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GUÍA DE ESTUDIO
CROMATOGRAFÍA
- 2017 -
1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
1) Realice una clasificación general de los diferentes mecanismos de separación cromatográficos,
indique la naturaleza del las fases y el tipo de interacción que tiene lugar en cada caso. Dé algunos
ejemplos de los métodos comprendidos
5) Una mezcla de cafeína y fosfato de piridoxal (vitamina B6) se separa en una columna C18 con
una fase móvil metanol:agua 30:70 (v/v). En estas condiciones indicar:
a- El orden de elución, sabiendo que el fosfato de piridoxal es más polar que la cafeína (ver
estructuras químicas).
b- Si el tiempo de retención del analito más retenido fuera muy alto (factor de capacidad mucho
mayor a 5), cómo procedería para disminuirlo si dispone solamente de esa columna?
1
c- Discuta los ítems a y b si se hubiera resuelto la mezcla con una cromatografía de fase normal
d- ¿Qué término de Van Deemter incide más en el valor H en una cromatografía líquida de alto
rendimiento con fase estacionaria líquida?
6) Una mezcla conocida de los compuestos C y D produce los siguientes resultados en HPLC:
C 1.03 10.86
D 1.16 4.37
Se prepara una solución mezclando 12.49 mg de D más 10,00 mL de una solución que sólo contiene
C y se diluye a 25,00 mL. La áreas de los picos son de 5.97 y 6.38 cm2 para C y D respectivamente.
Hallar la concentración de C (mg mL-1) en el problema.
7) Para cuáles de los siguientes casos aplicar HPLC será una buena opción de análisis:
1) Estudio de la composición del humo del cigarrillo
2) Determinación de ácido ascórbico (vitamina C) en tabletas
3) Determinación de cafeína en bebidas
4) Determinación de azúcares
8) En un análisis por HPLC con detección UV, en columna de 15 cm, se analizan múltiples
contaminantes. Dos de ellos (carbaril y 1-naftol) registran tiempos de retención de 3,4 y 3,8
minutos, con ancho de base de 0,4 minutos en ambas bandas. El pico de un compuesto no retenido
ocurre a 1 minuto de la inyección. Calcular:
- los factores de retención (k’), indicando qué miden y justificar si en este caso sus valores son
adecuados.
- el factor de separación (α) indicando qué mide este parámetro.
- el número promedio de platos teóricos.
- la altura promedio del plato (en mm).
- la resolución entre ambos picos, justificando si la separación es o no completa.
9) Los siguientes datos corresponden a una cromatografía L-L de fase ligada (250 mm de empaque)
Compuesto Tiempo de retención (min) Ancho de base (min)
compuesto no retenido 0.5
sacarina 3.8 0.2
cafeína 5.9 0.7
2
Calcular el número promedio de platos teóricos (N), la altura promedio del plato (H) y la resolución
para dichos compuestos indicando si se separan.
11) a- Realice una clasificación de tipos de resinas de intercambio iónico, indicando grupo iónico
fijo y contra ión (ión intercambiado).
b- Indicar los efectos de aumentar el entrecruzamiento en las columnas de intercambio iónico.
2) Los siguientes datos fueron obtenidos por medio de un cromatograma gas líquido, en una columna
de 1.50 m., cuya fase estacionaria es de escualeno (no polar).
3
d- En base a los datos obtenidos grafique un cromatograma, respetando las escalas. Considere que el
hexano es el compuesto que está en mayor concentración.
e- ¿Cómo se puede mejorar la resolución entre dos picos próximos en CG?
3) Los siguientes tiempos de retención y ancho de picos fueron observados en una columna gas-
líquido de 1,50 m, rellena con FE muy polar, de composición química del tipo del etilen glicol.
Compuesto tr (min) w (min)
no retenido 0.40 -
hexano (PE 68 °C) 4.60 0.35
1-metiletil metanoato (PE 68 °C) 5.00 0.37
Calcular: a- El factor de capacidad (k') para cada sustrato. b- El factor de selectividad (α). c- La altura
equivalente del plato teórico (AEPT o H).
4) Para determinar la op de una CGL, se procede a inyectar alícuotas iguales de una misma muestra, a
distintas velocidades de flujo cada vez y se registra en cada caso el tiempo de retención (tr) y los
anchos de pico (w). Los datos obtenidos son los siguientes:
Alícuota tr (min) w (min) (cm/seg)
1 5.53 0.70 5
2 8.58 0.85 10
3 11.33 0.80 20
4 11.64 0.85 30
5 11.92 0.90 40
6 12.16 1.00 50
7 6.9 0.70 70
a- Con esta información dibuje la curva de Van Deemter, indicando en la gráfica la op y la Hmin. La
longitud de la columna es de 90 cm.
b- ¿Qué proceso dispersivo está incluido en cada término de la ecuación de Van Deemter?
c- ¿Por qué la difusión longitudinal (término B) es un problema más serio en CG que en CL?
d- ¿El término A de Van Deemter se presenta en una columna capilar abierta? Justifique.
5) Se desea determinar la concentración de etanol en sangre mediante un método cromatográfico
utilizando patrón interno. Para ello se procesan, de la misma manera, una serie de soluciones
acuosas patrón de etanol y una muestra de suero: una alícuota de 0.01 mL de cada solución se
diluyen con 0.1 mL de una solución patrón de 2-propanol 0.1mg/mL. Se inyectan 0.1 l de cada
solución en un CG provisto de un detector FID (ionización de llama), un integrador y una columna
PEG-400 (polietilenglicol) a 80 °C. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Medida del integrador
Patrones de etanol (mg/mL)
Pico del etanol Pico del propanol
0.5 5518 12754
0.75 7563 11893
1.0 10350 12084
1.25 13935 12870
1.5 15628 12314
Muestra de sangre 9862 12604
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a- Construir el gráfico de calibración correspondiente y a partir de este gráfico determinar la
concentración de etanol en la muestra de sangre.
b- ¿Qué ventajas tiene emplear las áreas integradas de los picos en vez de sus alturas para realizar la
cuantificación?
RESPUESTAS
1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
1)
MECANISMO DE NATURALEZA DE LA FASE INTERACCIÓN
SAPARACIÓN
F. MÓVIL F. ESTACIONARIA
Partición Líquida o gaseosa Líquida convencional y fase ligada Solubilidad
Adsorción Líquida o gaseosa Sólida Fuerzas de Van der
Waals y enlaces
hidrógeno
Intercambio iónico Líquida Resina Fuerzas electrostáticas
Exclusión molecular Líquida Gel poroso Tamizado
Afinidad Líquida Sólido Reacción especifica
Ejemplos de métodos:
Partición. Planar (papel, HPTLC) – Columna (LLC clásica, HPLC, GLC)
Adsorción. Planar (TLC, HPTLC) – Columna (LSC clásica, HPLC, GSC)
Intercambio iónico. Columna (IEC)
Exclusión molecular. Columna (SEC)
Afinidad. Columna (AC)
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una bomba binaria). Por otro lado, al poder combinar distintos solventes orgánicos y/o aumentar su
proporción durante el desarrollo cromatográfico aumenta, en general, la generación de desechos
tóxicos, considerándose menos "verde".
3) a) Las burbujas pueden obstruir el sistema aumentando la presión. Además, al llegar al detector
pueden dar alteraciones en la línea de base y a veces altos registros de absorbancia cuando se
utiliza un detector UV-visible.
b) Distintos componentes del suero como las proteínas pueden obturar los tubos del sistema
aumentando la presión y también dañar la columna.
c) En presencia de metanol precipitarán los iones del buffer, formando sales que quedarán
depositadas en la tubería. El analista debe lavar primero con agua calidad HPLC y luego con
metanol hasta estabilizar la presión habitual de la columna para el flujo de trabajo.
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F = CC . AD / CD . AC = 4.37 cm2 x 1.03 mg.mL-1 / 10.86 cm2 x 1.16 mg.mL-1 = 0.357
7) 1) La composición corresponde a una mezcla de hidrocarburos y sería un claro caso para GC que
dará una rápida, fácil y económica separación respecto de HPLC.
2) La determinación puede hacerse por HPLC pero resulta más fácil determinar vitamina C por
volumetría y por métodos electroquímicos.
3) La cafeína debe ser separada de colorantes, aditivos y otros componentes presentes en las bebidas
y HPLC es la técnica adecuada de elección.
4) Los azúcares pueden ser determinados por GC o HPLC; pero la última es la técnica de elección
ya que los azúcares no son volátiles y deben ser derivatizados con trimetilsilano si se elige CG
haciendo más complicada la determinación.
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1.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES
2) a- tr' = tr - tm
tr'(Benceno) = 10 min - 3 min = 7 min
tr'(Hexano) = 11 min - 3 min = 8 min
b- N = 16 (tr/w)2
N (Benceno)= 16 (10/1.1)2 = 1322
N (Hexano) = 16 (11/1.4)2 = 988
Nprom = (1322 + 988) / 2 = 1155
c- R = 2 (tr(H) - tr(B)) / (W(B) + W(H))
R = 2 ( 11 min - 10 min ) / ( 1.1 min + 1.4 min) = 0.8
Para una separación completa R debe ser mayor o igual a 1.5. En este caso la separación no es
completa.
d-
8
tr
señal
tr(A) (B)
Z
WA WB
3 10 11 tiem po
e- Para mejorar la resolución entre dos bandas cromatográficas se debe aumentar la separación entre
bandas (Δtr) y disminuir su ancho. La separación se puede lograr modificando las variables
termodinámicas (K, k y α) modificando fase móvil, fase estacionaria y/o temperatura. Las bandas se
afinan modificando las variables que permiten disminuir H y aumentar el N (ver ecuación de van
Deemter modificada. Es decir, usar una columna de menor diámetro, una fase estacionaria con
menor espesor- película de fase estacionaria más delgada, partículas de fase estacionaria muy
pequeñas, etc.)
4) a- N = 16 ( tr / w )2 H = L/N
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Alicuota N H 0,1
H (cm)
3 3209 0.028
4 3000 0.029 0,04
cm/seg
5) a-
y = 0.8316x + 0.028
1.4 R2 = 0.9986
areaEtOH/areaPropOH
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.5 1 1.5 2
[EtOH] ]
R = 0.91 mg/mL
b- Si varían ligeramente las condiciones de una columna, el tr de un compuesto y la altura del pico
pueden modificarse. Pero el ancho y la altura varían simultáneamente y el área correspondiente se
mantiene constante.
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PREGUNTAS Y CUESTIONES ADICIONALES
3) Definir los parámetros cromatográficos número (N) y altura (H) de platos teóricos. Indicar con
qué característica del pico cromatográfico se relacionan y justificar a través de qué variables pueden
ser modificados dichos parámetros para lograr mejores separaciones.
4) Dibujar, en un mismo gráfico, cada uno de los términos dispersivos de la ecuación de Van
Deemter modificada y la curva resultante. Indicar la condición óptima de trabajo.
5) Explicar la relación entre la altura del plato (H) y la difusión en remolino (término A) de un
compuesto en una cromatografía en columna. Indicar cómo se genera dicha difusión, su relación con
la velocidad lineal de la fase móvil y en qué tipos de columnas cromatograficas está ausente.
Justificar.
6) Explicar la relación entre la altura del plato (H) y la difusión longitudinal (término B) de un compuesto
en una cromatografía en columna. Indicar cómo se genera dicha difusión, su relación con la velocidad
lineal de la fase móvil y en qué tipo de cromatografía es más importante. Justificar.
7) Explicar en qué consiste efectuar una curva de calibración con patrón interno en método
cromatográfico y las ventajas de este procedimiento.
8) Justificar:
– qué tipo de especies se separan con HPLC y no con CG
– qué tipo de especies se separan con exclusión molecular
– qué tipo de especies se separan con intercambio iónico
9) En cromatografía líquida: definir los conceptos de fase normal y fase reversa. Ejemplos.
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11) En una cromatografía líquida de adsorción: definir la naturaleza de fase móvil y estacionaria
(ejemplos de cada una de ellas). Describir el fundamento de la separación y fuerzas que intervienen.
Indicar qué mide el parámetro de fuerza del solvente (o). Justifique si la fase móvil es o no
interactiva.
12) Describir las diferencias entre una cromatografía líquida convencional y una de fase ligada, y
mencionar al menos 3 ventajas de la fase ligada respecto a la cromatografía convencional.
13) En una cromatografía líquida de intercambio iónico, defina la naturaleza de la fase móvil y de la
fase estacionaria (ejemplos de cada una de ellas). Describa el fundamento de la separación y fuerzas
que intervienen. Justifique si la fase móvil es o no interactiva.
14) Describir las características generales de las columnas cromatográficas usualmente empleadas
en HPLC y los distintos tipos de rellenos.
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CROMATOGRAFIA PLANAR
La cromatografía plana tiene dos modalidades: capa delgada y papel. En la primera, la
separación se produce sobre un sólido finamente dividido que se ha fijado sobre una superficie
plana. La sustancia que más se utiliza como adsorbente es el gel de sílice que puede funcionar a
veces como soporte para el agua u otros disolventes polares en las separaciones líquido – líquido.
Pero si se seca en una estufa, la capa de gel de sílice pierde la humedad, su superficie resulta
predominantemente sólida y sirve como adsorbente en las separaciones líquido – sólido.
En el caso de cromatografía en papel se utilizan papeles de alta pureza y características
reproducibles de porosidad y grosor. Estos papeles contienen suficiente agua retenida, de manera
que la cromatografía de papel se puede clasificar como una cromatografía de tipo líquido – líquido.
Es posible hacer que otros líquidos reemplacen al agua, proporcionando un tipo diferente de fase
estacionaria y originando una cromatografía en papel de fase reversa en donde la fase móvil sea un
solvente polar.
También existen en el comercio papeles que tienen un adsorbente o una resina de
intercambio iónico que permite realizar cromatografía en papel de adsorción o de intercambio
iónico, respectivamente.
La siguiente figura es el esquema de una placa de cromatografía en capa delgada donde se
indican las distancias recorridas por uno de los sustratos (a) y por el solvente (b) a partir de la línea
de siembra.
Frente del
solvente
a
Origen o
línea de
siembra
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CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA
La fase estacionaria está constituida por una capa de adsorbente finamente dividido
extendido sobre una placa de vidrio o de plástico. El sustrato a analizar se siembra cerca del borde
inferior de la placa, la cual se sumerge en una cámara que contiene el disolvente de desarrollo, que a
la vez puede ser el revelador, y que constituye la fase móvil.
El solvente asciende por capilaridad, arrastrando al sustrato. Antes de que el líquido llegue al
borde superior se retira la placa y se marca la posición alcanzada por el frente de solvente. Se señala
la posición de la mancha y se calcula el parámetro Rf .
Rf = distancia recorrida por el sustrato/ distancia recorrida por el frente de solvente
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CELULOSA: Se usa sólo cuando los compuestos a separar se unen muy fuertemente a la alúmina o
al silicagel (compuestos muy hidrofílicos).
Fase móvil
La función de la fase móvil es desplazar al soluto de la fase estacionaria, de manera de
correrlo a través de la placa. Ayuda a separar una mezcla de solutos de modo que cada uno quede
detenido en distintos puntos de la placa.
La efectividad de un solvente de desplazar al soluto del adsorbente se denomina “poder de
elución”. Está asociado con la función llamada parámetro de fuerza del disolvente o coeficiente
eluotrópico que es la energía de adsorción por unidad de área de un adsorbente patrón. Así, un
mayor coeficiente eluotrópico, , implica una interacción más fuerte del disolvente con la superficie
del adsorbente y las moléculas de soluto son desplazadas hacia mayores Rf.
La fuerza de los solventes da lugar a una serie eluotrópica.
Cuando se cambia el adsorbente, el coeficiente eluotrópico del solvente cambia también. El
coeficiente eluotrópico se define en términos de atracción solvente/ adsorbente.
Existe un equilibrio entre solvente, soluto (muestra) y adsorbente, en donde el solvente
compite con el soluto por los sitios activos de la fase estacionaria. Pero no solamente debe tenerse
en cuenta la relación entre el tipo de adsorbente usado y el disolvente o mezclas de disolventes que
determinan el coeficiente eluotrópico, sino también la relación entre la naturaleza química del
soluto o muestra y la del disolvente. Todo ello contribuye a la determinación del Rf y a la calidad de
la resolución en la separación de los componentes de la muestra. Puede ocurrir que dos disolventes
diferentes tengan, para el adsorbente dado, el mismo coeficiente eluotrópico, pero los valores de Rf
y la resolución serán mejores en un caso que en otro, considerando la naturaleza química de los
constituyentes de la muestra y su relación con el disolvente. Se elige en este caso el disolvente que
de mejores Rf y resoluciones.
Muestra
La interacción de la muestra y el absorbente se puede establecer de diferentes modos: mediante
fuerzas de Van der Waals para moléculas neutras; unión dipolo para solutos que tiene un grupo
polar C-Cl o C-NO2, siendo esta interacción más importante en la alúmina; puente hidrógeno entre
el soluto y la sílice en la que los grupos silanos actúan como dador o aceptor de protones; o por
una unión química más que física, de tipo covalente. Se denomina quimiosorción. Se presenta para
algunos ácidos carboxílicos y cetonas.
Cantidad de muestra
Conviene siempre sembrar poca cantidad de muestra. Cuando se usa mucha cantidad de
muestra surge un efecto denominado 'en cola'.
Es preferible secar entre aplicación y aplicación para eliminar el exceso de solvente, de lo
contrario aparecen anillos de muestra.
Resolución
Rs = X / 0.5 (d1 + d2)
donde X es la distancia entre dos manchas, y d1 y d2 sus diámetros promedios .
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Se considera una buena separación cuando Rs es igual a 1. La resolución se puede modificar
aumentando X, respetando el pero cambiando la naturaleza del o de los solventes, o
disminuyendo d colocando menos cantidad de muestra.
Visualización
Métodos no destructivos:
- Radiación visible.
- Radiación ultravioleta (en algunos casos puede ser destructiva, por ejemplo ciertas vitaminas
sufren variación fotoquímica).
- Vapor de iodo (en algunos casos puede ser destructivo porque reacciona químicamente con la
muestra).
- Agua (salvo para ciertos ésteres que son hidrolizados).
Métodos destructivos: El revelador reacciona con la muestra para dar productos coloreados
(aminoácidos con ninhidrina), H2SO4.
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