INTRODUCCIÒN

Una sonda es un reactivo biológico constituido por un fragmento de ADN que

posee una secuencia de bases complementaria a la del genoma de un
microorganismo. Las sondas génicas son moléculas de ADN señaladas con un
marcador que tienen el poder de reconocer genes en los cromosomas y establecer si
dichos genes son normales o portadores de alteraciones.

Las ventajas de las técnicas moleculares han sido ampliamente

publicitadas en los últimos 7 años, lo que sin duda ha aumentado la presión
en los laboratorios clínicos para comenzar a usarlas en una amplia
variedad de enfermedades infecciosas, genéticas, oncológicas y
neurológicas.

Usando las nuevas técnicas de la ingeniería genética, es posible localizar y

analizar un gen entre miles, utilizando el PCR o construyendo y usando
sondas genéticas. Estos hechos han convertido a las técnicas de genética
molecular y biotecnología en herramientas fundamentales para la
detección y tratamiento de estas enfermedades no sólo en la especie
humana, sino en el mundo de la veterinaria.

Hasta hace algunos años, sólo se podía saber que un individuo había
heredado tal o cuál enfermedad genética, cuando los síntomas se hacían
evidentes y sólo podía darse una estimación de la probabilidad de que sus
hijos heredaran un desorden en particular. Usando las nuevas técnicas de
la ingeniería genética, es posible localizar y analizar un gen entre miles,
utilizando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, del inglés
Polimerase Chain Reaction) o construyendo y usando sondas genéticas.

Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente

de una muestra clínica (secreciones bronquiales, orina, etcétera) o para
confirmar la identificación de un cultivo que por otros métodos tarda
varios días (Legionella pneumophila, Chlamydia trachomatis, etcétera).
Además, las sondas pueden ser usadas para hibridación in situ para
evaluar la respuesta del huésped a un agente infeccioso en particular y
también para determinar la extensión de la infección mediante el estudio
de muestras de tejidos de varios órganos. Muchos de ellos han sido
desarrollados por varios fabricantes y sólo se diferencian en la secuencia a
la cual está dirigida la sonda.
El diagnóstico mediante el empleo de sondas génicas puede utilizarse también
después del nacimiento, por ejemplo, para precisar la naturaleza y amplitud de
una alteración genética; o para el caso de parejas procedentes de familias "de
riesgo" en particular para las mujeres que deseen saber si son "portadoras " de un
determinado precursor de enfermedad.
 OBJETIVOS

 Conceptualizar de manera clara las sondas génicas.

 Identificar los tipos de sondas génicas.

 Describir el desarrollo de la obtención de sondas génicas.

 Identificar su utilidad.
 SONDAS GÉNICAS COMERCIALES

I.- Definición

La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unirá

exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama especificidad
de la sonda.

Es decir, Sonda es una secuencia (fragmento) de ADN monocatenario marcada con

algún isotopo radiactivo o mediante métodos no radiactivos (como fluorescencia); que se
usa para detectar fragmentos de ADN o ARN con homología secuencial en la paridad de
bases nitrogenadas específicas (Guanina con Citosina y Adenina con Timina).

Las sondas de cDNA se obtienen a partir de la copia de un mRNA y, por tanto,

corresponden a secuencias codificantes de un gen. Las sondas RNA son copias del RNA
y se obtienen in vitro, mediante la síntesis de una cadena complementaria utilizando una
RNA-polimerasa.
El uso y aplicación de las sondas génicas está basado en la aplicación de la técnica
citogenética de Hibridación in situ por fluorescencia (cuyas siglas en inglés la denominan
FISH).

Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La detección
solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo detectable. Dependiendo del
número de estos grupos incorporados y de la señal que emitan la sonda puede tener
diferente sensibilidad.

II.- TIPOS DE SONDAS

A) Según el tamaño: Se escogen en función de la secuencia diana (ADN o ARN) y se

tienen en cuenta la longitud y el tipo de secuencia diana así como el medio de
marcaje y detección.
1. Sondas grandes: secuencias de ADN bicatenario de una longitud de 1-4 kb.
Pueden ser genómicas, secuencias con intrones y exones, o de ADNc, sin
intrones, obtenidas a partir de la transcripción inversa del ARNm.
2. Sondas pequeñas: son secuencias monocatenarias de 15-50 nucleótidos.
Reciben el nombre de oligonucleótidos sintéticos. Son de ADN.
3. Sondas intermedias: son de ARN.

B) Tipo de sonda y método de síntesis: Distintos tipos de sondas de ácidos

nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridación in situ:

1. Sondas de DNA doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando técnicas

 como “nick translation, random priming o PCR”, en las cuales el nucleótido
marcado es incorporado. PCR y random priming proporcionan una buena
actividad específica. Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de
usar. Cuando se usan para detectar una cadena simple como mRNA, estas
son menos sensibles debido a que la concentración de la sonda marcada es
reducida

2. Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas

utilizando “primer extensión” en templados de cadena simple o por PCR con
un nucleótido marcado. Éste último es el más usado porque es más fácil de
llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material.
El PCR permite una gran flexibilidad en la elección de las secuencias
marcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido ampliamente usadas.

3. Oligonucleótidos (entre 20 y 40 bases). Son marcados incorporando

oligonucleótidos modificados durante la síntesis química o adicionando una
cola marcada. Una de las desventajas es que algunos oligonucleótidos
marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.

4. Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de una
RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la
sonda es clonada en un vector que flanqueará dos sitios distintos de
iniciación.

La cadena de RNA antisentido (sonda) es sintetizada en dirección opuesta al

gen endógeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con enzimas que
dejen el extremo 5’ cohesivo, porque se ha reportado, que el extremo 3’ romo
promueve la síntesis de transcritos anormales.

III.- MARCAJE DE SONDAS.

Sitios de marcaje o modificación:

Para detectar hibridación hay que usar sondas marcadas o modificadas y para ello se
marcan los nucleótidos sin que se vea disminuida la capacidad de apareamiento entre
bases complementarias. La 2-amino-adenina se incorpora en sondas pequeñas y forma 3
puentes de H con su complementaria, la timina. La caseina sustituye a la guanina en el
ARN rico en GC y solo forma 2 puentes de H con la citosina. Si se añaden isótopos
radiactivos las propiedades del marcaje no se ven modificadas.

Posibles sitios de marcaje de las bases:

Adenina: Citosina: Uracilo: Guanina: Timina:

Existen dos alternativas para que el marcaje sea incorporado dentro de la sonda: el
marcaje radioactivo que es detectado por autorradiografía, o por haptenos (no radioactivo)
el cual es detectado directa o indirectamente por inmunocitoquímica.
 Isotópicos radioactividad
Sistemas directos
No isotópicos no radioactivos
Indirectos

Los sistemas isotópicos ofrecen una alta sensibilidad, particularmente con tritio, así
como alta resolución. Por otro lado el empleo de radioisótopos requieren licencia
especial. El método de detección (autorradiografía) requiere un tiempo de
exposición de semanas.
Con el uso de sondas radioactivas es posible hacer un método cuantitativo.

El marcaje de la sonda se puede dar de 2 formas:

Marcaje radiactivo

Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucleótidos que tengan alguno de sus
átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P, pero también es frecuente el uso de
tritio. Este tipo de marcaje es apreciable mediante autorradiografía. El uso de este tipo de
marcaje va a asociado con los peligros que trae el uso de elementos radiactivos, así como
también por ser un agente mutagénico este podría llegar a modificar la ultra estructura del
ADN de muestra, razón por la que se desarrolla otro método que es el marcaje
inmunológico.

Algunos isótopos han sido usados para marcajes radiocativos en la hibridación in situ,
que difieren en cuanto a la resolución de la señal, la velocidad en obtención de
resultados y la estabilidad de la sonda.

a) 3H - proporciona una señal a nivel subcelular pero requiere largas

exposiciones autorradiográficas.

b) 35S – proporciona resolución de un diámetro celular, con tiempos de

exposición de una semana. Agentes reductores como el ditiotreitol (DTT)
pueden ser incluidos en la solución que contenga 35S para proteger al azufre de la
oxidación. La vida media de este isótopo es de 87 días y la marca debe ser usada
en un mes aproximadamente.

c) 32P – da una resolución menor que el 35S y además proporciona una baja
eficiencia en la autorradiografía, ofrece una pequeña ventaja en cuanto a la
velocidad de obtención de resultados. Posee una vida media de 14 días.

d) 33P – da una resolución similar a 35S, pero éste tiene una vida media más corta
(25 días) y el costo es mayor.

Marcaje no radioactivo

Las sondas se marcan utilizando nucleótidos que llevan unida una molécula
(digoxigenina), a la solución se le añaden anticuerpos específicos que se unen a
esa molécula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto luminiscente o
fluorescente (como fluoróforos o fluorocromos: fluoresceína, rodamina) que deja
impronta fotográfica.

Existen dos tipos de sistemas no isotópicos para la prueba de hibridación: directo e

indirecto.
 El método directo, la molécula detectable (reportera) es enlazada
directamente al ácido nucleico y este híbrido puede ser visualizado en
el microscopio inmediatamente después de la reacción de hibridación. El
paso limitante en éste método es que el híbrido subsista a las condiciones de
lavado. Lo más importante, además, es que la molécula reportera no
interfiera con la hibridación.
 Los métodos indirectos, requieren una marca que contenga la molécula
reportera, introducida química o enzimáticamente, que pueda ser detectada
por afinidad citoquímica. En este método al igual que el anterior, el marcaje
no debe interferir con la hibridación, ya que la molécula reportera debe estar
accesible a los anticuerpos que la detecten.
IV.- VENTAJAS DE LAS SONDAS GENÉTICAS

Las ventajas de estas técnicas son que nos permiten investigar directamente al
microorganismo, sin necesidad de que se encuentre viable, ni de que esté en cultivo puro.
Hoy en día se utiliza para identificar microorganismos no cultivables, de lento crecimiento
o difícil y de identificación compleja. Es posible utilizarlo en cualquier tiempo de muestra
biológica y permite la identificación de genes no expresados fenotípicamente. Son
técnicas muy válidas, pues el ADN es muy estable.

Los inconvenientes más importantes son que se necesitan un número mínimo de copias
del fragmento de ácido nucleico problema que se quiere detectar, por eso en las muestras
con escasos número de unidades infecciosas se obtiene una baja sensibilidad. En
ocasiones este problema se resuelve detectando ARN en vez de ADN, pues el primero
suele estar en mayor cantidad.

Otra forma de intentar resolver este problema consiste en aumentar en vitro el número de
copias mediante técnicas de amplificación.

Actualmente disponemos de sondas (Gen-Probe®, Syngene®) para identificación de M.

tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae. Entre las principales
ventajas de las sondas genéticas hay que destacar la sencillez de su manipulación, que
permite su adaptación a cualquier laboratorio. El principal inconveniente es su coste. Es
una tecnología muy utilizada en la actualidad en laboratorios nivel II.

SONDAS GÉNICAS COMERCIALES

Sondas Génicas
Se obtienen y basan su elaboración a partir de la gran cantidad de secuencias de ADN
repetitivo (intergénico: disperso o yuxtapuesto “en tándem”) encontradas en y alrededor
del centrómero de cromosomas específicos. En la actualidad son usadas para el
diagnóstico rápido.
Tipos de sondas utilizadas en FISH convencional:

En la actualidad hay un gran número de sondas comerciales disponibles, ofreciendo

todas ellas un resultado rápido y fiable en la caracterización de determinadas anomalías
cromosómicas.
Se distinguen 4 tipos de sondas, en función de las estructuras que son capaces de
detectar en el núcleo celular o en metafase.

 Sondas locus específico:

Estas sondas hibridan con una secuencia única de ADN, son específicas para un
locus determinado. Se conocen como sondas LSI (locus specific identifier). EN
función de su diana, tienen un tamaño de 1-10 kb (plámidos) o son vectores más
largos 80kb - 1Mb (Bacterial artificial chromosomes – BACs, Yeast artificial
chromosomes-YACs)
Las sondas de secuencia única permiten detectar reordenamientos estructurales
de genes o de regiones cromosómicas concretas e identificar delecciones y
duplicaciones submicroscópicas de hasta 3 Mb: No obstante, su aplicación
requiere conocer a priori la región que se desea estudiar.

 Sondas centroméricas:
Identifican los centrómeros, los cuales a pesar de ser prácticamente idénticos para
todos los cromosomas, se distinguen en 2-3% de su secuencia, lo que permite que
la mayor parte de los centrómeros individuales puedan ser distinguidos a
excepción de los centrómeros de los cromosomas 13 y 21, y de los centrómeros
de los cromosomas 14 y 22.
Permiten detectar cromosomas concretos e identificar alteraciones de tipo
numéricos, especialmente monosomías, trisomías y otras aneuploidías en
metafases y también en núcleos interfásicos. Se conocer como sondas CEP
(chromosome enumeration probe)

 Sondas subteloméricas:
Son sondas de ADN que identifican regiones cromosómicas próximas a los
telómeros, que contienen secuencias únicas que son específicas para cada
cromosoma. Poseen una alta resolución que varía según la medida de la sonda
utilizada (30-100 Kb). Han demostrado ser una herramienta muy útil para la
detección de muchas anomalías cromosómicas que implican las regiones
teloméricas. Dicha identificación es importante dado que estas regiones
subteloméricas contienen gran cantidad de genes.

 Sondas de pintado cromosómico:

Con la sonda de pintado cromosómico simple correspondiente a un determinado
cromosoma se consigue pintar sólo los cromosomas homólogos correspondientes,
 permitiendo así detectar de forma rápida, alteraciones numéricas y estructurales
intercromosómicas que afectan a ese cromosoma específico.
Son sondas complejas de ADN, generadas a partir de cromosomas
microdiseccionados que se amplifican por DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide
Primer-Polimerase Chain Reaction), se marcan e hibridan con múltiples
secuencias del cromosoma, con excepción de las regiones centroméricas y
teloméricas. Así, tras la hibridación aparece pintado uniformemente todo el
cromosoma. Estas sondas, también conocidas como sondas WCP (whole
chromosome painting) sirven fundamentalmente para detectar traslocaciones
difíciles de identificar con las técnicas de citogenética convenciones, así como
para identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma
derivativo o en pequeños marcadores supernumerarios. Si bien se pueden utilizar
en interfase, se aconseja su uso sobre metafase.
Los principales inconvenientes de la utilización de estas sondas son la no
detección de inversiones paracentroméricas y su baja resolución, que impide
detectar pequeñas delecciones, duplicaciones y traslocaciones (˂ 2-3 Mb)
Con el pintado cromosómico múltiple se consigue pintar de forma simultánea todos
los cromosomas pero en metafases independientes. Esta variante de FISH se
realiza utilizando el Kit comercial Chromoprobe-M Multiprobe System, (CytoCell
Ltd, UK).

OTRAS SONDAS

Sondas BCR/ABL:
Especificaciones de la sonda:
BCR (22q11.23) verde
ABL (9q34) rojo.
La presencia del cromosoma Filadelfia (Ph') tiene una importante repercusión diagnóstica
y pronóstica en una serie de enfermedades hematológicas. Esta anomalía es
característica de la leucemia mieloide crónica (LMC), esta anormalidad afecta a los
cromosomas 9 y 22.
El defecto genético del cromosoma Filadelfia consiste en un fenómeno conocido como
translocación. Partes de dos cromosomas, el 9 y el 22 (translocación 9-22), intercambian
sus posiciones. El resultado es que parte del gen de región de fractura (BCR, Breakpoint
Cluster Region, en inglés) del cromosoma 22 (región q11) se fusiona con parte del gen
ABL del cromosoma 9 (región q34). El gen ABL toma su nombre de «Abelson», el nombre
de un virus causante de leucemias precursor de una proteína similar a la que produce
este gen.
El resultado de esta translocación es la producción de una proteína de peso p210 o p185
(p es una medida de peso para proteínas celulares en unidades de masa atómica).
Puesto que el código del gen ABL es capaz de añadir grupos fosfatados a residuos de
tirosina (mediante la enzima Tirosinquinasa), la fusión de los genes BCR-ABL también es
una enzima Tirosincinasa (Aunque la región BCR del gen es también una enzima
serina/treonina proteína-kinasa, la función de la tirosina kinasa es muy relevante para la
terapia de esta enfermedad).
La proteína resultante de la fusión BCR-ABL interactúa con la subunidad receptora
Interleuquina 3beta(c). La transcripción del BCR-ABL permanece activa continuamente,
sin necesidad de ser activado por otras proteínas mensajeras. En cambio, el BCR-ABL
activa un número de proteínas y enzimas controladoras del ciclo de división celular.
Además, inhibe la reparación del ADN, causando la inestabilidad del genoma y siendo
una potencial causante de la temida «crisis en cadena» de la leucemia mieloide crónica,
con una alta tasa de mortalidad.
El cromosoma Filadelfia se designa como cromosoma Ph (o Ph'), y la translocación que lo
causa se expresa como t (9;22)(q34;q11).

Actualmente se realiza esta técnica en el Laboratorio de Genética del instituto de

Enfermedades Neoplásicas para 2 tipos de leucemias:
Leucemia Mieloide Crónica para la detección de la fusión génica BCR-ABL
Leucemia Mieloide Aguda tipo M2 para la detección de la fusión génica AML-ETO y
para el cáncer de mama para la detección de la amplificación del gen Her-2 neu ETO
AML / ETO AML AML / ETO Sonda AML / ETO ETO ML Citogenética Molecular

Sondas Unilocus:
Son específicas para un locus particular. Se utilizan con éxito en la identificación de
minúsculas delecciones y duplicaciones submicroscópicas.

Pintar cromosomas:
Consiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un cromosoma en particular.
Cuando esta mezcla de sondas se usa en una hibridación, el cromosoma entero fluorece,
por lo que decimos que está “pintado”. Pintar cromosomas es muy útil para caracterizar
reordenamientos complejos, tales como translocaciones sutiles, y para identificar el origen
de material adicional de un cromosoma, como pequeños marcadores de supernumerarios
o anillos.

Pintar a la inversa:
En este procedimiento una porción de material cromosómico no identificado, pequeños
marcadores supernumerarios o anillos, se usa para pintar por hibridación una metafase
normal. El cromosoma no identificado se obtiene por separación de células activadas por
fluorescencia, el cual es amplificado utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) para preparar dicha pintura. El origen del segmento no identificado se obtiene
mediante la identificación del cromosoma sobre el cual se hibrida.

Cariotipo de espectro multicolor:

El último logro de la tecnología FISH es utilizar todas las sondas cromosómicas para
obtener un cariotipo humano multicolor, en el cual cada par de homólogos cromosómicos
puede ser identificado en base a su color. Para un cromosoma completo cada sonda se
prepara de tal forma que, cuando se une a un marcador fluorescente, da una señal
espectral diferente, que se analiza con un programa de ordenador. Este abordaje es
extremadamente útil para detectar sutiles reordenamientos cromosómicos o
constitucionales en pacientes con anomalías adquiridas, como el cáncer, o del desarrollo.

HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA (CGH)

La CGH (del inglés comparative genomic hybridization) es una ventajosa modificación del
método de pintar a la inversa, de gran utilidad en genética del cáncer para detectar
regiones de pérdidas alélicas y amplificación génica. El ADN experimental o tumoral se
pinta de color verde y rojo el ADN control. Las dos muestras se mezclan e hibridan sobre
metafase normal. Si la muestra experimental contiene más ADN de una región
cromosómica en particular que la muestra control, la región se identificará por el
incremento de fluorescencia verde sobre la roja. De forma análoga, una delección en la
muestra experimental mostrará una reducción en la proporción verde sobre rojo.
Sondas PML/RARA

Las sondas satélites consisten en secuencias específicas generadas de satélites DNA

altamente repetitivo, localizados en regiones centroméricas, pericentroméricas o
heterocromáticas de cada cromosoma.
Estas sondas permiten una rápida identificación y enumeración de cada uno de los
cromosomas, tanto en interfase como en metafase.
También se ofrecen sondas satélite doblemente marcadas para X e Y, cada una de ellas
marcada con rojo o verde respectivamente.

AQUARIUS HEMATOLOGY PROBES

Referencia: LPH
FISH Líquida desórdenes Hematológicos.
FISH específicas para anomalías relacionadas con problemas hematológicos:
 13q14,3 Delection Probe (D13S39, D13S25)
 MYH11 (16p13,1) Breackpoint Probe.
 PML/RARa Translocation Probe

AQUARIUS PAINTING PROBES

Referencia: LPP
FISH marcaje cromosomas completos.
Marcaje mediante sondas que hibridan a lo largo de cada cromosoma completo para
identificación de cada uno de ellos y detección de traslocaciones.
Cada una de las sondas está disponible marcada en verde y en rojo para la mejor
combinación y estudio.
AQUARIUS SUBTELOMERIC PROBES

Referencia: LPT
FISH Liquida Regiones Subteloméricas
Reestructuraciones cromosómicas relacionadas con los extremos de los cromosomas son
causa importante de enfermedades genéticas. La región cercana a los telómeros es
enormemente rica en genes.
Estas anomalías de las regiones subteloméricas están íntimamente ligadas a retrasos
mentales y anomalías congénitas.

AQUARIUS MICRODELECTION PROBES

FISH Liquida Microdelecciones

Los síndromes de microdelecciones son un grupo heterogéneo de desórdenes genéticos
causados por la delección de regiones específicas de DNA cromosómico, causando
haploinsuficiencias de genes importantes.
Estas delecciones son difíciles de detectar utilizando técnicas tradicionales de
citogenética.
La Fluorescencia In Situ (FISH) puede resolver la detección de estas delecciones
submicroscópicas a un límite aproximado de 3 Mb de resolución y por lo que se ha
convertido en el método de elección para el diagnóstico de estas enfermedades.
Las diferentes sondas de microdelecciones son las siguientes:

 DiGeorge/VCFSTUPLE1
 DiGeorge/VCFSN25
 Prader-Willi/Angelman
 Angelman(UBE3A/D15S10)
 Smith-Magenis/Miller-Dieker/ILS
 Williams-Beuren
 Wolf-Hirschhorn
CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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Barcelona-España; 2011.

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México. [Acceso 12 de Abril del 2014]. Disponible en:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/hibridacion_in_situ.pdf

4. Pedro Fernández Ruiz. “Hibridación de los ácidos nucleicos”. Hospital Clínico/

IDIBAPS/Universidad de Barcelona. [Acceso 12 de Abril del 2014]. Disponible en:
http://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-bcfb-
d75fd6b2ee9f&groupId=10157