REACCION DE FEULGEN

COMPETENCIAS:

1. Desarrollar una técnica de coloración específica para la detección de ADN.

2. Comparar la coloración obtenida a través de la reacción, con las otras convencionales
para teñir al núcleo.
3. Comprender la importancia para la realización de análisis cualitativo de ADN.

INTRODUCCIÓN

La Citoquímica tiene como propósito la identificación y utilización de los diferentes

componentes químicos dentro de la célula en forma cualitativa o cuantitativa. Para la
determinación citoquimica de una sustancia deben cumplirse dos condiciones:

1. Que la sustancia sea inmovilizada en su localización original.

2. Que la sustancia sea identificada por un procedimiento que sea específico para ella o
para el grupo químico para el cual pertenece.

En las reacciones histoquímicas en las que se usa el reactivo de Shiff, por ejemplo, puede
considerarse tres tipos de aldehídos.

a) Aldehídos presentes en forma natural en los tejidos (reacción plasmar)

b) Aldehídos producidos por oxidación selectiva (Reacción PAS)
c) Aldehídos producidos por hidrólisis selectiva (Reacción de Feulgen).

La reacción de FEULGEN (1884-1955) es una técnica histoquímica de coloración

desarrollada por Roberto Feulge, químico alemán en 1924 para detectar selectivamente la
presencia de ADN. Es una de las más importantes reacciones citoquimicas tanto por su
sencillez como por su reproductividad.

El materia a procesar puede ser de diversa naturaleza, pudiendo utilizarse monocapas de

cultivos celulares, frotis de biopsias de aspiración con aguja fina, preparados exfoliativos,
citocentrifugados de ascitis, orina, liquito obtenido por punción de la pleura, o liquido
cerebrospinal, así como cortes de tejido fijados con formalina incluidos en parafina.

Los tejidos se someten a una hidrolisis acida y luego se tratan con el reactivo de SChiff para
aldehídos. En la preparación de reactivo, la fucsina básica se trata con anhídrido sulfuroso,
transformándose en u compuesto incoloro (ácido bis- N aminosulfónico o reactivo de SChiff)
que luego es recoloreado por los grupos aldehídos presentes en el tejido. El análisis cualitativo
en microscopia de campo claro revela la presencia de un color rojo purpureo 0 o magenta del
que se tiñen los cromosomas de preparados citológicos, permaneciendo las otras áreas
relativamente incoloras. En el núcleo las áreas de cromatina condensada son positivas, y el
nucléolo es feulgen negativo. El análisis cualitativo revela la presencia de ADN midiendo la
cantidad transmitida a través de núcleos teñidos con la presente técnica.

Dentro de los fundamentos de la técnica se pueden resumir dos etapas:

1. Si el ADN se trata con un ácido caliente (hidrolisis), las bases puricas se separan
(extracción de purinas a nivel de la unión desoxirribosa – purinas del ADN,
obteniéndose un ADN apúrico, sin afectarse esencialmente el eje de la molécula
desoxirrobosa- fosfato- desaoxiribosa- fosfato…). Por lo tanto la sesaxirribosa presente
en el ADN es la responsable de ña reacción de Feulgen.
2. Los grupos aldehídos (CHO), del azúcar libres en todos los lugares donde se hidrolizo
una purina (por adición de moléculas de agua, en puntos específicos), al añadir el
reactivos de Schiff, reacciona con la fucsina decolorada del reactivo, dando un
compuesto de color rojo magenta o rojo purpúreo característico.

La reacción de Feulgen como se puede advertí es específica para ADN, y ni el ARN ni

cualquier otra sustancia celular dará el tipo preciso de respuesta coloreada. En el caso del
ARN, este no libera aldehídos, pues el eje de su molécula (ribosa-fosfato-ribosa-fosfato … =
es más sensible a la hidrolisis que la unión entre la desoxirribosa y su base
correspondiente, por esta razón la mayor parte del ARN se degrada a nucleótidos durante
la hidrólisis.

III. MATERIAL Y METODOS

 Bulbos de cebolla con meristemos en desarrollo

 HCL N
 Reactivo de Schiff
 Agua sulfurosa (metabisulfito 10% , 5ml; HC 1N 5ml; 90 ml de agua destilada)
 Pisetascon agua destilada
 Luna de reloj
 Beackers de 250 ml.
 Microscopios.
 Laminas, laminillas
 Hojas de afeitar
 Pipetas Pasteur, goteros.

IV. METODOS

1. Dejar desarrollar el sistema radicular de bulbos frescos de allium cepa.

2. Cortar de 1 a 2 ml del ápice y colocarlo en una luna de reloj con una solución de HCl 5N
a 20C (temperatura ambiente) por espacio de 10 a 15 minutos. Lavar con agua
destilada.
3. Colocar gotas de reactivo de Schiff y colorear por espacio de 15 a 20 min. A
temperatura ambiente.
4. Eliminar el colorante y lavar con agua sulfurosa 2 a 3 veces 5 minutos.
5. Lavar con agua corriente.4Realizar un aplastado en una gota de agua siulfurosa con
ácido acético 50%
6. Observar los preparados a mediano y mayor aumento.
7. Las preparaciones permanentes pueden realizarse por el método de nieve carbónica,
congelando la muestra y retirando la laminilla con una hoja de afeitar, luego
deshidratando en alcohol en 7 = %, 96% y absoluto para después mostrar en bálsamo
de Canadá o euparal.
Reactivo de Schiff: Componentes: Fucsina básica 1 gr, Bisulfito de Sodio 1 gr., Ácido
clorhídrico QP. 1,2, agua destilada 200 ml., carbón vegetal 1.5 gr.
HCl 5N: medir 20.75 ml de Hcl concentrado y completar a 50 ml con agua destilada.

V. RESULTADO
VI. CONCLUSIONES
VII. CUESTIONARIO

1. Cuál es el fundamento de la reacción de PAS o Perrodic Acid Schiff

2. Que es la citofotometría y en qué consisten los métodos citofotometricos para
analizar cuantitativamente el ADN
3. Que aplicaciones tiene la reacción de Feulgen como técnica de citodiagnostocp en
medicina.

ANEXOS
Reactivos de Schiff (Laboratorio de Citogenética Embrapa Recursos genéticos y
Biotecnología 2004)

3.5 gr de Fucsina Básica

5,7 gr. De Metabisulfito+6 gr. De carbón activado

300 ml de Hcl 0.15N

Agitar todo por dos horas, adicionar carbom por mas de 2 horas a temperatura
ambiente. Filtrar dos veces o si es necesario hasta ka solución quede cristalina.
Gusrdar en frasco oescuro en la refrigeradora.

HCl 0.15: medir 13.3 mlde Hcl, completar para 100 ml de agua destilada.

Reactivos de Schiff (Basado en Greihuber y Ebert 1994)

Dos gramos de Fucsina insulta en 60 ml de agua.

7,6 gr de metabisulfito disuelto de 340 mL de agua destilada.

Mezclar las dos soluciones y agitar por 3 ½ hora con agitador magnético

Adicionar un gramo de carbón activado a la solución y agitar nuevamente.

Filtrar la solución con ayuda de una bomba de vacío.

Si la solución aun no estuviera cristalina, adicionar más carbón y filtrar nuevamente.
Repetir si es necesario.

El PH de la solución fina debe estar entre 1,9 y 2,2. Si es necesario ajustar el pH con
NaOH o Hcl. Guardar en frasco oscuro en la refrigeradora.

Reactivo de Schiff (Basado en García, 1990)

0,8 gr. De fucsina básica

0,8 ml de ácido clorhídrico concentrado

400 ml de agua destilada en ebullición}

Mezclar todo y agitar en agitador magnético por 20 minutos.

Agregar 26 gr de metabisulfito de sodio

Agitar en agitador magnético por 30 minutos

Agregar 3,2 gr de carbón activado y dejar decantar por 1 a 2 horas

Filtrar

Ajustar el PH entre 1,9 a 2,0

Guardar en frasco de vidrio en la refrigeradora.