Introducción

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es de 1-10 u. por lo que resultan difíciles de observar con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, por lo
que el método más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre diferentes tipos de células o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.

Dentro de los métodos para la observación de microorganismos, se encuentran las tinciones simples y las
diferenciales:

Las tinciones simples: consisten en aplicar un solo colorante a la preparación para observar la morfología del
microorganismo. Se usan principalmente colorantes básicos como el azul de metileno, el cristal violeta y la
safranina.

Las tinciones diferenciales: consisten en aplicar una combinación de colorantes, mordentes y aclaradores que
permiten poner de manifiesto alguna diferencia importante en la composición de los microorganismos.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación.
Para bacterias, la fijación por el calor es lo más común, aunque también puede fijarse con sustancias químicas
como formaldehído, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen
ulteriores cambios estructurales en el citoplasma.
 PRACTICAS N° 1
Tema: “Técnica de tinción de Gram”
Objetivos:
Conocer la técnica de la tinción de Gram.
Identificar bacterias Gram positivo y Gram negativo.
Emplear técnicas bacteriológicas simples.
Conocer el fundamento estructural de la Tinción de Gram.
Utilizar colorantes y comprender su utilización.
Utilizar el microscopio con el objetivo de inmersión.
Observar células procariotas
Lograr el óptimo procedimiento para poder aprender la técnica de Tinción Gram de todos los integrantes del
grupo y comprender la importancia y la diferencia entra las estructuras de las diferentes bacterias .

Materiales y métodos
1. Biológico:
a) Cultivos bacterianos diversos

2. Equipos:
a) Portaobjetos: varios
b) Agua destilada estéril: 10mL
c) Guantes: varios
d) Asa bacteriológica
e) Mechero de alcohol o gas: uno por mesa
f) Rejilla de tinción
g) Microscopio: dos por mesa
h) Aceite de inmersión para microscopio: uno por mesa

3. Colorantes y reactivos
a) Solución violeta de genciana al 1%
Violeta de genciana................................... 1g
Cristales de ácido carbólico....................... 2g
Alcohol absoluto........................................10 mL
Agua destilada .......................................... 100 mL

Desarrollo de la práctica
PROCEDIMIENTO:

SIEMBRA: Preparar un porta bien limpio y Coger una porción pequeña de muestra con un palillo o una
aguja enmangada y hacer una extensión sobre el porta.
Procesamiento de la muestra
1. Se toma cuidadosamente el plato de cultivo bacteriano con las manos cubiertas con guantes como forma de
evitar contacto directo con el germen cultivado.
2. Con el asa bacteriológica esterilizada (por flameo), se toma una pequeña muestra del cultivo y se deposita
sobre una gota de agua esterilizada en un portaobjetos limpio y debidamente rotulado y se distribuye
homogéneamente por la plaquita sin dispersarlo mucho o dejarlo muy compacto para luego proceder al
proceso de fijación.
3. Inmediatamente se distribuye el contenido el asa bacteriológica la misma se procede a esterilizar
nuevamente previo a su empaquetamiento y almacenaje.
a) Para fijar la muestra a la plaquita o portaobjetos se procede al proceso de.

FROTIS: Se fijo las células de ida y vuelta – hasta que se desagrego - hasta la mitad del portaobjetos.

FIJACIÓN: con esto evitamos que cualquier sustancia infecte nuestra muestra y luego, que nuestra
muestra permanezca en el porta objeto (Se fijo por calor – a mechero.
 Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.
 Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.
 Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa),
hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual
servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
 Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos,
proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos
mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la
lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como
producto una espiral en la parte media de la lámina.
 Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en
cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede
cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos
sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

TÉCNICA DE TINCIÓN: Sobre el frotis fijado se vertió la solución de violeta y se deje en reposo 1 minuto.
Tinción GRAM

1. Verter la solución de violeta de genciana, hasta cubrir el frotis, dejando que el colorante actué por espacio de
30 segundos.
Tinción
Con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de
dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se
deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para
trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.

2. Lavar la preparación ligeramente con agua corriente.

Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra
con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el
chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer
sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado,
aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la
lámina en posición inclinada hacia abajo.
3. Echar sobre la preparación el lugol de Gram., hasta cubrir el frotis dejando que actué durante 30 segundos.

Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol
durante 1 minuto más. El mordiente es cualquier sustancia que forme
compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias

4. Lavar la lámina con agua corriente.

Echar sobre la preparación el alcohol etílico 95 % o el alcohol acetona al 20 %, hasta que se evidencie que este
solvente no extrae más el colorante violeta. Esta operación debe durar aproximadamente de 1 a 2 minutos

DECOLORACIÓN con alcohol al 95 % durante 1 min moviendo el portaobjetos en ambos lados o a cada extremo,
hasta que desaparezcan los chorros gris violáceos del colorante. Después lave con
agua.
Este paso es fundamental porque en el reside la respuesta diferencial de
las Gram + y las Gram –
Sabemos que el alcohol deshidrata y contrae las células por contacto.
Sabemos también que los poros de las Gram + son mas pequeños que los
de las Gram -.
Entonces, la solución alcohol, contrae los poros de las bacterias cerrando completamente los de las Gram + y
parcialmente los de las Gram -. El resultado es que dicha solución ingresa en estas últimas decolorándolas. Hasta
aquí tenemos las Gram + violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas.

5. Lavar la lámina con agua corriente.

Lavado y secado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y
esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la
llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

6. Echar sobre la preparación la solución de safranina, dejándola actuar por espacio de

30 segundo.
Tinción de contraste
Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a
utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante
1 minuto.

7. Lavar con agua corriente.

Nuevo enjuague
Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se
escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.

8. Secado de lámina
Al concluir el proceso de coloración, la lámina se debe colocar de canto para que se
escurra. Debe tenerse en cuenta que el agua y en especial, el agua destilada, es un agente decolorante, por lo
que si se deja sobre el portaobjetos después de teñirlo demasiado tiempo quita parte del colorante. Lo ideal es
escurrir la lámina poniéndola de canto y seguidamente secarla con papel de filtro.
 Observar en el microscopio

Gráficos:
Cuestionario
1. Cuál es el fundamento de la tinción de Gram?
La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas, una
característica taxonómica importante de las bacteria es su respuesta a la tinción a de Gram esta
característica parece ser fundamental, reacción a la tinción se correlaciona a con muchas otras propiedades
morfológicas en maneras relacionadas filogenéticamente. Microorganismo potencialmente gran positivo
puede verse como tal cuando concurre un conjunto de particular de condiciones ambientales en un cultivo
joven. El procedimiento para tinción de Gram se inicia con la aplicación de un colorante básico el cristal de
violeta. Luego se aplica una solución de yodo en este momento todas las bacterias de tiñen de azul.
 Continuación las células se tratan con alcohol las células grampósitiva contienen el cristal violeta-yodo y
permanecen de color azul; en cambio las gramnegativa se descoloran completamente por el alcohol. Por
último se aplican un colorante de contraste safranina, que es un colorante rojo. De esta manera, las células
gramnegativas, previamente descoloradas, toman el colorante de contraste y las células gran positivas ahora
aparecen púrpura. La base de la reacción diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta
técnica diferencial es una de las de uso más común en microbiología. El frote bacteriano teñido se somete a
las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal violeta, alcohol y safranina o alguna otra
solución de contraste conveniente. Las bacterias gramnegativas contienen un gran porcentaje mas alto de
lípidos que de las bacterias grampositivas. Las paredes celulares de la bacterias gramnegativas son también
más delgadas que las grampositivas con alcohol extrae lípidos con lo cual se aumenta la porosidad o
permeabilidad de la pared celular gramnegativa. Así el complejo cristal violeta-yodo (CV-I) puede extraerse
en los organismos gramnegativos y de esta manera se destiñen las paredes celulares de las bacterias gran
positivas, por su composición diferente (bajo contenido lípido) se deshidratan alcohol y se logra extraer el
complejo (CV-I).En las bacterias (CV-I) queda retenido en la pared después del tratamiento con etanol, la
cual se supone se supone causa una disminución de en el diámetro de los poros glucopéptido o
péptidoglicano de la pared celular. Las bacterias gran negativas tienen una cantidad mucho menor de
pépidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias grampositivas.

2. Cual son los colorantes que se utiliza para la tinción Gram?

3. Cuál es el decolorante?
Decolorar agregado una mezcla de alcohol-acetona (70:30 u 80:20) a la preparación, colorante resbala
lentamente por muestra. Tan pronto como las gotas de esta disolución ya no arrastren color, lavar con
agua para detener la acción del colorante.

4. Qué color toman las bacterias Gram positivo y Gram negativo?

Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las
Gram positivos permanecen azules.

Resultados:
Observamos que las tinciones son muy útiles para identificar los microorganismos, como bacterias, parásitos,
helmintos, protozoos, en fin; una gran gama de organismos patógenos para el hombre. Pero también se han
descubierto microorganismos que son benéficos para el hombre.

Conclusiones:
Nos dimos cuenta de la importancia de las tinciones en la microbiología, ya que se observan mejor las formas de
los microorganismos, es sumamente importante e interesante que sepamos para que nos sirvan exactamente
las tinciones, y nos abre la mente a otro pequeño mundo que nos rodea, nos afecta, nos benefician, nos mata.

Recomendaciones:
Se recomienda realizar el tiempo explicado y las técnicas, para un buen resultado.

BIBLIOGRAFIA:

 Laboratorio de Microbiología: Instrumentación y principios básicos/ José González Alfaro, Boris González
González, Rosa T. Barrial González. La Habana: Editorial Ciencias Médicas; 2004.

 MANUAL DE TÉCNICAS EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA. M. V. Álvarez, E. Boquet, I. De Fez. AEFA. 1990.

 http://2l2m-laboratoristaclinico.blogspot.com/2009/06/practica-6-tincion-de-gram.html

 http://www.pucmmsti.edu.do/cienciasfisiologicas/tinciongram.pdf

 http://es.wikipedia.org/wiki/Tinción_de_Gram

PRACTICAS N° 2
Tema: “Técnica de tinción de Ziehl- neelseen(BAAR)”
Objetivos:
 Conocer la técnica de la tinción de ziehl – neelsen(BAAR)
 Identificar bacteria BAAR.
 Determinar la ácido alcohol resistencia de las micobacterias en muestras clínicas
 Diagnostico de pacientes bacilíferos

Materiales y métodos
1. Biológico:
b) Bacilos ácido alcohol resistentes

2. Equipos:

Portaobjetos: varios
Agua destilada estéril: 10mL
Guantes: varios
Asa bacteriológica
Mechero de alcohol o gas: uno por mesa
Rejilla de tinción
Microscopio
Aceite de inmersión para microscopio

3. Colorantes y reactivos
b) Colorante 1º: fucsina fenicada (carbolfucsina)
Contracolorante: azul de metileno o verde malaquita
Decolorante (Alcohol ácido)
Aceite de inmersión
Cuerpos tensioactivos sin necesidad de calentar el colorante Auramina.
Colorante 1º:fluorocromo

Desarrollo de la práctica
PROCEDIMIENTO:

a) Filtre la fucsina fenicada antes de usarla, utilizar láminas nuevas, limpias y sin
grasa. Marque las láminas correctamente con un diamante o un lápiz de mina.

b) Saque del frasco una porción amarillenta de esputo y colóquela sobre la lámina con el extremo rugoso del
palillo.
c) Extienda el material uniformemente en una superficie de aproximadamente 2cm x 1cm, de manera que se
pueda leer un periódico a través el frotis después del secado.

d) Seque completamente el frotis al aire y luego proceda a su fijación por el calor de una llama.

e) Cubra la superficie del extendido con fucsina.

f) Pase la llama del mechero (o torunda empapada en alcohol) por debajo de la lámina, hasta que se produzca
la emisión de vapores blanquecinos. Deje de calentar y repita el procedimiento dos veces más. La emisión
de los vapores blanquecinos debe lograrse tres veces en 5 minutos, que es el tiempo adecuado de contacto
entre el extendido y el colorante. La fucsina no debe hervir sobre la lámina, si disminuye por evaporación o
derrame, hay que reponerla.

d) Elimine la fucsina con agua del tubo a baja presión, de manera que la película no se desprenda.

e) Gire la lámina para lavar su cara inferior y así eliminar la fucsina ahí
depositada.
f) Cubra la superficie del extendido con alcohol-ácido al 3% efectuando un movimiento de vaivén y espere 2
minutos de modo que el alcohol-ácido lo decolore y arrastre suavemente la fucsina. Esta operación puede
repetirse hasta que sobre el extendido se observe un color rosado.

g) Lave la lámina con agua. Si la lámina no esta uniformemente decolorada, repita la etapa por 10 por 1 a 3 min
mas, Haga escurrir el agua.

h) Cubra el extendido durante 1 minuto con solución de azul de metileno, y haga escurrir la contratinción.

i) Enjuague con agua, seque el reverso de la lamina con el papel poroso, seque las láminas a temperatura
ambiente, en posición vertical, con el extendido hacia el frente

k) Revise la identificación de los frotis y rotúlelos de nuevo si se borraron durante la tinción.

Secado de lámina
Deja sobre el portaobjetos después de teñirlo demasiado tiempo quita parte del colorante. Lo ideal es escurrir la
lámina poniéndola de canto y seguidamente secarla con papel de filtro.
Observación microscópica:
 La observación microscópica debe determinar la presencia de BAAR (concordancia cualitativa) y establecer su
número aproximado por campo microscópico (concordancia cuantitativa).
 Considere campo microscópico útil aquel en el cual se observan elementos celulares de origen bronquial
(leucocitos, fibras mucosas y células ciliadas). Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben
contabilizarse en la lectura.
 Observe cada campo microscópico, en superficie y profundidad, con objetivo de inmersión
 Establezca una pauta uniforme de observación
 El número de campos que se debe observar variará según la cantidad de bacilos que contenga la muestra. Si
no se encuentran BAAR o se observa menos de 1 bacilo por campo en promedio, deben examinarse por lo
menos 100 campos. Si se encuentran de 1 a 10 BAAR por campo en promedio, es suficiente observar 50
campos. Si se encuentran más de 10 BAAR por campo en promedio, basta con observar 20 campos.
 Cuando aparecen grumos de bacilos se debe contar como uno. Si el número de grumos que aparece es
significativo, se debe hacer la observación en el reporte: “hay BAAR en grumos”, para indicar que el número
verdadero de BAAR puede ser mayor que el que se reporta.
 Cuando el frotis es de otro tipo de muestra, que no sea esputo o del sedimento de un esputo, solamente se
reporta cualitativamente.

Reporte de resultados

Gráficos:
Cuestionario:
1.- Cual es el fundamento de la tinción de Ziehl – Neelsen?

La tinción de Ziehl-Neelsen denominan gérmenes alcohol ácido-resistente a un grupo de organismos que, una vez teñidos con
solución colorante-mordientes, tienen la propiedad de resistir la decoloración por ácidos minerales (ácido sulfúrico o nítrico)
y alcohol.Este carácter de ácido alcohol resistencia se debe a las sustancias serosas y lipídícas que contiene la membrana de
envoltura de éstos gérmenes y que varía en las diferentes especies.Entre los gérmenes ácido-resistentes se encuentran
especies saprofitas y patógenas. Saprofitas son: por ejemplo M. phlei, M. Smegmatis, Representantes patógenos son el M.
tuberculosis, M. leprae, M. kansaii

2.- Cuales son los colorantes que se utiliza para la tinción BAAR?

Colorante 1º: fucsina fenicada (carbolfucsina)

Solución de alcohol-acido
Azul de metileno.

3.- Cual es el decolorante?

Alcohol-acido

4.- Que color toman las bacterias BAAR?

Las bacterias ZN+ o BAAR se observarán teñidos intensamente de color rojo.

Conclusiones:
La tinción de Ziehl-Neelsen detecta Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. contienen ácidos grasos
(ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-
alcohol resistentes es interesante que sepamos para que nos sirvan exactamente las tinciones, y nos abre la
mente a otro pequeño mundo que nos rodea, nos afecta, nos benefician, nos mata.
Recomendaciones:
Se recomienda realizar el tiempo explicado y las técnicas, para un buen resultado.

BIBLIOGRAFIA:

 Laboratorio de Microbiología: Instrumentación y principios básicos/ José González Alfaro, Boris González
González, Rosa T. Barrial González. La Habana: Editorial Ciencias Médicas; 2004.

 MANUAL DE TÉCNICAS EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA. M. V. Álvarez, E. Boquet, I. De Fez. AEFA. 1990.

 http://www.pucmmsti.edu.do/cienciasfisiologicas/tinciongram.pdf

 http://es.wikipedia.org/wiki/Tinción-Zielh-Neelsen.

 Trinidad Sabalete Moya _Centro de Enfermedades Infecciosas y Salud Internacional Granada- IAMA
Málaga_FUNDACIÓN IO.

 Manual de biología medica; Facultad de Estudios Superiores Zaragoza ;QFB

 Manual de técnicas para el diagnostico morfológico de las parasitosis; Paz María Salazar S. Irene de Haro
A. Ed. Francisco Méndez Cervantes.