Aula Tempo Real

Fundamentos da PCR Quantitativa em
Tempo Real (qPCR): uma abordagem

teórico-pratica
Especialista de Produtos
The world leader in serving science

1
• Fale um pouco sobre você
• Qual é a sua experiência com qPCR?
• Quais são suas expectativas para o

treinamento?
2
Objetivo
• Treinamento da utilização da PCR Quantitativa em Tempo

Real para a quantificação e detecção de ácidos nucleicos,
nas plataformas da Applied Biosystems/Thermo Fisher
Scientific.
3
Resumo
• Princípios da PCR Quantitativa
• Introdução à qPCR
• Sistemas de Detecção (SYBR e Taqman)
• Equipamento de Real Time PCR
• Manutenção e Calibração
• Ensaios Qualitativos
• Genotipagem de SNPs
• Ensaio de presença/ausência
• Ensaios Quantitativos
• Quantificação absoluta
• Quantificação relativa
• Otimização de Reações
• Resolução de Problemas
4
Treinamento - Parte integrante do equipamento
https://learn.thermofisher.com/br
5
Importante
• Tempo integral: 9h as 18h

• Dedicação exclusiva dos participantes
• Certificação
• Presença > 90 %
6
Por Favor
7
Suporte – Literatura e softwares
8
Suporte – Literatura e softwares
9
Suporte e Literatura
10
11
12
13
Symphoni qPCR®
Partilha de
arquivos de
corrida, Pptx,
Excel ...
• Combina mais arquivos de corrida .eds em um projeto:

• 500 Taqman® Array Card/ 384W Plates, 100 OpenArray® Plate
• Analisa 100 placas em 4 min (GEx) ou 10 min (GT)
14
Introdução à PCR Quantitativa em
Tempo Real

15
PCR: reação para amplificação de segmento específico de
DNA
PCR
DNA total
reação enzimática de polimerização de DNA in vitro
16
Como a PCR é possível?
Polimerase
Mg2+
DNA
Primers
Nucleotídeos
17
Amplificação Exponencial
18
Limitações da PCR convencional
• Intensa padronização
• Baixa sensibilidade
• Baixa resolução (≥ 1 log)
• Colorações não quantitativas
• Contaminação (brometo)
• Discriminação baseada apenas no tamanho do amplicon
• Pobre discriminação entre o tamanho dos amplicons
• Não automatizado
• Necessidade de pós-processamento do produto da PCR
• Resultados não são expressos em números
19
PCR em tempo real - qPCR
Polimerase
Mg2+
DNA
Primers
Nucleotídeos
22
PCR em tempo real - qPCR
 método baseado em PCR
 monitoramento contínuo do sinal fluorescente ao longo

dos ciclos de amplificação - permite análise dos dados
durante todo o proceso
 conversão do sinal fluorescente em valor numérico para

cada amostra
23
Como funciona a PCR em Tempo Real?
A fluorescência irá aumentar de maneira proporcional à

amplificação do fragmento
PCR PCR
PCR product
Final da PCR
24
PCR em Tempo Real
Independente do modelo, os instrumentos de Real Time

possuem 3 partes em comum:
2. Fonte Luminosa
3. Detector
1. Termociclador
25
Taxa de Duplicação de DNA por PCR
Na teoria
Log quantidade
DNA
Na prática
Ciclos
26
Fases de uma PCR
Platô
Linear
Exponencial
27
Real-Time x End-Point
Leitura ‘End
Point’
linear
log
Quantificação
‘Real Time’
28
PCR Quantitativa em Tempo Real
• Método usado para medir a quantidade de DNA/cDNA inicial amplificado por PCR
• Há uma relação quantitativa entre a quantidade inicial da amostra alvo e a

quantidade de produto da PCR após um determinado número de ciclos.
P = Produto final
P=T (1+E)n
T = Template no início da
Pfinal reação
Tinicial = n = Número de ciclos
(1+E)n
E = Eficiência
29
Amplificação Geométrica
Eficiência de 100% Eficiência de 85%
30
Eficiência de Amplificação
Depende de:
● Preparo da reação (pipetagem)
● Qualidade do template (integridade do DNA/cDNA)
● Presença de inibidores (qualidade de extração)
● Desenho dos primers (Tm, estruturas secundárias)
● Condições de termociclagem (T de anelamento, rampa)
● Qualidade dos reagentes
● Concentração dos reagentes
● Tamanho do amplicon
31
Entendendo a curva de amplificação

32
Gráfico de Amplificação: ciclo vs. fluorescência
33
Baseline
Fase onde a intensidade de sinal de produto amplificado ainda não

ultrapassou a intensidade da fluorescência encontrada no meio.
Ciclos iniciais da
PCR com poucas
mudanças no sinal
de fluorescência
Baseline
34
Baseline
Background - fluorescência dos primeiros ciclos da PCR.
35
Baseline
Em que ciclo começa?
36
Baseline
Em que ciclo termina?
37
Baseline
O que acontece se o baseline for muito baixo?
Formato sigmoidal
Sinal fluorescente não
informativo
38
Baseline
O que acontece se o baseline for muito alto?
Efeito dupla cascata

Perda de sinal
fluorescente
informativo
39
Threshold
Nível arbitrário de fluorescência estabelecido acima do Baseline e dentro
da região de crescimento exponencial.
40
Threshold Cycle (Ct) ou Quantification Cycle (Cq)
0.35
Quantidade de ciclos
de PCR que cada
amostra precisa
para atingir o
threshold
9 13 15.8 20.1 23.8 27.7 30.9 34.1
41
Threshold Cycle (Ct)
A posição de cada curva

de amplificação depende
do número inicial de cópias
de DNA presente em cada
amostra.
42
1.25mil
2.5mil
5mil
10mil
20mil
CT aumenta um (1)
ciclo quando o número
inicial de cópias na
reação é a metade
CT=
43
44
Multicomponent
45
Reporter Normalizado (Rn)
• Sinal fluorescente de um “reporter dye” normalizado pelo sinal fluorescente de uma
referência passiva (ex: ROX)
• ROX: fluorescência presente no meio (correção do volume e resolução de problemas)
• Normalização: fluorescência do alvo ÷ fluorescência ROX
46
Fluorescência
Fluorescência
(Reporter)
(RoxTM)
(Reporter)
(RoxTM)
Reporter/RoxTM
Poço 1 Poço 2
Fluorescência
Fluorescência
Rn
(Reporter) (Reporter)
Poço 1 Poço 2
47
36 réplicas analisadas
com a referência
passiva ROX™
36 réplicas analisadas
sem ROX™
48
Duas considerações sobre o ROX™
• Todos os Master Mixes de qPCR da Applied contém ROX™
• Os softwares da Applied realizam a normalização automaticamente pelo ROX™
• Caso não queira usar o ROX™, deve-se desabilitar a referência no software
para uma análise exata.
49
Reporter Normalizado (Rn)
• Reporter normalizado corrigido pelo Baseline (Rn)

− Rn (ciclo) = Rn (ciclo) – Baseline, onde Rn = Reporter normalizado
CT
50
Reporter Normalizado (Rn)
Rn Antes da subtração do baseline
Rn Após a subtração do baseline
51
INTERVALO!!!
52
Sistemas de Detecção:
SYBR® Green e TaqMan

53
Sistemas de Detecção
• A Applied Biosystems oferece dois tipos de químicas para detecção de produtos
de PCR:
• Agentes ligantes de DNA (SYBR® Green I e MeltDoctor ®/SYTO 9)
• Sondas de hidrólise (Química TaqMan®)
54
Agentes Ligantes de DNA
55
56
57
58
Uma consideração sobre o SYBR Green
• Liga-se inespecificamente a qualquer fita

dupla de DNA
• Produtos não específicos geram sinal
• Resultados quantitativos incorretos
59
Curva de Dissociação (melting curve)
Desnaturação do DNA
Fluorescência
Temperatura
60º 95º
60
• Experimento utilizado para detectar e discriminar moléculas de ácido
nucléico dupla fita resultantes da reação de PCR
• Temperatura de melting (Tm): temperatura onde metade do produto da
PCR está dissociado (desnaturado)
• Tm: depende do tamanho do fragmento e %GC
61
Quantidades diferentes
do mesmo template
62
Target Amplification
Target Amplification
NTC
NTC
Produtos inespecíficos (dímeros) são comuns nos poços negativos

e facilmente diferenciados pela curva de dissociação.
63
Produtos inespecíficos
(dímeros) também são
comuns quando há excesso
de primers em uma reação
ou quando houve falha no
desenho dos primers (grande
região de homologia).
64
Sondas TaqMan®
FRET
• Sondas Lineares (de hidrólise):
> Propriedade 5’- 3’da Taq DNA polimerase
• PCR inclui, além dos primers, uma sonda conjungada com:

> Fluorocromo “reporter”  emite fluorescência
> Molécula “quencher”  absorve fluorescência emitida pelo reporter (sonda

intacta)
65
Sondas TaqMan®
R 5’ 3’ Q
5’Nuclease
R
Q
66
Sondas TaqMan®
• Características:
• Altamente específica e sensível

• Não permite, nem precisa de curva de dissociação
• Permite multiplex
• Localiza-se ~1-5 bases de um dos primers
• Tm deve ser ~10°C maior que Tm dos primers
• A primeira base não pode ser G (efeito quencher)
• Não pode ter mais Gs do que Cs
• Não deve ter mais que 3 bases consecutivas iguais
67
Sondas TaqMan®
StepOne™ Real-Time PCR

System
TaqMan® Reporters: FAM™, VIC®, JOE™
68
Sondas TaqMan®
StepOne Plus™ Real-Time

PCR System
TaqMan® Reporters: FAM™, VIC®, JOE™, NED™
69
Sondas TaqMan®
7500 / 7500 Fast Real-Time

PCR Systems
• JUN
• ABY
TaqMan® Reporters: FAM™, VIC®, JOE™, NED™,
CY3™, ABY®, JUN®, CY5™
70
Tipos de sondas TaqMan®
− TaqMan® TAMRA™ Probes
> Quencher fluorescente (TAMRA™)
> ~30-40 bases
− TaqMan® MGB Probes

> Quencher não fluorescente (NFQ)
> Sonda com cauda MGB (Minor Groove Binding)
> ~15-20 bases
− TaqMan® QSY®
> Quencher novo não fluorescente (QSY ®)
> ~30-40 bases (sondas TAMRA, NFQ ou BHQ não precisam de redesenho)
> Eficiência máxima para formato multiplex

www.lifetechnologies.com/multiplexqPCR
71
Sondas TaqMan®
Quenchers: TAMRA™/ vs MGB-NFQ
Duas considerações:
•TAMRA é fluorescente e ocupa um filtro

•A probe é maior (~30-40 bases)
• Menos específico
TAMRA
NFQ
72
Sondas TaqMan®
Quenchers: TAMRA™ vs MGB-NFQ
73
TaqMan® ou Sybr® Green?
TaqMan® SYBR®
• Pros:
• Pros:
• Mais específico
• Pode ser mais barato
• Não precisa de curva de melt
• Possível multiplex
• Cons:
• Sem otimização
• Menos específico
• Milhões de ensaios validados
por bioinformática • Necessária curva de melt
• Sem multiplex
• Cons: • Grandes otimizações
• Pode ser mais caro • Usuário necessita fazer
estudos de bioinformática
74
Purificação de ácidos nucleicos

75
Fluxograma para isolar DNA/RNA
Coleta da Amostra
Linhagens
Estabilização
Celulares
Homogeneização Tecidos
Isolamento DNA/RNA
Sangue Análise quanti/quali
Ensaios
76
Métodos para purificação de ácidos nucleicos
Filtro com Fibra de

Método Orgânico Beads Magnéticas
Vidro (GFF)
- ISTNGu/Fenol - ISTNGu + Álcool -Beads Magnéticas
Protocolo - Extração - Filtro G/F
- Precipitação: álcool
- Gold standard - Pureza - Protocolo simples
- Baixo custo - Fácil, rápido - High throughput
Vantagens - Altamente adaptado - Variedade amostras - Alta sensibilidade
- Amostras difíceis - Médio throughput - Alta consistência
- Baixo throughput -Entupimento do Filtro -Necessita de rack
Desvantagens - Produto tóxico -Processamento de magnética
- Potencial inibição amostras > 24 e <96
Tempo ~2 horas ~60 minutos ~30 minutos
Produto Trizol Plus™

TRIzol ou DNAzol Kit kit
PureLink® MagMaxTM
Trizol Plus
77
Fluxograma para Isolar RNA
Coleta da Amostra
Linhagens
Celulares Estabilização
Homogeneização
Tecidos
Isolamento RNA
Sangue
Análise quanti/quali
Ensaios
78
Métodos de quantificação
• Espectrofotômetro (absorbância UV)
• Simples, sensível, amplamente utilizado
• Quantificação e pureza
• Agilent Bioanalyzer
• Ideal para medir a integridade
• QubitTM
• Fluorímetro
• Corante específico
• Requer quantidade pequena de amostra (1 µL- 20 µL)
• Maior precisão e sensibilidade do que leitura de abs. em UV
79
Análise qualitativa de ácidos nucleicos
• Pureza (A260/A280 e A260/A230)

• Integridade
80
Pureza
•Espectro de Absorbância: Absorbância máxima em 260nm

• A260/280 = ~1.8-2.0 (DNA)
• A260/280 = ~1.9-2.1 (RNA)
•A260/280 < 1.7

• Indica presença de proteínas ou outros contaminantes que absorvem
em 280 nm
•A260/230
• Medida secundária de pureza
81
Analisando a Integridade do RNA
• Eletroforese em gel de agarose desnaturante
RNA degradado
RNA intacto
- Bandas 28S e 18S
- Razão de 2:1 ratio
apresentam smear
entre rRNAs 28S e
- Razão 28S/18S muito
18S
baixa
82
Síntese de cDNA

83
Dogma Central da Biologia Molecular
Transcrição Tradução
Amplificação DNA RNA Proteína
B
PCR Transcrição Reversa
A RT
A: Transcriptase Reversa
B: DNA Polimerase (ex: AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, UP)
84
RT-PCR
• Reação de transcrição reversa seguida de PCR

• Material de partida: RNA
RT PCR
RNA cDNA DNA
1ª fita
85
Tipos de primers
Oligo (dT) Randômicos Específicos
Two steps
One step
87
Tipos de primers
 Opções de primers:
− Random Primers: todos os RNAs servem como molde
− Oligo dT: específico para mRNA - Cauda poli (A)
− Primer Específico: complementar ao RNA alvo
* in Nature Technology Feature 2011
88
1-Step x 2-Step RT-qPCR
1-Step 2-Step
Passo 1:
Conversão do
RNA para
cDNA
Único Tubo:
Conversão do
RNA para cDNA,
amplificação e
quantificação do
cDNA
Passo 2:
Amplificação e
quantificação do
cDNA
89
Aspectos para considerar:
One-step Two-step
• Kit contém enzima para RT e • RT e PCR em tubos separados

enzima para amplificação
• RT feita com primers randômicos
• RT e PCR no mesmo tubo e/ou oligo dT
• Necessita de primer específico • Mais lenta
para a RT
• Maior chance de erro
• Mais rápida
• Maior risco de contaminação
• Menor chance de erro
• Maior flexibilidade
• Menor risco de contaminação
• Permite usar cDNA em mais de
• Formato mais conveniente uma reação
• Demanda alta
90
Comprovar remoção do DNA
• Reação de amplificação RT(-)
RT(+)
RT(-)
RT(-) : Amostra de RNA que não passou pela transcrição reversa.

Usada para verificar possíveis contaminações de DNA genômico.
91
SuperScript® VILO
Variable Input, Linear Output
• SuperScript® III + tampão otimizado

• Alto rendimento
• Linearidade (1 pg – 2.5 ug RNA)
• Indicada para ensaios de PCR em tempo real
92
INTERVALO!!!
93
Aplicações Qualitativas
Ensaios de Presença/Ausência

94
Ensaios Qualitativos
Genotipagem (SNP)
End-Point Mutação
Qualitativo Detecção de patógenos
Farmacogenômica
Translocações
Eficácia de terapias
95
• Detecção de uma sequencia: está presente ou não?
• Ensaio não é quantitativo
• Usa um controle interno positivo (IPC) para identificar falsos

negativos
96
Configuração sugerida
Alvo
FAM Quencher
IPC
VIC Quencher
IPC: Internal Positive Control – Controle positivo da PCR.

Geralmente um DNA exógeno inserido na reação juntamente com um par
de primers e sonda para amplificá-lo.
97
Reação realizada com TaqMan® Assays em multiplex:
Ambos, alvo e IPC são amplificados

simultaneamente em um mesmo tubo.
98
Setup IPC
• Unknown (patógeno) + IPC
• Negative control + IPC
• Negative control + blocked IPC
99
Dois controles essenciais
• No-template controls (NTCs) – reação contém todos os componentes para a

PCR, exceto o template desconhecido (unknown)
• Somente o IPC deverá amplificar
• No-amplification controls (NACs) – sem a amostra desconhecida; o agente

bloqueador para o IPC é adicionado separadamente
• Não pode haver qualquer amplificação
100
3 etapas de leitura
Leitura “Pre-read”
Leitura “Real Time” OPCIONAL
Leitura “Post-read”
101
Amostras positivas
Controles negativos
Amostras negativas
102
103
Saúde Alimentar
104
Saúde animal
105
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
(IPC)
•Primers + sonda TaqMan para

um alvo exógeno
•Concentração primer limitante
•Reporter: VICTM
•Quencher: TAMRATM
•Monitoramento de inibição na
PCR
P/N 4308323
* Alternativa: pode-se também utilizar um alvo endógeno
para monitorar eficiência de extração e inibição na PCR
(ex: beta-actina)
106
Aplicações Qualitativas
Genotipagem de SNPs

107
Ensaios Qualitativos
Genotipagem (SNP)
End-Point Mutação
Farmacogenômica
Translocações
108
Single Nucleotide Polimorphism (SNP)
• SNPs são alterações de base única na sequência de nucleotídeos, que

podem ou não apresentar uma repercussão funcional.
...GAC ACT TTC GAA CAC GTG ATA GAA GAG CTG...
D T F E H V I E E L
...GAC ACT TTC GAA CAC ATG ATA GAA GAG CTG...
D T F E H M I E E L
109
SNPs
• Farmacogenômica/genética
• Variação genética afetando resposta a medicamentos
• Doenças genéticas
• SNPs como causa de doenças
• SNPs associados a doenças
• Mapas para estudos de desequilíbrio de ligação
• Agricultura e Pecuária
• Agricultura
• Pecuária: qualidade da carne/leite
• Evolução humana e genômica
110
SNPs
• Organismo diplóide: 2 cópias
TTGCGCAATAAACCTGCATGCATGCATGCTGCCCTCGCATTTTA
AACGCGTTATTTGGACGTACGTACGTACGACGGGAGCGTAAAAT
TTGCGCAATAAACCTGCATACATGCATGCTGCCCTCGCATTTTA
AACGCGTTATTTGGACGTATGTACGTACGACGGGAGCGTAAAAT
Um G/A SNP (Indivíduo heterozigoto)
111
SNPs
Três possibilidades de genótipos para um SNP G/A
ACCTGCATGCATGCATGC
TGGACGTACGTACGTACG
ACCTGCATGCATGCATGC
ACCTGCATGCATGCATGC
TGGACGTACGTACGTACG
TGGACGTACGTACGTACG
ACCTGCATACATGCATGC
ACCTGCATACATGCATGC TGGACGTATGTACGTACG
TGGACGTATGTACGTACG
ACCTGCATACATGCATGC
TGGACGTATGTACGTACG
112
Ensaio de discriminação alélica
TaqMan® Allelic Discrimination Assay
Sondas Alelo-específicas
FAM™ MGB
C
G
VIC® MGB
T
A
dsDNA de células diplóides
113
Alelo 1
VIC Quencher Homozigoto alelo 1
= VIC
Alelo 2
FAM Quencher Homozigoto alelo 2
= FAM
Heterozigoto alelo 1 + 2
+ = VIC + FAM
114
Sondas com cauda MGB
115
3 etapas de leitura
Leitura “Pre-read”
Leitura “Real Time” OPCIONAL
Leitura “Post-read”
116
Plot de discriminação
FAM (G/G)
Ambos (G/A)
VIC (A/A)
NTCs
117
Relatório final dos genótipos
119
Concentração de DNA
• Usa somente 1-20 ng de DNA genômico por reação
• Pureza e homogeidade das amostras permitirá obter uma melhor clusterização

dos genótipos
• SEMPRE correr No Template Controls (NTCs)

• Checar contaminação.
• Permite o instrumento realizar a denominação automática dos genótipos
de forma mais fácil.
120
Dicas para melhorar os resultados
• Homogeneidade das amostras: todas as amostras na placa devem estar na mesma

quantidade e com mesmo grau de pureza
• Controles: uma amostra representante de cada genótipo e controle negativo em toda

placa
• Utilizar o “ Genotyping MasterMix ” : mastermix otimizado para aumentar a

estringência das sondas, aumentando a especificidade
• Aumentar o número de ciclos: aumentar o número de ciclos de 40 para 50 pode

ajudar a melhorar a separação entre os clusters
• Aumentar o tempo de extensão/anelamento: aumentar o tempo de 60 segundos para

1 minuto e 30 segundos
121
Ensaios prontos TaqMan
~4.5 milhões de ensaios prontos
122
Ensaio de discriminação alélica (Symphoni® Módulo
Genotyping)
• Análise Multi-placa
• Análise integrada entre resultados de Genotipagem e análise
da curva: curvas de amplificação e gráfico de
multicomponent
• Possibilidade de análise de resultados por ciclo
123
Ensaio de discriminação alélica (Symphoni® Módulo
Genotyping)
Ensaio 1 Ensaio 2
124
HRM (High Resolution Melt)

125
HRM
Corantes HRM vs SyBR Green
Novos corantes:
• MeltDoctor®
• SYTO®9
Visualização dos dados

utilizando uma curva
padrão de dissociação:
• Melhor separação dos
alelos (Tms)
• Fácil identificação de
heterozigotos
126
HRM
Plot de diferença
• Uma alternativa é mostrar o gráfico por meio das diferenças de padrão de
melting
• Adota-se uma amostra como o 'normal' (linha de base) e apresenta os
demais em função da semelhança com essa referência.
127
INTERVALO!!!
128
Ensaios Customizados
Desenho de Oligos e Sondas

129
Custom TaqMan® Gene Expression/Genotyping Assays
• Usuário envia arquivo, Thermo Fisher (Applied Biosystems) envia o ensaio
https://www.thermofisher.com/order/custom-genomic-products/tools/genotyping/
https://www.thermofisher.com/order/custom-genomic-products/tools/gene-expression/
130
A Família TaqMan®
131
Escolha das Sequências Alvos
• Biologicamente relevante
• Ambiguidades – substituir por N
• Análises de bioinformática
• Escolha dos “target sites”
132
Avaliação prévia da sequência alvo
Significado biológico:
mRNA/cDNA x gDNA
• Expressão gênica: expressão espacial/temporal; variantes de

splicing; regiões de alta homologia (genes parálogos,
ortólogos)
• SNP – mais de uma linha de evidência experimental; dados

de frequência alélica mínima; SNP identificado na população
de análise
133
Sequência única
• verificar se a sequência alvo é única dentro do organismo de

estudo para garantir o desenho de primers/sondas únicos.
Outras versões do gene?
• se grandes regiões de similaridade com outras sequências

em uma família de genes forem evidenciadas, utilize uma
área diferente da sequência que seja única ao seu gene de
interesse
• evitar polimorfismos
134
Splicing Alternativo
135
136
• Mascarar repetições
http://www.repeatmasker.org/
137
Resultado da análise (output)
138
Primer Express Software
Primer Express software é uma ferramenta para desenho

de sondas e primers para serem utilizados com os
equipamentos de PCR em Tempo Real:
139
As sondas e os primers desenhados pelo software são utitlizados para as

seguintes aplicações:
• Quantificação Absoluta/Relativa
• Discriminação Alélica
140
TaqMan® Probe Primer
(recomendados amplicons de 50 a 150pb)
Conteúdo de G/C de 20 a 80%
Evitar repetição consecutiva da mesma base

Repetições de mais do que 4 bases Gs devem ser evitadas
Usando Primer Express® software, o Usando Primer Express® software, o

Tm deve ser de 68 a 700C Tm deve ser de 58 a 600C
Nenhum G na extremidade 5’
Os 5 nucleotídeos da extremidade 3’
Selecionar a fita que contenha não devem ter mais do que dois Gs e/ou
mais Cs que Gs Cs
141
Sondas e primers customizados
• Usuário desenha, Thermo Fisher sintetiza os primers e sondas

• Primers
• Liofilizados (10.000, 80.000 e 130.000pmol)
• Ressuspender a 100 µM em TE
• Alíquotas 50 µM e 5 µM em H2O
• Sondas
• 100 µM: alíquotas 50 µM e 5 µM em H2O
• TaqMan® MGB Probes
• TaqMan ® TAMRA™ Probes
• TaqMan® QSY® Probes
142
Primer Dimers
• Hairpin (interação intramolecular)
• Self dimer (interação intermolecular)

ex: primer forward x primer forwad
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
• Cross dimer (interação intermolecular)

ex: primer forward x primer reverse
5’ 3’
3’ 5’
143
Conhecendo o seu instrumento:
Hardware, Manutenção e Calibrações
7500 e 7500 Fast

144
7500 e 7500 Fast
145
Características do 7500 Standard
• Pode ser utilizado tanto com placas, strips ou tubos individuais opticos
• Flexibilidade para utilização de outros dyes
• Fonte de Excitação: lâmpada halógena

• Vida útil de ~2.000 horas
• Monitoramento pelo software
• Fácil substituição
146
Características 7500 Fast
• Pode ser utilizado somente com placas ou strips, sendo que para uso de strips é
necessária aquisição de uma bandeja específica
• Flexibilidade para utilização de outros dyes
• Termociclador de alta velocidade (7500 Fast)
• Fonte de Excitação: lâmpada halógena

• Vida útil de ~2.000 horas
• Monitoramento pelo software
• Fácil substituição
147
Sistema de Ciclagem
Instrumento 7500 System 7500 Fast System
Volumes 25-100µL 10-30µL
•Standard Optical 96 -well •Optical Fast 96-well plates

Consumíveis plates •Optical Adhesive Covers
•8-strip 0.2mL tubes •8-strip 0.1 mL tubes
•0.2mL tubes •Optical Flat Caps
•Optical Adhesive Covers
•Optical Flat Caps
148
Placas
Opção de correr volumes menores
Fast plate Standard plate
Nota: As placas Fast são específicas para o bloco

do instrumento, não para o módulo de corrida.
Placas Fast podem ser corridas no módulo
standard.
149
Strips
Disposição dos strips/tubos
Bandeja específica para

tubos/strips
150
Substituição da Lâmpada
151
Troca da Lâmpada
O equipamento indica o estado

da lâmpada, através da medição
da corrente.
Importante!!!
152
Sistema Óptico (7500 Real-Time PCR System)
halogen light
Excitation
filter wheel
mirror
lens CCD
Emission
excitation emission filter wheel
96 well plate
154
Sondas TaqMan®
7500 / 7500 Fast Real-Time

PCR Systems
• JUN
• ABY
TaqMan® Reporters: FAM™, VIC®, JOE™, NED™,
CY3™, ABY®, JUN®, CY5™
155
Sistema de Leitura Multiplex
4 Color Multiplex – detecção de 5 cores:
FAM, VIC, NED, Cy5 e ROX (referência passiva)
Cy5 FAM
VIC
NED
156
Calibrações

157
Calibrações
ROI: Semestral (mapeia as posições dos poços,

determina o tempo de exposição da camera e
verifica contaminação do bloco)
Background: Mensal (quantifica ruído basal do

equipamento)
Óptica (7500/7500Fast): Semestral (normalização

dos filtros de emissão e excitação)
Pure Dyes (Spectral): Semestral (determina a

contribuição do sinal de cada fluoróforo em cada
filtro)
158
Calibração ROI
159
Calibração Background
Mede o sinal gerado

pela placa, selo adesivo
e água, que durante a
análise dos resultados,
será subtraído do total
de emissão
fluorescente de cada
poço.
Sinal tem que ser menor do que 72000 FSU (filtros A, B, C e D) e 90000 (filtro E)
160
Background acima do limite
Limpeza do Bloco
Limpar com:
• Água Ultrapura
• Etanol 100%
• Hipoclorito10% (seguido de água)
161
Calibração Óptica (7500 e 7500 Fast)
• Compensa efeitos físicos do filtro E

• Realizada com a placa ROI
162
Calibração Pure Dye
Apresenta ao equipamento as
diferentes cores que serão
usadas, para poder distinguir
a contribuição individual de
cada um dos corantes na
fluorescência geral coletada.
163
Perfis da Calibração Pure Dye
164
Placa de Verificação/Instalação RNase P
Curva padrão com 20K, 10K, 5K, Amplificação de 36 réplicas

2.5K e 1.25K cópias em quatro com 10K e 5K
réplicas
165
Manutenção do Equipamento
ABI Prism 7500 / 7500 Fast
•Troca da lâmpada
•Limpeza periódica do bloco
•Calibrações (ROI, background, óptica e espectral)
Computador:
•Não instalar outros aplicativos que não sejam recomendados pela AB
•Não mudar a configuração
•Não deixar antivírus automático
•Back up de corridas e desfragmentação do disco uma vez por mês
166
Conhecendo o seu instrumento:
Hardware, Manutenção e Calibrações
StepOne e StepOne Plus

167
168
StepOne™ Real-Time PCR System
StepOneTM StepOne PlusTM

• Bloco com 48 poços (usar placas
• Bloco com 96 poços (usar
ou tubos) placas ou tubos)
• Sistema de 3 cores
• 6 blocos independentes
• Velocidades Fast e Standard
• Volume de reação: 10-30 μL • Sistema de 4 cores
• Standalone ou co-located • Velocidades Fast e Standard
• Volume de reação: 10-30 μL
• Standalone ou co-located
169
Base para strips e tubos
Step One Plus
Step One
170
Sistema Óptico
StepOne/StepOnePlusTM Real-Time PCR System
LED
Fotodiodos
Emission
Filter
96-Well Plate
171
Sondas TaqMan®
StepOne™ Real-Time PCR

System
TaqMan® Reporters: FAM™, VIC®, JOE™
172
Sondas TaqMan®
StepOne Plus™ Real-Time

PCR System
TaqMan® Reporters: FAM™, VIC®, JOE™, NED™
173
Calibrações

174
Calibrações
Espacial: 18 meses (mapeia as posições

dos poços)
Background: Mensal (quantifica ruído basal

do equipamento)
Dye (Spectral): 18 meses (determina a

contribuição do sinal de cada fluoróforo em
cada filtro)
175
Limpeza do Bloco
Limpar com:
• Água Ultrapura
• Etanol 100%
• Hipoclorito10% (seguido de água)
176
Calibração Background
1. Verificar status
(passou/ falhou)
2. Selecionar todos os
poços da placa
3. Verifique o dado
bruto, verificando se
não há poços
contaminados
4. Caso os resultados
sejam aceitáveis,
clicar em Finish
5. Salvar a calibração
Background
177
Calibração de Dyes
1. Verificar status (passou/ falhou)

2. Para cada dye, (a) selecione os poços
respectivos usando o Ctrl e (b) verifique
se o dado bruto aparece com o mesmo
perfil para todos os poços da mesma
cor, no filtro correto e com intensidade
fluorescente dentro da faixa aceitável
3. Caso os resultados sejam aceitáveis,
clicar em Plate 2
4. Repetir o passo 2b
5. Caso os resultados sejam aceitáveis,
clicar em Finish
6. Salvar a calibração de Dyes
178
Placa de Verificação/Instalação RNase P
• Precisa ser corrida apenas na

instalação do StepOne/StepOne Plus
• A placa já vem pronta para correr
(quantificação absoluta)
• Pode ser corrida pelo computador ou
por um Wizard no próprio instrumento
• No final, verificar os resultados e
salvar
179
Manutenção do StepOne/StepOne Plus
• Descontaminação do bloco
• Calibrações (espacial, background e espectral)
Computador:
• Acesso remoto: trabalhar em rede segura
• Não instalar outros aplicativos que não sejam recomendados pela AB
• Não mudar a configuração
• Não deixar antivírus automático
• Back up de corridas e desfragmentação do disco no máximo uma vez por mês
180
INTERVALO!!!
181
Tipos de Quantificação

182
Carga Viral
Absoluta Curva Padrão
Real-Time
Quantitativo Expressão Gênica
Δ Δ Ct
Relativa MicroRNA
Curva Padrão siRNA
Genotipagem (SNP)
End-Point Mutação
Farmacogenômica
Translocações
183
Quantificação Absoluta:
• Trabalha com unidades palpáveis
• Determina n° de cópias, quantidade em nanogramas, n° de
genomas, etc.
• Necessária curva padrão para cada alvo
• Ensaio utilizado para quantificar amostras desconhecidas interpolando
sua quantidade a partir de uma curva padrão
184
• Quantificação Relativa:
• Ensaio utilizado para avaliar mudanças na expressão gênica de grupos
experimentais distintos
• Células tumorais vs células normais
• Cultura celular tratada vs cultura celular não tratada
• Diferentes condições de tratamentos
• Resultados expressos em ordem de grandeza
186
Quantificação Absoluta x Quantificação Relativa
No Cópias
1000
900 1000
800
700
600
500
400 500
300
200
100
0
Amostra 1 Amostra 2
Valor relativo
2
1.75
1.5
2
1.25
1
0.75
1
0.5
0.25
0
Amostra 1 Amostra 2
188
Princípios da Quantificação Absoluta

189
Tipos de quantificação

Real-Time
Quantitativo
Δ Δ Ct
Relativa
Curva Padrão
190
Quantificação Absoluta
Curva Padrão
CT
CT
0 1 2 3 4 5 6 7
log n° cópias
CT é inversamente proporcional ao log da quantidade inicial de DNA/RNA
191
Construção da Curva Padrão
Quantidade absoluta do padrão (estoque) deve ser conhecida

inicialmente por algum método independente:
• Aquisição de painéis comerciais (RNA e DNA);
• Oligos sintéticos/produtos de PCR;
• Clonagem de controles para ensaios RNA em vetores de expressão;
• Clonagem de controles para ensaios DNA.
194
Controle Interno
• Mesmo tipo de molécula do gene-alvo (DNA para DNA e

RNA para RNA) e presente (ou adicionado) na mesma
quantidade entre diferentes amostras
• Idealmente, utilizado para normalizar os dados com relação

à eficiência de extração, eficiência de RT, quantidade de
DNA/RNA inicial na reação de qPCR - à semelhança do
gene de referência na quantificação relativa
195
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control
Reagents
196
Controle Interno
Exemplo - HBV
HBV HBV
Amostra Valor de CT No de cópias
29.025  0.047 4.994  150,2
CT
#1
#2 27.059  0.043 9.836  285,4
#3 30.924  0.074 2.484  126,2
#4 29.546  0.049 4.789  76,1
Quantidade (cópias)
Controle Interno
Amostra Valor de CT
#1 21.209  0.024
#2 21.216  0.027
#3 21.247  0.047
#4 21.141  0.023
197
Controle Interno
Exemplo - OGM
TaqMan® GMO Soy 35S Detection Kit

TaqMan® GMO Maize 35S Detection Kit
5’ 3’
Promotor Transgene Terminador
FAM Quencher
Gene Alvo: Promotor do
vírus do mosaico da
couve-flor (35S)
VIC Quencher Controle Interno Positivo (CIP):

Lectina para soja, Invertase para
milho
198
Controle Interno
Exemplo - OGM
Curvas azuis = 35S

Curvas verdes =
Lectina
0.01%
0.1%
0.5%
1%
2%
5%
Ct Lectina = 22
STD5% = Ct 24.5 ; Ct = 24.5-22 = 2.5
STD2% = Ct 26 ; Ct = 26-22 = 4
STD1% = Ct 27 ; Ct = 27-22 = 5
STD0.5% = Ct 28 ; Ct = 28-22 = 6
STD0.1% = Ct 31 ; Ct = 31-22 = 9
199
Análise de OGMs: Curva Padrão de CT
Análise de regressão linear logarítmica

dos Ct’s dos padrões de referência (0%,
0.1%, 0.5%, 1%, 2% e 5%). O Ct de
cada amostra é então inferido a partir
desta curva para determinar a %OGM.
 Ct
LOG % OGM
200
Construção da Curva Padrão

201
Construção da curva padrão - DNA
PCR Inserir fragmento no vetor Transformar bactérias Selecionar colônias
Cultivar e miniprep Confirmar sequência Tratar com RNase Linearizar
202
• Quantificar de forma precisa o clone linearizado e

purificado.
Determinação do número de cópias:
X g/uL DNA x 6,022 x 1023

Tamanho do clone em pb x 649
Observações:
clone = plasmídeo + inserto

649 g/mol = PM médio de 1 pb DNA
6,022x1023 = no de moléculas em 1 mol (no de Avogadro)
203
Exemplo:
Tamanho do clone: 3954 + 400 = 4354 pb

Concentração: 50 ng/uL = 50 x10-9g/uL
Cálculo:
50 x 10-9 x 6,022 x 1023 = 1 x 1010 moléculas/uL

(4354 x 649)
204
Exemplo: Concentração estoque do clone = 1 x 1010 cópias/uL
Ci x Vi = Cf X Vf
Cf = 108 cópias/uL
Vf = 1000 uL
Ci = 1 x 1010 cópias/uL
108 x 1000 = 10 uL estoque + 990 ul diluente

Vi =
1 x 1010
205
Diluente = Yeast tRNA 100 ng/uL
Exemplo:
900 uL de
yeast tRNA
100 ng/uL
+ 108 107 106 105 104 103 102 101
100 uL da
diluição
anterior
206
Construção da curva padrão - RNA
RT-PCR Inserir fragmento no vetor Transformar bactérias Selecionar colônias
Cultivar e miniprep Confirmar sequência Linearizar Transcrição Tratar com DNase
207
Construção da curva padrão - RNA
Determinação do número de cópias:
X g/uL RNA x 6,022 x 1023

Tamanho do transcrito x 320
Observações:
tamanho do transcrito: no bases entre sítio de início da transcrição

no promotor e sítio de corte da enzima de restrição utilizada
320 g/mol = PM médio de 1 base de ssRNA
6,022x1023 = no de moléculas em 1 mol (no de Avogadro)
208
Fator de conversão dos resultados
• Resultado em 1 mL de plasma → 2,5 x 20 x 2 x 105 cópias
• Etapas: x 2,5
− Extração: 400 uL de plasma → 20 x 2 x 105 cópias
− Eluição: 100 uL de tampão → 20 x 2 x 105 cópias

x 20
− Reação qPCR: 5 uL de eluato → 2 x 105 cópias
Fator de conversão = 50 x
209
Construção da curva padrão
Metodologia alternativa
• Misturar o plasmídeo (na quantidade certa para cada ponto da curva)

ao plasma negativo para o alvo do teste e depois fazer a extração
210
PCR Digital

211
PCR Digital
Analógico vs. Digital
Exemplo: Que horas são?
Analógico
Digital
Aproximadamente
8:28:47pm
8:30pm
Em relação • Menos suscetível a ruidos.

• Mais acurado.
ao analógico, • Mais preciso.
digital é • Mais reprodutível.
tipicamente… • Fácil de analisar e interpretar.
212
PCR Digital
PCR Digital é uma técnica de análise para

quantificação absoluta de amostras de ácidos
nucléicos, baseada na amplificação por PCR de
uma única molécula molde sem referência a
uma curva padrão.
QuantStudio 12K Flex QuantStudio 3D
213
PCR Digital
Fluxograma
Preparação Distribuição Reação de PCR Ajuste de

Poisson e leitura
gDNA ou cDNA
TaqMan® Assay Reações Negativas
Master mix
Use o número de reações negativas da

PCR para calcular o número de moléculas-
alvo.
www.lifetechnologies.com/digitalpcr
214
PCR Digital
Fluxograma QuantStudio 12K
215
PCR Digital
PCR digital 3D
Elevada Flexibilidade (Capacidade para aumento do throughput)
Simples
1 min para carregar e 1min para leitura.
Escalabilidade
Plataforma baseada em um Chip - aumento
de throughput e intervalo dinâmico.
Acessível
Com preço aproximadamente 50% mais
barato que as plataformas concorrentes.
217
QuantStudio™ 3D
Fluxograma simples
Mix Carrega Amplifica Leitura
Sistema Fechado
O Fluxograma possui 3 passos:
1. Carrega a amostra, o MasterMix, o ensaio e a Loading solution no

QuantStudio™3D Digital PCR Chip (~ 1min.)
2. Termociclagem do chip usando protocolo apropriado.
3. Leitura do chip no Instrumento QuantStudio™3D Digital (<1min)
218
Plataforma acessível
QuantStudio™ 3D Digital
PCR $44,000
Sistema baseado em um Chip

(20k partições no lançamento)
The QuantStudio™ 3D Digital PCR System is For Research Use Only, not for use in diagnostic procedures
219
QuantStudio™ 3D Digital PCR 20K Chip
• 20,000 reações por chip 20,000 Reações

• Perda mínima de amostra
• Uma amostra/chip
• Simples e consistente carregamento
• Selagem reduz a possibilidade de
contaminação
• Cada chip identificado por um único
número de identificação
• Volume de reação fixo – redução da
manipulação da amostra inicial
220
QuantStudio™ 3D
Aplicações
• Detecção de alvos de câncer raro
• Detecção de patógenos raros
• Quantificação absoluta de carga viral
• Detecção de OGMs em sementes normais
• Quantificação de biblioteca de NGS
• Validadção de dados de NGS
• Geração de padrões e referências precisas
222
Conclusões
PCR Digital…
• Não necessariamente substitui a qPCR, porém amplia as
capacidades dos ensaios já existentes.
• “Conta” moléculas de ácidos nucleicos: quantificação
absoluta
• Sem necessidade de uma referência
• É apropriada quando a sensibilidade, especificidade e/ou
precisão necessitam ser expandidas além das capacidades
da qPCR.
223
Princípios da Quantificação Relativa
(Parte I)
Escolha dos genes de referência

224
Tipos de quantificação

Real-Time
Quantitativo
Δ Δ Ct
Relativa
Curva Padrão
225
Propósito da Normalização
Variação técnica:
Qualidade e quantidade do RNA
Eficiência da RT
Eficiência da PCR
Objetivo: Remoção de variação não específica

(Ruído induzido experimentalmente)
226
Breve estratégia de normalização
Passos para normalização:

Amostra
Extração do RNA Quantidade/Qualidade de amostra
RNA similar
Realiza RT Concentração similar do RNA

cDNA
Amplifica cDNA Quantificação do gene de referência
Resultado (controle endógeno)
227
Estratégia para normalização
• Gene de referência (Controle endógeno )

• Controle interno que está submetido às mesmas condições do
mRNA de interesse;
• Normalmente validado usando as mesmas condições
experimentais;
• Possibilidade de normalização com mais de um gene de
referência;
• Amplamente usado para controlar variações.
228
Escolhendo o(s) gene(s) de referência
• Um bom gene de referência tem um nível constante de
expressão em todas as amostras do estudo (tempo,
condições, estímulos, etc.).
• NÃO existe gene de referência universal.
• Comumente usados: ACTB, PPIA, GAPDH, B2M, HPRT1,

etc.
229
Escolhendo o(s) genes de referência
• Use a literatura (e.x. PubMed)
230
RefGenes – www.genevestigator.com
• Ferramenta on-line para busca de genes mais estáveis, dentro de um conjunto de
tecidos ou condições escolhidas;
• Análise baseada em inúmeros experimentos de microarray;
• Comparação com base na intensidade do sinal/SD.
231
Ferramentas on-line de busca de genes de referência
232
Escolhendo o(s) genes de referência
Siga os 3 passos abaixo:

1. Identifique genes candidatos – e.x.
PubMed, RefGenes;
2. Teste a expressão de genes
candidatos em suas amostras;
3. Analise os dados usando algoritmos
tais como: geNORM, NORMFINDER,
Data Assist, ExpressionSuite,
qbasePLUS ou StatMiner.
233
Testando a expressão de genes candidatos
• Seleção dos candidatos (TaqMan® Assays)
• Selecione ”amostras representativas do estudo”;
• Faça em paralelo RT com quantidades iguais de RNA, carregue
quantidades iguais de cDNA
• Escolha o(s) genes com pouca/sem variação;
• Dica: Tente outros candidatos se nenhum forneceu resultados
aceitáveis.
• Alternativamente - avalie vários candidatos ao longo de
todo o estudo e escolha o normalizador no final.
• e.x. TaqMan® Arrays
234
Gene de referência
Como validar seu normalizador?
• Softwares para análise
• GeNorm, Vandesompele et al., 2002
• REST, Pfaffl et al., 2002
• Normfinder, Pfaffl et al., 2004
• BestKeeper, Andersen et al., 2004
• qBase, Jan Hellemans & Jo Vandesompele 2006
• StatMiner, Integromics 2007
• ExpressionSuite v1.0.3 (Life Technologies 2013)
• Symphoni qPCR® (Life Technologies 2014)
237
Algoritmo de normalização - geNorm
Avaliação de 10 genes de referência amplamente utilizados em 5 painéis de

tecidos diferentes.
http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/
238
Algoritmo geNorm
• Identificação dos genes expressos mais estáveis em um determinado
conjunto de amostras. Menor valor de M = expressão mais estável.
• Determinação do número mínimo de genes necessários para calcular

um fator de normalização confiável;
• Estratégia: calcular a razão da razão de todos os potenciais genes de

referência em todas as amostras.
• Resultado: Medida de estabilidade gênica e classificação dos possíveis

genes de referência.
geNorm: Encontra o melhor par de genes
genormPLUS: Encontra o melhor gene
239
geNorm no software ExpressionSuite e Symphoni
qPCR®
ExpressionSuite e Symphoni qPCR®: ferramentas de análise de dados,
que utiliza o método do Ct comparativo(Cτ). De forma rápida permite
gerar com precisão dados quantitativos da expressão gênica relativa de um
grande número de genes e amostras.
241
Resumo - métodos de normalização por genes de referência
Todos os métodos (geNorm, Normfinder,

BestKeeper, etc), na maioria dos casos,
encontra os mesmos genes de referência
242
Resumo sobre as etapas de Normalização
Como? Ferramentas
Selecione genes Seleciona vários genes • Literatura (PubMed)

candidatos
candidatos • RefGenes
Verifica a expressão de • TaqMan® Assays
Coleta de vários genes de
• Placas/arrays (Genes de referência)
dados referência candidatos
nas suas amostras
Analise com um • RQ (CT) vs amostra de referência
algoritmo que permita
• geNorm, Normfinder, BestKeeper, etc
escolher o(s)
Análise de melhor(es) • DataAssist, ExpressionSuite,
Dados (combinação de genes qbasePlus, StatMiner, etc.
de referência)
243
INTERVALO!!!
244
Princípios da Quantificação Relativa
(Parte II)
Ct e Curva Padrão Relativa

245
Métodos para Cálculo da Quantificação Relativa
• Ct Comparativo (Ct) – Preparo mais simples pois não

requer curva padrão. É necessária a validação das
eficiências dos ensaios do gene alvo e referência, que
devem ser semelhantes
• Curva Padrão Relativa – Não requer validação da eficiência,

nem que a eficiência dos ensaios do alvo e do endógeno
sejam semelhantes. Requer construção de curva padrão,
portanto uso de mais reagentes e espaço na placa
246
Para checar a eficiência: utilizar uma diluição seriada
Faça diluição
seriada
1000 500 250 125 62,5
247
Resultados
28 29 30
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
Número de ciclos
248
Q: Posso dizer algo sobre as concentrações iniciais?
28 29 30
Amostra 1
Amostra 2 Relativamente falando. . .

Sim!
Amostra 3
Número de ciclos
249
A PCR deve dobrar o produto após cada ciclo na fase
geométrica
28 29 30
ΔCt=1
Amostra 1
Amostra 2
Diferença de 2 vezes
Amostra 3
Número de ciclos
250
Relação para cálculo de quantidades relativas iniciais
ΔCt de 1 = 2-fold de diferença

ΔCt de 3.3 = 10-fold de diferença
251
ΔΔCt
Eficiência de PCR
100% eficiência: diluição 1:10, 3.32 ciclos entre cada diluição
threshold
15,00 18,32 21,64

ciclo
252
ΔΔCt
Eficiência de PCR
50% de eficiência: diluição 1:10, 5.68 ciclos entre cada diluição
?
threshold
30.00 35.68
ciclo
253
ΔΔCt
Eficiência de PCR
127% de eficiência: diluição 1:10, 2.27 ciclos entre cada diluição
threshold
13.00 15.27 17.54

ciclo
254
ΔΔCt
Eficiência de PCR
• Por exemplo, um valor de slope igual a -3.3 sugere que os

primers estão amplificando com aproximadamente 100% de
eficiência.
• Um valor mais negativo (ex: -3.5) sugere uma reação com
uma eficiência menor que 100%.
Cálculo: E = 10(-1/slope) -1
255
Métodos para Cálculo da Quantificação Relativa
Ct Curva Padrão Relativa
Slope = -3.38 -4.21

Alvo
Ct -3.34
Ct
Slope = -3.32 Alvo Referência

Normalizador
Log [cDNA] Qty (Log)
256
Um requerimento fundamental para o Ct
Os dois genes (alvo e referência) devem

praticamente apresentar a mesma eficiência
de amplificação!
257
ΔΔCt
Validação do Método do CT Comparativo (Ct)
Gene Alvo - Gene

Referência Eficiência*
* Tolerância de +- 10%
Cálculo
Alvo = GR 100 % 2-Ct
Alvo= GR <100% (1+ E)-Ct
Alvo GR NA Curva Padrão
Relativa
258
Calibrador

259
Calibrador
Amostra utilizada como base para resultados comparativos
Calibrador
tempo
t =0 t=12 t=24 t=48
260
Resultados da Quantificação Relativa
50
t=0
40
37.01
x-fold Expression
t = 12 h
30 t = 24 h
20 t = 48 h
5.6
10
1 0.7
0
Calibrador
t=0
261
ΔΔCt
Passo a passo
Passo 1: Normalização pelo gene de referência

Ct gene alvo – Ct gene de referência = ΔCt
Passo 2: Normalização pela amostra calibradora

ΔCt amostra – ΔCt Calibrador = ΔΔCt
Passo 3: Use a fórmula

Fold Change = 2-Ct
262
ΔΔCt
c-myc GAPDH Tecido Ct Ct 2-Ct

Ct  desvio Ct  desvio c-myc - GAPDH Ct-Ct Rel. ao cérebro
Cérebro 30.49  0.15 23.63  0.09 6.86  0.17 0.00  0.17 1.0  0.11
Rim 28.03  0.06 23.66  0.08 4.37  0.10 -2.50 0.10 5.6  0.32
Figado 25.35 0.07 23.70  0.07 1.65  0.10 -5.21  0.10 37.0  2.52
Pulmão 26.32  0.07 23.51 0.07 2.81  0.10 -4.05  0.10 16.5  1.10
∆CT = CT (alvo) - CT (gene de referência)

∆∆CT = ∆CT (amostra) - ∆CT (calibrador)
Quantidade Relativa = 2 -∆∆Ct
263
ΔΔCt
Melhor parte do nosso software
Ele faz a matemática para você!
264
ΔΔCt
ExpressionSuite Software
Novo software de análise de expressão gênica para CT comparativo
• Suporta arquivos de qPCR (.eds & .sds):

• QuantStudio™ 12K Flex (Plates, Cards & OpenArrays)
• QuantStudio™ 6 & 7
• ViiA™ 7 (v1.1)
• 7900HT (v2.4)
• 7500 / 7500 FAST (v2.0.5)
• StepOne™ / StepOne™ Plus (v2.2)
• Free Download!
GeNorm, Vandesompele et al., 2002

ΔΔCt, Livak KJ & Schmittgen TD, 2001
265
ΔΔCt
Acesso rápido aos alvos para normalização

• É necessário o gene de referência em todas as placas;
• Opções de normalização: controle(s) endogeno(s) ou normalização global;
• Visão de todos os candidatos e controles selecionados em gráfico, com pontuação de
estabilidade.
266
ΔΔCt
267
ΔΔCt
268
Ensaio de ΔΔCt
Symphoni® Módulo Expressão Gênica
• Grupos de análise permitem comparar diferentes parâmetros ex:
diferentes condições experimentais nas mesmas placas
• Set up da placa
• Para alterar não necessita voltar ao SW de corrida
• Análise flexível
• Escolha de gene de referência para cada placa e possibilidade de
calibrador inter placa
269
Curva Padrão Relativa
• Qualquer estoque de cDNA, RNA ou

DNA contendo o alvo apropriado, pode ser
utilizado para preparar a curva padrão
• Apenas as diluições relativas necessitam

ser conhecidas
c-myc
• Ex: diluição de 10x  200, 20, 2, 0.2,
0.02
0.02
c-myc
0.2
20
GAPDH 200
GAPDH
270
Passo a passo
Passo 1: Calcular a quantidade da amostra a partir dos valores

arbitrários da curva padrão
Passo 2: Normalização pelo gene de referência

Quantidade alvo ÷ Quantidade referência
Passo 3: Normalização pela amostra calibradora

Quantidade alvo normalizado ÷ Quantidade Calibrador normalizado
271
c-myc GAPDH c-mycN c-mycN

Tecido Valor Arbitrário Valor Arbitrário Norm. c/ GAPDH Rel. ao cérebro
Cérebro 0.039  0.004 0.54  0.034 0.07  0.008 1.0  0.12
Rim 0.25  0.016 0.62  0.052 0.40  0.025 5.5  0.35
Fígado 0.70  0.036 0.28  0.013 2.49  0.173 34.2  2.37
Pulmão 0.93  0.044 0.81  0.041 1.15  0.079 15.7  1.09
Gene alvo Amostra alvo normalizada

Gene de referência Amostra calibradora normalizada
272
Melhor parte do nosso software
Ele faz a matemática para você!
273
INTERVALO!!!
274
Aula Prática – POP 1.1
1:10 1:10 1:10 1:10
Faça diluição
seriada
100ηg 10 1 0,1 0,01
1µg de RNA - 1µg de cDNA - 20µL de reação

Xµg de cDNA - 1 µL de reação
X = 0,05 µg/µL de cDNA = 50 ηg/µL
275
M mM µM ηM
1 000 000 000
10-3 10-6 10-9
1 M = 1000 mM
1 M = 1.000.000 µM
1 M = 1.000.000.000 ηM
1 mM = 1.000 µM
1 mM = 1.000.000 ηM
1 µM = 1.000 ηM
276
colágeno β-actina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 100 100 100 100 100 100
B 10 10 10 10 10 10
1 1 1 1 1 1
C
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
D
0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
E
A1 A1 A1 A1 A1 A1
F
A2 A2 A2 A2 A2 A2
G
NTC NTC NTC NTC NTC NTC
H
277
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Rim Rim Rim
B Cor Cor Cor
C Cer Cer Cer
D Bex Bex Bex
NTC NTC NTC

E
278
INTERVALO!!!
279
Otimização de reações
e fatores que interferem nos resultados

280
Otimização de um novo ensaio
1. Verificação do ensaio: testar controles positivos e negativos (NTC)

sem limitar concentração de primers e sonda (exemplo: 600nM e
250nM, respectivamente quando separados ou 1x quando misturados
em um assay).
281
2. Titulação de primers: 100, 300, 600nM (fixar 250nM sonda, fixar

amostra/concentração da amostra)
• Objetivos
• Concentração que gere MENOR Ct dentro de uma faixa de confiança (15 a 25)
• MAIOR ΔRn
• SEM presença de dímeros, mesmo em poços NTC (caso esteja utilizando SYBR)
Forward Primer (nM)

100 300 600
Primer (nM)
100 100/100 300/100 600/100

Reverse
300 100/300 300/300 600/300
600 100/600 300/600 600/600
282
Curva de Melting
ALVO
NTC/ALVO
600/600
300/300
100/100
283
3. Titulação de sonda: Utilizando a condição ótima estabelecida de primers,
variar a concentração de sondas, entre 50nM a 250nM.
• Objetivos
• Concentração que gere MENOR Ct dentro de uma faixa de confiança (15 a 25)
• MAIOR ΔRn
• SEM presença de dímeros, mesmo em poços NTC (gel de agarose)
284
4. Avaliar eficiência do ensaio: Tomando as concentrações de primers e sondas

determinadas no passo anterior, amplificar diluições seriadas de uma amostra
ou um pool para avaliar a eficiência do experimento, indicada pela inclinação
(slope) da curva padrão. Eficiência de 100% resulta em curva padrão com
slope de -3.32.
E=10(-1/slope) -1
285
Fatores que interferem nos resultados
Quantidade de amostra: amostras muito concentradas podem inibir a

reação e amostras pouco concentradas podem favorecer a formação de
dímeros de primers. Para se determinar a faixa de quantidade (Ct) com a
qual se pode trabalhar, recomenda-se fazer diluições seriadas de uma
amostra e observar os perfis de amplificação
1000
100
10
Delta Rn
0.1
0.01
0.001
0
10 20 30 40
Ciclos
286
Eficiência do ensaio: valores de slope e Y-intercept
Fonte: Real-time PCR; Dorak MT.
287
5. Singleplex vs Multiplex (Taqman apenas): avaliar se as amplificações dos dois alvos

possuem eficiências equivalentes em single e multiplex, especialmente quando um deles
está presente em baixo número de cópias. Se as eficiências não são alteradas no
multiplex, o Ct não deve mudar. Mudança no Ct indica competição entre os sistemas.
Deve-se então limitar a quantidade de primer do sistema mais expresso, seguindo a
matriz abaixo, sendo que o ΔRn pode diminuir, mas o Ct deve se manter o mesmo.
Matriz de Otimização da Limitação de Primers
289
Otimização de um novo ensaio – Multiplex
A B A+
B
20 25 25
25,5
Singleplex Multiplex
Existe competição? Qual o sistema favorecido?

Multiplex
290
Utilização dos mesmos estoques de padrões de cDNAs (curva padrão) e
amostra calibradora: O preparo de cDNA em momentos diferentes pode
acarretar diferenças nas quantidades e na qualidade do cDNA, gerando grande
variabilidade nos resultados. Assim, no preparo destas amostras, deve-se preparar
um grande volume já prevendo seu uso durante todos os experimentos. Esses
grande volume deve ser aliquotado em volumes menores de forma a evitar
descongelamentos sucessivos e, consequentemente, degradação dos cDNAs.
Controle
Extração
Tratado RT qPCR
Uso de Mastermix: o uso de Mastermix de PCR diminui o número de pipetagens

e erros relacionados no preparo da reação.
291
Pipetagem: erros de pipetagem aumentam o desvio padrão e afetam

consideravelmente as curvas padrão. Pipetas bem calibradas, volumes
maiores e spin nas placas ou tubos antes de iniciar a corrida são fatores
cruciais para a qualidade dos resultados.
R2 ideal
≥0.99
292
Problema Observado Fator de Pipetagem
Alto desvio padrão ou R2 <0.99 (no caso

Erros na pipetagem das replicatas
da curva padrão)
Erros na diluição dos padrões para a

R2 ≥0.99, mas slope alterado
curva
293
Diferença de performance do Master Mix
Alvo: colágeno amostra NTC

amostra
NTC
Master Mix 1
amostra
amostra
Master Mix 2
NTC
NTC
294
Troubleshooting
Resolução de Problemas

295
Troubleshooting
Solucionar problemas de um experimento pode

ser difícil, uma vez que podem haver diferentes
causas
296
Troubleshooting
Fontes comuns de problemas
Consumíveis Hardware
Amostras
Desenvolvimento de Ensaio Calibrações
297
Troubleshooting
Problemas mais comuns
• Curvas com formato “estranho” no gráfico de Amplificação ou no Multicomponent
• Amplificação não esperada/falha de amplificação
• Baixa precisão entre as réplicas técnicas
• Alta porcentagem de poços com flags
• Usuários de SYBR® Green: múltiplos picos de melt ou com formato “estranho”
298
Troubleshooting
Curvas com formatos estranhos
A descrição “formato estranho” pode ser aplicada a diversos desvios da

normalidade.
299
Troubleshooting
Curvas com formatos estranhos – Exemplo 1
Estranho
Normal
Por que as curvas vermelhas parecem diferentes?
300
Troubleshooting
Possível resposta: baseline errado
• Esse problema é as vezes identificado em Auto Baseline.

• O End Cycle programado é muito baixo, causando distorção do formato.
• Solução:
• Vá em “Analysis Settings”
• Clique em Advanced Settings
• Altere o “End Cycle” desses poços para o valor correto
• Re-analise os dados
301
Troubleshooting
302
Troubleshooting
Ir ao Multicomponent Plot
• Queda no FAM™ / aumento no

ROX™.
• Nota: esse padrão de pico está
normalmente associado a bolha no
poço.
• No entanto, duas evidências sugerem
que não é o que estamos vendo aqui.
303
Troubleshooting
Evidência contra bolha
: Mesmo quando vemos uma bolha estourar no MC Plot, ROX™

normalmente corrige essa falha no gráfico de amplificação
: Quando marcamos todos os poços da placa, todos possuem o mesmo

padrão
304
Troubleshooting
Diagnóstico
• Problema sistêmico que está afetando todos os poços da placa

simultaneamente
• A causa provável pode ser:

• Mau funcionamento do instrumento (se acontecer novamente, procurar a Thermo)
• Ou uma oscilação de energia
305
Troubleshooting
Curvas achatadas
306
Troubleshooting
Curvas achatadas
• Provavelmente não é o instrumento ou o master mix

• “Ninguém mais no laboratório está tendo problemas.”
• Podem ser os primers

• Teste: corra primers diferentes utilizando a mesma amostra e mesmo reagente. Se o
problema persistir, não são os primers
• Considere
• “O que é único ao meu experimento?”
307
Troubleshooting
Possível culpado: inibidor na amostra
• Usuário desconfia do processo de purificação da amostra
• Como resultado, decide correr um teste para checar se a amostra contém

altos níveis de inibidores
• Se fosse você, como você faria esse teste?
308
Troubleshooting
Abordagem mais fácil: diluição seriada
• Diluir serialmente a amostra e amplificar cada diluição
• Evidência de inibidor na amostra:

• Em algum ponto, a curva resultante parecerá linear.
Ct
[template]
309
Troubleshooting
1:10
1:100
1:1000 1:5
Não diluido
310
Troubleshooting
Exemplo de inibidores de PCR
• Melanina • EtOH
• Polissacarídeos • Proteinase K
• Hemoglobina • Guanidina
• Uréia • Fenol
• Etc.
311
Troubleshooting
Inibidores de PCR – nota final
• Inibidores nas amostras de RNA podem inibir a reação de transcrição reversa.
• A única evidencia nos dados de qPCR são Cts maiores que os esperados (ou
ausencia de Cts devido à completa falha da RT)
• Assim, recomendamos fortemente a correr curvas de diluição de RNA para

definir a extensão dinamica do RT
312
Troubleshooting
• Curvas com formato “estranho” no gráfico de Amplificação ou no

Multicomponent
313
Troubleshooting
No Template Control - NTC
• O usuário deve correr pelo menos 2-3 poços de controles sem amostra (branco)
para cada ensaio em todas as corridas.
• NTCs: água é adicionada ao poço ao invés de amostra
• Esses poços não devem gerar amplificação nos 40 ciclos de PCR.
314
Troubleshooting
NTC positivo
• Algumas vezes, entretanto, os NTCs são claramente positivos
315
Troubleshooting
NTC positivo
• Possível fonte de contaminação de ácidos nucléicos:

• Reagentes (ex. master mix, água)
• Ensaio
• Pipetas
• Aerosol
316
Troubleshooting
NTC - recomendações
• Algumas boas ideias:
• Aliquote todos os reagentes, ensaio e Master Mix
• Use ponteiras com barreira
• Limpe as pipetas regularmente
• Mantenha áreas separadas no lab para adição de amostra e para montagem de master
mix
• Sele a placa rapidamente após término da pipetagem
317
Troubleshooting
318
Troubleshooting
Baixa precisão entre as réplicas
• Normalmente, a razão de falha entre as réplicas é simples
Pipetagem imprecisa
319
Troubleshooting
Exemplo de precisão excelente
40 réplicas identicas
(Std. dev of Ct = 0.03)
320
Troubleshooting
Exemplo de baixa precisão
Três réplicas
(grande desvio nos Cts)
321
Troubleshooting
Outras possíveis causas
• Pipeta com mal funcionamento
• Não usar ROX™
• Falha na homogenização do Master Mix e do ensaio antes de pipetar na placa
• Mr. Poisson
Vamos focar nos dois últimos
322
Troubleshooting
Homogeneíze o mix pipetando
• Adicione Master Mix, ensaio e água
• Programe uma pipeta com pelo menos metade do volume do mix
• Pipete para cima e para baixo12-15 vezes
Apenas bater no tubo algumas

vezes NÃO é adequado!
323
Troubleshooting
Por que as amostras com altos Cts são normalmente imprecisas?
Ct
Efeito da Distribuição
de Poisson
Inicial [cDNA]
324
Troubleshooting
Exemplo de Poisson
10μL
10μL
10μL
30 uL /9 moléculas
Com qual frequência teremos 3 moléculas por tubo?

Não sempre
325
Troubleshooting
Baixos valores de R2
• Um valor menor que 0.99 provavelmente indica um problema:

• Pode ser baixa precisão entre as replicatas
• Inibidores,
• Diluição imprecisa
• etc.
• A solução está em seguir algumas recomendações quando preparar a diluição

seriada
326
Troubleshooting
Baixos valores de R2 - sugestões
• Utilize pipetas bem calibradas
• Dilua serialmente o material padrão
• Pipete os padrões após homogenizar completamente cada dluição
• Trabalhe com volumes altos (≥ 2-3 uL) para melhor precisão
• Corra pelo menos em triplicata cada ponto de diluição, assim é possível monitorar a
precisão
• Use um mínimo de 5 pontos de diluição.
• Se a curva possui mais de 1 ou 2 outliers, ou o espaçamento entre os pontos for

irregular, repita a curva (incluindo as diluições)!
327
Troubleshooting
328
Troubleshooting
Muitos poços com flags
• Os poços com Flags, no geral, não são um grande problema
• No entanto, Flags em toda a placa ou numa secção da mesma indica um

problem sistêmico
• Reagente ruim/inapropriado.
• Mau funcionamento do instrumento.
• Calibração do instrumento vencida ou corrompida.
• Erro de usuário: ex., marcação errada do fluoróforo no software.
329
Troubleshooting
Muitos poços com flags - evaporação
• Se o selo óptico não estiver selado corretamente, os dados serão afetados
• Sinal: aumento de fluorescência do ROX™ e outros fluoróforos no

Multicomponent Plot
Sempre sele as placas completamente!
330
Troubleshooting
Muitos poços com flags - sumário
• Cheque se os Flags estão num poço ou num grupo de poços
• Verifique se o “problema” é realmente um problema
• Procure padrões, veja se há recorrência nas corridas seguintes
331
Troubleshooting
• Curvas com formato “estranho” no gráfico de Amplificação ou no

Multicomponent
332
Troubleshooting
Curva de Melt ruins
O que não queremos ver são múltiplos picos, picos

“deformados”, picos duplos, invertidos ou qualquer
outro pico que não seja bom e limpo.
334
Troubleshooting
Curva de Melt ruins
335
Troubleshooting
Curva de Melt ruins - causas
• Amplificação inespecífica
• Usuário deve redesenhar os primers para máxima especificidade
• Dímeros de Primer
• Pode ser solucionado otimizando a concentração dos primers
• Uso de DNA genomico como molde  muito ruído

• Uso de gDNA com SYBR® não é recomendado
• Etc.
336
Troubleshooting
Curva de Melt ruins - dímeros
Baixa quantidade de primer Alta quantidade de primer
337
Troubleshooting
Curva de Melt
• Nunca confie em um resultado de PCR em tempo real se as curvas de melt

não forem confiáveis e com a Tm esperada
• Não gaste muito tempo tentando otimizar um par de primers

• Primers são baratos
• Tempo é inestimável
338
Troubleshooting
Concluindo. . .
339
Troubleshooting
• Tente prevenir dados ruins em primeiro lugar

• Faça as calibrações no instrumento regularmente
• Recalibre as pipetas regularmente
• Utilize somente ensaios validados por bioinformática e reagentes apropriados para

sua aplicação.
• Boas práticas nas técnicas em bancada

• Mantenha os reagentes no gelo
• Pipete com cuidado
• Homogenize bem
• Centrifugue quando necessário
• Sele as placas com cuidado
• Etc.
340
Troubleshooting
Quando as coisas vão mal. . .
• Lembre-se. . . você não está sozinho
• Há diversas ferramentas de ajuda no website da Life
• Entre em contato com suporte técnico
341
Troubleshooting
Ferramenta importante
342
0800-772 5433
Horário de atendimento: segunda à sexta (08h – 18h)
suporte.br@lifetech.com
AtendimentoD1.lsg.Br@lifetech.com (SP)
AtendimentoD2.lsg.Br@lifetech.com (RJ, MG, PR, SC e RS)
AtendimentoD3.lsg.Br@lifetech.com (Norte, Nordeste e CO)
343
High Resolution Melting (HRM):
Princípios e Aplicações

344
Introdução ao HRM

345
HRM
High Resolution Melting (HRM) consiste em um método de análise (pós-PCR que

utiliza uma curva de dissociação de alta resolução, o qual permite identificar
variações em sequencias de ácidos nucléicos.
• Difere da curva de dissociação do corante SYBR® Green:

• Química: corantes de DNA dupla-fita que saturam a molécula que possuem
maior brilho
• Instrumento: coleta de mais pontos de dados que uma curva de dissociação
padrão
• Software: novos gráficos e algorítmos de normalização da fluorescência
346
HRM
Intercalantes de DNA
347
HRM
348
HRM
349
HRM
Novos corantes:
• MeltDoctor®
• SYTO®9
Visualização dos dados

utilizando uma curva padrão
de dissociação:
• Melhor separação dos alelos (Tms)
• Fácil identificação de heterozigotos
350
HRM
MeltDoctor™ dye SYBR® Green dye
351
HRM
Denaturação do DNA
Fluorescência
Temperatura
Tm (melting temperature) - temperatura na qual metade da sequência de bases de

determinada molécula de DNA, está desnaturada.
352
HRM
Perfil de dissociação de uma amostra heterozigota
Combinação observada
de 4 Duplexes
Dois Dois
heteroduplexes homoduplexes
Fluorescência
C
C T
A
A A
T C
T G
G
G
Temperatura
353
HRM
Dado bruto
354
HRM
Dado normalizado
Análise baseada na diferença de Tm e no formato da curva

3 amostras
• homozigoto wt (verde)
• homozigoto mutante (azul)
• heterozigoto (vermelho)
355
HRM
Plot de diferença
• Uma alternativa é mostrar o gráfico por meio das diferenças de padrão de melting
• Adota-se uma amostra como o 'normal' (linha de base) e apresenta os demais em
função da semelhança com essa referência.
356
HRM
Fluxograma
357
HRM
Equipamentos fast
• O software HRM é utilizado para análises e

funciona separadamente do equipamento
• O software HRM é compatível com as corridas

da curva de dissociação dos Sistemas fast de
PCR em Tempo Real
358
HRM
Reagentes
Especialmente formulados para um maior desempenho e totalmente integrado ao

Workflow para HRM da Applied Biosystems
• MeltDoctor™ HRM Master Mix

• MeltDoctor™ HRM Reagent Kit
• MeltDoctor™ HRM Dye
• MeltDoctor™ HRM Calibration Plates
• 384-well
• 96-well
• MeltDoctor™ HRM Positive Control Kit
359
HRM
Reagentes
Life Technologies MeltDoctorTM HRM Master Mix
• Fácil uso, com todos os reagentes requeridos para a reação de HRM – concentração de
[2X]
• Apenas adiciona amostras e iniciadores (e água se requerido)
• Formulado para um excelente desempenho - vários tipos de ensaios de HRM

• Todas as classes de SNPs
• Inserções/Deleções
• Metilação
• Maior consistência e estabilidade dos resultados.

• Enzima Hot Start
• Estável a 4oC após o descongelamento inicial
360
HRM
Reagentes
Life Technologies HRM Reagent Kit
• Componentes individuais para reação – definição das condições de ensaio pelo

usuário
• HRM Enzyme
• HRM Buffer
• HRM Dye (20x)
• dNTPs
• MgCl2
• GC Enhancer
361
Calibrações

362
HRM
Para iniciar um experimento
Realizar três calibrações no sistema:
1. Calibração Background
 Amplificação
2. Calibração Pure dye
3. Calibração HRM
363
HRM
Calibração - amplificação
• Correr como Quantitation (Standard Curve)

• Ajustar o reporter para SYBR
• Mudar o protocolo de termociclagem
• Correr
IMPORTANTE!
Ajustar a referência
passiva para (none)
pois não há o corante
ROX no tampão
364
HRM
Calibração - amplificação
Verificar se todos os poços amplificaram com sucesso
365
HRM
Calibração – pure dye
Utilize a placa de calibração do corante para o HRM para realizar a calibração pure dye
Ir para: Instruments>Instruments maintenance manager e selecionar a opção Pure Dye
366
HRM
Calibração – pure dye
O software indica se a calibração passed ou failed
367
HRM
Calibração – HRM
• A calibração HRM quantifica o corante durante a curva de dissociação (melt

curve)
• A qualidade da calibração HRM é importante para a análise do HRM
• Para quem prepara a placa de calibração:
A placa deve ser preparada no momento da corrida

• Não congelar, armazenar à 4oC ou deixar à temperatura ambiente
Pipetagem é muito importante. Utilize sua habilidade de pipetagem!
368
HRM
Para realizar a calibração HRM no instrumento 7500 fast

1. Utilizar a mesma placa da calibração do corante para o HRM utilizada na calibração Pure Dye
2. Correr a curva de dissociação utilizando o “expert mode”.
• coleta dados apenas em um filtro,
• gera pontos de dados necessários para a “high resolution”
369
HRM
370
HRM
• Para realizar a calibração HRM nos instrumentos StepOne ou StepOnePlus
1. Utilizar a mesma placa da calibração do corante para o HRM utilizada na calibração
Pure Dye. Centrifugar e placa e retorná-la
2. Em Run Method no modo e taxa da rampa (sistemas StepOne™ and StepOnePlus™) –

Selecionar o modo de rampa Continuous, e selecionar a taxa de rampa para 0.3%.
371
HRM
Importante!
Quando o software HRM

for iniciado pela primeira
vez, ele irá solicitar a
abertura desse arquivo.
O arquivo de calibração
HRM melhora a
uniformidade da placa e
melhora a precisão.
372
HRM
Analise os experimentos
Todos os arquivos .sds e .eds têm que ser analisados e salvos antes de serem
abertos no Software HRM. Caso contrário, os arquivos não serão reconhecidos.
373
High Resolution Melting
Exemplos de Aplicações

374
Pesquisa de Mutações

375
HRM
Pesquisa de mutação
• Detectar variações desconhecidas em sequências específicas de DNA

genômico com suspeita de associação com uma doença
• Utilizada como ferramenta de pré-sequenciamento
376
HRM
Por que considerar HRM?
• Sequenciamento de todas as amostras não é viável para alguns

pesquisadores
• Etapas do trabalho podem ser beneficiadas por uma pré-seleção das

amostras para aumentar a taxa de acerto do sequenciamento
• Uso do HRM para validar a presença de polimorfismos (classe 1 – 4 SNPs,

in/dels) para justificar o investimento em sequenciamento de variantes
377
HRM
HRM irá:
• Usar uma amostra referência (wild-type)
• Fornecer indicação do número de variantes e mutações complexas
• Mais efetivo para identificar mutantes homozigotos
• Deve ser seguido por sequenciamento – confirmação de variantes
378
HRM
• Pode ser utilizado um único conjunto de primers que englobe a região de

interesse
• Possível desenhar múltiplos conjuntos de primers para busca de possibilidades

de SNPs
• Tamanho dos amplicons irá variar e o número de conjuntos de primers vai

depender da escala do projeto
– Considere redundância no desenho dos primers para sobreposição no gene de
interesse, para que mutações sejam detectadas duas vezes
• Condições de termociclagem podem variar; otimização pode ser necessária para

cada ensaio
379
HRM
• Rastreamento prévio - aumentar o sucesso com o sequenciamento
Eg. BRCA1 Pathway
ATM
Chk2
BRCA1
P53
BRCA2
• Pesquisa de mutações - múltiplos exons de um gene de interesse altamente

polimórfico
• Melhor estratégia – Sequenciamento
• Múltiplos passos, requer instrumento para sequenciamento
380
HRM
• Toda a extensão do gene precisa ser pesquisada

• Tamanho do amplicon ~ 300bp (fragmentos menores = melhor
resolução)
• Sequências alvo devem sobrepor-se, pelo menos, 25 pontos para
assegurar a cobertura completa
381
HRM
• Tipo selvagem é conhecido
• Variantes são atribuídas com base na similaridade entre os grupos  silhouette score
Wildtype
Variant 1
Variant 2
382
HRM
• Notar a dispersão dentro das curvas

que representam a população
selvagem
• Sequências variantes são facilmente

identificadas
383
HRM
Pesquisa de mutação – baixa frequência
• HRM parece ter uma sensibilidade única na frequência de mutação baixa –

ocorrência em menos de 1%*
• Útil em:
• Detecção de mutações somáticas adquiridas
• Populações heterogêneas (e.g., células infectadas com vírus, culturas de
vírus e bactérias)
• Pool de várias amostras
* Kristensen LS, et al, Nucleic Acids Research, 2008, 36(7): e42

Snell C, et al, Breast Cancer Research; 2008, 10(1):R12
384
Genotipagem de SNPs

385
HRM
SNPs
• Foram os primeiros polimorfismos em DNA a serem utilizados
• Representam 90% da variação genética no genoma humano
• Ocorrem geralmente a cada 1000pb
• Polimorfismos estáveis
• Baixa taxa de mutação (10-7)
• As transições são mais frequentes
• (entre bases púricas GA/ entre bases pirimídicas CT)
• A maioria dos SNPs é sinônimo
386
HRM
SNPs - aplicações
• Doenças Genéticas: Estudos de Associação

• Doenças Mendelianas:
• Associados com a condição patológica
• Teste molecular para genotipagem do SNP
• Diagnóstico pré-natal
• Diagnóstico pós-natal
• Doenças Complexas:
• SNPs aumentam susceptibilidade, mas não necessariamente levam ao
genótipo
• Mapas baseados em SNPs
• Estudo de genes candidatos a marcadores genéticos
• Desequilíbrio de ligação/ Haplótipos
387
HRM
SNPs - aplicações
• Farmacogenômica
• Variação genética afetando resposta a medicamentos
• Agricultura
• Qualidade da semente, propriedades nutritivas, resistência à pesticidas
• Pecuária
• Qualidade da carne e do leite, reprodução
• Estudos evolutivos e Migracionais
• Identificação humana
388
HRM
SNPs – classe I
• Sistema Real-Time 7500 Fast

• 3 replicatas de cada amostra são
mostradas
• As curvas vermelhas representam a
variante homozigota, as verdes o
genótipo selvagem e as azuis a
população de amostras heterozigotas
• Os dados são mostrados em um
gráfico de diferença, o qual é utilizado
pelo software HRM para facilitar a
interpretação dos dados
* SNPs da classe I incluem as mutações C/T e G/A e geralmente resultam em

alterações de Tm>0.5°C
389
HRM
SNPs – classe III
• Estes dados referentes à SNP*

classe III foram gerados no sistema
real-time 7900 HT e analisados no
software HRM
• Foi observado 100% de exatidão na
chamada dos genótipos utilizando
as condições padrões de análise do
software HRM com controles
selvagem e homozigoto
• 40 amostras de DNA humano
foram corridas em duplicatas
*SNPs da Classe 3 incluem trocas C/G e geralmente resultam em alterações de Tm de

0.2°-0.5°C
390
HRM
SNPs – classe IV
• Sistema Real-Time 7500 Fast

• 100% de exatidão na chamada dos
genótipos utilizando as condições
padrões de análise do software
HRM com controles selvagem e
homozigoto
• As curvas azuis representam a
população de amostras
homozigotas, as verdes selvagens e
as vermelhas as heterozigotas.
SNP da Classe 4 incluem trocas A/T e geralmente resultam em alterações de Tm

inferiores à 0.1oC
391
HRM
SNPs
Formação de Formação de
heteroduplexes homoduplexes
A T A C A T
&
G C G C
G T
gDNA de um indivíduo heterozigoto
392
HRM
SNPs
60
65
Temperatura
Tm
70
Tm
75
80
393
HRM
SNPs
• A análise é baseada na diferença nos formatos das curvas assim como nos
valores de Tm
• Amostras heterozigotas (azul) possuem curvas com formato diferente

comparado às curvas das amostras homozigotas selvagens (verde) e às das
variantes homozigotas (vermelho)
394
HRM
SNPs
Genotipagem: Desenho inapropriado ou
Descoberta?
395
HRM
SNPs
G/T
F-Primer R-Primer
Descoberta de um novo SNP
396
HRM
SNPs
397
HRM
SNPs
Por que utilizar HRM no seu projeto de genotipagem?
• Sistema fechado, realizado em um instrumento de PCR em tempo real – comum

à outros projetos genômicos
• Ferramenta de investigação de baixo custo para a análise de variações em ácido

nucléico para ensaios com polimorfismos desconhecidos
• HRM é apropriado em situações particulares, como por exemplo:

• Incapacidade de desenhar sondas TaqMan® devido à limitações inerentes na
sequência
• Grande número de SNPs, porém poucas amostras
• Tipagem de amostras altamente mutáveis, nas quais a especificidade da sonda
pode perder algumas espécies
398
Detecção de Patógenos

399
HRM
Detecção de patógenos
• HRM é um método rápido e preciso para pesquisa de cepas microbianas
conhecidas ou não
• Comparado com a técnica de PCR-RFLP, HRM permite identificar cepas
microbianas de forma rápida e com excelente custo benefício
• HRM screening:
• Permite detectar baixas concentrações de cepas microbianas;
• Minimização de perdas de detecção de novas cepas microbianas semelhantes a sequencias
sondas específicas
• Minimiza interpretações subjetivas quando comparados com métodos tradicionais
• Produto proveniente das reações de HRM podem ser diretamente sequenciadas, sem
necessidade de prévia realização de reações de purificação
400
HRM
Genotipagem vs detecção de patógenos
Amostras com
sequencias
idênticas
(wild-type)
Amostras com
sequencias
variantes
(mutante)
• “Gene” e “Alelo” • “Espécies” e “Cepa”

• Curvas geralmente apresentam um ponto • Curvas podem apresentar vários
de inflexão = um SNP pontos de inflexão = vários SNPs
• Uma amostra terá 2 alelos na
concentração de 50% por exemplar • Uma amostra pode apresentar
muitas cepas em concentrações
<50%
401
HRM
Detecção de patógenos
$ Amostra Cultura Coloração
Extração PCR Restrição Eletroforese
Real-Time PCR HRM

Screening
Confirmação TaqMan
$$$ Descoberta Sequenciamento
• Identificação de cepas novas e conhecidas;

• Identificação de baixos títulos (<50%) de cepas microbianas que podem ser
perdidas por TaqMan ou sequenciamento;
• Identificação de múltiplas cepas microbianas em um único tubo.
403
Metilação

404
HRM
Metilação
O que é epigenética?
Qualquer mudança na expressão de um gene sem que ocorra alteração
estrutural na sequência de DNA.
405
HRM
Metilação
• Objetivo
- Detectar a presença ou a porcentagem de DNA metilado
• Método
• Tratamento do DNA com bissulfito
• Altera citosinas não-metiladas para uracila, deixando citosinas metiladas inalteradas
• Amostras metiladas e não metiladas apresentaram diferentes perfis de melting
406
HRM
Metilação
• Valores desconhecidos são estimados com base no padrão mais próximo

• Vantagens
• Simples
• High throughput
• Focando sobre análises de sequências específicas de amostras informativas.
• Custo-benefício
• Detectáveis baixos níveis de metilação
407
HRM
Metilação
Amostra 100% Me: Conversão por Bisulfito (CG) -> Amplificação por PCR -> Análise por HRM
Amostra 0% Me: Conversão por Bisulfito (TG) -> Amplificação por PCR -> Análise por HRM
409
HRM
Metilação
Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion System
410
HRM
Metilação - primers
• Methyl Primer Express® Software

• Automatiza o desenho de iniciadores da PCR para amplificar fragmentos de gDNA
convertido pelo bissulfito
• Pode incluir dinucleotídeos (CpG) nos iniciadores permitindo preferencialmente

amplificar sequências metiladas.
• Modificações na temperatura de anelamento aumentam a resolução do intervalo

de metilação de 0-2%
412
HRM
Metilação - primers
Desenho e pedido de iniciadores

• Primers com/sem CGs
• Tamanho do amplicon: 100-200 pbs
• Número de dinucleotídeos CG no amplicon
• Número de pares de primers para cada alvo
Otimização das condições de reações para HRM

• Testar diferentes condições de reação
• Confirmar o tamanho do fragmento
• Especificidade da reação: banda única/pico único
• Eficiência da reação: intensidade da banda/valor do Ct
413
HRM
Metilação
Aumentar seletivamente as resoluções dos ensaios
Tann=60°C Tann=63°C Tann=64°C
100%
100% 100%
10%
10%
1%
10% 1%
0% 0% 0%
415
HRM
Metilação – banco de dados
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/epigenomics
416
HRM
Metilação – banco de dados
https://commonfund.nih.gov/epigenomics/
417
INTERVALO!!!
418
Software HRM

419
HRM
Software
• Stand-alone, software de análise HRM
• Compatível com:
• Software StepOne v2.2 (Apenas a versão 3.0.1)
• 7500 Software v2.0.4 (ou posterior)
• Nova aparência com novos recursos

• Ver o layout da placa;
• Respostas mais rápida;
• Algoritmos avançados para cálculo dos dados;
• Habilidade para selecionar o número esperado de clusters.
421
HRM
Software
• Especificação do número esperado de clusters para facilitar a genotipagem
• Facilmente altera o layout da placa, identifica as amostras e seleciona controles
• Configurações avançadas para uso em testes de rotina
• Linha vertical para visualização de valores de Tm, nos plots de dados
• Fácil configuração da placa com o copiar e colar a partir do Excel
422
HRM
Software
423
O que é o Silhouette Score?
• Uma medida de quão bem uma Curva de Melting pode ser

distinguida de outras Curvas de Melting para o mesmo
ensaio.
• Silhouette scores entre 0.8 e 1.0 são desejáveis. Indica o
quanto uma curva de melting é mais semelhante aquelas
assinaladas com a mesma denominação (variant call) e
quando esta difere daquelas assinaladas com outras
denominações (variant calls).
428
Desenvolvimento de ensaio HRM

430
HRM
Desenvolvimento
• PCR eficiente e efetiva

• Desenho e condições da PCR são críticos para obtenção de bons
resultados com o HRM
• Boas práticas laboratoriais

• É critico possuir boa técnica laboratorial
• Inclusão de controles apropriados

• A precisão dos resultados (cluster) pode melhorar com a utilização de
controles
431
HRM
Desenvolvimento
Desenho do primer
• A especificidade do iniciador é importante pois os corantes para o HRM não
possuem ligação específica
• Comprimento do amplicon mantido pequeno maximiza diferentes

comportamentos da curva de dissociação de produtos similares:
• Ideal 70-150bp (50-250bp aceitável)
• Com otimização é possível usar amplicons mais longos (~400bp)
• Evitar produtos inespecíficos (dímeros de primers)
432
HRM
Desenvolvimento
• Primer Express® Software
• Automatiza o desenho de iniciadores para a reação de amplificação
433
HRM
Desenvolvimento
• Maioria dos ensaios são bem sucedidos com uma concentração de primers de
300 nM
• Concentração pode ser aumentada (até 600nM) em ensaios problemáticos
• Utilizar preferencialmente primers purificados por HPLC

• Não necessariamente requeridos
• Desenho dos primers tem efeito no ensaio HRM

• Mesmos princípios do desenho de primers para o SYBR Green
• Alguns ensaios podem necessitar da utilização de outros conjuntos de primers
434
HRM
Desenvolvimento
Amostra
• Padronização da quantidade inicial (concentração dos ácidos nucléicos) para todas as
amostras
• Ácidos nucléicos com alta concentração e alta qualidade.

• Boa concentração de trabalho é 10-20ng de DNA por reação
• Ao se deparar com ácidos nucléicos de baixa qualidade:
 tente aumentar a concentração inicial
 tente aumentar o número de ciclos da PCR
 tente pré-amplificação
• Amostras e controles devem ser do mesmo tipo do molde e estar na mesma concentração
que as suas amostras testes
A qualidade da amostra AFETARÁ os resultados de HRM
435
HRM
Desenvolvimento
• Concentração de cloreto de magnésio (MgCl2) é crítica

• Concentração de MgCl2 é um dos primeiros passos para resolução de problemas
• Maioria dos ensaios são bem sucedidos com 1,5mM
• Pode aumentar para 2,5mM (ou mais se necessário)
• Escolha da polimerase
• MeltDoctorTM HRM Enzyme
• AmpliTaq Gold® ou AmpliTaq 360®
• Pequena quantidade de enzima pode afetar os resultados
• Use pelo menos 1,25-1.5U/µl
436
HRM
Desenvolvimento
Boas práticas laboratoriais propiciarão resultados melhores:
• Pipetagem precisa é crítica

• Mantenha volumes de reação altos o suficiente para reduzir erros de pipetagem (20µl é
ideal)
• Montar os mixes de reação no momento que for utilizá-los (evitar dispersão dos resultados)
• Correr as placas dentro de duas horas do preparo
• NÃO deixar as placas preparadas “overnight”
• Realizar a curva de dissociação imediatamente após a amplificação
• É sempre aconselhável correr as amostras em replicatas, os controles e NTCs
437
HRM
Desenvolvimento
• Amplificação no termociclador é possível,

entretanto, é extremamente valioso possuir
os resultados da PCR em Tempo Real para
resolução de problemas
• Objetivo: valores de CT de 15-25
• Observar se todos as amostras
amplificaram em ciclo semelhante
• Nítida fase exponencial
• Reação deve atingir um plateau nítido
438
Resolução de Problemas

439
HRM
Resolução de problemas
• Calibração Background
• Exemplo de dois outliers que não
podem ser aceitos pois
excederam 72000 FSU.
Solução
• Limpar o bloco antes de realizar a
calibração HRM
• Usar ddH2O, repetir a calibração
background
• Se não limpar, utilizar solução de
hipoclorito 10% v/v seguida de
ddH2O
440
HRM
• Curva de dissociação apresentando

possível degradação da química.
• Notar um arraste de fluorescência
ao longo da coleta de dados.
Solução
• Criar (repetir) nova placa de
calibração HRM
441
HRM
• Pobre amplificação da placa Pure

Dye e Calibração HRM
• Notar o ruído
• Amplificação tardia em um ou dois
poços
• Alto desvio padrão no Ct
Solução
• Criar (repetir) nova placa de
calibração HRM
442
HRM
Spread
• Efeito da utilização da placa de
Velho calibração armazenada à 4C
overnight antes da amplificação
• Notar alta dispersão,
particularmernte na população
heterozigota e os outliers nos
Novo
mutantes homozigotos
Solução
• Correr novamente a calibração
utilizando química nova
443
HRM
• Baixa performance da PCR gera

maior dispersão entre as amostras
no software HRM
Solução:
• Quantidade de enzima?
• Quantidade de MgCl2?
• Quantidade de primers?
• Aumentar tempo de extensão?
• Alvo degradado?
• Montar reação no gelo?
• Nova sequência de primers?
444
HRM
• Contaminação na PCR
• Notar o pico extra no gráfico do
dado bruto (abaixo)
• Essas amostras nomeadas como
NTCs são automaticamente omitidas
no gráfico dos dados analisados
(acima)
• Contaminação pode ser proveniente
de outras amostras e alterar o
comportamento de dissociação
Solução
• Repetir experimento (otimizar, se
necessário)
Nota: semelhante ao problemas com dímeros de primers.
445
HRM
• Efeito de um master mix armazenado à

temperatura ambiente por 2 horas
• O gráfico debaixo mostra o Velho
agrupamento correto de uma placa
corrida imediatamente após a
montagem
• O gráfico acima mostra uma maior
dispersão das amostras de um
master mix que foi deixado à
temperatura ambiente por 2 horas Novo
Solução
• Montar o master mix no momento de
correr as placas
446
HRM
• NTCs não nomeados
• Notar as curvas errôneas no gráfico da curva de dissociação normalizada
• Os ajustes das regiões pré e pós dissociação podem não ser ideais
• Solução
Nomear NTCs
• Abrir novamente os arquivos *.sds ou *.eds e nomear os NTCs
• Abrir novamente no software HRM
ou
• Omitir os poços no Software HRM e manualmente ajustar as regiões pré e pós
447
HRM
• Região de pré dissociação distante
• Ruído na região afeta a formação
dos clusters
• Ocorre inclusão de mais variantes
Solução
• Trazer a região de pré dissociação
para próximo do ponto de inflexão
451
HRM
• Região pré dissociação muito perto
• Perda da primeira parte da curva,
achatando o gráfico da diferença
• Resultará em resultados incorretos dos
clusters
• Solução
• Movimentar as barras para a região
achatada antes do início da
dissociação
452
HRM
• Escala incorreta no gráfico da curva de dissociação normalizada

• Curva aparece achatada, difícil de distinguir os variantes
• Solução
Ajustar o eixo Y
• Clicar no ícone ‘plot properties’
453
HRM
• Arquivos de experimentos *.sds ou *.eds não abrem

• Checar se arquivos foram analisados e salvos
• Checar se o arquivo do experimento nos softwares SDS do ABI7500fast (v2.0.4 ou posterior)

ou do StepOne ou StepOnePlus (v2.2 ou superior) contém um programa de dissociação
completo e sem erros presentes.
• Os arquivos *sds do 7500 fast devem ser corridos com a versão SDS v.2.0.4 ou superior
• Se o Software estiver lento:

• Computador possui 1GB RAM
• Abrir um experimento de cada vez
• Fechar outras aplicações
454
0800-772 5433
Horário de atendimento: segunda à sexta (08h – 18h)
suporte.br@lifetech.com
AtendimentoD1.lsg.Br@lifetech.com (SP)
AtendimentoD2.lsg.Br@lifetech.com (RJ, MG, PR, SC e RS)
AtendimentoD3.lsg.Br@lifetech.com (Norte, Nordeste e CO)
455

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Fundamentos da PCR Quantitativa em

Tempo Real (qPCR): uma abordagem

The world leader in serving science

• Qual é a sua experiência com qPCR?

• Quais são suas expectativas para o

• Treinamento da utilização da PCR Quantitativa em Tempo

• Princípios da PCR Quantitativa

• Tempo integral: 9h as 18h

• Combina mais arquivos de corrida .eds em um projeto:

The world leader in serving science

reação enzimática de polimerização de DNA in vitro

 método baseado em PCR

 monitoramento contínuo do sinal fluorescente ao longo

 conversão do sinal fluorescente em valor numérico para

A fluorescência irá aumentar de maneira proporcional à

Independente do modelo, os instrumentos de Real Time

• Há uma relação quantitativa entre a quantidade inicial da amostra alvo e a

Eficiência de 100% Eficiência de 85%

● Preparo da reação (pipetagem)

● Qualidade do template (integridade do DNA/cDNA)

● Presença de inibidores (qualidade de extração)

● Desenho dos primers (Tm, estruturas secundárias)

● Condições de termociclagem (T de anelamento, rampa)

● Qualidade dos reagentes

● Concentração dos reagentes

The world leader in serving science

Fase onde a intensidade de sinal de produto amplificado ainda não

Efeito dupla cascata

9 13 15.8 20.1 23.8 27.7 30.9 34.1

A posição de cada curva

• Reporter normalizado corrigido pelo Baseline (Rn)

Rn Antes da subtração do baseline

Rn Após a subtração do baseline

The world leader in serving science

Uma consideração sobre o SYBR Green

• Liga-se inespecificamente a qualquer fita

• Produtos não específicos geram sinal

• Resultados quantitativos incorretos

Produtos inespecíficos (dímeros) são comuns nos poços negativos

• PCR inclui, além dos primers, uma sonda conjungada com:

> Molécula “quencher”  absorve fluorescência emitida pelo reporter (sonda

• Altamente específica e sensível

StepOne™ Real-Time PCR

TaqMan® Reporters: FAM™, VIC®, JOE™

StepOne Plus™ Real-Time

TaqMan® Reporters: FAM™, VIC®, JOE™, NED™

7500 / 7500 Fast Real-Time

> ~30-40 bases

− TaqMan® MGB Probes

> Sonda com cauda MGB (Minor Groove Binding)

> ~15-20 bases

> Eficiência máxima para formato multiplex

Quenchers: TAMRA™/ vs MGB-NFQ

•TAMRA é fluorescente e ocupa um filtro

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Sangue Análise quanti/quali

Filtro com Fibra de

Tempo ~2 horas ~60 minutos ~30 minutos

Produto Trizol Plus™

• Pureza (A260/A280 e A260/A230)

•Espectro de Absorbância: Absorbância máxima em 260nm

•A260/280 < 1.7

• Eletroforese em gel de agarose desnaturante

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