ela fermentación se pueden
identificar 6 fases de crecimiento. (Figura 2)

Figura 2 : Curva de crecimiento microbiano

Como se puede constatar en el anterior gráfico, el crecimiento en un sistema

cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:
1) Fase de latencia: Es el período de tiempo durante el que el inóculo se adapta
a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un
período de ajuste metabólico. Su duración depende de varios factores:
- Tamaño del inóculo
- Estado fisiológico del inóculo: Si las células están dañadas por algún agente, la
fase de latencia también es larga, ya que necesitan un tiempo para la reparación
de los daños.

Si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase exponencial, la

fase de latencia es más corta.
- Medio de cultivo del que procede el inóculo:
Si el medio es similar al medio fresco, la fase de latencia es más corta;
Si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más pobre, la fase
de latencia se hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional
para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el
medio rico.

2) Fase de transición, de crecimiento acelerado, que conduce a la siguiente

fase

3) Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase se produce un

crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones
(normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es característico para
cada especie o cepa, en cada medio concreto:

El valor del tiempo de generación (g) depende de: composición del medio,
temperatura, pH, osmolaridad (tonicidad), entre otros.

Los microorganismos heterótrofos suelen crecer más rápidamente en los medios

complejos, ricos, que en los medios sintéticos, y dentro de estos últimos, mejor
con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos microorganismos tienen,
a su temperatura óptima tiempos de generación muy cortos (15, 20 min),
mientras que otros tienen crecen más lentamente, con tiempos de generación
que pueden ser de varias horas o incluso días.

4) Fase de aceleración negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce

a…
5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de
crecimiento se hace nulo ( = 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es
que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares.

En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de

desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el
crecimiento celular.

Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transición (de aceleración

negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes
alternativas (p. ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez
agotados los hidratos de carbono).

6) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del

cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energía. Algunas veces las células
aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas “fantasmas”, “ghost”). La
pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en
bacterias entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada).

2.2: Modelos Matemáticos del crecimiento microbiano

Para muchos propósitos en biotecnología microbiana es necesario conocer el

número de generaciones, la población de bacterias con el fin de estimar el estado
fisiológico de la población microbiana y establecer relaciones con los sustratos del
medio de cultivo o los productos de biosíntesis.

En los organismos unicelulares la célula se divide por fisión binaria dando lugar a
dos células hijas, cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos
células nuevas, por lo que en cada periodo e división la población se duplica. Esta
multiplicación representa una progresión geométrica en la cual hay una relación
directa entre el número de células iniciales y la cantidad de células en otro
tiempo determinado. La expresión matempática que representa esta relación es:

N = No2n Donde:
N= numero final de células,
No = número inicial de células
n = número de generaciones

Para explicar la anterior ecuación en términos de n se aplica una transformación

logarítmica cuyo resultado es:

El tiempo de generación (G) de la población es:

donde,

t = horas o minutos de crecimiento exponencial

Una expresión alternativa del crecimiento se deriva de asumir que la velocidad de

incremento en la masa celular o densidad celular (dx/dt) en un tiempo (t) es
proporcional a la densidad celular en dicho tiempo. Por consiguiente:

de donde:

x = número de células o algún componente (proteína)

Integrando se obtiene:

ln X1 –= ln Xo + µt

Tomando el antilogaritmo a cada lado se obtiene

µt
X1 = Xoe
Considerando que después de un tiempo la población se duplica (td) entonces:
X1 = 2Xo por tanto, la duplicación de la población celular se puede expresar así:

X1/Xo = 2 reordenando los valores en la penúltima ecuación se obtiene:

2 = et aplicando antilogaritmo a cada lado se obtiene:

entonces:

µ = 0.693/td

Ejemplo explicativo:

A continuación se muestran los datos de un experimento de crecimiento

bacteriano de E. colli el cual se realizo durante 5 horas. El número de células fue
cuantificado por unidades formadoras de colonia por cajas petri. Con los datos
de la tabla calcular el número de generaciones, el tiempo generacional y la
velocidad especifica de crecimiento (µ)

Tiempo(hr) N
Número de
células /ml
0 2x107
1 3x107
2 4 x107
3 6 x107
4 8 x107
5 1 x108

Debido a que el crecimiento bacteriano es una progresión geométrica, existe una

relación directa entre el número de células presente en el momento inicial y el
habido en un momento determinado del crecimiento exponencial de modo que:

N= N2n
Donde N = numero final de células, No= numero inicial de células y n = numero
de generaciones, por tanto despejando la ecuaciones anteriores tenemos que

n= ( logN-logNo) / log 2

n =( log N – log No ) / 0,301; remplazando tenemos

n= log 108 – log (2 x 107 ) / 0.301, resolviendo :

n=(8 – 7,301) /0,301

n = 2,32

G = t/n
G= 5hr/2.32 generaciones

G= 2.15 horas

µ = ln 2 /td

µ= 0.6931/ 2.15
µ = 0.3223

Una aplicación especialmente importante de la constante de velocidad

instantánea, es el Quimiostato, el cual es un dispositivo de cultivo continuo
donde el Volumen es constante y el nutriente entra con la misma velocidad con la
que sale. En este equipo el tamaño de la población y la velocidad de crecimiento
pueden mantenerse constantes, puesto que la velocidad de crecimiento es una
función de la concentración de nutrientes. Monod propueso la siguiente ecuación
para representar esta relación:

Donde µmáx. es la velocidad de crecimiento a saturación de nutriente, S es la

concentración de nutriente, y K es una constante de saturación que es

numéricamente igual a la concentración de nutriente a la que µ= ½ de µmax La
ecuación anterior es formalmente equivalente a la ecuación de Michaelis- Mente
usada en el análisis de la cinética enzimática. La determinación de los parámetros

desconocidos µmax y Ks se puede hacer representando 1/sobre el eje y frente a

1/S sobre el eje X. Se obtendrá una línea recta que corta al eje Y, y el valor en el

punto de intervenciones 1/µmax .La pendiente de la recta es Ks/máx y como se

conoce µmáx se puede calcular Ks. En general los valores de Ks son muy bajos

LECCIÓN 3: SISTEMAS DE FERMENTACIÓN

3.1 Tipos de fermentación

1) Fermentación discontinua: Una fermentación discontinua (en «batch»)
puede ser considerada como un sistema cerrado. A tiempo cero t = 0, la solución
esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se permite que se
lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de
toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un
agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del
medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metaboli-
tos cambia generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de
las células. Después de la inoculación de una solución nutritiva estéril con
microorganismos y su cultivo en condiciones fisiológicas se observan cuatro fases
típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase
de muerte
2) Proceso de fermentación alimentada (fed-batch)

En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos

los substratos se añaden al principio de la fermentación. Una mejora del proceso
cerrado discontinuo es la fermentación alimentada, que se utiliza en la
producción de substancias como la penicilina. En los procesos alimentados los
substratos se añaden escalonadamente a medida que progresa la fermentación.
La formación de muchos metabolitos secundarios está sometida a represión
catabólica por altas concentraciones de glucosa, por otros carbohidratos, o por
compuestos nitrogenados. Por esta razón en el método alimentado los elementos
críticos de la solución de nutrientes se añaden en pequeñas concentraciones al
principio de la fermentación y continúan añadiéndose a pequeñas dosis durante
la fase de producción.

Puesto que generalmente no es posible medir la concentración del substrato

directa y continuamente durante la fermentación a fin de controlar el proceso de
alimentación, tienen que ser medidos parámetros indirectos que estén
correlacionados con el metabolismo del substrato crítico. Por ejemplo, en la
producción de ácidos orgánicos, el valor del pH puede ser utilizado para
determinar la velocidad de alimentación de la glucosa. En fermentaciones con
valores osmóticos críticos la alimentación puede ser regulada controlando el valor
de pO2 o el contenido en CO2, en los gases que se liberan.

3) Fermentación continua.
En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva
estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de
solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca
simultáneamente del sistema. Entre las distintas clases de fermentaciones
continuas pueden ser distinguidos dos tipos básicos:

a. Biorreactor mezclado homogéneamente. Este es utilizado como un

quimiostato o como un turbidostato. En el quimiostato en estado de
equilibrio, el crecimiento de las células se controla ajustando la
concentración de un substrato (Fig. 3.A). cualquier substrato que se
requiera (carbohidrato, compuesto nitrogenado, sales, a,) puede ser
utilizado como substrato limitante. En el turbidostato el crecimiento de las
células se mantiene constante utilizando la turbidez para controlar la
concentración de biomasa y la velocidad de alimentación de la solución de
nutrientes se ajusta de forma apropiada (Fig. 3).

Figura 3 Fermentación continua en quimiostato A), Turbidostato B) y

Fermentador de flujo de tapón
Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial

b. Reactor de flujo de tapón. En este tipo de fermentación continua la solución

de cultivo fluye a través de un reactor tubular sin mezclado. La composición de la
solución de nutrientes, el número de células, la transferencia de masa
(suministro de O2) y la productividad varían en distintas posiciones dentro del
sistema (Fig. 3C). A la entrada del reactor las células deben añadirse
continuamente junto con la solución de nutrientes (generalmente como un flujo
que revierte de una desviación desde la salida del fermentador o desde una
segunda fermentación continua).

En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la pérdida de células debida

al fluido que sale debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo
La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumétrico (que
entra y sale) a través del volumen del fermentador.
Utilizando la ecuación de Monod que describe la dependencia de la velocidad
específica de crecimiento sobre la concentración de substrato limitante pueden
ser determinados en el biorreactor la constante de rendimiento
biomasa/substrato (Y X/S), la densidad de las células (X) y la concentración de
substrato (S).

A velocidad más baja de flujo el substrato es casi completamente agotado por las
células (S  O). La concentración de células es entonces X = So/Y. Si D aumenta,
X desciende lentamente, al principio en forma lineal y luego a D = µm cae
bruscamente hasta O. S aumenta lentamente al principio y se aproxima a So a D
= µm. Cuando X es cero en la ecuación que explica el sustrato (S), se alcanza el
punto de lavado Dm.
Por encima de Dm no es posible un estado de equilibrio. Si la velocidad de flujo es
sólo ligeramente más baja que D" el sistema es muy sensible a las influencias
externas. Pequeñas desviaciones en la alimentación pueden originar cambios
extremos en la biomasa o en la separación de las células. La Figura 4 muestra la
interdependencia de la velocidad de flujo, la concentración de substrato, la
concentración de células y la velocidad de formación de células (µm = 1 h-1 Ks =
0,2 g/l Y = 0,5).

Figura 4. Efecto de la velocidad de flujo sobre la concentración de substrato (5),

la concentración de células (X). Tiempo de duplicación (1,) y velocidad de
fermentación de células (D * X)

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial

La velocidad específica máxima de crecimiento en los procesos industriales se

escoge de forma que se obtenga el rendimiento más alto en el volumen más
pequeño de fermentador y en el tiempo más corto.

El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentación continua a

velocidades muy bajas o muy altas de dilución. A velocidades medias de dilución
la relación molar entre la biomasa producida y el CO2 que se desprende es
constante. A bajas velocidades de dilución la proporción de CO2 se hace más
grande. Esto se debe a que se utiliza más fuente de energía para el
mantenimiento de la estructura celular, para la regulación osmótica o para la
motilidad. Por otra parte, a velocidades altas de flujo una parte del carbono
añadido es oxidado incompletamente (a productos como piruvato, acetato o
ácidos tricarboxílicos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas
velocidades de flujo, con nitrógeno como substrato limitan te, se forman
materiales de reserva, como polisacáridos, lo que resulta en un aumento en el
tamaño de la célula y por tanto de la biomasa.

3.2 Productividad y velocidad específica de producción

La productividad de una fermentación se define como

Productividad P = Concentración de producto / I = unidades
Tiempo de fermentación hxL
Para evaluar la economía de un proceso deben ser considerados varios factores,
el tiempo de producción de la fermentación, el tiempo requerido para limpiar y
poner a punto el fermentador, el tiempo de esterilización y la duración de la fase
de latencia. En la Figura 5 la pendiente de la tangente de la curva de formación
del producto es una medida de la productividad máxima y la pendiente de la línea
recta, al final de la curva de formación de producto, indica la productividad total.

Que el proceso de fermentación termine al tiempo de la productividad máxima o

más tarde depende de los costes de operación, que incluyen la energía, gastos
generales, costes de mano de obra, gastos en personal y la capacidad del
sistema. Utilizando una gráfica como la de la Figura 5 se puede hacer una
estimación de como optimizar el proceso. En fermentaciones a tiempo corto (8-
70 h) el tiempo para la puesta a punto es significativo, mientras que en
fermentaciones largas (>3 días) el tiempo de puesta a punto es menos crucial.

Las condiciones de fermentación afectan directamente la productividad. La Figura

6 muestra la productividad de un proceso para la obtención de proteína de origen
unicelular en relación al contenido del substrato (hidrocarburo). Existe un
aumento lineal de [a productividad a medida que el contenido del substrato
aumenta, hasta que se alcanza la concentración a la que el hidrocarburo se
convierte en la fase continua (aceite y agua no son miscibles). Por encima de
esta concentración la productividad decrece.

Figura 5. Productividad total y productividad máxima

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial

En fermentaciones continuas la productividad puede ser expresada como:

P = D * X (g/l *h)
Cuando se utiliza la relación de la ecuación sobre sustrato (S) resulta la siguiente
ecuación:
P=D*Yx/y (S0 – D*Ks/µm-D)
Figura 6. Productividad en relación a la concentración de ácidos grasos en un
proceso de producción de proteína de origen unicelular.

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial

En fermentaciones continuas la productividad máxima es igual a la productividad

total ya que el tiempo de establecimiento y la fase de latencia pueden ser
despreciados. Por ejemplo, si el tiempo inicial de puesta a punto requiere 24 h Y
la propia fermentación continua funciona durante 24 horas con una velocidad de
flujo de O,1 h-l, 24 h con 0,15 h-l Y al menos 72 h con 0,2 h-l, la productividad
total para el producto X se calcula como se muestra en la Tabla 2.
La velocidad específica de producción qp deriva de la ecuación 1 de la siguiente
forma:

El valor P1 es la concentración de producto y la velocidad específica de producción

qp es equivalente a la velocidad específica de crecimiento µ en la ecuación 1. Sin
embargo, en los procesos de tipos II y IlI no hay correlación directa entre µ y qp

3.3 Coeficientes de rendimiento

Monod definió originalmente el coeficiente de rendimiento Y como la relación de

células producidas a substrato consumido:
Hoy los coeficientes generales de rendimiento se utilizan para caracterizar los
procesos de fermentación, es decir las relaciones de las células producidas a los
substratos individuales convertidos o a la energía liberada o energía consumida.
Sin embargo, los coeficientes de rendimiento no son constantes, ya que
dependen de parámetros biológicos (X, µ) y de parámetros químicos (pO2
relación C/N, y contenido en fósforo del medio.

Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos. El primer

grupo de coeficientes (Ys Y02 Ykcal) da información acerca de los procesos técnicos
y por tanto acerca de la economía. El segundo grupo (Yc Yp YN Yave) describe el
catabolismo, anfibolismo y anabolismo.

El tercer grupo incluye YATP un coeficiente que describe las relaciones de energía
de las células (Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores utilizan otros
coeficientes de rendimiento que deben ser propiamente designados, como
muestra;

3.4 PRINCIPIOS DE BIOINGENIERÍA

Como ya se dijo, el equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o

fermentados. El mismo provee todos los servicios que son necesarios para el
cultivo, tales como mezclado, termostatización, suministro de oxígeno, entradas
para adición de nutrientes, control del pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de
sistemas de cultivo o, también, métodos de cultivo, se hace referencia al modo
de operar el biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. En esta fase
nops ocuparemos de los birreactores.

3.4.1 Biorreactores
El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología
industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal
que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. Las
"tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo:
a) Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo
a fin de prevenir la sedimentación o la flotación.
b) Mantener constante y homogénea la temperatura.
c) Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
d) Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
e) El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo
el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo
deseado.

Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor esté
provisto de un sistema de agitación, a demás para el punto d) se requiere de un
sistema que inyecte aire en el cultivo.

Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el

tanque “agitado” y al "air lift". En el primero de ellos (Figura 7) la agitación se
realiza mecánicamente mediante un eje provisto de turbinas accionado por un
motor.
Figura 7. Esquema de un reactor aerobio con agitación mecánica.

El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona
que posee pequeños orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale
de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina inferior generándose
de este modo miles de pequeñas burbujas de aire, desde las cuales difunde el O2
hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o seis
deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que
imprimen las turbinas al líquido, generando de este modo mayor turbulencia y
mejor mezclado. El tanque está rodeado por una camisa por la que circula agua,
lo que permite controlar la temperatura. Para tanques mayores que 1000 ó 2000
litros este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un serpentín que
circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a
medida que es mayor el volumen de cultivo también lo es la cantidad de calor
generado, por lo que se hace necesario una mayor área de refrigeración. Los
tanques son de acero inoxidable y están pulidos a fin de facilitar la limpieza y
posterior
esterilización.

Figura 8. Esquema de un reactor tipo Air lift.

El aire que ingresa al biorreactor debe estar estéril, lo que se consigue haciéndolo
pasar por un filtro cuyo diámetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el
paso de microorganismos y esporas. En los reactores de tipo "air lift" (Figura 8)
es el mismo aire inyectado al cultivo lo que promueve la agitación. Básicamente
consiste en dos cilindros concéntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo
el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulación de líquido
ascendente en el comportamiento interno y descendiente en el externo, lo que
favorece el mezclado.

4.4.2Transferencia de O2

En los procesos de fermentación aerobios es necesario un suministro adecuado

de oxígeno que satisfaga los requerimientos metabólicos de los microorganismos
empleados. La oxidación de la fuente de carbono y su transformación en células,
productos y CO2 establece una demanda de oxígeno que es esencial satisfacer a
a través de la aireación y mezclado del cultivo.
Por ejemplo en el cultivo de levadura sobre medio mineral glucosado al 1%, la
demanda de O2 para una concentración celular de 10 g de peso seco de células /
litro es de 41 mg/lmin

Esta demanda de oxigeno es bastante más alta en comparación con la

concentración de saturación de oxigeno a temperatura normal de la fermentación
(30°C) que es de 7.5 mg/l.
Cuando se evalúa la transferencia de oxigeno en una fermentación es necesario
calcula las resistencia a la transferencia que encuentra el O2 antes de llegar a la
célula.

la resistencias a la transferencia de una gas poco soluble, tal como el O. a partir

de una burbuja hacia una agregado microbiano se puede descomponer en :
- Difusión del oxigeno del interior de la burbuja hacia la interfase gas –
liquido
- Transferencia a través de la interfase
 - Difusión en la película liquida de la burbuja
- Transferencia en la fase liquida homogénea
- Difusión en la película líquida que rodea el agregado
- Difusión dentro del agregado.

Se ha demostrado que la resistencia mayor la opone la película de líquido que

rodea las burbujas. Pero esto solo ocurre en el caso de los organismos
unicelulares; en los agregados celulares (pellets) la difusión a través del
agregado mismo constituye el paso controlante.

La velocidad de transferencia de 02, R02, desde el seno de la fase gaseosa

(burbujas) hasta la fase líquida está dada por la siguiente ecuación:

Donde KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, C la

concentración de 02 disuelto en el seno del líquido y C* la concentración de 02
disuelto que estaría en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase
gaseosa. El KLa depende del diseño del biorreactor, de las condiciones de
operación (caudal de aire, agitación) y de la viscosidad del cultivo. A mayor
viscosidad menor K La. El KLa es una medida de la capacidad que posee un
biorreactor para sumínistrar O2 y el rango de valores usuales está comprendido
entre 50 h-1 y 1000 h. por tanto la ecuación sería :

4.3: Características de la Fermentación en gran escala.

El fermentador donde se lleva a cabo los procesos industriales pueden variar en

tamaño de la escala pequeña de laboratorio 5-10 litros a la enorme escala
industrial de 400.000 litros. Las dimensiones dependen del proceso y de cómo
opera. Los procesos manejados en lote o batch requieren fermentadores más
grandes que los manejados en forma contínua o semicontínua.

Tabla 1. Tamaño de fermentadores para varios procesos

Tamaño del fermentador Producto
(litros)
Enzimas para diagnóstico, sustancias
1-20.000
para biología molecular
40-80.000 Algunas enzimas, antibióticos
Penicilina, antibióticos amino-glicósidos,
100- 150.000 proteasas, amilasas, transformaciones de
esteroides, amino ácidos
450.000 Amino ácidos ( ácido glutámico)

- Control y monitoreo del proceso.

Debido a los elevados costos de producción, los fermentadores industriales están
cuidadosamente controlados. No solo se necesita controlar el crecimiento y la
formación del producto, sino que se deben controlar otros factores ambientales a
medida que el proceso se efectúa. Los factores ambientales controlados más
frecuentemente son: la concentración de oxígeno, pH, masa celular y
concentración del producto. También es necesario en muchos casos controlar la
espuma dentro del fermentador y ajustar la temperatura. En la actualidad se
utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentación ya sea en la
obtención de datos que reflejen los cambios que tienen lugar durante el proceso
de fermentación o en el control de varios factores ambientales que se deben
ajustar o alterar durante la fermentación. La obtención de datos a medida que el
proceso de fermentación tiene lugar se llama adquisición inmediata y tiene un
valor especial cuando estos datos se puedan procesar para convertirlos en cifras
que puedan interpretarse en términos microbiológicos o bioquímicos. Las
computadoras también permiten graficar los datos obtenidos permitiendo al
operador del fermentador tener una representación visual del progreso de la
fermentación. Finalmente la computadora nos permite almacenar los datos en
forma legible de modo que estos datos se puedan traducir a otro sistema, o
analizar en forma mas sofisticada.

Un uso mas sofisticado de las computadoras es el control inmediato del proceso

de fermentación por ej. cambiando los parámetros ambientales a medida que la
fermentación progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio
exacto del crecimiento, en esta forma el nutriente es añadido cuando se necesita
evitando en algunos casos que el mismo sea metabolizado a productos
indeseables.

Finalmente, las computadoras pueden ayudar a modular los procesos de

fermentación, para ello se debe desarrollar un modelo matemático del proceso de
fermentación, el cual incorpora ecuaciones diferenciales para describir el
crecimiento microbiano y la formación del producto. El valor del uso de una
computadora para modelar el proceso de fermentación es que se puede ensayar
el efecto de varios parámetros sobre el crecimiento y sobre la formación del
producto en forma rápida e interactivamente, y entonces hacer modificaciones en
los parámetros para ver como afectan al proceso. De esta forma se pueden
estudiar con gran economía muchas variaciones de la fermentación en la
Terminal de la computadora y no en forma más costosa en la planta piloto o en la
planta industrial.

- Escalamiento del proceso de fermentación.

Uno de los aspectos mas importantes y complicados de la microbiología industrial
es la transferencia de un proceso del equipo de laboratorio a pequeña escala, al
equipo comercial a gran escala, procedimiento que se llama escalamiento. Es
sumamente importante comprender los problemas del escalamiento ya que es
raro que un proceso microbiano se comporte de la misma forma en
fermentadores a gran escala que en un equipo de laboratorio a pequeña escala.
La mezcla y la aireación son mucho mas eficientes en el matraz de laboratorio
pequeño que en el fermentador industrial grande. A medida que cambia el
tamaño del equipo, cambia la relación superficie/volumen. El fermentador tiene
un volumen mucho mayor para un área superficial determinada. Como la
transferencia del gas y la mezcla dependen de la superficie expuesta más que del
volumen del fermentador, es obvio que sea más difícil mezclar el contenido del
tanque grande que del matraz pequeño. Como la mayor parte de las
fermentaciones industriales son aeróbicas, es indispensable una transferencia
efectiva del oxigeno. Con el medio de cultivo rico que se utiliza en los procesos
industriales se obtiene una alta biomasa, que origina una gran demanda de
oxigeno. Si se reduce la aireación, aun durante un periodo corto, el cultivo puede
experimentar una anaerobiosis parcial, con serias consecuencias en términos de
rendimiento del producto.
El escalamiento en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero bioquímico,
quien esta familiarizado con la transferencia de gases, la dinámica de fluidos y la
termodinámica. El papel del microbiólogo industrial en el proceso de
escalamiento es trabajar estrechamente con el ingeniero bioquímico para
asegurar que se han abarcado los parámetros necesarios para una fermentación
exitosa y que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una
fermentación en gran escala.

Las distintas etapas que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio
a un proceso industrial son las siguientes:
1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera
indicación que es posible un proceso de interés industrial.

2) El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequeña,

generalmente de
vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el fermentador de laboratorio es posible
ensayar variaciones en el medio de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que
los costos son bajos tanto en el equipo como en los medios de cultivo.

3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000
litros. Aquí las condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no
es aun un factor de importancia. En el fermentador de una planta piloto es
deseable una cuidadosa instrumentación y un control con computadora, de modo
que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador
industrial.

CAPITULO 3: PRINCIPIOS DE BIOTECNOLOGÍA ENZIMÁTICA

Lección 1: Las enzimas, biocatalizadores de naturaleza proteínica
Definición:
El choque entre dos moléculas produce energía que puede ser absorbida por las
moléculas mismas, o puede ser disipada bajo forma de calor en el medio.
Si la energía absorbida por el substrato (S) es suficiente para franquear la
barrera de potencial, llamada energía de activación, el substrato se puede
transformar y conducir a la formación de un producto (P), es decir llegar a un
estado final, diferente del estado inicial.
Esta energía de activación generalmente es elevada y no es compatible con las
condiciones del medio en el cual se deben desarrollar las reacciones del
metabolismo de los organismos vivientes: pH vecino de la neutralidad,
temperatura comprendida entre O y 40°C, presión vecina a la presión atmos-
férica. Por tanto, la realización de esas reacciones necesita de catalizadores
bioquímicos, las enzimas cuya acción consiste, como la de todo catalizador abatir
la energía de activación lo que tiene por efecto acelerar la reacción, cuya
velocidad se encuentra multiplicada por un factor del orden de 1012-1020.
Al final de cada ciclo de reacción, la enzima permanece inalterada.

• E+S ES E+P

Las enzimas son pues, catalizadores biológicos de naturaleza protídica que

intervienen en todas las reacciones metabólicas energéticamente posibles, que
ellas aceleran por activación específica. Permiten alcanzar rápidamente el estado
de equilibrio de la reacción sin modificarlo. Son las llaves útiles de la
biotecnología y de la bioindustria. Son ellas las que en la ingeniería micro-
biológica, catalizan las reacciones metabólicas puestas en juego y aseguran su
regulación. Son ellas igualmente las que conducen la ingeniería genética para
realizar las modificaciones del equipamiento enzimático de ciertos
microorganismos con vista a hacerlos aptos para la biosíntesis de metabolitos
interesantes
El conocimiento de las enzimas, de su naturaleza y de sus propiedades, así como
de la cinética de las reacciones que catalizan es fundamental en biotecnología

1.2 Naturaleza de las enzimas

Todas ellas son macromoléculas que corresponden a la clase de las proteínas
globulares. Algunas son holoproteínas constituidas únicamente por un enca-
denamiento de ácidos aminados; otras son heteroproteínas, que poseen una
parte no proteínica, el cofactor, necesario para la actividad catalítica y asociado
más o menos fuertemente a la proteína.

Especificidad de la catálisis enzimática sitio activo:

Una de las características más importantes de la catálisis enzimática reside en su

especificidad, mucho más marcada que la especificidad de la catálisis química.
Esta especificidad presenta un doble aspecto:

• Especificidad de reacción. Una enzima no puede catalizar sino un solo tipo

de reacción, por ejemplo: hidrólisis de enlaces glucosídicos o hidrólisis de
enlaces ésteres (lipólisis), etc. Esta especificidad sirve de base a la
clasificación de estos catalizadores bioquímicos.

• Especificidad en cuanto al substrato. Esta propiedad resulta delhecho,

plenamente establecido, de que toda reacción enzimática implica la
fijación del substrato en puntos bien precisos de la proteína enzimática.
Esta fijación se hace por el establecimiento de enlaces de tipo del de
hidrógeno, hidrófobos o de Van der Waals.

La conformación de la proteína enzimática es tal, que no reconoce sino un tipo de

substrato. Ciertas enzimas presentan una especificidad estricta y son capaces de
asociarse a un único substrato; éste es el caso de la fumarasa (EC. 4.2.1.2) que
transforma el L-malato en fumarato y que no tiene acción sobre el D-malato o
sobre ningún otro compuesto relacionado. Otras enzimas, por el contrario, se
pueden fijar a substratos diferentes, pero de la misma naturaleza y provocar un
mismo tipo de reacción química.
La enzima, después de haber fijado el substrato, lo transforma en seguida. Para
esto, su estructura espacial es tal, que en la vecindad y a las distancias
adecuadas se encuentran grupos funcionales en donde las acciones diferentes y
complementarias realizan la reacción. La pequeña porción de la enzima,
implicada en la fijación y posicionamiento del substrato, así como en la reacción
de catálisis, delimita un volumen denominado "sitio activo".
En las enzimas holoproteínicas, éstos son principalmente los agrupamientos
funcionales libres situados en los radicales de algunos ácidos aminados que
intervienen al nivel del sitio activo (función OH de la serina, núcleo imidazol de la
histidina, función fenol de la tirosina, función COOH de los ácidos aspártico o
glutámico, función tiol de la cisteína).

En lo que concierne a las enzimas del tipo heteroproteínico, la fijación al

substrato se hace sobre la parte proteínica, la apoenzima, mientras que la
catálisis de la reacción es hecha por la parte no proteínica, el grupo prostético o
el cosubstrato.

La parte "apoenzima" de la molécula enzimática que lleva el sitio de fijación al

substrato es por consiguiente responsable de la especificidad en cuanto al
substrato de esa enzima. Pero también puede intervenir en la especificidad de la
reacción e inducir un tipo particular de reacción. Así es, por ejemplo, que en el
metabolismo de los ácidos aminados, el fosfato depiridoxal puede, de acuerdo a
la apoenzima con la cual está combinado, catalizar reacciones, sean de
transaminación, sean de descarboxilación, de desaminación, o de racemización.

La actividad de las enzimas es función directa de su estructura terciaria o de la

cuaternaria. En estas condiciones, todo tratamiento que modifique la
conformación de la enzima (calentamiento, modificación del pH), es decir
estorbando o impidiendo, la fijación del substrato a la enzima o cambiando la
estructura del sitio activo, alterará las propiedades catalíticas de la enzima y por
tanto su función.
1. 3: Cofactores
Las enzimas heteroproteínicas utilizan diversos tipos de cofactores: algunos
son iones metálicos (Mg++, Fe++, eu++, Mo+++, Zn++), Fig. otros cofactores
son orgánicos (heme, nicotinamida, flavina, coenzima A, fosfato de piridoxal,
tiamina, etc.). Este tipo de enzima adopta diversas formas de funcionamiento, lo
que con frecuencia entraña una confusión en la terminología de estos cofactores.
En efecto, algunos están combinados fuertemente a la apoenzima por intermedio
de enlace covalente; son parte integrante de la enzima y no se le separan: se les
designa con el nombre de grupos prostéticos. Otros, por el contrario, son co-
substratos; se fijan en un primer tiempo sobre la apoenzima, provocando la
transformación del substrato sufriendo una modificación en su estructura
química; después se separan de la apoenzima: se les denomina coenzimas.
Regresan a su estado inicial en el transcurso de una segunda etapa enzimática
fijándose sobre otra apoenzima.

Para ilustrar esta distinción, tomemos el caso de dos enzimas responsables de la

oxidación de ácidos aminados: la L-aminoácido-oxidasa y la glutamato
deshidrogenada.

La primera (EC. 1.4.3.2) es una flavoproteína en la cual el cofactor, la flavina

adenosina dinucleótido (FAD) se comporta como un grupo prostético.
Permaneciendo fija a la apoenzima provoca la oxidación por deshidrogenación y
desaminación del ácido aminado y se reduce a F ADH:z. La enzima regresa a su
estado inicial cediendo los dos hidrógenos, fijados transitoriamente, a un
segundo substrato, oxidante más potente, que provoca la reoxidación del F
ADH:z a F AD.

A la inversa, la glutamato deshidrogenasa (EC. 1.4.1.2) cataliza una reacción del

mismo tipo, la oxidación del ácido glutámico a ácido 2-oxoglutárico con ayuda de
la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido (NAD). Esta se encuentra
reducida. Abandona la superficie de la apoenzima. En seguida será reoxidada a
expensas de otro substrato que es reducido por otro sistema enzimático del
medio. El NAD se comporta en estas dos reacciones sucesivas como un
substrato.

1.4 Nomenclatura y clasificación de las enzimas:

La nomenclatura y la clasificación de las enzimas han sido normalizadas por la

Comisión sobre Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica, creada en 1955
antes de solucionar la confusión que había y el-riesgo de que la situación se
agravara con el rápido progreso del conocimiento acerca de las enzimas.
Los objetivos que fueron asignados a esa Comisión sobre Enzimas desde su
creación fueron:
• Hacer un inventario de las enzimas identificadas y caracterizadas,
precisando para cada enzima la naturaleza exacta de la reacción
catalizada.
• Establecer, a partir de este inventario, una clasificación de las enzimas.
 • Definir, con base en esta Clasificación, reglas de nomenclatura que
permitan designar, sin ambigüedad, a una enzima dada, proporcio-
nando la mayor información posible sobre la naturaleza de la reacción
catalizada.

Para cada enzima es preciso:

• La reacción catalizada.
• Su nombre sistemático en nomenclatura normalizada.
• Y sobre todo su número de identificación que define sin ninguna am-
bigüedad, el lugar de la enzima en la clasificación normalizada. Este I
número contiene 4 cifras o números, separados por puntos, cada uno de
ellos corresponde a los elementos siguientes:
a) La primera cifra indica la clase a la cual pertenece la enzima. Estas
clases, en número de 6 se definen de acuerdo a la naturaleza general de
la reacción catalizada. Hay: l-oxidorreductasas, 2-Transferasas, 3-
Hidrolasas, 4-Liasas, 5-Isomerasas, 6-Ligasas (o sintetasas). I
b) La segunda y la tercera cifras designan la subccase y la sub-sub- I
clase, definiendo en cada clase, según ciertos criterios que se pre-
cisarán más adelante.
c) La cuarta cifra da el número de orden de la enzima en la sub-clase
considerada

La regla general adoptada para designar a una enzima de acuerdo a la

nomenclatura sistemática es que el nombre de una enzima se forme de dos
partes:

La primera lleva el nombre del substrato; o en el caso de reacciones

bimoleculares, los nombres de los dos substratos separados por "dos puntos".

La segunda parte indica la clase a la cual pertenece la enzima; el nombre de la

clase puede. Precisarse por un prefijo que precede al tipo exacto de reacción
catalizada.
1.4.1: Clasificación de las enzimas según la naturaleza de la reacción

OXIDORREDUCTASAS
Catalizan las reacciones de oxidorreducción: transferencia de hidrógeno o de
electrón(es) de un donador, que está oxidado, a un receptor, que está redu-
cido.(Fig. 5) En esta clase, que lleva la cifra, se reagrupan todas las enzimas
llamadas: oxidasas, reductasas, deshidrogenasas y peroxidasas.

Los nombres comunes que se han retenido son del tipo "donador: deshi-
drogenasa" o "receptor: reductasa". El término oxidasa no se ha conservado
salvo cuando el receptor es el oxígeno.

Fig. 3 . Enzimas de oxido –

reducción, participan en la
respiración y fermentación

TRANSFERASAS
Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de agrupamientos
(metilo, hidroximetilo, carboxilo, acilo, glucosilo, amino, etc.).

En esta clase, que lleva la cifra 2, se reagrupan las transferasas, fosforilasas,

cinasas, entre otras

Las sub-clases se definen por la naturaleza del agrupamiento que es transferido

(agrupamientos de un carbono, de dos carbonos, nitrogenados, etc.).

El nombre sistemático está formado según el modelo: donador: receptor o grupo

transferido: transferasa.

Fig. 4: TRANSFERASAS se
encargan de transferir grupos
funcionales
HIDROLASAS
Provocan la hidrólisis de diversos tipos de enlaces: éster, acetal (osídico), amida
(peptídico), (Fig. 7)

Las subclases son definidas por la naturaleza general del enlace que es
hidrolizado.

El nombre sistemático se forma de acuerdo al modelo "substrato hidrolasa", un

prefijo que precisa la naturaleza del grupo eliminado cuando la enzima es
específica para este enlace. -
El nombre común que se recomienda es, en la mayor parte de los casos,
formado por el nombre del substrato al cual se adiciona el sufijo "asa". En
general las hidrolasas son holoproteínas. Algunas pueden tener un grupo
prostético, por ejemplo el fosfato de piridoxal.

Fig.5: HIDROLASAS..Reacciones
de hidrólisis, transforman polímetro
en monómeros

LIASAS
Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u algún otro, por medios
diferentes a la hidrólisis o a, la oxidación, con formación de un doble enlace en
alguno de los dos fragmentos. Cuando ellas actúan en sentido inverso -
condensación de dos moléculas con desaparición de un doble enlace se les
designa con el nombre de sintetasas.
Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub. clases
precisan la identidad de la fracción eliminada: CO2, aldehído, amoniaco, etc.
El nombre sistemático se forma de acuerdo al modelo, substrato: fracción
eliminada-liasa.

Fig. 6: Liasas. Condensación

de moléculas con desaparición
de doble enlace
ISOMERASAS
Catalizan las reacciones de isomerización: racemización, epimerización,
isomerización cis-trans, o también originan modificaciones intramoleculares tales
que transfieren un agrupamiento o producen oxidorreducción.

Para su nomenclatura se retiene el principio "substrato. . .asa", pero el término

isoÍnerasa se reserva a ciertas subclases; un prefijo hace precisa la naturaleza de
la isomerización, por ejemplo cis-trans isomerasa.

Fig. 7: Ejemplo de
Isomerización

LIGASAS O SINTETASAS
Son enzimas que catalizan la reacción de unión de dos moléculas, acopladas a la
ruptura, sin intervención del agua, de un enlace pirofosfórico en el ATP o
eventualmente en un nucleótido trifosfórico del mismo tipo.
Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - °, C - S, C -
N, C - C) y la sub-subclases se refieren a la naturaleza del producto formado
(amida, péptido, etc.) o a la reacción que es catalizada.
El nombre sistemático es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa (formando
ADP), X Y, son los dos substratos que se condensan; el producto formado a partir
del nucleótido trifosfórico implicado .en la reacción (ADP o AMP) se indica entre
paréntesis.
Para darle nombre común se utiliza, en general, el nombre del producto formado
seguido del término "sintetasa".

Fig. 8: Ligazas
Capitulo 3: CINETICA ENZIMATICA

El objeto de la cinética enzimática es el estudio de las enzimas en su

funcionamiento. Se propone, en particular, establecer las relaciones que existen
entre la velocidad de la reacción enzimática y las concentraciones del substrato
(S) y de la enzima (E), así como la influencia de algunos factores: pH, tem-
peratura, presencia de efectores y eventualmente, actividad del agua.
La Comisión sobre Enzimas ha definido una unidad internacional de actividad
enzimática, el katal, cantidad de enzima que transforma un mol de substrato por
segundo bajo las condiciones experimentales estándar. Esta es una unidad de
valor elevado: por ello se utilizan más corrientemente sub. múltiplos de ella:
microkatal (JLkat), nanokatal (nkat) y picokatal (pkat), que valen,
respectivamente 10-6, 10-9 y 10-12 katal (kat).

Las enzimas se pueden presentar bajo la forma pura, o bajo la forma de

preparaciones enzimáticas, más o menos purificadas. Con frecuencia es
interesante determinar la actividad enzimática de una cantidad unitaria de prepa-
ración enzimática no purificada o de una enzima purificada. Se refiere entonces la
actividad, sea a 1 kilogramo de proteína, sea a una molécula gramo, así se define
una actividad específica, katal por kg de proteínas y una actividad molar, katal
por mol de enzima.

2.1: Enzimas Michaelianas

Principales hechos experimentales: Debemos subrayar, como un preámbulo,

la necesidad absoluta de que las enzimas sean puras y desprovistas de actividad
parásita.

Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales
de la cinética enzimática son:
a) El substrato, S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario
transitorio ES. Este complejo resulta de una complementaria de la estructura
entre el sitio activo de la enzima y la molécula del substrato.

b) La velocidad de la reacción en el tiempo t, es decir la velocidad de dS/dP

desaparición del substrato, o de aparición del producto, dt/dt que se representa
por la pendiente de la tangente a la curva, P o S = f(t) no es constante para las
concentraciones dadas en enzima o en substrato (fig.9), y disminuye en función
del tiempo debido a la desaparición del substrato en el curso de desarrollo de la
reacción.
Siempre, al principio de la reacción, se puede considerar que la tangente a la
curva se confunde con aquélla en que la velocidad permanece constante.
Los estudios de cinética enzimática corresponden siempre a esta parte lineal de
la curva; lo que implica el trabajar a velocidades iniciales. En estas condiciones,
al principio de la reacción, la concentración en producto es muy débil; puede
despreciarse, así como la reacción inversa de transformación del producto en
substrato. Entonces se puede escribir
k1 k3
E + S = ES E + P
k2

Fig. 9. Curva de aparición del producto en función del tiempo

Fuente: Scriban, Biotecnología,

1985

c) Por otra parte, para una concentración dada de substrato, el estudio de las
variaciones de la velocidad inicial de reacción en función de la concentración
de enzima (fig. 10) muestra que esta variación no es lineal. La curva presenta
un trazo hiperbólico correspondiente al hecho de que para una cierta
concentración de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la forma
de complejo enzima-substrato;
 Fig. 10. Curva que representa
la velocidad enzimática en
función de la concentración de
la enzima

Fuente: Scriban, Biotecnología,

1985

de lo que resulta que la velocidad inicial, función de la concentración de este

complejo, permanece constante. Para los estudios cinéticos, es necesario situarse
en las condiciones que corresponden al principio de la curva, donde es lineal, es
decir a concentraciones bajas de enzimas.
En otros términos, la cantidad de enzima debe ser pequeña en comparación a la
concentración del substrato, de tal manera, que la formación del complejo
enzima-substrato, ES, no modifica, o modifica poco la concentración del
substrato,

Hipótesis de Michaelis-Menten: Al establecer la ecuación de la velocidad,

Michaelis y Menten toman como principio de que la velocidad de transformación
del complejo ES en E + P es muy lenta, con relación a la velocidad de la ruptura
del complejo que vuelve a dar E + S.
Esta hipótesis significa que k3 ~ k2 Y que E y ES están en equilibrio, sea:

Hipótesis del estado estacionario de Briggs y Haldane: Estos autores

consideraron que la hipótesis de Michaelis-Menten es demasiado restrictiva y que
es preferible postular un estado estacionario, estado para el cual la velocidad de
formación del complejo ES es igual a su velocidad de descomposición en todas
las direcciones (formación de productos y aumento del substrato).
Velocidad de formación de ES = k1 [E] [S]

Velocidad de desaparición de ES = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3)

[ES]
El estado estacionario se describe entonces:

Al escribir que la cantidad de enzima que se ha puesto en el medio de reacción

[ET] se reparte en una fracción libre [E], y una fracción que forma un complejo
[ES], se tiene:
[ET] = [E] + [ES]
Al sustituir E por su valor, se obtiene:

La velocidad de formación del producto está dada por: v = k3 [ES], la ecuación

general es de la forma:
Ecuación de Michaelis-Menten: Cuando la concentración en substrato cambia al
infimito; la velocidad inicial tiende hacia k3 [Er], o sea hacia la velocidad máxima
V m; toda la enzima se encuentra entonces bajo la forma ES.
La ecuación es en su forma más simple:

Esta es la ecuación de Michaelis-Menten, según la cual la velocidad de la reacción

enzimática es una función hiperbólica de la concentración del substrato.

Los resultados experimentales en el caso de las enzimas michaelianas con un

solo substrato corroboran la validez de esta ecuación.

Significación de Km Y de Vm: Vm representa la velocidad máxima que puede

alcanzar la reacción: toda la enzima se encuentra bajo la forma compleja ES.

Cuando la velocidad de la reacción alcanza la mitad de la velocidad máxima, v =

1/2 Vm, Km es entonces igual a (S].

Si kz > k3, Km = kz/k1 que es la hipótesis de Michaelis-Menten : [E] + [S] y

[ES] están en equilibrio y la formación del producto representa una ligera fuga.
En este caso, Km puede ser asimilada a la inversa de la afinidad de las enzimas
por el substrato. Mientras más pequeña sea Km, mayor será la afinidad y
viceversa.

Si kz < k3, la hipótesis de Michaelis-Menten no tiene validez y Km ya no tiene

relación con la afinidad de la enzima por el substrato. También es preferible
considerar Km como una constante empírica igual a la concentración del
substrato para la cual la velocidad inicial es igual a V m/2en las condiciones
experimentales definidas.

Reversibilidad y relación de Haldane: En distintos puntos de la curva las

reacciones enzimáticas son reversibles, es decir las enzimas pueden catalizar la
reacción inversa:
Keq = constante de equilibrio de la reacción global.

Figura 11 : Representaciòn
gráfica de Michaelis-
Menten

Representación gráfica de la cinética michaeliana de un substrato: La

representación de Michaelis-Menten, v en función de S.
Esta relación resalta la interdependencia de la constante de equilibrio y de los
parámetros cinéticos de una reacción enzimática reversible y muestra que no es
posible olvidar la reacción inversa en la que los productos se acumulan.

2.2 Enzimas alostéricas

Las enzimas con múltiples subunidades tienen estructura cuaternaria. Una
consecuencia de las subunidades múltiples es que cada subunidad catalítica
individual tiene su propio centro activo. Esto significa que una enzima con
estructura cuaternaria puede unir más de una molécula de sustrato. Alostérico
significa "forma diferente". Las enzimas alostéricas cambian de forma entre las
formas activas e inactivas como resultado de la unión de los sustratos en el
centro activo y de las moléculas reguladoras en otros sitios. En el caso simple de
una enzima alostérica con una forma activa e inactiva, el cambio en la velocidad
de reacción con el incremento de la concentración de sustrato es típicamente una
curva de forma "S".

El significado de la curva de forma S para una enzima alostérica

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima está en la forma inactiva

(conformación inactiva). Cuando la concentración de sustrato aumenta, el
sustrato se une a la enzima y provoca un cambio de conformación a la forma
activa de la enzima. Después de que el primer sustrato esté unido, la segunda y
siguientes moléculas de sustrato se unen con mayor afinidad. Este fenómeno es
lo que se llama "cooperatividad", y la forma S de la curva indica la unión
cooperativa del sustrato. El resultado del cambio a la forma activa es un fuerte
incremento en la unión de los otros sustratos, y como resultado, la velocidad de
reacción aumenta muy rápidamente en un estrecho margen de concentración de
sustrato. Cuando todos los centros activos de una enzima alostérica están
ocupados con sustrato, la velocidad de la reacción es constante y se alcanza la
meseta de la Vmáx.
3. PRODUCCIÓN DE ENZIMAS

La producción mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5 millares de

millones de dólares, 60% de ellos con utilización en las industrias agroali-
mentarias.

Las enzimas que se utilizan en procesos agroalimentarios son objeto de una

reglamentación estricta, en lo que concierne a su producción, su pureza química
y microbiológica. En su presentación comercial, sea bajo la forma más o menos
diluida, fijada sobre soportes inertes, o diluyentes están también igualmente
reglamentadas. Las enzimas, biocatalizadores utilizados en la bioindustria o en
otras diversas industrias (farmacia, textiles, pieles...) pueden provenir de varias
fuentes, especialmente:

De origen vegetal, de origen animal y de origen microbiano.

Cada una de estas fuentes se estudiará tomando en cuenta sólo algunos

ejemplos.

3.1 Enzimas de Origen Vegetal

Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por orden
decreciente de interés tecnológico, una de las más importantes enzimas
vegetales de uso industrial se encuentran: la papaína que proviene de una planta
ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la bromelina, extraída de la pifia (Ananas
comosus Merr) y la ficina proveniente del higo (Ficus carica).

La preparación de papaína industrial más pura (papaína refinada) ha sido

desarrollada en 1969 por Baudard en Zaire (Jones y Mercier, 1974). El látex
fresco es guardado en frío, agitado, diluido, centrifugado, filtrado sobre kieselgur
y a través de placas esterilizantes, a fin de eliminar toda impureza y finalmente
atomizada al vacío a 50°C. Se debe obtener un polvo blanco y evitar por un lado
cualquier obscurecimiento debido a la oxidación y el empleo de temperaturas
anormales, además evitar toda infección microbiológica (Escherichia co/i,
Salmonella, . . .). El látex fresco contiene alrededor de 12% en peso de papaína.

Son numerosas las aplicaciones de la papaína industrial (alrededor de 300 ton.),

de las cuales se usa 75% en la industria cervecera para la estabilización coloidal
de la cerveza; 10% en la industria de la carne (ablandamiento), 5% en la
fabricación de hidrolizados de pescado destinados a la alimentación animal, 2%
en la industria farmacéutica, entre otros. La tasa de utilización puede variar
seriamente en función de la legislación alimentaría de cada país. El desarrollo de
la papaína industrial es ciertamente interesante de seguir, pues puede sufrir
fluctuaciones por razones diversas (producción, acontecimientos políticos,
cambios de tecnologías). En los últimos años se han introducido exigencias muy
estrictas sobre la calidad del producto.

3. 2:Enzimas de origen animal

Un ejemplo importante de este tipo de enzimas en la pepsina, esta enzima es

producida industrialmente a partir de la mucosa gástrica del cerdo donde se
encuentra en forma de un precursor, el pepsinógeno, de una masa molecular de
42,000. La preparación industrial de la pepsina se puede hacer de acuerdo a
varios métodos: en general se practica la auto digestión de mucosas gástricas
de cerdo, raspadas y trituradas, en medio acuoso. acidificado con ácido clor-
hídrico, en presencia de cloroformo. Después de flltración se efectúa una
concentración por liofilización. La pepsina purificada es blanquecina y soluble en
agua.
Su actividad enzimática es más elevada entre pH 1 Y 4 con un máximo a valores
de 1.8 y varía según la naturaleza del substrato; es termosensible en solución
arriba de los 55°C, lo que limita su utilización en tecnología.

Sin embargo, puede ser utilizada en bebidas refrescantes, en cervecería en el

transcurso de la estabilización coloidal durante la pasteurización en botellas
(Trolle, 1949) en razón de su actividad en medio ácido (pH de la cerveza = 4 a
4.5). Tiene, como la papaína, la propiedad de precipitar las proteínas o los
polipéptidos en medio líquido (leche, cerveza.) (efecto "coagulante ").
Finalmente es necesario advertir que la pepsina puede provocar la hidrólisis de
enzimas como las amilasas, la tripsina, la papaína industrial, lo que debe tenerse
en cuenta para su uso tecnológico ocasional.

3.3: Enzimas de Origen Microbiano

Desde que el desarrollo de la microbiología ha permitido comprender mejor los

sistemas que condicionan la síntesis de enzima s en los microorganismos, la
producción industrial de enzimas se ha orientado hacia los procesos de
fermentación. Las principales ventajas de las enzimas en la fermentación con
relación a las enzimas en la extracción son las siguientes:
- Una producción independiente de restricciones estaciónales o geográficas.
- La posibilidad de utilización de materias primas de fácil adquisición.
- Los rendimientos en la producción se pueden aumentar en proporción
importante al mejorar las capas microbianas y aplicar las óptimas condiciones de
fermentación.
Por otro lado, las enzimas de origen microbiano presentan propiedades y
especificidades diversas.
Estas ventajas predominan sobre los inconvenientes propios de las industrias de
fermentación (fuertes inversiones, consumo de energía, riesgos de
contaminación...) y en el transcurso de los últimos treinta años se han
desarrollado un número importante de fermentaciones productoras de enzimas.
Las principales producciones se presentan en el cuadro 1
La fundamentación de la producción de enzimas microbianas exocelulares es muy
simple: un microorganismo es cultivado en un medio apropiado, a partir del cual
es extraída la enzima (para las enzimas endocelulares es necesario Un
tratamiento previo de la biomasa). Los problemas radican en los detalles de
proceso.

En la Industria alimentaría, existe una gran variedad de enzimas de mucha

importancia. En el cuadro (2) se muestran algunos ejemplos:

3. 4: Producción Industrial de enzimas

En la producción industrial de las enzimas se consideran las siguientes etapas .

(Scriban, 1985)
A. Definición de la enzima que se busca
La producción de una enzima industrial que responda, en principio, a una
exigencia potencial de quienes la pueden utilizar, hace necesario determinar las
propiedades que esta enzima pueda tener. Prioritariamente, de acuerdo a Sicart
(1980):
- La especificidad: Aunque en la industria las enzimas sean utilizadas para la
hidrólisis de macromoléculas complejas en las cuales los sitios de acoplamiento
con, frecuencia se desconocen, el efecto global que se busca involucra,
generalmente, la utilización de un tipo preciso de enzima. En ciertos casos, como
sucede con la pectinasa, una enzima asocia tres actividades diferentes, y se debe
precisar estrechamente la relación entre estas tres actividades de acuerdo al
producto que se vaya a tratar.
Cuadro: 2 Enzimas utilizadas, en la industria alimenticia

INDUSTRIA ENZIMAS USOS

Enmascara el gusto a óxido.
Tripsina.
Láctea Fabricación de leche delactosada, evita la cristalización de
Lactasa
leche concentrada.
Quimosina
(renina) Coagulación de las proteínas de la leche (caseína).
Quesería
Lactasa Influencia en el sabor y aceleración de la maduración.
Lipasa
Lactasa
Evita la textura “arenosa” provocada por la cristalización.
Helados Glucosa-
Permite la utilización de jarabes de alta fructosa.
isomerasa
Papaína,
Ablandamiento de carnes.
Cárnicas Fiscina
Producción de hidrolizados.
Bromelina
Amilasa Mejora la calidad del pan.
Proteasa Disminuye la viscosidad de la pasta.
Panificación
Lipoxidasa Produce una miga muy blanca
Lactasa Mejora la coloración de la superficie.
Amilasas Usadas para licuar la pasta de malta.
Cervecería Papaína, Evitan la turbidez durante la conservación de ciertos
Pepesina productos.
Pectinasas
Mejoran la clarificación y extracción de jugos.
Vinificación Glucosa-
Evitan el oscurecimiento y los sabores desagradables.
oxidasa
Pectinasas
Mejoran la clarificación de jugos.
Glucosa-
Conversión de la glucosa en fructosa (jarabes de alta
Bebidas no isomerasa
fructuosa).
alcohólicas Tannasa
Aumenta la solubilidad y disminuye la turbidez del té.
Glucosa-
Evita el oscurecimiento y los sabores desagradables.
oxidasa
- El valor óptimo de pH: Este factor tiene una influencia variable según las
enzimas; algunas de ellas, como la proteasa alcalina aún son activas a pH = 10,
en tanto que las enzimas fúngicas funcionan aún a pH = 3.
- El valor óptimo de temperatura: Generalmente, quienes utilizan enzimas se
interesan en poder disponer de enzimas que soporten temperaturas elevadas, ya
que estas temperaturas conservan en parte la esterilidad del medio de
fermentación.
Después, es necesario definir el sistema que se adoptará para medir su actividad,
pero conviene disociar la noción de actividad que se aplica a la cantidad de
enzima presente en una preparación, la que se puede determinar mediante un
método de laboratorio, de la noción de eficacia que caracteriza el
comportamiento de la misma preparación colocada en las condiciones industriales
en las que vaa utilizarse. (Sicart, 1980).

B. Selección de una cepa microbiana

Los microorganismos que son capaces de producir enzimas de degradación de
ciertos compuestos se localizan generalmente en donde abundan esas subs-
tancias. Por ejemplo, los microorganismos que secretan celulosas son numerosos
en el suelo de los bosques. Inicialmente, las cepas se han aislado del suelo o de
elementos naturales.

Los métodos de aislamiento que se utilizan son los métodos clásicos, el más
importante es el cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub cultivo en un
medio selectivo. En el medio selectivo ideal, el substrato de la enzima es la única
fuente de uno de los elementos vitales. Por ejemplo, el almidón como única
fuente de carbono. para aislar a los microorganismo s que tienen una amilasa.
Las técnicas de difusión en agar se han desarrollado para la detección de la
actividad enzimática. Esta prueba, en las condiciones estándar, puede dar
información de orden cualitativo. Para que la cepa aislada sea retenida
definitivamente debe presentar algunas características, de acuerdo a Aunstrup y
col. (1979) y Sicart (1980):

- Desarrollarse sobre un medio sencillo fácilmente asequible.

- Producir el menor número posible de metabolitos secundarios, como
antibióticos, por ejemplo.

- Excretar la enzima en forma que se facilite su separación y su purificación. .

- No originar contaminantes diversos
- No ser patógena ni producir compuestos tóxicos.
Con los progresos de la genética, las posibilidades de mejoramiento de las cepas
son, teóricamente, ilimitadas; por una 'parte por una mutación, por otra parte,
mediante la nueva vía de la ingeniería genética.

En cualquier forma, la genética de los microorganismos que se utilizan en la

producción industrial de enzimas (Bacillus, Aspergillus) aún está mal conocida
para que puedan realizarse las aplicaciones de la ingeniería genética y son las
mutaciones las más utilizadas.

Las cepas industriales deben ser protegidas contra la degeneración, la pérdida

de viabilidad y las contaminaciones. Los medios más seguros son la liofilización
o la conservación a temperatura del nitrógeno líquido. Estas técnicas permiten
conservar las cepas casi indefinidamente.

C. Producción industrial de la enzima

Tradicionalmente, las enzimas microbianas eran producidas por cultivo en
superficie, en una delgada capa de medio líquido o de medio semisólido. Esta
técnica es aún utilizada para algunas producciones, en particular de enzimas de
origen fúngico, tales como las amilasas de Aspergillus, las proteasas de
Aspergillus y de Mucor o las pectinasas de Penicillium. Pero existen varios
problemas en el control de la temperatura, de la aireación y de la humedad, por
ello se prefieren los cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos
en medio líquido, profundos, agitados, son mejor adaptados a los diferentes
controles mediante métodos modernos y reducen los riesgos de contaminación.
Además se prestan mejor a las operaciones de extrapolación y de optimización
necesarias para el paso del fermentador piloto de laboratorio al fermentador
industrial.
Preparación del inóculo
En esta etapa de preparación del inóculo, la capacidad de producción de la cepa
debe conservarse y eliminarse todo riesgo de contaminación. Para ello es
necesario evitar que haya un número excesivamente grande de cultivos
sucesivos. Es preferible el sembrar directamente un matraz de medio gelosado,
a partir de la cepa liofilizada, después, a partir de este cultivo se sembrará un
único fermentador que servirá el mismo de inóculo para el fermentador
industrial. El volumen del inoculo representa generalmente de 3 a 10% del
volumen del fermentador de producción y la composición del medio para la
preparación del inóculo se aproxima bastante a la del medio de producción. El
tiempo de permanencia en el fermentador varía de 10 a 80 horas según el
procedimiento, la cepa, las condiciones de cultivo, (Aunstrup y col., 1979)

D. Composición del medio de cultivo

El medio de cultivo debe contener la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y
los principales factores de crecimiento necesarios para la cepa microbiana. Se
pueden adicionar ciertos factores para abreviar la fase de latencia. De todas
formas, la producción de enzima puede no tener lugar a pesar de que el medio
sea el conveniente para un buen desarrollo. Hay que tomar en cuenta la
necesidad de un inductor, de las represiones posibles debida a algún componente
del medio, de la represión catabólica producida por la glucosa. Esta represión
puede ser evitada reemplazando la glucosa por glúcidos fermentables lentamente
o por almidón parcialmente hidrolizado.
Para aumentar la productividad, se utilizan medios concentrados, pero esta
concentración puede igualmente -ser causa de aumento en la presión osmótica y
dificultar la aireación.
A menudo se adicionan sales para complementar la cantidad de nitrógeno en el
medio
E. Fermentación y equipo necesario
Vincent y Priestley (1975) han detallado las condiciones de fermentación que
deben mantenerse para producir una enzima.
Los fermentadores utilizados habitualmente contienen volúmenes de 100 a 200
m3. Deben estar equipados de un sistema de agitación de gran potencia, capaz
de agitar medios relativamente viscosos, ya que pueden contener hasta 350 g/lt.
de materia seca (Sicart, 1980).
Los fermentadores están equipados de una corona clásica de aereación, ya que la
mayor parte de las fermentaciones productoras de enzimas tienen una fuerte
demanda de oxígeno. Generalmente, estas fermentaciones son conducidas en
condiciones limitadas de oxigenación. Para la glucoamilasa, la productividad está
limitada a la transferencia de oxígeno (Aunstrup y col., 1979).

Los equipos de medición y de control del fermentador permiten seguir y regular

los parámetros del cultivo. Los controles se ejercen generalmente sobre el pR, la
temperatura, el oxígeno disuelto, la espuma y la evolución de la concentración de
ciertos nutrientes. Además la medición de la aparición de la actividad enzimática
se efectúa a intervalos regulares por el laboratorio de control. Aún no existen
reguladores que permitan hacer esas mediciones en forma continua. (Sicart,
1980). Esta medición es importante porque de ella depende la decisión de
detener la fermentación.
Para la producción de enzimas, son necesarias condiciones rigurosas de asepsia,
por una parte para obtener un buen rendimiento, por otra parte para no tener el
riesgo de secreción de substancias tóxicas como contaminantes. Esta asepsia es
difícil de mantener, siendo el medio muy rico y el pH cercano a la neutralidad.

Se necesita tomar precauciones a nivel de la construcción del fermentador y para

la elección de las instalaciones y los equipos colaterales. Durante toda la
fermentación, una ligera supresión de aire en el fermentador impide la
penetración de contaminantes, esta precaución la refuerzan las protecciones de
vapor en todos los puntos de comunicación con el exterior (fig. 12).

Aún no se ha establecido el modelo cinético general para la síntesis de enzimas,

pero, ya se ha estudiado la regulación de la formación de algunas enzimas.
Algunas enzimas se forman durante la fase exponencial de crecimiento, pero la
mayor parte aparecen en la fase postexponencial. Según sean las enzimas y los
procedimientos, la fermentación dura de 30 a 150 horas.
La cantidad de proteína -enzima en el medio, al final de la fermentación,
representa de 1 a 5% de la materia seca inicial, en tanto que la biomasa celular
puede alcanzar de 2 a 10%.

La calidad de las enzimas producidas está en estrecha relación a la forma en que

se condujo la fermentación. La selección de las materias primas, el método de
esterilización, el procedimiento para regular la formación de espuma, la aireación
y la agitación, así como la duración de la fermentación afectan, no solamente al
rendimiento y al costo de producción, sino también al color, olor y a la
estabilidad de la enzimas.

Fig. 12: Esquema para una producción de fermentación para la

producción de enzimas (Aunstrup, 1979)
Utilizado este biocatalizador. En la práctica, la mayor parte de las operaciones
industriales se realizan de forma discontinua, en lotes, con la renovación de la
enzima al principio de cada ciclo.
Para los enzimólogos, la fijación sobre un soporte realiza un modelo cercano a
las condiciones de la célula viviente, en donde las enzimas se encuentran con
frecuencia asociadas a la membrana ó a organelos intracelulares.

Desde 1916, Nelson y Griffin habían demostrado que la invertasa adsorbida

sobre carbón activo, conservaba su actividad. Pero de cualquier modo hubo
que esperar hasta la década de los 50's para que aparecieran las primeras
aplicaciones de esta técnica, en particular con los trabajos de Grubhofer y
Schleith.

Después de 1960, las investigaciones se han intensificado y bajo el impulso de

los equipos de Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han
multiplicado las utilizaciones potenciales de las enzimas inmovilizadas. En1969
Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japón el primer reactor industrial
con enzima fijada, una L-aminoácidos a partir de la correspondiente mezcla
racémica. Esta técnica permitiría, según los autores, disminuir el precio de
costo a menos del 40% con relación al procedimiento convencional.

En la actualidad, se han desarrollado numerosos métodos de fijación de interés

para más de 100 enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como en escala piloto
y se ha abierto un campo de experimentación, después de algunos años, para la
inmovilización de células intactas, vivas o muertas. Esta multiplicación de
trabajos ha dado lugar a una abundante literatura científica.

5. Inmovilización de enzimas

La actividad de las enzimas está ligada al mantenimiento de la integridad de su

conformación temaria, en particular al nivel de su sitio activo. Los procedimientos
de inmovilización deben, por consiguiente, ser métodos suaves, bien regulados,
que respeten la estructura nativa de la proteína, que los enlaces que se crean
entre el soporte y la enzima, excluyan los ácidos aminados involucrados
directamente en la reacción catalítica.
Se han propuesto diversos tipos de métodos y en 1971, en la primera
conferencia de Ingeniería Enzimática de Henniker (E.U.A.) se definió una
clasificación de enzimas inmovilizadas, según el método de fijación utilizado.

Fig : 13 : Clasificación de formas de obtención de enzimas

En esta clasificación, las enzimas inmovilizadas se consideran como un caso

particular de las enzimas modificadas. Después apareció la técnica de reticulación
(enlazamiento cruzado) en el cual las moléculas enzimáticas son polimerizadas
por intermedio de un ligando polifuncional.

- Propiedades de las enzimas inmovilizadas

Los efectos de la inmovilización sobre la actividad de las enzimas resultan de la

interacción de diferentes factores:
a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a causa
de tensiones durante la fijación.
b) Modificaciones del microambiente: pH local, interacciones electrostáticas.
c) Fenómenos difusionales en el interior del complejo.
d) Impedimentos estéricos.
Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y
la estabilidad de la enzima.
- Medición de la actividad

Las condiciones óptimas de acción de las enzimas inmovilizadas difieren a

menudo de las de las enzimas en solución y deben ser perfectamente conocidas
para evitar todo riesgo de error de interpretación. Así para la ureasa, fijada
sobre bentonita, la actividad de pH 7.7 no alcanza sino a 75% de la actividad de
la enzima libre mientras que es de 100% a pH 7.1.17

La Comisión Internacional de Hennicker en 1971, ha propuesto caracterizar la

actividad de los complejos por la velocidad inicial de reacción expresada en
microkatales (JIkat): cantidad de producto formado en micromoles por segundo y
por mg (materia seca) o por unidad de superficie del soporte; precisando las
condiciones de determinación de la materia seca, el tenor en proteínas fijadas y
la actividad específica de la enzima antes de la inmovilización.

Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilización entraña con
frecuencia una pérdida de actividad, muy variable según sea la naturaleza de la
enzima y el modo de fijación; pero también se han señalado algunos casos en los
que hay aumento de actividad. Estas variaciones en un sentido o en otro podrían
explicarse por una modificación estérica del sitio activo de la enzima bajo el
efecto de un cambio de conformación de la cadena polipeptídica.

Gracias a la gran especificidad en su acción, las enzimas constituyen una

herramienta de fabricación y de análisis indispensable en numerosos sectores de
la investigación, del control y de la producción industrial.

La introducción de las técnicas de insolubilización de los biocatalizadores suscita

un interés considerable en razón de las ventajas que presenta: tratamientos en
continuó, control automatizado, mejoramiento de los rendimientos por unidad de
enzima, obtención de derivados más puros, disminución de requerimientos
energéticos. . . y los recientes desarrollos de los métodos de inmovilización de
células enteras han abierto nuevas perspectivas.
A pesar de los numerosos trabajos de investigación, las instalaciones de
producción industrial son aún muy limitadas. Es necesario buscar la causa en la
complejidad del funcionamiento de los reactores, en donde la matriz es a menudo
muy delicada y en la gran inestabilidad de los catalizadores biológicos; sin olvidar
las limitaciones debidas a regulaciones legales.
La obtención de nuevas fuentes de enzimas más estables, el desarrollo de
sistemas multienzimáticos, la recuperación y la re utilización de cofactores de.
Las enzimas son las vías de investigación susceptibles de ampliar el campo de las
aplicaciones actuales:
Actividades 1:
1. Realice un mapa conceptual sobre las generalidades de la Biotecnología,
teniendo en cuenta: definición, historia, tipos y tendencias.

2. Teniendo en cuanto los modelos matemáticos que explican el crecimiento

microbiano. Realice los siguientes ejercicios.
a. Comenzando con 4 células bacterianas por mililitro en un medio rico, con una
hora de fase de adaptación y un tiempo de generación de 20 minutos. Cuántas
células habrá en un litro de este medio en una hora?; y en dos horas?

b. Calcule el tiempo de generación en un experimento de crecimiento en el que

el medio se inoculó con 5 x 106 células /ml de E. coli y después de una hora de
fase de adaptación, creció exponencialmente durante 5 horas, siendo entonces
la población de 5,4 x 109 células ml.

c. En un Cultivo de Cephalosporium sp productor de una sustancia antibiótica,

en medio de cultivo agitado con glucosa 30 g/L

Tiempo X (Biomasa P S (Sustrato

(hr) g/L) (µg/L) g/L)
0 0.05 0 30
1 0.1 0 27
2 1.4 0 24
4 4.6 0 14.5
6 7.4 0 7.0
8 10.8 1 5.8
10 14.21 7 4.6
12 14.1 15 3.0
24 14.0 30 2.0

1. Cual es la relación entre el crecimiento y la formación del producto

 2. Calcule el tiempo de duplicación (Td) y µ.
3. Calcule el rendimiento biomasa/ sustrato (Y X/ S) y producto/ sustrato (Y
P/ S).
4.

3. Investigue en su localidad los sustratos o subproductos que pueden utilizarse

como fuente de Carbono, nitrógeno y fósforo. Enuncie sus características
relacionadas en cuanto a producción mensual del sustrato, estabilidad del
sustrato y concentración de los nutrientes.

4. Investiga sobre métodos de cuantificación del crecimiento microbiano, realiza

un foro con tus compañeros y compara las diferentes técnicas.

5. Establezca las ventajas y desventajas entre los diferentes métodos de

fermentación.

6. Realice una investigación bibliográfica sobre las enzimas más importantes en

la industria alimenticia, escoja una de ellas y realice un diagrama de flujo para la
producción de la misma.
UNIDAD 2: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA
BIOTECNOLOGÍA

El principal objetivo de la ingeniería genética en el campo de la Biotecnología es

alterar la composición genética de los seres vivos de importancia industrial, con
el fin de incrementar la eficiencia global del proceso para el que se emplea dicho
ser vivo. Aunque el objetivo principal es incrementar el rendimiento de un
producto específico, es interesante tener en cuenta otros parámetros,
particularmente los que se refieren a las mejoras en las características de
crecimiento y la eliminación de subproductos perjudiciales. (Wiseman, A,1986)

El desarrollo de organismo súper productores, se considera el principal objetivo

de este campo de la biotecnología, aunque se podrían añadir otros dos: en
primer lugar, la obtención de nuevas especies que produzcan productos nuevos o
modificados y en segundo lugar, el conocimiento de las rutas biosintéticas que
conducen a la producción de metabolitos de interés comercial, así como
mecanismos de control que regulan estas rutas.(Wiseman, A. 1986)

La estructura y función básica de los genes se conocía desde finales de los años
sesenta. Más aún, la labor de los bioquímicos había producido un gran cúmulo de
conocimientos respecto de los conjuntos de reacciones químicas que ocurren
dentro de los seres vivos. Las vías metabólicas fundamentales para la generación
de energía y la biosíntesis de la mayoría de los compuestos esenciales para la
vida ya estaban establecidos. (Saberon , 1997)

Este conocimiento se basaba en la aplicación inteligente de métodos de ensayo y

purificación de enzimas clave, y de la identificación y análisis de sus sustratos y
productos. Al mismo tiempo, otras disciplinas como la inmunología y la genética,
realizaban avances y eran actividades de gran complejidad y finura.

La biología molecular, sin embargo, se encontraba en un punto en el que su

desarrollo se había hecho muy lento. Una vez sentadas las bases fundamentales
de la replicación y expresión de la información genética, el siguiente paso era
desentrañar; en forma detallada, los mecanismos de regulación de la expresión
genética.

Todas las vías metabólicas, la expresión de anticuerpos, la actividad de los virus,

en fin, todas las manifestaciones del fenómeno viviente, están, en última
instancia, orquestados por la expresión ordenada y regulada de los genes, por
medio de la producción de proteínas específicas.

El extraordinario proceso por el cual una sola célula, el huevo fecundado, da

origen a un organismo complejo, es decir; las etapas de diferenciación celular;
constituía un reto extremadamente atractivo, pero a la vez formidable. Un
descubrimiento clave inició el cambio dramático que conocemos hoy como
ingeniería genética o ADN recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel
Nathans descubren una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias
específicas, que les valió el Premio Nobel de fisiología o medicina, compartido con
Werner Arber, en 1978.

Este descubrimiento (consecuencia de un hallazgo accidental, en el que los

investigadores profundizaron con gran sentido) dio origen a una sucesión de
nuevos descubrimientos y potenció el desarrollo de toda una serie de otras
disciplinas y metodologías. En este capítulo revisaremos los fundamentos de
algunas de las más importantes.

Capitulo 1: TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIÓN GENÉTICA IN

VITRO.

Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el

ADN. Estos sistemas, llamados de modificación-restricción, son análogos a un
sistema inmune, los cuales probablemente evolucionaron como un mecanismo de
protección de los microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las
bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacteriófagos, que
inyectan su propio ADN en la célula bacteriana para después controlar su
maquinaria celular y redirigirla hacia la síntesis de sus propios componentes,
dando como resultado final la ruptura de la célula y la liberación de cientos o
miles de nuevos virus. En algunas bacterias el ADN propio está modificado en
ciertas secuencias. Una enzima de modificación se desliza sobre la hebra de ADN,
y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce
un pequeño grupo químico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de
restricción, también se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia
GAATTC, corta el ADN en esa posición. La enzima, sin embargo, no corta el ADN
modificado, por lo que efectivamente es capaz de degradar el ADN extraño que
puede entrar a la célula, sin alterar el ADN propio.

Hoy en día se conoce miles de diferentes enzimas de restricción, provenientes de

otros tantos distintos microorganismos. Más de cien distintas secuencias
pequeñas de ADN pueden ser rotas, específicamente, por medio del uso de la
adecuada enzima de restricción. Otra interesante propiedad de las enzimas de
restricción es que, en general, reconocen secuencias palindrómicas, es decir;
secuencias que son iguales si se leen en una dirección, o en la dirección
contraria. Por ejemplo:
— 5´GAATTC3´—
— 3´CTTAAG5´—

Es una secuencia palindrómica. Cuando actúa la enzima que reconoce y corta

esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se
proyectan fuera de la doble cadena:
— 5´G AATTC3´—
— 3´CTTAA G5´—
Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse
o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por
un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por
la misma enzima. Los descubridores de las primeras enzimas de restricción
pronto se dieron cuenta de que su acción sobre el ADN (comúnmente llamada
"digestión") producía un conjunto definido de diferentes segmentos.
Súbitamente, el ADN dejó de ser una sustancia monótona y frágil, donde purificar
un segmento específico resultaba una tarea ardua o imposible. Al poder generar
segmentos específicos, con las enzimas de restricción, la molécula de la vida
quedó a merced del biólogo molecular y por lo tanto nos facilitó el camino para
manipular la secuencia del ADN, de cualquier especie. Este, entonces se convirtió
en la nueva herramienta de la Biología moderna y por lo tanto de la
BIOTECNOLOGÏA.

Figura 1. La separación de los ácidos nucleicos

Cuando se utiliza la electroforesis, es posible visualizar
la acción de las enzimas de restricción. Si se colocan
muestras que contienen ADN de diversos tamaños en los
pozos de un gel en forma de placa, y se aplica corriente
eléctrica, la diferencia de velocidad de migración de
estas moléculas las distribuirá, por separado, al cabo de
un tiempo, dentro del gel. Si después se agrega una
sustancia que se hace luminosa al interaccionar con el
ADN y bañarse con luz ultravioleta, directamente se
puede observar el patrón de distribución de las bandas
constituidas por las moléculas de diversos tamaños, por
medio del cual es factible deducir sus respectivas
dimensiones

Al usar diferentes enzimas de restricción, se generan

diferentes segmentos. Por ejemplo, si la secuencia
reconocida por la enzima Sall aparece en la molécula del
ejemplo una vez, cortaría el segmento en dos partes. Si la
secuencia reconocida por EcoRI, aparece dos veces,
generaría tres pedazos. Al usar las dos enzimas
simultáneamente, se producirían cuatro segmentos.

Fuente: Saberon Maneiro, Biología molecular y la nueva

Biotecnología, Mexico, Fondo de cultura, 1997

Lección 1: Tecnología del ADN recombinante.

Como se menciono anteriormente, los fragmentos generados por las enzimas de
restricción tienen además la propiedad de reasociarse unos con otros, por medio
de sus extremos cohesivos. La importancia de manipular este
procedimiento(también conocido como tecnología del ADN recombinante) es la
que nos permite en primer lugar evitar los múltiples mecanismo que restringen la
transferencia de genes entre organismos no relacionado y, en segundo lugar, que
se lleven a cabo manipulaciones precisas y sutiles aprovechando estas
características del proceso de recombinación Este procedimiento consite,
entonces, en cortar el ADN en fragmentos específicos utilizando enzimas
llamadas endonucleasas de restricción y ligar los fragmentos a un vector, es
 decir, una molécula de ADN que es capa de ser incorporada y replicada por la
célula hospedadora..
En resumen, los elementos esenciales de la técnica de ADN recombinante (véase
la figura 2): son los siguientes

1. Obtención de fragmentos específicos de ADN (enzimas de restricción).

2. Ligación (o reasociación covalente) de las moléculas para obtener hebras
continúas de ADN (enzima ligasa).
3. Mecanismo para introducir al interior de células vivas el ADN
recombinante (transformación).
4. Mecanismo para asegurar la replicación e identificación de la molécula
recombinante dentro de la célula (vehículo molecular).

El primer experimento en el que se puso en práctica este concepto, realmente

simple, que se conoce como clonación molecular se logró al utilizar plásmidos
bacterianos como vehículos y ADN, también bacteriano, como pasajero. (Fig.2)

El producto de la digestión del ADN con endonucleasas de restricción está constituido por muchos
fragmentos específicos, cuyos extremos son compatibles o cohesivos unos con otros. Estos
fragmentos se ligan después a un segmento especial de ADN, el vehículo de donación
(usualmente un plásmido), que fue cortado con la misma enzima. Las moléculas recombinantes
resultantes contienen un ADN vehículo o vector y un ADN pasajero, constituyendo una nueva
molécula circular continua.

Estas moléculas se introducen a células bacterianas y se seleccionan por medio de "genes

marcadores" presentes en el vehículo de donación. Dentro de su secuencia de ADN los vehículos
de donación contienen señales que inducen la replicación del ADN, y otras que producen,
típicamente, resistencia a algún antibiótico. Así, las células que reciben una molécula
recombinante la perpetúan en su interior, y se pueden detectar porque ésta confiere a la célula
la capacidad de sobrevivir en presencia del antibiótico.
Fig. 2. Los procedimientos básicos del ADN recombinante

Fuente: Raven, J. Biology, 2002

A. Corte y ligadura del ADN

Hasta el momento hemos mencionado a la ADN ligasa, una importante enzima

que permite ligar o unir moléculas de ADN. La investigación sobre la fisiología de
los ácidos nucleicos ha proporcionado, además, una serie de enzimas que se
utilizan ampliamente para manipular los ácidos nucleicos en el tubo de ensayo, y
que forman parte importante de las herramientas del ADN recombinante. Cada
una de estas enzimas, al igual que las endonucleasas de restricción, cumple un
papel dentro de la célula viva, para alterar el material genético (por ejemplo,
para repararlo, replicarlo, degradarlo, recombinarlo, etc.). en el laboratorio se
pueden usar estas enzimas, después de purificarlas de sus fuentes naturales,
para efectuar transformaciones útiles a los propósitos del experimentador. Por
ejemplo, la enzima transcriptasa reversa, que naturalmente producen ciertos
virus para invadir el genoma de sus células blanco, se utiliza ampliamente para
clonar genes a partir de sus ARN mensajeros
Dado que el propio desarrollo del ADN recombinante , ha potenciado, a su vez el
desarrollo de herramientas moleculares, hoy en día contamos con un enorme
número de enzimas y reactivos que permiten gran versatilidad en la
manipulacion del ADN.

B- SECUENCIACIÓN DEL ADN

Una consecuencia inmediata de la clonacion molecular es que permite disponer

de cantidades ilimitadas de cantidades especificos de ADN pasajero se encuentra
formando parte de un plásmido, es factible separarlo fácilmente del resto del
ADN celular, que se encuentra en el cromosoma bacteriano, una molécula mucho
más grande. A partir de un cultivo de E. coli, se puede separar suficiente ADN
plasmídico para caracterizarlo. Una vez que se dispuso de genes individuales
purificados, el escenario estaba listo para la siguiente etapa.
Walter Gilbert, en la Universidad de Harvard, y Frederic Sanger, en Cambridge,
Inglaterra, se dieron a la tarea de desarrollar técnicas para determinar la más
importante característica del ADN, su secuencia de bases. Pocos años después
lograron su objetivo, y compartieron el Premio Nobel de química en 1980. Las
técnicas de secuenciación actuales (véase el recuadro II.5) son usadas
abundantemente e, inclusive, han sido automatizadas. A la fecha, genes de las
más diversas fuentes han sido secuenciados, acumulando una base de datos que
representa cientos de millones de nucleótidos: Esta cantidad crece a paso
inexorable y se espera que lo haga cada vez más aceleradamente .
C. Vectores para el clonaje

Además de las enzimas que hacen posible la transformación y manipulación del

DNA, hay otro elemento indispensable para el trabajo del ingeniero genético: los
vectores. Los vectores no son más que los portadores del fragmento de DNA
que se quiere aislar o “clonar”.

Se usan tres tipos de vectores diferentes:

✔ Plásmidos
✔ Fagos
✔ Cósmidos

Plásmidos:

- Son moléculas de DNA circular de doble cadena extracromosomales

presentes en bacterias que son capaces de autoreplicarse.
Fueron descubiertos en bacterias, quienes además de sus cromosomas
principales de 4x 106 bp, poseen estos elementos de pequeño tamaño
(~103 bp). Ellos fueron descubiertos como elementos portadores de la
resistencia a antibióticos. El hecho de que estos genes de resistencia a
antibióticos fueran hallados en plásmidos no fue una casualidad ya que la
resistencia a antibióticos requiere de grandes cantidades de enzima que
neutralice quimicamente los antibióticos. Al estar presentes en un No. De
copias mayor que lo que estuvieran representados en el cromosoma
principal.
- En la naturaleza existen una amplia diversidad de estas moléculas. Ellos
especifican:
Resistencia a antibióticos
Resistencia a metales pesados
Sensibilidad a mutágenos
Sensibilidad o resistencia a fagos
Producción de enzimas de restricción
 Producción de aminoácidos raros
Catabolismo de sustancias complejas

La replicación de los plásmidos puede o no requerir de proteínas codificadas

por ellos y puede o no estar sincronizada con la del cromosoma bacteriano.

Ya en la década de los 70, en los primeros trabajos de Biología Molecular y de

I.G. se construyeron muchos plásmidos naturales para ser usados como
vectores

Todos los plásmidos que se usan como vectores poseen tres características
comunes:
1. Un sitio replicador
2. Un marcador de selección
3. Un sitio de clonaje (Polylinker o Multiple cloning site)

1. Sitio replicador:

El replicador es el segmento de DNA que contiene el sitio a partir del cual

se comienza a replicar el DNA usualmente llamado origen de replicación:
ORI. Este sitio incluye los genes que codifican para las proteínas y RNAs
que se requieren para la replicación.

El número de copias de un plásmido puede ser alto o bajo en

dependencia del control al que estén sometido los replicadores. Este
control puede ser de dos tipos: relajado o restringido

Control relajado: La replicación del plásmido no depende de las

proteínas sisntetizadas al comienzo del ciclo celular bacteriano: proteínas
de la iniciación de la replicación. Por tanto estos plásmidos se pueden
amplificar aun cuando se trate la cepa bacteriana con inhibidores de la
síntesis de proteínas (cloranfenicol). Produce un número de copias alto del
plásmido (>20 copias por célula en condiciones determinadas)

Control restringido: La replicación precisa de la síntesis de proteínas

inestables que participan en la iniciación de la replicación y por tanto está
sincronizada con el ciclo celular o sea con la replicación del cromosoma
bacteriano. Produce un bajo número de copias (<20 copias por célula)

2. Marcadores de Selección:

Los marcadores de selección más usados sobre todo en bacteria son genes
que codifican para la resistencia a determinados antibióticos. Los
antibióticos son sustancias químicas que producen la muerte de los
microrganismos pero son relativamente poco tóxicos a las células
eucarióticas.

Los vectores plasmídicos o de fagos portan genes para la resistencia a

estos antibióticos. Estos genes son normalmente dominantes y por lo
tanto las células que los contengan pueden ser identificadas por su
capacidad de crecer y formar colonias en presencia del antibiótico. Los
plásmidos que contienen tales genes le confieren a las células donde son
isertados la capacidad de vivir en presencia de tales sustancias.

Los antibióticos se añaden usualmente a medio sólido recien autoclaveado

antes que la temperatura haya disminuido por debajo de 50 oC. En casos
de emergencia se pueden añadir directamente a plcas ya preparadas,
dando tiempo para que el antibiótico pueda difundir (~60 min). Se deben
guerdar a 4 oC pues los antibióticos pierden potencia a RT. Algunos como
la Tet y la Rifampicina deben guardarse en la oscuridad pues son sensibles
a la luz

En levaduras se emplea la auxotrofia a determinados amoniácidos como

marcadores de selección.
 3. Sitio de Clonaje
Es una región donde un número diverso de enzimas de restricción tienen
sitios de reconocimiento y por tanto pueden insertarse el DNA foráneo sin
causar interferencias ni con la habilidad del plásmido de replicarse ni con
su capacidad de conferirle a la cepa hospedera la resistencia a
antibióticos. Usualmente se le conoce con el nombre de Multiple Cloning
Site o Polylinker

Lección 2: La Reacción en cadena de Polimerasa (PCR)

Otro de los avances metodológicos más importantes es la reacción en cadena de

polimerasa (PCR, siglas en ingles polymerase chain reaction). Este procedimiento
constituye un ejemplo sumamente interesante de la importancia de la
metodología en el desarrollo científico. También ilustra la manera como ocurren
muchos de los descubrimientos: a partir de intuiciones que integran
conocimientos que han estado disponibles durante cierto tiempo.

En efecto hacia 1985 —con el ADN recombinante ya plenamente establecido

como una técnica aplicada rutinariamente por cientos de laboratorios en el
mundo—, Kary Mullis, quien a la sazón trabajaba para la compañía Cetus, en San
Francisco, California, tuvo una súbita inspiración mientras manejaba su auto y se
dirigía hacia una cabaña en la que se disponía descansar el fin de semana. Como
muchos otros investigadores, Mullis se encontraba desarrollando aplicaciones
para los oligos sintéticos. Concibió entonces la idea de que combinando el uso de
los oligos con varios ciclos de replicación in vitro se podía amplificar, es decir;
obtener en gran cantidad, un segmento de ADN específico (por ejemplo, un gene
en particular).

En esencia la idea consiste en que la enzima ADN polimerasa participa en la

replicación del ADN (Ver fig. 3) . Para convertir una molécula de ADN de doble
cadena en dos moléculas idénticas, la enzima requiere que las cadenas de la
molécula inicial se separen, para así tener un molde disponible.
Además, la enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre, que sirve
para cebar o iniciar la reacción de replicación y los nucleótidos precursores. Si se
colocan estos sustratos en un tubo de ensayo, la ADN polimerasa puede
incorporar uno por uno los nucleótidos correspondientes, es decir, frente a una A
en el molde, adicionará T en la cadena creciente; frente a G, C, etc.

En realidad, éste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde mucho

antes de que se concibiera la técnica de la PCR. Lo original de la idea de la
concepción de Mullis fue pensar qué sucedería si se aplica este procedimiento en
ciclos sucesivos, en una reacción en cadena. Los oligos sintéticos, en virtud de su
propiedad de hibridación de los ácidos nucleicos, definen los puntos de partida
para el copiado de las cadenas de ADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia
define los extremos de un segmento determinado de ADN, se hacen hibridar con
las hebras del molde, previamente separadas, y se someten a una reacción con
ADN polimerasa, de lo que resultarán dos moléculas cuyos extremos están
definidos por los oligos y que corren en sentido opuesto. Las cadenas resultantes
son complementarias entre si: existen ahora el doble de moléculas con la
secuencia que demarcan los oligos. , por lo tanto sí el proceso se replica
cíclicamente entonces, la replicación del ADN, será exponencial. En el siguiente
ciclo de separación de cadenas, hibridación con los oligos y reacción con ADN
polimerasa, se obtendrán cuatro moléculas de la región entre los oligos. Los
ciclos subsiguientes generarán 8, 16, 32, 64 moléculas, y así sucesivamente.
(Fig. 3 )
 Fig. 3 : Replicación del ADN, utilizando (PCR)

Fuente: Raven, J. Biology, 2002

Así, con la técnica de la PCR se pueden amplificar segmentos específicos de ADN
para crear muchos millones de moléculas a partir de unas cuantas, o incluso de
una sola. Para esto se requirió adaptar el concepto básico haciendo uso de ADN
polimerasas provenientes de microorganismos termófilos (que crecen a
temperaturas de más de 70 grados en manantiales termales). De otra manera, la
enzima se inactivaba cada ciclo, pues se requiere aplicar calor para separar las
moléculas del ADN molde. Hoy día un ciclo puede tomar cinco minutos o menos,
por lo que el proceso de amplificación se lleva a cabo en menos de dos horas
(normalmente 20 o 30 ciclos son suficientes).
La aplicación de la PCR, en sí misma, constituye un avance revolucionario en la
investigación biológica moderna.

Capitulo 2: OTRAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGÍA

Lección 1: Mutagénesis

La tecnología del DNA recombinante ha abierto todo un nuevo campo de

mutagénesis. Mientras que los mutágenos convencionales actúan al azar,
mediante el uso de DNA sintético y las técnicas del DNA recombinante es posible
introducir mutaciones en sitos determinados con toda precisión en los genes.
Este proceso se denomina mutagénesis dirigida. Es de esperar que las proteínas
fabricadas a partir de cepas que cuyas mutaciones tengan propiedades diferentes
de las proteínas de las cepas silvestres, propiedades que pueden predecirse al
conocerse la estructura de la proteína. A continuación se esquematiza los
procedimientos básicos utilizados en esta técnica (Fig. 4)

MUTAGENESIS

Al Azar (Random) Dirigida

(Site-Specific)

Coloca mutaciones Mutaciones puntuales en

En cualquier sitios determinados
Sitio del ADN

1. Mutagénesis dirigida por

oligonucleotidos

2. Mutagénesis por casette

 Lección 2: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos

Consiste en sintetizar un corto oligodesoxirribonucleotido que contenga el

cambio de bases deseado y dejar que se hibride con un ADN monocanetario que
contenga el gen de interés.

Fif. 5 Mutagenensis dirigida, utilizando cortos fragmentos de

oligodesorribonuceótido

El procedimiento completo de
mutagenesis dirigida, ha sido modificado
continuamente, encaminadas a
incrementar la tasa de mutantes
obtenido, se debe empezar con el gen de
interés clonado en un ADN
monocaternario. Un vector ampliamente
utilizado para la mutagénesis dirigida es
el bacteriófago M13que tiene
propiedades utiles en la tecnología del
ADFN recombinante. El AFN diana se
clona en M13. Como las células
infectadas con este fago permanece viva,
se dispone de una fuente continua de
ADN

Esta tecnología puede utilizarse para

obtener un gen completo. Insertado en
la localización deseada. Aunque es difícil
sintetizar el gen de una sola pieza, se lo
puede obtener por partes y luego unirlo
para producir el gen completo.
Añadiendo sitios adecuados en los
extremos del gen, éste puede unirse
luego a un vector y ser clonado. Las
posibilidades de este método son
prácticamente ilimitadas.
Fuente: Brock, Biología de los microorganismos,1998

Lección 3: Mutagénesis en Casette o interrupción génica

Fig. 6. Interrupción de un gen

utilizando la mutación por casette: (a)
Un plasmado que contiene una copia
clonada del gen X del tipo silvestre se
corta con la enzima de restricción
EcoRi u se mezcla con un fragmento
de ADN (la casette dela kanamicina y
que se ha obtenido utilizando la
misma enzima de restricción. Se ligan
el plásmido cortado y la casete. (b) El
producto dela unión es un plásmido
que ahora contiene la casette de la
kanamicina como una mutación por
inserción dentro del gen X. (c) La
célula transformada contiene el
plásmido linearizado con un gen X
interrumpido y su propio cromosoma
con una copia del gen del tipo
silvestre.

CAPITULO 3: APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE:

Sin lugar a dudas, estas técnicas han revolucionado la forma obtener productos y
su comercialización, sin embargo existen todavía muchos inconvenientes de
costos y éticos que aun no se han resuelto. Una de las mayores controversias se
ha suscitado ha raíz de la obtención de animales y vegetales transgenicos con
fines terapéuticos y /o alimenticios.
Lección 4: Animales Transgénicos

Las investigaciones con sistemas de microinyección y cultivo de embriones, en la

actualidad, permiten introducir genes a varias especies en forma estable, entre
las que se encuentran entre otros animales como las ovejas.. A partir de las
ovejas se obtienen grandes cantidades de leche, rica en proteínas. En efecto, en
la medida que sabemos acerca de la expresión de los genes de la glándula
mamaria, podemos pensar en manipular este sistema para que se elaboren en
ella productos diferentes. Utilizando estos conceptos, ya existen los primeros
animales transgénicos que producen proteínas de interés médico.

La posibilidad de utilizar "granjas moleculares" en las que los animales producen

leche proteínas de altísimo valor y utilidad es realmente un triunfo mayúsculo de
la biotecnología moderna.( Fig7). Con gran seguridad, en pocos años los
enfermos con deficiencias de alguna de estas proteínas, por ejemplo los
hemofílicos, dispondrán de una fuente relativamente barata para conseguirlas.
Recientemente se anunció ya la obtención de vacas transgénicas.
Los animales transgénicos también pueden usarse para muchos otros propósitos.
Fig. 7 . Mejoramiento genético de bovinos

Fuente : Raven, J. Biology, 2002

Lección 5: Plantas transgénicas

Las posibilidades de beneficiarnos a través del mejoramiento genético de las

plantas ya existentes por medio del transplante de genes es enorme, puesto que
uno de los problemas que se han generado a partir del cultivo intensivo es el uso
exagerado de fertilizantes y pesticidas. Debido a esto, el desarrollo de
bioinsecticidas ha recibido importante atención en los últimos tiempos. En
particular, el microorganismo, Bacillus thuringiensis, que naturalmente produce
una proteína tóxica (toxina BT) para diversas especies de artrópodos (insectos y
arácnidos, por ejemplo). Estas bacterias pueden ser cultivadas y administradas a
los cultivos, y constituyen un insecticida biodegradable y seguro. El paso
siguiente consistió en introducir el gene que codifica para esta toxina a una
planta de tabaco (por supuesto fusionado a una región regulatoria que permitiera
su expresión en la planta, particularmente en las hojas). Las plantas transgénicas
resultantes son inmunes a las larvas de palomillas que normalmente merman
este cultivo. Al cabo de consumir un poco de la hoja, la larva se vuelve inactiva y
muere, envenenada por la toxina BT. Es importante resaltar que esta toxina es
completamente inocua para otros animales, incluido, desde luego, el ser humano.
Una característica muy interesante del reino de las plantas es que para vivir se
han adaptado a ambientes extremos, ya que no pueden huir de ellos. Así,
encontrarnos plantas capaces de vivir en condiciones de sequía, salinidad, etc.
También los vegetales han desarrollado funciones para defenderse de ser
ingeridas indiscriminadamente. Cada especie animal gusta sólo de ciertas plantas
y las puede comer sin enfermarse.( Por encima de todo esto, los seres humanos
tendemos a ser muy selectivos en nuestra alimentación. Algunos de nosotros sólo
compramos frijol "flor de mayo", sin importarnos si nos resulta un poco más
caro, o si sus propiedades alimenticias no son tan buenas como las de alguna
otra variedad. Así que no todas las características apreciadas se encuentran
juntas en la misma planta. Típicamente encontraremos que unas variedades son
sabrosas, otras son nutritivas, otras más, resistentes a las inclemencias del
clima, etcétera.)
La nueva biotecnología de plantas permitirá ir introduciendo, al principio uno por
uno, los genes que se vayan identificando como responsables de conferir ciertas
características atractivas a las variedades de plantas que son más útiles. (Fig. 7)
 Fig. 7 .Ejemplo de plantas genéticamente modificas

Fuente: Wisseman A, Principios de Biotecnología .1886

Lección 6: Alimentos genéticamente modificados

La demanda de alimento global ha aumentado la necesidad de cultivos

mejorados. la biotecnología ofrece la tecnología necesaria para producir
alimentos más nutritivos y de mejor sabor, rendimientos más altos de cosecha y
plantas que se protegen naturalmente contra enfermedades, insectos y
condiciones adversas.
Esto permite efectuar la selección de un rasgo genético específico de un
organismo e introducir ese rasgo en el código genético del organismo fuente del
alimento, por medio de técnicas de ingeniería genética. Esto ha hecho posible
que se desarrollen cultivos para alimentación con rasgos ventajosos específicos u
otros sin rasgos indeseables. Resumiendo, se puede decir que la biotecnología
tiene un amplísimo rango de aplicación en la industria alimenticia, ofreciendo los
medios para producir alimentos de mejor calidad en forma más eficiente y segura
para la salud y el medio ambiente. Una de las promesas de la biotecnología es
generar innovaciones y mejoras en los alimentos conduciendo a prácticas
agrícolas más ecológicas, contribuyendo a una agricultura sustentable que utiliza
con respecto los recursos del medioambiente.

El área de mayor aplicación de la biotecnología en alimentos y la más antigua,

corresponde a las fermentaciones, de gran importancia dentro de la tecnología de
alimentos y que abarca varios campos, como fermentaciones alcohólicas,
fermentaciones cárnicas y fermentaciones lácticas.

El área más reciente y de mayor proyección dentro de la biotecnología de

alimentos está en el desarrollo de alimentos genéticamente modificados o
transgénicos, cuyas principales ventajas se ven en mejoras nutricionales, mayor
productividad de cosechas y mayor protección medioambiental. Además,
alimentos gm poseen hoy en día gran importancia en las soluciones de graves
problemas de escasez de alimentos, desnutrición y problemas de salud pública en
general del mundo en vías de desarrollados

Actividad:
- Investigue un tipo de alimento gm que se este comercializando en Colombia
explique la técnica de ingenieria genética utilizada en la producción.
- Organice un foro con sus compañeros sobre las ventajas y desventajas de los
alimentos gm en la alimentación mundial, saque las conclusiones
correspondientes y preséntelas en un informe: Para ello tenga en cuenta:
definición, tipos de alimentos gm, técnicas que se utilizan, ventajas y
desventajas.
UNIDAD 3: PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS DE INTERES ALIMENTARIO

Los microorganismos han sido utilizados durante siglos para modificar los
alimentos, y tanto éstos como las bebidas fermentadas constituyen un sector
primario y extremadamente importante de la industria aumentaría. En este ca-
pitulo se describirán algunos procesos para la obtención de compuestos derivados
del metabolismo energético (fermentación), metabolismo intermedio y biosíntesis

Capitulo 1: APLICACIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA EN LA OBTENCIÓN DE

PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGÉTICO POR VÍA
FERMENTATIVA.

Lección 1: Bebidas alcohólicas

Las bebidas alcohólicas se producen a partir de diversas materias primas, pero
especialmente a partir de cereales, frutas y productos azucarados. Entre ellas
hay bebidas no destiladas, como la cerveza, el vino, la sidra y el sake, y
destiladas, como el whisky y el ron, que se obtienen a partir de cereales y mela-
zas fermentadas, respectivamente, en tanto que el brandy se obtiene por destila-
ción. del vino. Otras bebidas destiladas, por ejemplo el vodka y la ginebra, se
elaboran a partir de bebidas alcohólicas neutras obtenidas por destilación de
melazas, cereales, patatas o lactosuero Fermentados. Además también se obtie-
nen una gran variedad de vinos de alta graduación mediante adición de alcohol
destilado a los vinos normales con objeto de elevar su contenido alcohólico hasta
el 15 o el 20 %; entre éstos se incluyen productos tan notables como el jerez, el
aporto y el madeira.
Un detalle común importante en la producción de todas estas bebidas alcohólicas
es el empleo de levaduras para convenir los azúcares en etanol. Por consiguiente,
la primera parte de esta sección se concentrará en la biología de las
fermentaciones de levaduras y seguidamente se discutirán los procesos concretos
de obtención de la cerveza, el whisky y el vino.
Lección 2: Biología de las fermentaciones con levaduras
Aproximadamente el 96 % de la fermentación del etanol se lleva a cabo me-
diante cepas de Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas, particular-
mente S. uvarum. El etanol se produce en la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas
(EMP), en la que el piruvato producido durante la glicosilación se convierte en
acetaldehído y etanol. La reacción global es la siguiente:
Glucosa + 2ADP-2 Etanol + 2CO~ + 2ATP

El rendimiento teórico de 1 g de glucosa es de 0,51 g de etanol y 0,49 g de CO2.

Sin embargo, en la práctica, aproximadamente el 10 % de la glucosa se
transforma en biomasa y el rendimiento en etanol y CO2 alcanzan el 90 % del
valor teórico. El ATP formado se utiliza para las necesidades energéticas de la
célula.
La envoltura de la célula de levadura incluye una membrana plasmática, un
espacio periplásmico y una pared celular constituida principalmente por
polisacáridos y una pequeña cantidad de péptidos. La pared tiene una estructura
semirrígida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una considerable
fuerza compresional y tensil. Los grupos carboxilo de los péptidos de la pared
celular confieren a las levaduras utilizadas en la elaboración de cerveza una
capacidad de floculación importante, lo que facilita la separación sólido-líquido
después de la fermentación. Se cree que la floculación se debe a la formación de
puentes salinos entre los iones calcio y estos grupos carboxilo de la pared celular.

Lección 3: Condiciones de la
fermentación
En la fermentación las levaduras utilizadas para la elaboración de cerveza (S.
cerevisiae) utilizan los azúcares sacarosa, fructosa, maltosa y maltotriosa en este
orden. La sacarosa es hidrolizada primeramente por la invertasa localizada en el
espacio periplásmico extracelular. Los azúcares son transportados a través de la
membrana celular por transporte activo o pasivo mediado por permeasas
producidas constitutivamente o inducibles. La maltosa y la maltotriosa son
hidrolizadas intracelularmente por la α-glucosidasa, Saccharomyces uvarum (S.
car/sbergensis) se distingue taxonómicamente del S. cerevisiae en que también
Utiliza melibiosa. El Kluyveromyces fragilis y Kluyveromyces lactis, que a
diferencia de S: cerevisiae pueden fermentar la lactosa, tienen un sistema
lactosa-permeasa para transportar la lactosa dentro de la célula, donde se hi-
droliza a glucosa y galactosa, que entran en la glicólisis. Excepto los Saccha-
romyces diasraucus, que no son adecuadas para la elaboración de cerveza todas
las levaduras Saccharomyces son incapaces de hidrolizar el almidón y las
dextrinas, y por consiguiente, el empleo de materiales basados en almidón para
la fermentación alcohólica requieren la acción de enzimas exógenos como las α y
β-amilasas de la malta o enzimas microbianos como a-amilasa, amiloglucosidasa
(glucoamilasa) y pululanasa. Los azúcares mayoritarios del mosto son la glucosa
y la fructosa y puesto que el S. cerevisiae metaboliza preferencialmente la
glucosa; el azúcar no fermentado que permanece en el vino resultante es la
fructosa. Por el contrario, las levaduras del vino de Saurernes fermeman la fruc-
tosa más rápidamente que la glucosa.
El mosto de cerveza producido a partir de malta contiene 19 aminoácidos además
de otros nutrientes. Estos aminoácldos son asimilados a distintas velocidades
durante la fermentación. Un aminoácido permeasa general (GAP puede
transportar todos los aminoácidos básicos y neutros excepto la prolina. En las
levaduras existen al menos otros 11 sistemas de transpone de aminoácidos más
específicos. La prolín permeasa es inhibida por otros aminoácidos: por el
amoníaco.

Aunque !as fermentaciones alcohólicas son en gran medida anaeróbicas. las

levaduras necesitan algo de oxígeno para sinterizar algunos esteroles y ácidos
grasas insaturados componentes de la membrana. El mosto de la cerveza con-
tiene normalmente niveles subóptimos de esteroles y ácidos grasos insaturados.
pero cuando el medio se suplementa con ácido oleico u oleanoico, la necesidad
de oxígeno desaparece.

Muchas cepas de S. cerevisiae pueden producir concentraciones de etanol de

hasta el 12-14 Existe un cierto interés en el empleo de levaduras tolerantes de
cantidades elevadas de alcohol en los procesos de fabricación de cerveza con
gravedad elevada y la producción de alcohol para la destilación con vistas a
incrementar la productividad de la planta y disminuir los costos de destilación.
Existen cepas seleccionadas capaces de producir hasta un 18-20 % de alcohol,
aunque la velocidad de fermentación se ve fuertemente reducida cando la
concentración de etanol aumenta. Los mostos con un contenido muy elevado de
azúcares fermentan únicamente con levaduras osmofílicas como Saccharomyces
rouxii y S. bailli, que poseen una gran capacidad para fermentar la fructosa.

La composición en fosfolípidos de la membrana plasmática es importante para

la tolerancia del etanol, observándose un incremento de ésta cuando el
contenido de ácidos grasos insaturados aumenta. La tolerancia alcohólica
puede elevarse suplementando el medio de crecimiento con ácidos grasos
insaturados, vitaminas y proteínas. Los factores fisiológicos tales como la forma
de aporte del substrato, la acumulación de etanol intracelular, la presión
osmótica y la temperatura influyen en la tolerancia de las levaduras al etanol.
Los enzimas glicolíticos de las levaduras, hexoquinasa, gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa son sensibles a la concentración de
etanol. .

En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayoría de

las veces favorables al crecimiento y actividad fermentaría; esta última es
mayor cuanto mayor sea el pH y se produce una caída notable a valores de pH
de 3-4. El pH influye en la formación de subproductos; por ejemplo, a valores
de pH elevados se incrementa la formación de glicerol. El pH del mosto de uva
está generalmente comprendido entre 3 y 3,9 debido a su elevado contenido de
ácidos (5-15 g/I), principalmente tartárico y málico, de forma que, como la
mayoría de las bacterias, con excepción de las bacterias del ácido acético y
láctico prefieren pH más neutros, la susceptibilidad del mosto de vino a la
contaminación bacteriana es reducida.
Las temperaturas óptimas de la fermentación, la respiración de las levaduras y
el crecimiento celular son claramente diferentes. La velocidad de fermentación
aumenta. generalmente con la temperatura entre los 15 y los 35°C y los
niveles de glicerol, acetona, buteno-2,3-diol, acetaldehído, piruvato y 2-
cetoglutarato se elevan en los caldos de fermentación. La formación de niveles
elevados de alcohol también depende de la temperatura. En los vinos blancos,
la menor temperatura de fermentación da lugar a vinos más frescos y afru-
tados, y el riesgo de infección bacteriana y de producción de ácidos volátiles
como resultado es reducido. Para la producción de vino tinto se utilizan tempe-
raturas más elevadas, de 22 a 30oC, y la fermentación con los hollejos conduce
a la intensificación del color y a la producción de un rico aroma.
Lección 4: Compuestos organolépticos

En la producción de bebidas alcohólicas deben controlarse las fermentaciones de

forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se
conviertan en alcohol y en compuestos con aromas característicos y deseables, y
por otro lado, se minimice la formación de aromas y sabores indeseables. Entre
los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del
etanol, ésteres, compuestos carbónicos, ácidos orgánicos, compuestos azufrados,
aminas y fenoles.
Cuantitativamente, y en función de su papel en el aroma y sabor, los com-
ponentes más importantes presentes en las bebidas alcohólicas son los alcoholes
superiores, denominados también alcoholes de fusel o aceites de fusel, entre los
cuales los más significativos en la cerveza Y el vino son el alcohol amlilico, el
isoamílico y el 2-fenoetanol. El vino tinto tiene una concentración mayor de estos
compuestos que el vino blanco. Las bebidas destiladas tienen un espectro
bastante diferente de alcoholes superiores, que incluyen butanoles y pemanoles.
El glicerol, alcohol polihídrico, está presente en casi todas las bebidas alcohólicas.
En el vino, el glicerol se encuentra a concentraciones de hasta el 1 % (pe-
so/volumen) y confiere cuerpo a esta bebida.
En muchas bebidas y licores, los ésteres constituyen un grupo importante de
compuestos volátiles debido a su penetrante aroma afrutado. Entre ellos, el
acetato de etilo está presente en muchas bebidas a concentraciones
organolépticamente importantes. Otros ésteres importantes incluyen el formiato
de etilo y el acetato de isoamilo.
El acetaldehido, con propiedades organolépticas indeseables, se produce como un
compuesto intermedio durante las fermentaciones alcohólicas, obteniéndose
niveles altos por tasas de levaduras elevadas o excesiva aireación. El diacetilo y
la pentano-2,3-diona, formados fuera de las células de la levadura por
decarboxilación oxidativa del α-acetolato y el α-cetohidroxibmirato, tienen
aromas y sabores indeseables característicos. Las levaduras pueden reducir el
diacetilo y la pentano-2,3-diona. La presencia de exceso de diacetilo en la
cerveza se produce cuando el α-acetolactato aparece en una etapa en la que las
levaduras ya han sedimentado o han perdido su capacidad para reducir el
diacetilo a acetoína o el exceso de diacetilo en la cerveza también puede deberse
a fa presencia de organismos que la deterioran, como Pediococcus y
Lacrobacillus.

Durante la fermentación primaria del mosto de la cerveza se producen cantidades

considerables de SH2 provenientes de la reducción de los compuestos azufrados.
Aunque en la cerveza pueden ser aceptables cantidades pequeñas de compuestos
azufrados, y en la cerveza normal el SO2 está usualmente presente a
concentraciones por debajo de su umbral de sabor, el exceso produce aromas y
sabores. desagradables. El dióxido de azufre influye positivamente en la fer-
mentación alcohólica, puesto que se une al acetaldehido y además inhibe algunas
de las reacciones de oxidación indeseables. En el mosto del vino, el SO2 inhibe
algunos microorganismos indeseables, entre ellos las bacterias del ácido láctico y
ácido acético, así como algunas levaduras naturales que producen un exceso de
ácidos volátiles, piruvato y α-cetoglutarato. Además la producción del
desagradable sabor del ácido acético también inhibe las fermentaciones de
levaduras, particularmente combinado con el etanol, Saccharomyces cerevisiae
es más susceptible a esta inhibición que Saccharomycoides ludwigii,
Schizosaccharomyces pombe. En los mostos cuya acidez total es baja, es muy
útil emplear S02 para inhibir la fermentación malo-Iáctica por las bacterias del
ácido láctico, impidiendo la disminución posterior del nivel de ácido. Una
concentración elevada de S02 puede retrasar el comienzo de la fermentación.

El bajo pH del mosto y del vino suministran un medio selectivo para el cre-
cimiento de las bacterias del ácido acético y del ácido láctico, aunque la super-
vivencia de !as primeras sea usualmente corta debido a las propiedades reducto-
ras del medio. Las bacterias lácticas del vino son anaerobias facultativas u orga-
nismos microfílicos que son homofermentivos (todas las Pediococcus y algunos
Lactobacillus producen ácido láctico a partir de glucosa) y heterofermentivos
(todos los Leuconostoc y algunos Lactobacillus producen ácido láctico, etanol y
CO2 a partir de la glucosa). Las bacterias lácticas pueden metabolizar los ácidos
málico y tartárico presentes en el vino a concentraciones elevadas, así como al
ácido cítrico, presente en cantidades más bajas. Existen métodos químicos para
reducir la acidez. La reducción de los ácidos puede impedir el deterioro de los
vinos de pH elevado. A pH 3,3-3,4, los Leuconostocoenus fermentan el ácido
málico aunque los Pediococcus no lo hacen. Los Lellconosto se adaptan bien a los
pH bajos y generalmente se prefieren siempre que se desee una fermentación
malo-Iáctica. Una fermentación malo-láctica por Pediococcus va con frecuencia
acompañada de la formación de diacetilo e histamina, indeseables.

Lección 5: Alimentos basados en soja fermentada

Las fermentaciones de productos a base de saja y otras materias primas re-
lacionadas se llevan a cabo desde hace muchos siglos, especialmente en Oriente.
Entre las fermentaciones más importantes se encuentran los procesos de pro-
ducción de salsas de saja, misa y tempeh, ilustrados en la Figura 1
Aunque existen diversos tipos de salsas de soja, la producida predominante-
mente en Japón, denominada «koikuchi», se obtiene por fermentación de una
mezcla de saja y trigo, que da lugar a una salsa con fuerte aroma y color
marrón-rojizo oscuro. El proceso consiste inicialmente en una fermentación
primaria de una mezcla al 50 010 de saja cocida al vapor, empapada y trigo
tostado y triturado, con un nivel de humedad del 27 al 37 %, que se extiende en
bandejas y se incuba con Aspergillus oryzae, que tiene actividad amilolítica y
proteolítica elevada, durante 2 Ó 3 días a 25-30 oC. Después de adherirle agua
salada, para hacer que el contenido de sodio alcance el 18 %, la masa o
«moromi» se transfiere a tinas grandes donde se produce la fermentación
secundaria, con bacterias holofilicas y levaduras osmofilicas; el proceso tiene
lugar a una temperatura de 35-40 oC, con agitación intermitente, y el tiempo de
fermentación oscila entre 2 y 12 meses. Al finalizar esta fermentación
secundaria, se recupera la salsa líquida y se pasteriza. Los enzimas producidos
en la fermentación primaria o fermentación «koji» hidrolizan las proteínas a
péptidos y aminoácidos libres y convierten el almidón en azúcares simples. Estos
productos de ruptura son a su vez metabolizados por otros microorganismos,
produciendo diversos compuestos aromatizantes y saborizantes. Utilizando
inóculos de levaduras, bacterias y hongos puros el proceso de fermentación se
controla mejor y se obtiene un producto de calidad, aroma y sabor consistentes.
En Oriente, las pastas de soja fermentada se preparaban tradicionalmente en
casa para su utilización en sopas y salsas. En Japón, el producto, denominado
misa, se elabora en la actualidad a gran escala, mediante un proceso que implica
inicialmente la fermentación koji del arroz empapado al vapor (o cebada, o soja,
con menor frecuencia), que después se extiende en bandejas, se inocula con
o
cepas seleccionadas de A. oryzae y se incuba a 28-35 C durante apro-
ximadamente dos días. A continuación el material se mezcla en recipientes con
soja empapada y cocida al vapor en una relación 1:2, y se añade cloruro de sodio
para dar una concentración del 4 al 13 %, La mezcla se inocula con bacterias y
levaduras y se deja fermentar entre 1 y 52 semanas. Finalmente, el producto se
amasa y se pasteriza, pudiendo obtener distintos tipos de miso con diferentes
grados de dulzura, salinidad y color, variando la materia prima koji, el contenido
de sal, los edulcorantes y la duración de la fermentación.
La producción de tempeh se basa en una fermentación en bandejas de soja
remojada cocida al vapor inoculada con Rhizopus oligosporus, e incubada a 30-38
o
C durante 24 horas. El producto, que usualmente se corta en rebanadas, se sala
y se consume frito, tiene una vida corta.

Lección 6: Productos cárnicos fermentados

La mayoría de los productos cárnicos fermentados consisten en fiambres (secos o
semiseco), con una relación humedad-proteína que oscila entre 1,5 y 3 a 1. En
general, la etapa de fermentación microbiana tiene lugar a una temperatura
óptima, previa a la de calentamiento y/o secado.

La fermentación microbiana, que da lugar a la formación de ácido, ayuda al

procesado de muy distintas formas, puesto que contribuye a la estabilidad y
alarga la vida del producto, facilita la posterior eliminación de humedad y genera
aromas y sabores característicos. Generalmente se recomienda que el pH del
producto sea inferior a 5,3, basados en la creencia de que dicho valor sirve para
controlar los Staphylococcus aureus. El proceso de fermentación para reducir el
pH por debajo de 5,3 deberá ajustarse a las normas de seguridad tem-
peratura/tiempo especificadas, comprendidas entre 23,9 y 43 oC durante un pe-
ríodo de incubación de entre 80 y 18 horas. Con frecuencia se utilizan inóculos
comerciales, como los Pediococcus, que tienen una buena capacidad para pro-
ducir ácido láctico. Los Staphylococcus carnosus, especies inocuas coagulasa
negativas, se emplean de forma rutinaria en la producción de embutidos secos.
Los nitritos influyen positivamente en la conservación de la carne, puesto que
controlan el desarrollo de Clostridium botulinum. Las especies de Micrococcus
capaces de reducir los nitratos a nitritos, de forma controlada, contribuyen a la
curación de la carne así corno al control de los e boculinum. También pueden
utilizarse cultivos «startem en el procesado del bacon, con objeto de eliminar
cualquier nitrito residual presente, disminuyendo o anulando la formación de
nitrosaminas, carcinógenos, durante la fritura.
Se puede predecir que a partir del mayor empleo de los inóculos comerciales, los
procesos de fermentación de los productos cárnicos se caracterizarán por su
elevado nivel de control del proceso, lo que dará lugar a productos de calidad y
consistencia reproducibles y manteniendo siempre las mayores condiciones de
seguridad.

Lección 7: Vinagre

El vinagre es una solución acuosa de ácido acético, se obtiene mediante la

fermentación por oxidación de una solución diluida de etanol. El proceso
metabólico se basa en la conversión del etanol, bajo la acción del alcohol
deshidrogenasa, en acetaldehído y del acetaldehído hidratado en ácido acético
por la acción de la acetaldehído deshidrogenasa:

C2H5OHCH3CHO+H2OCH2CH OH2CH3COOH+H2O
La materia prima de la fermentación del vinagre de alcohol (white spirit) consiste
usualmente en etanol purificado diluido. Los vinagres de vino, sidra, malta y
arroz se obtienen por fermentación alcohólica de zumos de uva, manzana,
cebada malteada y arroz, respectivamente. La fermentación del vinagre requiere
también una fuente de nitrógeno y una combinación apropiada de minerales y
con frecuencia es necesaria la suplementación con nutrientes. Las modernas
fermentaciones de vinagre consisten en procesos sumergidos muy aireados. El
acetator Frings (Fig. 7.8), muy utilizado en la producción comercial de vinagre,
es un fermentador provisto de deflectores, cuyo fondo contiene una turbina de
cuerpo hueco que gira a 1.450-1.750 rpm, cuya rotación hace que el aire sea
succionado a través del rotar hueco y se distribuya radialmente a lo largo de toda
la sección trasversal del fermentador.
Los procesos comerciales típicos, que producen ácido acético del 12 al 15 OJo, se
llevan a cabo de forma semicontinua. Las concentraciones de alcohol y de ácido
acético al comienzo del ciclo son del 7-10 % y del 5 1110 respectivamente;
la fermentación se efectúa entre 27 y 32 °e hasta que la concentración de alcohol
desciende al 0,1-0,3 %, momento en el cual se descarga una parte del vinagre
(aproximadamente la tercera parte) y el recipiente se vuelve a llenar con una
mezcla que contiene del O al 2 % de ácido acético y del 12 al 15 % de etanol y el
ciclo se repite. Un alcalógrafo mide la concentración de etanol y hace que las
operaciones de descarga y llenado se puedan llevar a cabo automáticameme, sin
interrupción del proceso de aireación/mezclado de forma que impida el ago-
tamiento total del etanol en el caldo de fermentación. El mezclado rápido conti-
nuo es esencial para minimizar los gradientes de concentración. Los tiempos del
ciclo varían de 24 a 48 horas.

Las bacterias acidoacéticas, que oxidan el etanol a ácido acético y pueden existir
a valores bajos de pH, pertenecen a los géneros Acetobacter y Gluconobacter,
estrechamente relacionados. Los cultivos puros de estos organismos se
caracterizan por su alto grado de variabilidad y en las fermentaciones industriales
se pueden desarrollar posteriormente cultivos mezclados a partir de cultivos
puros. Los cultivos industriales se seleccionan en función de que toleren una
acidez elevada y de que las velocidades de producción de acetato sean altas.
Estas bacterias son extremadamente sensibles y se mueren en ausencia de
oxígeno y etanol y también resultan dañadas a gradientes de concentración de
etanol y acetato. La sensibilidad a la falta de oxígeno aumenta a medida que lo
hace la concentración total de ácido acético más etanol. No obstante, con una
aireación suficiente, puede conseguirse una utilización del 80 % de oxígeno sin
producir efectos adversos en la fermentación. La sobreoxidación, esto es la
conversión de ácido acético en CO2 y H20 puede impedirse manteniendo la
concentración de ácido acético por encima del 6 % e impidiendo el agotamiento
total del etanol.

Lección 8: Ácido Láctico

Aproximadamente la mitad de la demanda mundial de ácido láctico se obtiene
mediante fermentación. Sus principales usos industriales son como acidulante
alimentario (50 % del mercado), y para la manufactura de estearoil-2-lactilato
(20 %) así como en la industria farmacéutica y en otras aplicaciones.
El ácido L-( + )-láctico se obtiene por fermentación anaerobia con Lactobacillus
de/bruckii y cepas homofermentativas relacionadas. El medio contiene
aproximadamente un 15 % de sacarosa o dextrosa y nitrógeno en forma com-
pleja. El pH se controla en fa región de 5,0 a 6,5 mediante neutralización con
CaCO3 o Ca(OH)2. la temperatura se mantiene entre 45 y 60 °C y el tiempo de
fermentación es de 3 a 4 días. con lo que se obtiene un rendimiento en ácido
láctico del 90 al 95 %, basado en el contenido inicial de azúcar. El proceso de
fermentación se basa en la conversión de hexosa en piruvato por la ruta de
Embden-Meyerhof-Parnas y su conversión en L-( + )-lactato por el enzima L--
lactato deshidrogenasa

Lección 9: Acido Acético

El mercado mundial anual del acetato es de unos 2,5 millones de Tm. Desde
1950 los métodos sintéticos han proporcionado la mayor parte del suministro
mundial de ácido acético, pero, como el etileno es la principal materia prima
utilizada y su precio se ha incrementado de 6 centavos/Kg a 30 centavos/Kg
desde 1970 a 1980. han ido ganando en importancia distintas rutas de produc-
ción alternativas, incluyendo los métodos biológicos. Brasil produce ácido acético
por conversión química de etanol, obtenido únicamente a partir de biomasa.
También tienen aplicación potencial los métodos de fermentación para la
producción de acetato como materia prima química.
En el Capítulo 7 ya se ha descrito el proceso aerobio para la producción de
vinagre. En las fermentaciones acidogénicas anaerobias se producen una gran
variedad de ácidos grasas volátiles. El ácido acético constituye el componente
mayoritario de la mezcla, aunque también se producen cantidades significativas
de ácido propiónico y butírico. Los Clostridium butyricum producen una mezcla de
ácido acético y butírico a partir de glucosa. Los Clostridium thermocel/um y e
thermoaceticum fermentan la glucosa y la fructosa casi estequiométricamente a
acetato. En la acidogénesis, es imperativo suprimir los metanógenos, asociados
frecuentemente con los formadores de ácido en los cultivos mixtos, ya que
convertirían el ácido en metano y C02.
Aunque en el proceso aerobio pueden obtenerse concentraciones de acetato más
elevadas, el rendimiento teórico en el proceso de acidogénesis anaerobio es de
1.0 comparado con el 0,66 de aquel. Las dos moléculas de C02 producidas
durante la conversión de piruvato en acetil CoA se asimilan justificando la tercera
molécula de acetato formada a partir de glucosa (Fig. 8.5). Además, las
necesidades energéticas para el proceso anaerobio son menores y también es
menor el valor de los substratos, puesto que pueden emplearse desechos de
destilería y desechos de plantas de celulosa. En consecuencia., las
fermentaciones acetogénicas anaerobias pueden llegar a ser el método de
elección para la producción de acetato destinado a la industria química.

Capitulo 2: COMPUESTOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA PRODUCCIÓN

DEL METABOLISMO SECUNDARIO.

Lección 1: Producción de acido cítrico

El ácido cítrico, ampliamente distribuido en la naturaleza, se utiliza desde hace
tiempo en la manufactura de bebidas refrescantes como acidulante, como auxiliar
en la fabricación de mermeladas y como aditivo general en las industrias de
repostería. Inicialmente se extrajo del zumo de limón, posteriormente se
sintetizó a partir de glicerol y de otros compuestos químicos y finalmente, desde
1923, se obtiene por fermentación industrial. En 1933, la producción mundial
anual superó las 10.000 Tm, de las cuales, más del 80 % se obtuvieron por
fermentación. Con la substitución de los polifosfatos por el citrato de so dio en los
detergentes en 1970, el mercado anual creció rápidamente y actualmente se
estima que se producen exclusivamente por fermentación unas 300.000 Tm. Ini-
cialmente se utilizaron métodos de cultivo en superficie con Aspergillus niger;
después de la segunda guerra mundial se introdujeron procesos de cultivo su-
mergidos también con A. niger y aproximadamente en 1977 se comercializó un'
proceso de cultivo sumergido con levaduras del género Candida.

En la Tabla 1 se muestran las principales características de los procesos

industriales empleados en la producción de ácido cítrico. Actualmente aún se
utiliza ampliamente el cultivo en superficie con A. niger, puesto que, aunque es
un proceso que requiere más trabajo que el de cultivo sumergido, las necesi-
dades energéticas son menores. En los procesos sumergidos se prefieren fermen-
tadores agitados por aire, que permiten utilizar recipientes de mayor tamaño, ya
que este producto es de un volumen de producción alto entre los obtenidos por
fermentación. La materia prima más utilizada para la producción de citratos son
las melasas, cuyo mayor problema consiste en la gran variabilidad del material.
En las fermentaciones sumergidas con A. niger las concentraciones elevadas de
azúcar estimulan la producción de citrato obteniéndose rendimientos bajos
cuando la concentración de azúcar es inferior a 140 kg m - 3. En general, se
- l
suministra nitrógeno a una concentración de 0,1-0,4 g 1 . La adición de NH4-
durante la fermentación aumenta la producción de citrato.

Tabla N 1 ..Características de la producción industrial de Acido cítrico

Fuente: Crueger, Manual de Microbiología
industrial, 1989
La producción de ácido cítrico con A. niger es extremadamente sensible a la
concentración de iones Mn2+, de forma que su producción se \'e ya drástica-
mente reducida a un nivel de manganeso del orden de 3 mg 1- 1. Por tanto, es
necesario pretratar las molasas con agentes que acomplejen o precipiten este
metal. por ejemplo con hexacianoferrato (HCF) o con cobre, que contrarresta el
efecto del manganeso al inhibir su absorción por las células. Las condiciones
deficientes en manganeso también favorecen la producción de pequeños gránu
los micelianos con superficies lisas y compactas, característicos de las buenas
fermemaciones fúngicas de citrato. Cuando la concentración de manganeso
aumenta, la morfología fúngica se vuelve fijamentosa, incrementando drástica-
mente la viscosidad del cultivo y disminuyendo rápidamente de forma conco-
mitante la tensión del oxígeno disuelto. Como la producción de ácido cítrico
necesita oxígeno, la velocidad de producción de ácido aumenta a medida que
aumenta la cantidad de oxígeno disuelto. Además, una corta interrupción del
suministro d~ oxígeno puede conducir al cese irreversible de la producción de
citrato. Para la biosíntesis de citrato es esencial mantener el pH por debajo de
2.0, puesto que a pH superiores, el A. niger acumula ácido glucónico en vez de
citrato.
La producción de citrato con Candida guíllermondi difiere en varios aspectos del
proceso sumergido con A. niger. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no es
un prerrequisito, siendo innecesaria una etapa de pre tratamiento para eliminar
este metal del medio; el citrato se produce a un pH superior (3,5-5,0). Además,
la limitación de nitrógeno provoca la acumulación de ácido. La principal ventaja
del proceso que emplea Candida respecto al que emplea A. niger consiste en que
la productividad global de la fermentación es superior, ya que se pueden utilizar
concentraciones de azúcar más altas debido a la naturaleza más osmotolerante
de los organismos y además la fermentación es más rápida.

- Bioquímica de la producción de citrato con A. niger

El proceso metabólico que conduce a la acumulación de citrato implica (a) la

descomposición de las hexosas a piruvato y acetil CoA, (b) la formación ana-
plerótica de oxalacetato a partir de piruvato y CO2 y (c) la acumulación de citrato
dentro del ciclo del ácido tricarboxliico. En este esquema no debería eliminarse
CO2 durante la producción de cítrato, puesto que el CO2 liberado en la
decarboxilación oxidativa del piruvato a acetil-CoA debería utilizarse en la
conversión de piruvato en oxalacetato. El enzima clave que cataliza esta reac-
ción, la piruvato carboxilasa, lo producen intrínsecamente las especies Aspergi-
Ilus. Las concentraciones elevadas de azúcar aumentan además la actividad de
este enzima así como la de los enzimas glicoliticas y pueden inhibir algunos de
los enzimas del ciclo del ácido tricarboxilico. Para que se acumule citrato es
necesario que al menos uno de las enzimas de este ciclo resulte inhibido. Las
evidencias recientes sugieren que la principal etapa reguladora es la de la ex-
cetoglutarato deshidrogenasa, etapa limitante de la velocidad en el ciclo y la
única reacción irreversible. Este enzima se inhibe al incrementar las
concentraciones fisiólogicas de oxalacetato y NADH durante la producción de
citrato. La fosfofructoquinasa es inhibida por el citrato, aunque esta inhibición
puede contrarrestarse con concentraciones intracelulares elevadas de NH4+
La deficiencia de manganeso reduce la actividad de algunos de los enzimas de la
ruta de la pentosa fosfato (que podrían desviar las hexosas de la glicolisis y la
producción de citrato) y también inhibe el ciclo del ácido tricarboxilico, y además
perjudica el metabolismo anabólico en general, incluyendo el recambio de las
proteínas y los ácidos nucleicos. Durante estas deficiencias, se forma una
proteasa ácida y la reserva intracelular de ácidos nucleicos y proteínas disminuye
con la producción concomitante de péptidos, aminoácidos y niveles elevados de
NH4+. Por tanto, en conclusión, el principal efecto de la deficiencia de manganeso
es su impacto en el recambio proteico, haciendo que la concentración de iones
amonio se incremente en tanto que contrarreste la inhibición de la
fosfofnlctoquinasa por el citrato.
Para la reoxidación metabólica del NADH durante la producción de ácido cítrico se
necesita oxígeno. Durante la acumulación de citrato, un sistema respiratorio
alternativo sensible al ácido salicilhidroxámico (SHAM), mantiene el sistema
respiratorio con la reoxidación del NADH, aunque sin producción concomitante de
ATP (Fig.2). El hecho de que la acumulación de ácido cítrico esté fuertemente
inhibida por el SHAM indica la importancia de este sistema. La respiración
sensible al SHAM depende de una tensión elevada de oxígeno y el sistema se
inactiva por una corta interrupción de la aireación.
La producción de ácido glucónico con A. niger está catalizada por una glucosa
oxidasa extracelular, parcialmente unida al micelio, que se inactiva a pH
inferiores a 2,0. A pH superiores, se produce ácido glucónico a partir de glucosa
mediante la acción de A. niger. La glucosa induce este enzima a pH superiores a
4,0, lo que hace necesario mantener en las fermentaciones para la producción de
citrato un pH inferior a 2,0.

En resumen, la producción de citrato por A. niger se caracteriza por:

• Una actividad elevada de los enzimas glicolíticos y de la piruvato carbo-
xilasa inducida por los carbohidratos que conducen a la síntesis de citrato.
• La inhibición de un enzima del ciclo del ácido tricarboxílico que podría
causar la descomposición del citrato.
• La producción mediada por una deficiencia de manganeso de una con-
centración elevada de NH: intracelular que contrarresta la inhibición de
la fosfofructoquinasa por el citrato.
• Una tensión de oxígeno elevada y el suministro continuo de oxígeno para
mantener activa la respiración sensible al SHAM para la reoxidación del
NADH.
• Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.

Capitulo 3: PRODUCTOS DERIVADOS DEL

METABOLISMO SINTETICO

A través de procesos derivados de la fermentación es posible obtener un numero

amplio de compuestos orgánicos derivados del anabolismo entre estos se destacan los
Biopolímeros que son aplicados en diferentes campos de la actividad humana por
ejemplo: proteína unicelular, enzimas, dextrano, pululano y polihidroxialcanoatos
entre otros.
Para fines prácticos en esta lección nos centraremos en los polisacáridos y en
polihidroxialcanoatos (PHAs).
Lección 1: Polisacáridos Microbianos y PHAs

Tradicionalmente, los polisacáridos industriales se obtenían a partir de plantas y

algas marinas. Los polisacáricos microbianos son una alternativa viable para
substituir algunos de los productos derivados de las plantas o de las algas pero
también para utilizar las en un amplio rango de nuevas aplicaciones industriales.
La ingeniería genética de algunos de estos organismos productores y/o la
regulación de las condiciones medioambientales en las que se lleva a cabo la
fermentación brindan la posibilidad de manipulación de las propiedades y ca-
racterísticas del producto, ampliando por tanto la diversidad de biopolímeros
disponibles.

La goma xantano es el único polisacárido microbiano obtenido por la fer-

mentación que representa una parte significativa del mercado mundial. Su uni-
dad repetitiva básica consiste en un pentasacárido que contiene glucosa, mano-
sa, ácido glucurónico, acetato y piruvato. Esta goma tiene una viscosidad elevada
a concentraciones bajas, que es estable en un amplio rango de pH y es inde-
pendiente de la temperatura y de la presencia de cationes. En solución acuosa y
combinada con polisacáridos de las plantas forma geles estables, por lo que se
utiliza como estabilizante de suspensiones y para controlar la viscosidad. Debido
a sus propiedades pseudoplásticas, combinadas con su estabilidad frente a la
temperatura ya los cationes, se emplea como lubricante. También se utiliza junto
con surfactantes e hidrocarburos para mejorar la recuperación de aceites.

Los alginatos se obtienen a partir de algas marinas, aunque como esta fuente
está sujeta a una gran variabilidad, se ha considerado interesante a nivel in-
dustrial el substituirlos por polisacáridos similares obtenidos por fermentación,
por ejemplo el polisacárido de Azotobacter vinelandii. Entre otros polisacáridos
microbianos de interés comercial se incluyen el pululano, producido por
Aureobasidium pullulans, el seleroglucano, producido por especies de Selerotium
y el gelano, producido por Pseudomonas elodea.
Los procesos destinados a la producción de exopolisacáridos microbianos se
caracterizan por la elevada viscosidad del medio de fermentación. Las bajas
concentraciones de producto obtenidas y los cambios conformacionales del
polímero ocurridos durante la fermentación. El control de los constituyentes del
medio así como de otros parárnetros de la fermentación es crítico para conseguir
las velocidades de síntesis deseadas. Los estudios limitados realizados indican
que la modificación del exopolisacárido mediante manipulación del medio de
cultivo parece influir en el grado de polimerización más que en la estructura real
y en la composición de la unidad repetitiva.

En el caso de la producción de goma xantano, el contenido de piruvato como

substitúyete se puede hacer variar del O al 75 % mediante una selección
adecuada de la cepa y el medio, lo que puede influir en las propiedades reológi-
cas del polímero, cuando la concentración del polímero cambia o cuando se al-
teran la fuerza iónica o la temperatura del medio. Algunos medios de crecimiento
para la producción de xantano dan lugar a la formación de mutantes 'que no
producen polisacáridos, aunque esto puede evitarse mediante una elección ade-
cuada del medio limitando la cantidad de nutriente para el crecimiento. En ge-
neral, en la producción de polisacáridos microbianos cargados debe controlarse el
pH; por ejemplo, el pH óptimo para la producción de xantano es de 7.0 cesando
el crecimiento y la formación de producto a un pH de 5,5. A lo largo de la
fermentación, las propiedades del caldo cambian, pasando de ser un fluido
newtoniano con viscosidad baja a ser un fluido no newtoniano con viscosidad
alta, a medida que la concentración de exopolisacárido aumenta. Estos cambios
influyen profundamente en el mezclado yen la transferencia de masa y calor en
la fermentación, por lo que el diseño y las condiciones de operación del
fermentador deben optimizarse ajustándose a estas condiciones reológicas. La
concentración final de xantano en los caldos de los fermentadores es de unos 50
-1
g. 1 Y los rendimientos, basados en la glucosa consumida, son del 50 al 60 %.
La mayoría de las síntesis de exopolisacáridos bacterianos se producen
intracelularmente, mediante la vía de los azúcares, activados con un nucleótido.
Los azúcares se transfieren desde el nucleótido a un lípido transportador, acti-
vado por transferencia inicial de un azúcar fosfato, dando lugar a la formación
de la unidad repetitiva de azúcar. El método exacto de elongación de la cadena
y de extensión del polisacárido es desconocido.

POLI –β- HIDROXIBUTIRATO (PHB)

La principal aplicación potencial del poli-β-hidroxibutirato (PHB) es como
substituto de los plásticos en casos en los que sus propiedades de biodegradabi-
lidad representan una ventaja. La capacidad de las bacterias para reoxidar el
NADH llega a ser limitante a concentraciones bajas de oxígeno, y entonces la re
oxidación da lugar a productos como el PHB, el etanol o el butano!. De esta
forma el PHB es acumulado como material de reserva por una amplia variedad de
bacterias entre ellas Alcaligenes eutrophus, que puede llegar a almacenar el 70-
80 % de su biomasa como PHB.

En el PHB la unidad repetitiva o monómero, el β-hidroxibutirato, se sintetiza a

partir de dos unidades de acetil CoA; el peso molecular ideal del polímero oscila
entre 200.000 y 300.000. La síntesis de PHB, además de estar influida por la
concentración de oxígeno, se ve favorecida por la limitación del nitrógeno o el
fósforo. El proceso de fermentación para la producción comercial de PHB debería
consistir probablemente en dos etapas, una de crecimiento, sin limitación de
oxígeno o substrato, que acumule concentraciones altas de biomasa, y otra de
formación de producto en condiciones óptimas de limitación de nutrientes o
Aunque la glucosa es Utilizada comúnmente como substrato por los A. eutrophus,
comercialmente sería deseable la posibilidad de Utilizar substratos más baratos
que redujesen de forma significativa los costos de producción.

Lección 2: Alimentos funcionales: El concepto de alimento funcional se

emplea para describir a aquellos alimentos adicionados con ingredientes de
diversas clases y orígenes que pueden ejercer efectos beneficiosos sobre quien
los ingiere. Este concepto surgido en Japón ha ido popularizándose y
expandiéndose hacia otros continentes como Europa fundamentalmente debido a
la preocupación sobre la nutrición, la dieta y la salud de la sociedad actual. Los
probióticos representan una gran área dentro de los alimentos funcionales y se
ha intensificado la investigación para desarrollar productos probióticos y
profundizar en el conocimiento de los efectos sobre la salud humana. Los
probióticos se definen como "suplementos alimentarios microbianos vivos que
afectan de forma ventajosa al animal huésped mejorando su equilibrio intestinal
microbiano". Son microorganismos que estimulan las funciones protectoras del
tracto digestivo, y también son conocidos como bioterapéuticos, bioprotectores o
bioprofilácticos, ya que se utilizan para prevenir las infecciones entéricas y
gastrointestinales. Un microorganismo probiótico efectivo debe poseer una serie
de características: no ha de ser no patógeno ni tóxico, debe ejercer efectos
beneficiosos sobre la salud de quien lo ingiere, tener origen humano, ha de ser
tecnológicamente utilizable, ha de presentar un elevado porcentaje de células
viables, debe ser capaz de sobrevivir a la flora intestinal, ha de permanecer
viable durante su almacenamiento en refrigeración, y tener capacidad de
adherirse a la superficie mucosa, etc. El establecimiento de criterios de selección
y controles de calidad para productos probióticos se considera una prioridad
debido a la rápida incorporación de estos productos en el mercado y su
distribución en el ámbito internacional sin la existencia previa de una normativa
comúnmente aceptada. En los últimos años ha aumentado el interés por los
productos elaborados con microorganismos probióticos, pertenecientes a los
géneros Lactobacillus y Bifidobac

La palabra Probiótico es de origen griego y significa "a favor de la vida” este

término se utiliza para bacterias benéficas que viven en el cuerpo de los animales
o del hombre trabajando en simbiosis con el hospedero. Entre las bacterias que
presentan esta característica se puede mencionar a Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum,
Bifidobacterium infantis

Este tipo de microorganismos se consideran como la primera línea de defensa de

nuestro cuerpo contra los microorganismos potencialmente patógenos que se
inhalan o ingieren. Estas bacterias están presentes en la piel, la boca, el sistema
digestivo y la mucosa vaginal, donde realizan numerosas e indispensables
funciones para proteger al cuerpo y los órganos contra las bacterias patógenas.

Entre los mecanismos por los cuales actúan estas bacterias se pueden
mencionar: primero, la transformación de la lactosa en ácido láctico, este último
compuesto funciona como un antiséptico del sistema digestivo, segundo, el ácido
láctico facilita la absorción del calcio y fósforo contenido en la leche, tercero, el
aumento de la población bacteriana benéfica suministrada en alimentos,
incrementa la producción de vitamina B6 potenciando y fortaleciendo el sistema
inmunológico. Cuarto, Al mismo tiempo minimizan la proliferación de agentes
patógenos peligrosos responsables de graves enfermedades seguidas de muerte
compitiendo por alojamiento o espacio físico en las paredes intestinales. Quinto,
los microorganismos prebióticos pueden sintetizar bacteriocinas, las cuales son
sustancias que inhiben el crecimiento de bacterias patógenas.

Un producto para que sea considerado como probiótico debe reunir las siguientes
características:

1. Contienen microorganismos vivos que pueden estar refrigeradas ó en

estado fresco ó en productos fermentados, pueden estar en alimentos,
capsulas o píldoras)

2. Mejoran la salud y el bienenestar de animales y humanos (Contribuyen al

crecimiento de los animales)

3. Pueden afectar todas las superficies mucosas del hospedero incluyendo la

boca y el tracto gastro intestinal, el tracto respiratorio superior o el tracto
urogenital

A los alimentos que contienen estos microorganismos se los denomina como

“alimentos funcionales”. Los cuales tienen una amplia aceptación en la población
de los países desarrollados, lo que ha generado una contribución significativa a la
expansión de estos productos en el mercado.

El termino “alimento funcional” se origina el la década de los 80s en el Japón,

donde los alimentos se suplementaban con otros ingredientes que beneficiaban la
salud del consumidor. Las definiciones de alimento funcional varían
considerablemente a lo largo de los años debido al gran desarrollo de este sector,
los ingredientes de los alimentos funcionales incluyen los probióticos, prebióticos,
vitaminas, y minerales.
Los prebioticos son ingredientes no digeribles que afectan benéficamente al
hospedero estimulando selectivamente a un número limitado de bacterias del
colon promoviendo el crecimiento, la actividad o los dos aspectos en estas
poblaciones microbianas. Los dos prebióticos más estudiados son los fructo-
oligosacáridos o FOS conocidos como oligofructosa e inulina. Otras de las
sustancias más comercializadas están:

- Fructooligosacáridos-Suntory(Japón),
Isomaltooligosacárido, ShowaSangyo(Japón)
- Oligomate(galactooligosacáridos) -
Yakult(Japón)
- Palatinosa-Südzucker(Alemania)
- polidextrosa
.

Son carbohidratos presentes en vegetales como ajo, cebolla, puerros, espárrago,

alcachofas, tomates, plátanos, entre otros.

Actividades:

1. Investiga los procesos de producción de cerveza y vino. Realice comparaciones

relacionadas con: Tipo de Microorganismos utilizados, Substratos y Procesos.
2. Elabore un mapa conceptual que permita visualizar las diferentes aplicaciones
de la Biotecnología en la industria alimenticia.
3. Consulte un proceso Biotecnológico a partir de un artículo o texto científico y a
partir de este: Describa el producto, aplicaciones y utilidades
B. Describa las características, físicas Y/o químicas y o Biológicas
C. Seleccione los microorganismos o agentes biológicos que se utilizan para la
producción, explique las condiciones de mantenimiento o cultivo.
D. Identifique y explique el fundamento tecnológico (Fermentaciones, Ing.
genética, Caracterización del producto, In. enzimático,) utilizado para la
producción, para ello realice un diagrama de flujo identificando cada una de las
partes e investigue las ventajas de este procedimiento frente a otros.
BIBLIOGRAFIA BASICA

1. Ayala Francisco. Evolución molecular, Edición Omega, Barcelona 1980

2. Burges A. Biología del suelo. Edición Omega S.A. Barcelona 1971
3. Camacho Rubio y otros, Hidrolizados enzimáticos de interés en la
I.A.A.(II) Hidrolizados enzimáticos de proteínas. Alimentos, Equipos y
Tecnología. XI.10.1992

4. Cruger y Cruger. Biotecnología: Manual de Microbiología Industrial.

Editorial Acribia S.A. Zaragoza, España. 1989

5. Galindo Fentanes, E. Selección y diseño de fermentadores a varias

escalas. Departamento de Bioingeniería. Instituto de Biotecnología. UNAM.
Cuernavaca México 1995

6. Madigan y otros. Biología de los Microorganismos, Brook. Prentice Hall

Internacional. España 1997

7. Martines Jorge, Microbiología Industrial. Una experiencia Cubana.

Editorial: El pueblo. Universidad de la Habana. 1997

8. Montoya Dolly- Las fermentaciones como soporte de los procesos

biotecnológicos. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, D.C. 1989

9. Owen P Word. Biotecnología de la Fermentación. Editorial Acribia.

Zaragoza 1979

10. Scriban Rene. Biotecnología. UNAM. Editorial Manual Moderno.

Mexico D.F. 1985
ANEXO : PRACTICAS DE LABORATORIO

PRACTICA 1. Aislamiento de levaduras silvestres a partir de sustratos

fermentados

Las levaduras son microorganismos unicelulares, que se reproducen

asexualmente por gemación en la mayoría de los casos, aunque también lo hacen
por fisión sexualmente por formación de esporas, estas al multiplicarse con
facilidad en la naturaleza , su aislamiento requiere de tiempo ya que las
diferentes especies de levaduras se encuentran entremezcladas , de modo que
integran comunidades mixtas.
Por esta razón, para poder estudiar un tipo de levadura, especifico es necesario
producir un cultivo puro, es decir, un cultivo en el que solo haya una especie, en
el laboratorio es posible cultivar levaduras en un medio agar (sustancia
solidificante que se extrae de algas marinas ) enriquecido con nutrientes
apropiados. Ese medio puede se vertido en un tuvo de ensayo o caja petri (un
recipiente plano de vidrio o plástico cubierto con una tapa), cuando el medio de
agar esta caliente su estado es liquido pero conforme se enfría va gelificandose
hasta que se convierta en un materia sólido. En ese medio sólido, las levaduras
no pueden moverse ni muy lejos ni muy rápido.

Materiales:
Cajas petri con Agar saboreau 20
Asas de argolla 20)

Caldo de fermentación
Sacarosa 20 g
Extracto de levadura 5g
K2HPO4 1g
Bisulfito de Sodio 150 ppm,
H2O d 1000 ml

Reactivos: Solución de orto-toluidina:

Acido acético concentrado 940ml
Tiourea 1.5g
Orto-toloudina pura 60ml

Patrón de glucosa: (0,1%)

Glucosa 0.5g
Agua destilada 500ml

Equipos:
Espectofotometro uv-visible, balanza y baño maría, incubadora,

Procedimientos

Con asas de argolla colectar una muestra del sustrato fermentado (guarapo) y
sembrar por estría la cajas petri con Agar saboreau, incubar a 30 OC durante 48
horas Describir la morfología de las colonias (Color, forma, borde, apariencia,
elevación)
Y compararlas entre sí identificando por cada sustrato el tipo de colonia.
Seleccionar varias colonias del mismo morfotipo e inocularlo en 200ml del caldo
de fermentación. Incubar a temperatura ambiente por ocho días.

Caldo de fermentación (sacarosa 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, 1g /l de

K2H3PO4,
Bisulfito de Sodio 150ppm , Un litro de agua destilada)

Con una asa estéril tomar una muestra del sustrato fermentado y hacer siembra
por estría en cajas petri e incubar a 30° C durante 48 horas.

Lecturas: Evaluar al tiempo cero y a los ocho días, la concentración de azúcar por
el método de orto-toluidina (Ver anexo) con el fin de evaluar el consumo de
azúcar en los procesos de fermentación.

Compare entre todas las cepas cual es más eficiente en el consumo de azúcar.

PRACTICA 2. Determinación de la curva de crecimiento de organismos

unicelulares

Objetivos : ejercitación de la determinación de la curva de crecimiento de

organismos unicelulares ( bacterias y levaduras), determinando los parámetros
principales que la caracterizan.

El crecimiento microbiano está definido como el aumento armónico e irreversible

de masa y estructura. Esto puede estar acompañado o no de la división celular,
ya que ésta no es un obligatorio requerimiento.

En el cultivo de microorganismos en condiciones artificiales, es muy empleado el

cultivo Batch, discontínuo o en lote.

Generalmente se trata de un cultivo en medio líquido, aereado o estático y a

temperatura constante, y en el cual se parte de una pequeña población inicial o
inóculo. En este no se adiciona medio fresco ni se extrae material exhausto, por
lo cual todos los parámetros varían con el tiempo, es decir, es un proceso en
estado transiente. Bajo estas condiciones, si determinamos el comportamiento
de una población de organismos unicelulares en función del tiempo (log del # de
células o de viables o de absorbancia vs tiempo) podremos al menos observar
cuatro etapas o estadios fisiológicos conocidos en su conjunto como “curva de
crecimiento”.
Existen muchos métodos para la medición del crecimiento. Entre los mas
utilizados se encuentran: recuento total de células, conteo de viables, peso seco
y turbidimetría. Este último es el más empleado para organismos unicelulares
por la rapidez y facilidad con que se logran los resultados, midiendo la densidad
del cultivo a medida que este crece. Para ello se utilizan los fotocolorímetros o
espectrofotómetro.

El aspecto de la curva de crecimiento varía de acuerdo con las condiciones del

cultivo, el medio empleado y características del inóculo (“edad del cultivo” y
medio de donde proceda) entre otros aspectos.

Materiales

4 erlenmeyers con 100 ml de H2O destilada esteril

8 Tubos de ensayo con agar saboreau (inclinado), sembrado con Sacharomices
cereviceae (24 h)
8 erlenmeyers con 45 ml de Caldo de fermentación
30 Pipetas esteriles de 5 ml

Equipos:
Espectofotometro uv-visible, balanza y baño maría, incubadora,

Procedimiento.
Prepare una suspensión del microorganismo a cultivar por lavado de un tubo con
agar-saboreau de 24 h de incubación con 5 mL de agua destilada estéril.

Transfiera 5 mL de inóculo a frascos erlenmeyers de 250 mL con 45 mL del

medio de fermentación, e incube con agitación a 37 °C.

Tome asépticamente 1 mL de cultivo a las 0; 0,5; 1; 2 ; 4 ; 8 horas y lea la D.O.

a 600 nm en un espectrofotocolorímetro. Debe tener en cuenta que si la lectura
es mayor de 0,8 debe realizar diluciones con el medio de cultivo o agua destilada
estéril. La muestra debe desecharse en un frasco conteniendo fenol al 5 % y la
cubeta lavada con solución de fenol en cada medición. Emplee como blanco
medio sin inocular.

Realice una grafica con producción de biomasa en unidades de absorbancia vs

tiempo de incubación.

Calcule:
Biomasa (X) por gravimetría inicial y final
Azúcar inicial y final por orto-toluidina

Determine Tiempo de duplicación µ. , Yx/s

 2,3 (log X2 - log X1)
µ = -----------------------------
t2 - t 1

Cálculo del rendimiento biomasa-sustrato :

biomasa producida (g/L)

Yx/s = ---------------------------------
sustrato consumido (g/L)

PRACTICA 3. Estudio de fermentación en levaduras

Las levaduras son ricas en proteínas y en vitaminas, especialmente del complejo

B, de manera que constituyen un material valioso para ser incorporadas a los
alimentos balanceados para uso animal, como así también a productos
alimenticios de consumo humano y en la elaboración de extractos para caldos,
alimentos dietéticos, etc.. Existen numerosas cepas apta para este tipo de
producción como por ejemplo especies de los géneros Saccharomyces, Torulopsis
y Cándida.

La producción de levaduras es un proceso de importancia desde el punto de vista

tanto de los alimentos como económico. El siguiente trabajo práctico persigue el
propósito de que el alumno conozca el manejo microbiológico de las levaduras,
su manipulación y control, tanto como su rendimiento proyectable a escala
industrial.

Las condiciones físicas y químicas óptimas para la multiplicación celular son muy
distintas de las que favorecen la fermentación de los hidratos de carbono, por
ejemplo en la fermentación alcohólica. En efecto, para obtener una multiplicación
rápida y una alto rendimiento, la velocidad de disolución de oxígeno debe ser
superior a la velocidad de consumo del mismo y en cambio la concentración de
los nutrientes, especialmente los hidratos de carbono, debe ser baja sin llegar a
cero, con lo que evita la fermentación (alcohólica) de los hidratos de carbono,
fermentación que de ocurrir, disminuiría el rendimiento de células por gramo de
azúcar colocado.

Procedimiento

Cultive el microorganismo seleccionado (Saccharomyces cerevisiae) durante 8

horas en medio extracto de malta, con agitación constante preferiblemente.

Transfiera 10 ml de medio de cultivo a un erlenmeyer de 500 ml con 300 ml de

medio de cultivo a fermentar, previamente estéril (Sacarosa 20 g/L, extracto de
levadura 1 g/L, KH2PO4 1 g/L.
 O
Incube durante cinco días con temperatura y agitación constante (30 C y 100
r.p.m.).

Realice al menos dos lecturas por día, para lo cual colecte muestras por triplicado
para cada una de las mediciones:

1. Producción de Biomasa por el método de peso seco

2. Azucar residual por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico de Millar.

3. Etanol producido por el método de Widmark.

Calcule: Rendimientos: Yp/s y Yp/x

Determinación de etanol por el método de Widmark
Este método se basa en la oxidación estequimétrica del dicromato en medio ácido
por el alcohol a sulfato crómico de color verde.

a) Coloque 3 mL del reactivo de Widmark en un frasco de reacción (o placa de

microdifusión).

b) Coloque con sumo cuidado 0,5 mL de la muestra a analizar en la cucharilla del

frasco de reacción y cierre herméticamente.

c) Coloque el frasco a 80 oC durante 1,5 h, enfríe y colecte el líquido del frasco en

un a probeta de 10 mL, completando a 6 mL con agua destilada.
d) Mezcle bien y determine la absorbancia a 540 nm contra un blanco procesado
de igual forma pero sustituyendo la muestra por agua destilada.
e) Calcule la concentración de etanol en la muestra mediante la formula : D.O.
x k = % EtOH
f) k = cot de la recta de calibración.

Reactivo de Widmark : mezclar con cuidado 40 mL de ácido sulfúrico en 40 mL

de agua destilada y disolver 0,1 g de dicromato de potasio

Determinacion de azúcares.

Azúcares reductores (C.A.R.) por el método del 3,5-dinitrosalicílico.

Se basa en la reducción del 3,5-dinitrosalicílico a 3-amino,5-nitrosalicilato por la

acción de los reductores y el cambio de la solución de amarillo a
pardo. El método es sensible en un rango de 200 - 800 mg/ mL

a)Coloque 1 mL de la solución de muestra en un tubo de ensayos (15 x 150 mm)

y añada 2 mL del reactivo 3,5-DNS. (la muestra no requiere desproteinizarse,
pero si libre de partículas).

b) Mezcle bien y coloquelo en baño de agua hirviendo durante 5 minutos

exactos.
c) Enfrie, complete a 10 mL con agua destilada y lea la absorbancia a 540 nm
contra un blanco procesado de igual forma, pero sustituyendo la muestra por H2O
destilada.

Preparación del reactivo:

Disuelva 10 g de ácido 3,5-DNS en 200 mL de una solución de NaOH y
manténgala caliente. Separadamente se disuelven 300 g de tartrato de sodio y
potasio en 500 mL de agua destilada, añadiendo esta solución a la del 3,5-DNS
en baño de agua caliente. Complete a 1 L con agua destilada. Mantenga bien
cerrado en frasco ambar a temperatura ambiente
PRACTICA 4 : Estudio preferencial de azucares en levaduras

INTRODUCCION
Los microorganismos consumen diferentes tipos de sustratos, pero poseen
preferencia por un tipo particular de sustrato y algunos resultan no consumibles
para algunas cepas de una especie en particular.

Cuando dos o mas sustratos están presentes en el medio de cultivo, los

microorganismos no los consumen por igual, sino que consumen
preferencialmente uno de ellos hasta agotarlo. Solo en este punto inician el
consumo del siguiente sustrato preferido. Este fenómeno se conoce como
diauxia.

Esa preferencia por un sustrato en particular es diferente para cada una de las
cepas de un organismo, y puede ser medida como la variación en la velocidad de
crecimiento, consumo de sustrato o generación de producto.

En este ejercicio de laboratorio analizaras estadísticamente las diferencias

existentes en el consumo de diferentes tipos de azúcar por diferentes cepas
comerciales de levaduras.

EQUIPOS Y MATERIALES
8 x 2 g de levadura seca o húmeda de cerveza o de
panadería. Preferiblemente 3 grupos de laboratorio deben trabajar con el
mismo tipo de levadura.
200 cm3 de solución de fructosa 0.2M
200 cm3 de solución de galactosa 0.2M
200 cm3 de solución de glucosa 0.2M
200 cm3 de solución de lactosa 0.2M
200 cm3 de solución de maltosa 0.2M
200 cm3 de solución de rafinosa 0.2M
200 cm3 de solución de sucrosa 0.2M
8 x 0.5g de ortofosfato dihidrogeno de amonio
8 x 0.5g de sulfato de amonio
(Alternativamente puede emplearse 1g de nutriente de levadura disponible
comercialmente, para reemplazar las dos sales de amonio)
8 x 250 cm3 erlenmeyers
8 x tapones de caucho con dos orificios
Varillas de vidrios
Bureta de 50 cm3
Jeringas aforadas de 25 cm3 o equivalentes para
muestreo
8 x 100 cm3 erlenmeyers para titulación
Solución de hidróxido de sodio 0.1M (alrededor de
400cm3)
Solución indicadora de fenolftaleina y gotero.

METODOLOGIA
1. Debes desarrollar el laboratorio de la manera más aséptica posible. Sin
embargo para evitar problemas asociados a la contaminación vas a emplear un

1
inoculo de gran tamaño (2g de levadura por fermentador) y un periodo de
incubación corto (24 horas).

2. Puedes cualquier tipo de azúcar rápidamente fermentable como alternativa a

los aquí sugeridos.

3. Para preparar una solución de azúcar 0.2 M adiciona las siguientes cantidades
de azúcar y llévalo hasta 200 cm3.
Fructosa 7.2g Galactosa 7.2g
Glucosa 7.2g Lactosa 14.4g
Maltosa 14.4g Rafinosa 23.8g
Sucrosa 13.6g

4. Adiciona a cada uno de los fermentadores 0.5g de ortofosfato dihidrogeno de

amonio, NH4H2PO4 y 0.5g de sulfato de amonio, (NH4)2SO4. Resulta más fácil y
conveniente si prepararas una única solución de todos estos componentes al
doble de la concentración final y empleas esta solución para preparar las siete
diferentes soluciones de azúcar y el control. Paras este caso particular 4g de
NH4H2PO4 y 4g de (NH4)2SO4 en 800 cm3.

5. Aunque el fosfato de amonio mencionado es NH4H2PO4, es también posible

emplear fosfato di amonio, (NH4)2HPO4, el cual es uno de los compuestos de
amonio encontrado en el nutriente de levadura disponible comercialmente.

6. Las jeringas plásticas usadas deben ser colocadas en una solución

desinfectante y fracciones de la solución absorbidas dentro de la jeringa.

7. La mayoría de las actuales levaduras comerciales pueden generalmente

fermentar los mismos azucares pero existen diferencias en las velocidades a las
cuales se lleva a cabo la fermentación. Si quieres observar la especificidad
existente entre las levaduras y un carbohidrato en particular, requieres de
diferentes especies de levaduras, tales como:
Kluyveromyces lactis, capaz de fermentar lactosa y Saccharomyces diastaticus,
capaz de fermentar almidón.

8. Monitorea la fermentación midiendo biomasa, gravedad especifica, titulación

(NaOH 0.1M) y CO2 generado después de 24 horas. Para llevar a cabo la
titulación emplea alicuotas de los medios de cultivo de 25 cm3.

ESTADISTICAS Y ANALISIS DE DATOS

Analiza estadísticamente la capacidad de las levaduras para fermentar un tipo
particular de azúcar. Si durante el experimento empleas diferentes cepas de
levaduras analiza su capacidad para fermentar un tipo particular de azúcar. En
este ultimo caso puedes aplicar el test Mann-Whitney U. Puedes analizar las
relaciones entre los diferentes tipos de azucares y las cepas de levaduras
aplicando el test de apareamiento por pares Wilcoxon.

BIBLIOGRAFIA

1
Schollar, J. and Watmore, B. Practical Fermentation. Technical Guide. National
Centre for Biotechnology Education, The Society for General Microbiology,
London, 1999. page 7

PRACTICA 5 :TRANSFERENCIA GENETICA ENTRE BACTERIAS GRAM

NEGATIVAS

1) Conjugación

Uno de los mecanismos más comunes de diseminación de genes en la naturaleza

es la conjugación, un fenómeno mediante el cual una cepa portadora de un
plásmido, denominado conjugativo, es capaz de transferir una copia de éste a
una bacteria receptora casi siempre de la misma especie. No obstante, existen
los denominados plásmidos conjugativos promiscuos, esto es capaces de saltar la
barrera de especie y, en ciertos casos, la de género. Este mecanismo es el
causante primario de la difusión de genes de resistencia a antibióticos y, por
tanto, de la pérdida de efectividad de éstos observada durante los últimos años.

Superpuesto sobre la capacidad de transferencia interespecífica de plásmidos se

encuentra la movilización de los genes de resistencia a antibióticos promovida
por elementos genéticos denominados transposones. Un transposón es un
fragmento de DNA con capacidad para cambiar de localización dentro de la
misma molécula de DNA o entre moléculas distintas (ej: plásmido a cromosoma o
al revés) y que en muchas ocasiones es portador de genes de resistencia a
antibióticos, contribuyendo de esta forma a su diseminación.

Objetivos: Vamos a transferir un transposón que confiere resistencia a

Kanamicina desde una cepa de E.coli a una cepa de Salmonella typhimurium,
utilizando plásmidos derivados del conjugativo y promiscuo RP4. Como medidas
de seguridad, tanto las cepas donadoras y receptoras como los plásmidos que
vamos a emplear son derivados inocuos de las formas naturales obtenidos en el
laboratorio.

Material biológico:

Plásmido: se utilizará el plásmido pUT (5.2 kpb). Este plásmido contiene el origen
de replicación de R6K, que sólo funciona en cepas de E.coli que expresen la
proteína p desde un bacteriofago lisogénico l (lpir), y el origen de transferencia
del plásmido conjugativo RP4. El plásmido contiene también el gen de la
transposasa (tnp) y un gen de resistencia a Kanamicina entre los extremos I/O
de recombinación (transferible mediante la actividad transposasa). Como
elemento de selección del plásmido, también lleva un gen de resistencia a
Ampicilina (una b-lactamasa, bla). Para que sea transferido, este plásmido
requiere otras funciones propias de RP4, que solo se encuentran en la cepa E.
coli S17-1lpir. El mapa de restricción del plásmido se presenta a continuación:

1
Cepas de E.coli: se emplearán las cepas de E.coli CC118lpir y S17-1lpir
transformadas con el plásmido pUT. Sólo la cepa S17-1lpir posee la capacidad de
transferir el plásmido a otras cepas, pues contiene en el cromosoma genes de
RP4 necesarios para la conjugación. La cepa CC118lpir será empleada como
control negativo en la transferencia.

Cepa de Salmonella. Utilizaremos como receptor la cepa de S. typhimurium

LB5010-R2 (resistente a Estreptomicina y a Rifampicina). Esta cepa posee otras
características especiales: es restricción menos, permitiendo una mayor
frecuencia de transferencia, y carece de la proteína p, por lo que el plásmido pUT
no puede replicarse en ella.

Material no biológico: Placas de agar común.

Placas de selección: se empleará agar común con Rifampicina (80 mg/ml), y

Kanamicina (10 mg/ml).

Solución de lavado. Solución estéril de ClNa al 0.9 % (p/v).

Solución de conjugación : SO4Mg 10 mM (estéril).

Procedimiento:

1) Crecimiento de las cepas (lo harán los monitores): Se emplearán cultivos

de 24 horas crecidos en caldo común conteniendo, para las dos cepas de E.
coli Ampicilina (100 mg/ml) y Kanamicina (30 mg/ml), y para la cepa de
Salmonella, Rifampicina (80 mg/ml). Una vez crecidas, las células serán lavadas
por centrifugación y resuspendidas en 1/10 del volumen inicial de SO4Mg 10 mM.

2) Sobre una placa de agar común, depositar dos filtros estériles de nitrocelulosa
separados (actuarán de soporte sólido para la conjugación). Marcad en las placas
debajo de cada filtro CC118 y S17. Añadir 10 ml de la suspensión de Salmonella
en cada uno de ellos, dejar que absorba el líquido y añadir sobre uno de los
filtros 10 ml de la suspensión de E.coli CC118lpir, y sobre el otro 10 ml de la de
S17-1lpir. Incubar toda la noche a 37ºC.

3) Al día siguiente, tomar cada filtro con las pinzas (en condiciones de
esterilidad), introducirlo en sendos tubos estériles. Añadir 5 ml de SO4Mg 10 mM,
agitar intensamente y extender 100 ml en dos placas de selección (Rifampicina
80, Kanamicina 10). Dejar crecer a 37ºC durante toda la noche.

Resultados: Confirmar la aparición de colonias únicamente en la conjugación

entre E. coli S17-lpir y Salmonella. Contar las colonias. Explicar los resultados
obtenidos en el informe de laboratorio.

2) Transformación

La transformación es un proceso a través del cual el DNA es introducido dentro

de un microorganismo. En algunas bacterias la transformación es un proceso
natural e inducible que les permite la adquisición de manera activa de DNA
exógeno. En otros muchos la transformación puede producirse de forma artificial
mediante tratamientos químicos o físicos. En esta práctica vamos a proceder a

1
introducir plásmidos de clonaje en una cepa de E. coli mediante el tratamiento
químico de éstas.

Materiales:

Cepa de E. coli JM83. Se trata de una cepa carente de actividad b-galactosidasa,

aunque dispone de las permeasas específicas de lactosa. En ausencia de
plásmidos esta cepa es sensible a ampicilina e incapaz de fermentar la lactosa,
por lo que genera colonias blancas en agar lactosado de McConkey. Cuando esta
cepa es transformada con un plásmido que porta un fragmento del gen de la b-
galactosidasa (fragmento alfa) la actividad enzimática es funcional y se obtienen
bacterias fermentadoras de lactosa (colonias rojas en este medio). Cuando el gen
de la b-galactosidasa portado por el plásmido es interrumpido artificialmente
mediante la introducción de un fragmento de DNA exógeno, este gen deja de
funcionar dando lugar a colonias blancas, una propiedad muy utilizada en como
indicador de clonaje.

Plásmidos: cada pareja dispondrá de una mezcla de los plásmidos pUC119 y

pUC119-X. Se trata de plásmidos con un origen de replicación autónoma
funcional en E. coli, un gen de resistencia a ampicilina, y el sistema de selección
de clones con inserto dependientes del gen b-galactosidasa comentado más
arriba. En pUC119 este sistema está intacto, mientras que en pUC119-X el gen
de la b-galactosidasa ha sido interrumpido por la inserción de un fragmento de
DNA (X) de otro organi

Material no biológico:

Soluciones frías de Cl2Ca y Cl2Mg a 100 mM

Dos placas de agar lactosado de McConkey con 100 mg/ml de ampicilina (Agar
Mc de selección)

Caldo común estéril

Procedimiento:

1) Cada pareja deberá centrifugar 1,5 ml (~ un tubo Eppendorf lleno) de cultivo

exponencial de la bacteria (5 min a 5.000 rpm) y resuspenderlas con cuidado y
en condiciones de esterilidad en 1 ml de Cl2Mg frío (4 ºC). Tras volver a
centrifugar en las mismas condiciones, las células serán resuspendidas en 200 ml
de Cl2Ca 100 mM, también frío, y dejadas en la nevera hasta el día siguiente.
Durante este tiempo se produce una inducción de competencia artificial en E. coli
mediada por las sales de calcio.

2) Tras esta incubación, distribuir las células tratadas con el Cl2Ca en dos tubos
con 100 ml cada uno. Añadir 10 ml de la mezcla de plásmidos a uno de ellos,
dejando el otro sin DNA (control negativo). Incubar ambos en hielo durante 20
min. Someterlos posteriormente a un choque térmico a 42 ºC durante 90
segundos exactamente en un baño de agua previamente estabilizado a esta
temperatura. Volver a enfriar en hielo (2 minutos), añadir 800 ml de caldo
común e incubarlos en la estufa de 37 ºC durante 30 min para que se exprese el

1
gen de resistencia al antibiótico. Tras ese tiempo, extender 100 ml de cada tubo
sobre sendas placas de agar Mc de selección e incubarlas a 37ºC durante 24 h

3) Observar la cantidad y tipo de colonias que aparecen sobre cada una de las
placas.

4). Registrar los resultados y análisis de resultados en el informe de laboratorio

PRACTICA 6 : ORGANOGÉNESIS IN VITRO PARA SAINTPAULIA SPP.

INTRODUCCIÓN

A principios del siglo XX, el fisiólogo austríaco Haberlandt enunció la teoría de la

totipotencialidad celular, proponiendo que todas las células vegetales tienen la
capacidad para regenerar plantas completas.

La órganogénesis constituye una de las posibles vías morfogenéticas para la

diferenciación de plantas de novo. Consiste en la formación de yemas o de
meristemas radiculares en forma directa, a partir de explantos (células, tejidos u
órganos vegetales iniciadores del cultivo in vitro), o en forma indirecta, a partir
de callos. Existe abundante bibliografía acerca de los variados factores que deben
ser considerados para la manipulación exitosa de la organogénesis. Entre ellos,
se mencionan variables tales como la edad fisiológica y el tamaño de los
explantos, el estado de la planta madre y el período del año durante el cual se
inicia el cultivo. Tambien la luz, la temperatura, la consistencia del medio
sintético y el pH son factores críticos para la iniciación de yemas in vitro.

Los reguladores del crecimiento desempeñan un papel fundamental en el

desarrollo de la respuesta organogénica. La diferenciación de yemas se logra
subcultivando los explantos o callos en un medio que contenga una baja relación
auxina: citoquinina, en tanto que para la diferenciación de raíces se requieren
medios con una relación auxina: citoquinina alta.

Protocolo de organogénesis in vitro para Saintpaulia spp.

a) Material vegetal

Como explantos, se utilizarán discos de 1 cm de diámetro y 3-4 mm de espesor

de hojas de Saintpaulia spp. crecidas en tierra.

b) Protocolo experimental

b.1.) Preparación de los explantos

Desinfectar superficialmente los explantos de hoja por inmersión en una solución

de hipoclorito de sodio (lavandina) al 20 %, durante 20 minutos. Lavar con
sucesivos enjuages de H2O estéril.

b.2.) Siembra

1
Cortar discos de hojas de 1 cm de diámetro sobre una superfície estéril (placa de
Petri o vidrio autoclavados) dispuesta dentro del gabinete de flujo laminar.
Disponerlos con la cara abaxial de la lámina en contacto con el medio sintético de
cultivo. Repicar los explantos a medio fresco cada 15-20 días.

b.3.) Registro de resultados

Luego de aproximadamente 60 días de iniciado el cultivo in vitro, observar la

aparición de neoformaciones. Las estructuras de novo aparecerán inicialmente en
los márgenes o superficies de corte de los discos y/o pecíolos parcialmente
desdiferenciados, bajo la forma de pequeños nódulos o grupos compactos de
yemas.

b.4.) Rusticación

Las yemas obtenidas en el medio de iniciación se repicarán a MS2 (MS sin

reguladores del crecimiento) para la diferenciación de raíces y la obtención de
plantas completas. Una vez enraizados los brotes (1 mes de cultivo en MS2) se
rusticarán a un sustrato mezcla (tierra:turba:vermiculita, 1:1:1) bajo condiciones
de invernáculo, para la obtención de plantas completas.

c) Medios de cultivo

Formulación medio básico, Medio Murashige/Skoog (MS):

Macronutrientes mg/L

NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCl2.2H2O 440

MgSO4.7H2O 370

Micronutrientes mg/L

KI 0.83

H3BO3 6.2

MnSO4.H2O 22.3

ZnSO4.7H2O 8.6

Na2MoO4.2H2O 0.25

CuSO4.5H2O 0.025

CoCl2.6H2O 0.025

Na2EDTA 37.3 mg/L

1
FeSo4.7H2O 27.8

Vitaminas mg/L

Myo-inositol 100

Acido Nicotínico 0.5

Piridoxina-HCl 0.5

Tiamina-HCl 0.1

Glicina 2.0

pH 5.7

Medio de iniciación y multiplicación (MS1): Solución salina básica y

orgánicos según Murashige/Skoog (MS), suplementada con sacarosa 3% y los
reguladores del crecimiento ácido naftalenacético (ANA) y 6-bencilamino-purina
(BAP) en una relación 0,1:1 mg/L

Medio de enraizamiento (MS2): Solución salina básica y orgánicos según

Murashige/ Skoog (MS), sin la adición de reguladores del crecimiento