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Con más de 800 miembros, los GPCR1 constituyen la mayor familia de receptores de membrana
(1, 2). Responden a una amplia variedad de estímulos extracelulares y son el objetivo de
aproximadamente la mitad de los medicamentos recetados para enfermedades humanas (3).
Los GPCR son controladores clave de los procesos fisiológicos, como la neurotransmisión, el
metabolismo celular, la secreción, la diferenciación celular y el crecimiento. La topología
prototípica de los GPCR consiste en un segmento extracelular amino terminal, un núcleo
hidrofóbico de siete hélices transmembrana (7TM) que interaccionan entre sí para formar un
barril tridimensional dentro de la membrana plasmática y una cola carboxilo terminal citosólica
(C -cola). Mientras que los aminoácidos dentro del núcleo 7TM extracelular y / o hidrófobo del
receptor están implicados en la unión del ligando, el dominio intracelular del receptor
compuesto por tres bucles y la cola C es importante para la transducción de señal (4).
Se han usado varias estrategias para identificar complejos asociados a GPCR. Los primeros
trabajos utilizaron columnas de afinidad con ligandos biotinilados para purificar los complejos
de proteína del receptor G de la somatostatina de los tejidos (5). Posteriormente, basado en el
trabajo pionero de Husi et al. (6), se llevó a cabo un análisis proteómico más sistemático de los
complejos proteicos asociados a GPCR utilizando anticuerpos específicos del receptor (7). Sin
embargo, la aplicación general de estos enfoques se vio limitada por la disponibilidad de
herramientas adecuadas (ligandos marcados, anticuerpos, etc.) para cada GPCR. Más tarde, los
dominios intracelulares aislados se usaron ampliamente para identificar proteínas asociadas a
GPCR como cebo en pantallas de dos híbridos de levadura o para generar matrices de afinidad
para la purificación de proteínas que interactúan a partir de extractos celulares (8-11). Usando
la cola C completa del receptor 5HT2c expresada como proteína de fusión GST, se han
identificado más de 15 proteínas (12). Además, se han usado con éxito motivos de interacción
proteína-proteína aislados tales como motivos de reconocimiento de dominio PDZ de GPCRs
para identificar parejas que interactúan con los motivos de reconocimiento de dominio PDZ de
los receptores 5HT2a, 5HT2c y 5HT4 (13, 14).
Aunque se pudieron identificar varias proteínas que interactúan con GPCR, estos métodos
obviamente tienen limitaciones importantes ya que los subdominios receptores aislados 1) no
imitan la topología de GPCR (dominio 7TM, disposición de bucles intracelulares y cola C y
oligomerización de receptores), 2) hacer no proporcionan un entorno de membrana adecuado,
y 3) no permiten el reclutamiento de complejos de proteínas tras la activación del agonista. No
es sorprendente que las parejas de interacción bien conocidas de los GPCR, tales como las
proteínas G heterotriméricas, sean difíciles de identificar usando estas técnicas.
Expresión funcional de las proteínas de fusión MT1-TAP y MT2-TAP en células HEK 293
Los receptores de melatonina MT1 y MT2 humanos se marcaron con la etiqueta TAP en sus colas
C, y se establecieron clones estables correspondientes en células HEK 293. Las células HEK 293
son de origen humano, están extremadamente bien caracterizados en términos de transducción
de señal GPCR, pueden producirse en cantidades que son compatibles con el análisis
proteómico, y no expresan cantidades significativas de receptores de melatonina endógenos. El
análisis de transferencia de Western con anticuerpos específicos del receptor reveló bandas
inmunorreactivas al tamaño molecular esperado de 85 kDa en un clon HEK-MT1-TAP que
expresa 1,0? 0,2 pmol de MT1-TAP / mg de proteína (n? 3) y en un clon HEK-MT2-TAP que
expresa 340? 41 fmol de MT2-TAP / mg de proteína (n? 3) (Fig. 1, ayb). Las constantes de afinidad
(Kd) del agonista del receptor de melatonina [125I] MLT fueron 85? 53 (n? 3) y 267? 78 pM (n?
3) para MT1-TAP y MT2-TAP, respectivamente, que están de acuerdo con los valores
previamente informados para los receptores de tipo salvaje (25). La expresión de los receptores
en la superficie celular se evaluó mediante microscopía de fluorescencia usando anticuerpos
específicos del receptor (Fig. 1, c-f). Los receptores marcados con TAP y de tipo silvestre se
expresaron todos en la membrana plasmática de los clones HEK 293 transfectados de manera
estable. La incubación de los clones HEK-MT1-TAP y HEK-MT2-TAP con melatonina condujo al
aumento transitorio esperado de la fosforilación de ERK1 / 2, que era comparable a la obtenida
para los receptores de tipo salvaje (Fig. 1g). En conjunto, estos datos demuestran que la adición
de la etiqueta TAP no afecta la localización subcelular y la funcionalidad del receptor de
melatonina.
El paso crucial para la purificación exitosa de los GPCR y las proteínas asociadas consiste en la
solubilización suave pero eficiente de las células para extraer cantidades máximas de complejos
de membrana intactos. Para cuantificar la cantidad de MT1 y MT2 solubilizados, utilizamos
células que expresan receptores MT1 y MT2 marcados con Rluc (luciferasa de Renilla) (19). Estas
células se incubaron durante la noche con concentraciones variables de detergentes, y el
rendimiento de solubilización se determinó midiendo la actividad de la luciferasa en las
fracciones solubles y no solubles (Fig. 2a). La cantidad de receptor solubilizado aumentó en
función de la concentración de detergente y alcanzó los máximos en 50% (CHAPS), 65%
(Brij96V), 70% (digitonina) u 80% (dodecilmaltosida).
Los datos obtenidos con Nonidet P-40 no pudieron analizarse en este ensayo ya que Nonidet P-
40 inhibe la actividad de la luciferasa. Se obtuvieron resultados comparables para MT1-Rluc y
MT2-Rluc. Se usaron concentraciones mínimas de detergente, que proporcionaban una
solubilización máxima del receptor, para estudiar la cinética de solubilización (figura 2b). Ambos
receptores se solubilizaron progresivamente con el tiempo alcanzando una meseta después de
15 h. Para experimentos adicionales, los receptores se solubilizaron con CHAPS al 0,5%,
digitonina, dodecilmaltosida o Nonidet P-40 o con 0,25% para Brij96V durante 15 h.