Ya Te Olvide - Armonia 10

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y
TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA
TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS –
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
BOGOTÁ
2009
DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para Optar el Título de
Microbiólogo Agrícola y Veterinario
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBÍOLOGIA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
BOGOTÁ D.C.
2009
2
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
2
DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y
DIANA ALEXANDRA PACHON CUBILLOS
APROBADO
Bact. MS.c. Adriana Pulido Villamarín MV. Carlos Alfonso Moreno Torres
Director. Revisor Consultor
Pontificia Universidad Javeriana. Universidad Nacional de Colombia
MV. MS.c. Rubiela Castañeda Salazar Biol. PhD. Julio Mario Hoyos Hoyos
Jurado Jurado
Pontificia Universidad Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.
4
DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y
APROBADO
__
INGRID SCHULER., Ph.D Bact. M.SC., M Ed. Janeth Arias P.
Decana Académica Directora
Facultad de Ciencias Carreras de Microbiología
4
A Dios por llenarme de bendiciones cada día y llevarme de su mano por el camino que
me permitirá alcanzar todos mis objetivos.
A mi madre por ser el mayor ejemplo de fortaleza, constancia, dedicación y superación;

por todo su esfuerzo para que juntas alcanzáramos esta meta, por su confianza y
dedicación y por haberme hecho el ser humano que soy ahora.
A mi padre por que desde el cielo me ha acompañado durante todos estos años, por su
ejemplo de entereza, sabiduría y fortaleza.
A mi hermano por su apoyo, confianza y compañía durante todos los años de mi vida, a
mi abuelita por estar siempre a mi lado haciendo de mi un ser humano fuerte y
perseverante, a mi sobrinito por ser la luz de mi vida.
A Javier por acompañarme durante todo este proceso, brindándome apoyo en los
momentos difíciles y por infundirme paciencia cuando creí que esto no sería posible.
6
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Adriana Pulido Villamarín, por haberme dado la confianza para la realización de
este proyecto, por su dedicación, compromiso y apoyo incondicional, aportando todos
sus conocimientos para la realización de este trabajo.
Al Dr. Carlos Moreno Torres por el aporte de sus conocimientos y constancia para
concluir con éxito este trabajo.
Al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la

Universidad Nacional de Colombia, a su directora Dra. Judith Figueroa Ramírez y Dra.
Derly Fierro Toscano por haberme dado la oportunidad de trabajar en sus instalaciones,
ya que sin su colaboración esto no hubiera sido posible.
Agradecimiento especial a Becton Dickinson LTDA por la dotación de medios de cultivo,

kit de identificación y sensidiscos.
A todo el personal de la Estación de Biología Tropical Roberto Franco por toda su

colaboración y especialmente a su directora profesora María Cristina Ardila por sus
aportes al trabajo.
ENERO DE 2009
7
TABLA DE CONTENIDOS
Página
1. INTRODUCCIÓN 17
2. MARCO TEÓRICO 19
2.1. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE 19
2.2. GÉNERO Salmonella 20
2.2.1. Caracterización morfológica y bioquímica 21
2.2.2. Clasificación taxonómica 22
2.2.3. Estructura Antigénica 22
2.2.4. Factores de virulencia 24
2.2.5. Patogénesis y patogenicidad 24
2.2.6. Salmonelosis 27
2.2.7. Diagnóstico 27
2.2.7.1. Métodos de aislamiento de Salmonella sp. 28
2.2.7.2. Identificación bioquímica 34
2.2.7.2.1. Diagnóstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp. 35
2.2.7.3. Serotipificación 37
2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann - White 38
2.2.8. Sensibilidad Frente a agentes antimicrobianos 39
2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos 40
2.2.8.2. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 41
2.2.8.2.1. Principios del método de difusión en agar (Kirby-Bauer) 41
2.2.8.2.2. Interpretación de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por
el método de difusión en agar. 42
2.2.8.2.3. Selección de los agentes antimicrobianos 42
2.3. EL GÉNERO Salmonella sp. ASOCIADO A LOS REPTILES 43
2.4. ESPECIES EN ESTUDIO 47
2.4.1. Caimán del Orinoco (Crocodylus intermedius) 47
2.4.2. Testudinos 48
2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles 49
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 51
3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 51
3.2 JUSTIFICACIÓN 52
4. OBJETIVOS 53
4.1 OBJETIVO GENERAL 53
8 Página
viii
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 53
5. MÉTODOLOGÍA 54
5.1. ÁREA DE ESTUDIO 54
5.2. POBLACIÓN MUESTRAL 54
5.3. TOMA DE MUESTRAS 54
5.3.1. Obtención de muestras por hisopado cloacal 56
5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques 57
5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques 58
5.4. FASE ANALÍTICA 59
5.4.1. Aislamiento e identificación de Salmonella sp. 59
5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo 59
5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo 59
5.4.1.3. Aislamiento primario en medio selectivo y diferencial 59
5.4.1.4. Identificación bioquímica 63
5.4.1.5. Serotipificación 63
5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibióticos 64
6. RESULTADOS Y DISCUSION 66
6.1. ANÁLISIS DE DATOS 66
6.2. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL GÉNERO Salmonella sp.
POR TÉCNICA BBL CRYSTAL® 66
6.3. POSITIVIDAD A Salmonella sp. EN ESTANQUES DE CROCODYLIA Y
TESTUDINEA 67
6.4. PRESENCIA DE Salmonella sp. SEGÚN LA ESPECIE 69
6.5. AISLAMIENTOS DE Salmonella sp. SEGÚN EL TIPO DE MUESTRA
PARA EJEMPLARES DE CROCODYLIA Y TESTUDINOS 71
6.5.1. Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia según
grupos etáreos 74
6.6. SEROTIPIFICACIÓN 75
6.7. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS 77
6.8. MICROORGANISMOS DIFERENTES A Salmonella sp. AISLADOS EN
LOS ESTANQUES DE LA ESTACIÓN 80
7. CONCLUSIONES 85
8. RECOMENDACIONES 86
9. REFERENCIAS 87
10. ANEXOS 106
ix8
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla Nº 1. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de

Salmonella sp. 34
Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de

microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. 37
Tabla Nº 3: Especies de Crocodylia y Testudines muestreadas y número de cepas

de Salmonella sp. aisladas para cada especie según estanques muestreados 55
Tabla Nº 4: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp.

aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los
antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer 77

aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los
antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer. 78
10x
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia 46
Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudinos 46
Figura Nº 3. Caimán del Orinoco o Caimán Llanero (C. intermedius) 48
Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la

E.B.T.R.F 49
Figura Nº 5. Toma de muestras: hisopados cloacales en Testudinos. 56
Figura Nº 6. Muestreo de ejemplares neonatos de Crocodylus intermedius

mediante hisopado cloacal. 57
Figura Nº 7. Muestreo de agua y sedimento de los estanques. 58
Figura Nº 7A y 7B. Muestreo en los estanques de Crocodylia neonatos

y Testudinos 58
Figura Nº 7C Muestreo en estanques de Crocodylia Adultos y Juveniles 58
Figura Nº 8. Muestreo de arena y materia fecal encontrada en los encierros

de los animales en estudio. 59
Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios

de cultivo selectivos. 60
Figura Nº 9 A. CRHOMagar Orientación 60
Figura Nº 9 B. Agar MacConkey 60
Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género

Salmonella sp. aisladas en los medios de cultivo diferenciales. 61
Figura Nº 10 A. CHROMagar Salmonella. 61
Figura Nº 10 B. Agar Hektoen Entérico. 61
Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en

las muestras. 62
Figura Nº 11 A. Staphylococcus saprophyticus. 62

Figura Nº 11 B. Escherichia coli. 62
Figura Nº 11 C. Enterococcus sp. 62
Figura Nº 11 D. Klebsiella sp. 62
Figura Nº 11 E. Citrobacter sp. 62
xi
11
Página
Figura Nº 12. Lectura de pruebas de identificación Crystal® para

microorganismos entéricos/no fermentadores. 63
Figura Nº 12 A. Identificación a partir de agua y sedimento del estanque

de Testudinos número 21. 63
Figura Nº 12 B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimán

neonato en el estanque número 47 63
Figura Nº 13. Esquema de una lámina hemoclasificadora utilizada para

la serotipificación de las cepas de Salmonella sp. y modo en que se empleó. 64
Figura Nº 14. Antibiograma 65
Figura Nº 15. Porcentaje de presentación de Salmonella sp. en los

estanques de la E.B.T.R.F. 67
Figura Nº 16. Estanques de Tortugas positivos y negativos

a Salmonella sp. 69
Figura Nº 17. Estanques de C. intermedius positivos y negativos a

Salmonella sp. en la E.B.T.R.F. 70
Figura Nº 18. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen

de la muestra en Testudinea 72
Figura Nº 19. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen de la muestra

en estanques de C. intermedius 72
Figura Nº 20. Porcentaje de aislamientos positivos a Salmonella sp.

en los estanques de Crocodylia según los grupos etáreos. 74
Figura Nº 21. Serotipificación de Salmonella sp. aislada en la E.B.T.R.F 76
Figura Nº 22. Pruebas de Sensibilidad a antimicrobianos 78
Figura Nº 23. Microorganismos diferentes a Salmonella sp

aislados en los estanques de C. intermedius y Testudinos de la E.B.T.R.F 80
Figura Nº 24. Microorganismos aislados las muestras de agua y sedimento

en los estanques de Testudinea muestreados 81
Figura Nº 25. Microorganismos aislados en las muestras

de arena y materia fecal en los estanques de Testudinea muestreados 81
Figura Nº 26: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados

cloacales de ejemplares de Testudinata muestreados 82
Figura Nº 27: Microorganismos aislados en las muestars de agua y

sedimento de los estanques de C. intermedius muestreados 82
Figura Nº 28: Microorganismos aislados en las muestras de arena y

materia fecal halladas en los estanques de C. intermedius muestreados 83
12
xii
Figura Nº 29: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados
cloacales de ejemplares de C. intermedius muestreados. 83
12
xiii
ÍNDICE DE ANEXOS
Página
ANEXO N º 1. Plano de la E.B.T.R.F 106
ANEXO Nº 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar

Orientación 107
ANEXO Nº 3. Sistema de Identificación BBL Crystal para Entericos/No

Fermentadores. 108
Anexo 3.1. Procedimiento para la identificación de los microorganismos por

sistema BBL Crystal. 108
Anexo 3.2. Ficha técnica de reacciones de color para lectura de resultados. 109
Anexo 3.3. Calculo del número de perfil 109
ANEXO Nº 4. Esquema de Kauffmann – White 110
ANEXO Nº 5. Interpretación de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos 112
ANEXO Nº 6. Resultados obtenidos por estanque en cada muestreo. 114
14
xiv
RESUMEN
Durante mucho tiempo las enterobacterias pertenecientes al género Salmonella han sido
reportadas como patógenos para humanos y animales tanto domésticos como silvestres;
aunque también hacen parte de la flora normal intestinal de reptiles, especialmente de
tortugas.
La Estación de Biología Tropical Roberto Franco de la Universidad Nacional de

Colombia, ubicada en la ciudad de Villavicencio, lidera el programa de recuperación del
Caimán Llanero (Crocodylus intermedius) que se encuentra en inminente peligro de
extinción y además cuenta con una colección viva de Testudinos de diferentes géneros.
Con el fin de evidenciar la presencia del enteropatógeno en la Estación, se procedió a

aislar microorganismos del género Salmonella a partir de muestras de origen ambiental y
cloacal de las especies allí encontradas, utilizando la metodología microbiológica
estándar; posteriormente se procedió a serotipificar los aislamientos por el método
convencional de Kauffmann-White especialmente a nivel de antígeno somático y
finalmente se realizó la prueba de sensibilidad a antimicrobianos para cada cepa
encontrada en la Estación.
Los resultados reportan una prevalencia del 52% de Salmonella sp. en el total de la
población muestreada, con una mayor positividad a partir de muestras de
agua/sedimento y las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos determinaron que el
100% de los aislamientos fueron sensibles a la norfloxacina. Teniendo en cuenta que
microorganismos del serogrupo C2 fueron los más prevalentes (41,4%) y conscientes del
riesgo zoonótico se dio inicio a la implementación de un manual de bioseguridad para la
estación y así prevenir todo riesgo para la población animal y humana.
Los resultados obtenidos fortalecerán programas de sanidad animal que pretenden

garantizar la salud de los ejemplares y realizar nuevas investigaciones de patogenia,
nutrición, etología y genética.
15
ABSTRACT
Salmonella sp. has been reported as pathogens for human and animals domestic as wild;
in spite of being part of the normal intestinal flora of reptiles especially of turtles.
The Estación de Biología Tropical Roberto Franco located in the city of Villavicencio is
part of the Universidad Nacional de Colombia, and it leads the program of recovery of the
Caiman Llanero (Crocodylus intermedius), which is in imminent extinction danger and
also bill with an alive collection of Testudinos of different families.
With the purpose of evidencing the presence of the enteropathogen, we proceeded to

isolate microorganisms of the gender Salmonella sp. starting from samples of
environmental and cloacae origin using the standard methodology; we proceeded to
serotyping the isolations for the conventional method of Kaufmann-White and finally we
did an antimicrobial susceptibility test for each strain found in the Estación.
Results reports a prevalence of 52% of Salmonella sp in the population sampled with a

bigger detection starting from samples of water/silt. Antimicrobial susceptibility test could
determine than 100% of the isolates were sensible to norfloxacine. Knowing that
microorganism of serogroup C2 were the most prevalent (41,4%) and aware of the
zoonotic risk we begin to the implementation of a biosecurity manual for the Estacion and
this way to prevent all risk for the animal and human population.
Results going to strength programs of animal sanity that seek to guarantee the health of
the animals and to carry out new in investigation in pathology, nutrition, etiology and
genetics.
16
1. INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se

encuentran como comensales y patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos
domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de
enfermedades en sus hospederos, considerándose como la principal enterobacteria de
importancia en salud pública (Selbitz et al.,1995. Turnbull, 1979).
Para el caso de Latinoamérica y especialmente para Colombia la investigación acerca de
microorganismos pertenecientes al género Salmonella se ha centrado en relación con las
enfermedades trasmitidas por agua y por alimentos (ETA) y es poco lo que se ha
investigado con respecto a la transmisión por reptiles donde esta enterobacteria hace
parte de la flora intestinal normal; a pesar que las autoridades reguladoras del medio
ambiente reconocen el problema zoonótico que representan las especies silvestres
frente a la población humana, las investigaciones en el área biológica y veterinaria son
insuficientes (Hernández, 2004)
Los reptiles frecuentemente son portadores asintomáticos de Salmonella sp. y por

consiguiente, los casos clínicos de salmonelosis son reportados con menor frecuencia
(Ramsay, et al, 2002). Sin embargo, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos
niveles de mortalidad en serpientes y tortugas, y a su vez, un gran porcentaje de
investigaciones han implicado la herpetofauna en la transmisión de Salmonella sp. hacia
los humanos, lo cual permite establecer la capacidad de generar procesos de infecciones
zoonóticas y la importancia de la bacteria a nivel de salud pública (Saelinger y Lewbart, 2006).
De manera natural los reptiles son susceptibles a enfermedades que contribuyen a la

disminución de las poblaciones; aunque en la mayoría de los casos se desconoce la
acción patógena de los microorganismos sobre estas especies silvestres, ignorándose el
impacto que tienen las enfermedades bacterianas sobre las mismas, así como el
tratamiento ideal para combatir los signos producidos (Mader, 1996). Sin embargo, es de vital
importancia tener en cuenta que la presencia de éste tipo de endopatógenos no se
asocia necesariamente con estados de enfermedad (Lax, et al., 1995). Desde el punto de vista
profiláctico, la susceptibilidad a patologías causadas por enterobacterias en reptiles se
relaciona con estados de depresión en el animal, que pueden producirce a causa del
estrés por el cautiverio, alteración en temperaturas medioambientales, el número de
microorganismos presentes, edad, estado nutricional del animal, entre otras (Mader, 1996).
Los resultados asociados a este tipo de condiciones son la afección de tejidos y fluidos
por generar un bloqueo de los vasos sanguíneos, edema, ulceraciones, necrosis,
17
disminución de actividad, pérdida de peso progresiva, anorexia, polifagia, regurgitación,
diarrea, constipación y letargia. (Jertborn et al 1990).
Estudios sobre Salmonella sp. en especies silvestres demuestran que su presencia es

constante, pero se deben conocer las serovariedades implicadas y la sensibilidad que
tienen tanto animales cautivos como salvajes para ser afectados por el microorganismo
con el fin de minimizar los posibles inconvenientes que se pueden presentar en los
programas de recuperación debido a enfermedades asociadas al enteropatógeno;
además, parece ser que en los centros donde los reptiles están en condiciones de
cautividad, hay más posibilidad de aislamiento de esta bacteria que en estado libre (Ramsay
et al., 2002). La Estación de Biología Tropical Roberto Franco, es el centro de recuperación

de especies silvestres en vía de extinción más importante en el país, ha demostrado una
excelente gestión en el manejo de estas poblaciones logrando así minimizar los riegos
de extinción de las especies; es una entidad encaminada al cuidado y recuperación de
ejemplares de Crocodylus intermedius (Caimán Llanero) y Testudines llevando a cabo
investigaciones en el ámbito de salud, nutrición y reproducción que permiten la
repoblación de estos ejemplares; sin embargo, las condiciones ex situ de los animales
producen estados de inmunosupresión donde microorganismos patógenos como
Salmonella sp. pueden llegar a colonizar generando cuadros de enfermedad en los
individuos; con base en ello, es necesario tener en cuenta que el conocimiento de la
microbiología entérica de estas especies es fundamental para diagnosticar desórdenes en
la flora digestiva así como para prevenir infecciones secundarias, todo ello dirigido a
optimizar los respectivos programas de conservación de estas especies silvestres (Saelinger y
Lewbart, 2006)
Mediante la realización de este estudio se pretende llevar a cabo un análisis sobre la

condición de los animales de Orden Crocodylia y Orden Testudinea cautivos en la Estación
de Biología Tropical Roberto Franco dependencia de la Facultad de Ciencias de la
Universidad Nacional de Colombia, en la ciudad de Villavicencio, debido a que de acuerdo
con las listas oficiales de especies amenazadas publicadas por la Unión Internacional para
la Conservación de la Naturaleza (UICN), son las especies de vertebrados más
amenazados en Colombia (Min. Medio Ambiente, 2002). Para tal fin, se llevará a cabo el aislamiento e
identificación de enterobacterias del género Salmonella, estableciendo los serogrupos que
predominan en dichas especies, identificados mediante pruebas serológicas, para
posteriormente reconocer su valor zoonótico y finalmente lograr con la investigación hacer
un aporte sustancial en cuanto a los riesgos biológicos y epidemiológicos de importancia en
salud pública dentro de la Estación y asimismo, promover la preservación de la fauna nativa
que se encuentra en peligro de extinción.
18
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Familia Enterobacteriaceae

La familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), pertenece al orden XIII
Enterobacteriales. Según la segunda edición 2001 del Manual Bergey de Bacteriología
Sistemática, está conformada por 41 géneros y más de 100 especies (Quinn et al., 2002),
aunque menos de la mitad tienen interés desde el punto de vista veterinario (Stanchi, 2007).
Su hábitat natural es el intestino y muchos de estos microorganismos provocan

enfermedades tanto en los animales productores de alimentos (diarrea de los recién
nacidos y salmonelosis), como en los animales de compañía (infecciones y abscesos del
tracto urinario) y en el hombre (Biberstein, y Chung Zee, 1990). Esta familia incluye géneros de gran
importancia a nivel epidemiológico como son Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella
sp, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Serratia sp., Proteus sp., Citrobacter sp., Edwarsiella
sp., Yesinia sp., Morganella sp., y Arizona sp. entre otras (Jawetz, et al, 2005).
Los microorganismos de esta familia son parecidos en cuanto a su morfología y

caracteres tintoriales por ser bacilos pleomórficos Gram negativos y asporógenos de un
tamaño de 2 – 3 µm por 0,4 – 0,6 µm, catalasa positivos y oxidasa negativo, por carecer
de citocromo c, lo cual es una propiedad bioquímica útil en el aspecto diagnóstico de la
familia (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990). Los representantes de este grupo de
microorganismos son anaerobios facultativos; en condiciones anaerobias, su crecimiento
depende de que en el medio existan carbohidratos como fuente de carbono; en
aerobiosis, la gama de sustratos apropiados para su crecimiento incluye ácidos
orgánicos, aminoácidos y carbohidratos (Biberstein y Chung Zee, 1990). Mediante observación
microscópica resulta difícil diferenciar los representantes de un determinado género de
los pertenecientes a los demás géneros. Son clave para el diagnóstico los productos
resultantes de la fermentación de azúcares; casi todos los microorganismos de este
grupo fermentan la glucosa a ácido pirúvico por la vía de Embden Meyerhoff (glicolisis);
fermentan la D-glucosa a menudo con producción de gas, reducen los nitratos a nitritos y
poseen un contenido de DNA del 39 al 59% de guanina mas citosina (G+C), algunos
poseen cápsula (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990).
Las propiedades que definen a la familia deben ponerse en evidencia para afirmar que la
cepa es una enterobacteria. A partir de ahí se realiza la identificación, fundamentalmente
por las características bioquímicas para estudiar el metabolismo proteico (presencia de
ureasa, producción de indol, degradación del triptófano), el metabolismo glucosídico
(fermentación de azúcares: glucosa, lactosa, sacarosa, etc.), la capacidad de utilizar el
citrato como única fuente de carbono, la presencia de enzimas descarboxilasa y
19
desaminasas y la producción de hidrógeno sulfurado, entre las características más
importantes (Biberstein y Chung Zee, 1990).
Las Enterobacterias pueden comportarse como apatógenas, patógenas oportunistas y
patógenas importantes. Las primeras, pueden encontrarse como contaminantes de
muestras clínicas, siendo aisladas del ambiente y/o materia fecal, como es el caso de
Hafnia; las enterobacterias patógenas oportunistas ocasionalmente producen
enfermedad a nivel del tracto digestivo, mientras que las patógenas importantes pueden
causar daños entéricos y sistémicos, por poseer una estructura antigénica compleja y
producir varias toxinas y otros factores de virulencia (Baümler et al. 1998, Muñoz et al, 2002, Biberstein y
Chung Zee, 1990).
2.2. El Género Salmonella

El género Salmonella recibe su nombre en honor al microbiólogo americano Daniel
Elmer Salmon (1850-1914), quien en 1876 fue reconocido como el primer doctor en
medicina veterinaria graduado en una universidad de los Estados Unidos. Junto a
Theobald Smith (1859-1934), conocido por su trabajo con anafilaxis, fueron quienes
descubrieron los gérmenes designados como salmonelas, en 1885, aislándolos de
cerdos con cólera (Stanchi, 2007)
Salmonella sp. es la enterobacteria de mayor importancia a nivel de salud pública por

producir trastornos del tracto gastrointestinal y septicemia no solo en el ser humano, sino
en todas las especies animales (Selbitz et al; 1995; Turnbull, 1979, Lujan y Blas, 2007)
Los microorganismos del género Salmonella están extensamente diseminados en la

naturaleza como comensales y como patógenos del aparato digestivo de los mamíferos
domésticos y silvestres, aves, reptiles e insectos, en los cuales pueden llegar a producir
una amplia gama de enfermedades. Todas las salmonelas son potencialmente
patógenas (Stanchi 2007; Smith et al. 1952; Mahajan et al. 2003) al ser parásitos intracelulares y por
medio de los macrófagos en los que se encuentran, se diseminan por todo el organismo
afectado aprovechando la vía linfática y sanguínea (Smith et al. 1952; Suter, 1956; Stanchi, 2007). En
medicina humana están descritas diversas presentaciones de salmonelosis: fiebre
entérica, septicemia, y finalmente gastroenteritis; mientras tanto, en medicina veterinaria
se ha determinado que esta bacteria puede provocar septicemia, enteritis aguda,
subaguda y crónica, y abortos en diferentes especies animales (Stanchi, 2007). Las diversas
especies de salmonelas se transmiten por contacto tanto con enfermos como con
portadores sanos, aunque por lo general la enfermedad producida por este agente
microbiano tiene un origen alimentario debido a la ingesta de alimentos contaminados
20
con el patógeno, teniendo en cuenta que la fuente de contaminación ambiental es
invariablemente la materia fecal (Stanchi 2007 ; Smith et al. 1952; CDC. 2007).
2.2.1 Caracterización morfológica y bioquímica

Los miembros del género Salmonella son bacilos Gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm,
no fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no esporulados (Terragno et al, 2003);
generalmente móviles por flagelos perítricos con la excepción de Salmonella gallinarum y

Salmonella pullorum, responsables de la tifoidea aviar y pullorosis respectivamente (Stanchi
2007, Terragno et al, 2003).
Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo; fermentan glucosa con producción de

ácido y gas (excepto S. typhi), también fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, D-
manosa, L-ramnosa, Dsorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcitol (Terragno et al, 2003). Son
oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges- Proskauer (VP) negativo, rojo de
metilo y citrato de Simmons positivo, producen H2S, son urea negativo, lisina ornitina y
descarboxilasa positivo (Terragno et al, 2003). Entre otras características bioquímicas se
encuentran la reducción de nitratos a nitritos, no desaminan la fenilalanina y son
tetrationato reductasa (Jawetz, et al, 2005).
Las salmonelas se multiplican bien en medios ordinarios, las colonias post incubación
por 18 a 24 horas a 32oC son de 2 a 3 mm de diámetro salvo algunos serotipos que
producen colonias pequeñas; con algunas excepciones no presentan cápsula (Smith et al.
1952; Suter 1956). Los miembros del género Salmonella crecen en un amplio rango de
temperaturas (7 - 28oC), el rango de pH ideal para su crecimiento es entre 6,6 y 8,2; son
incapaces de tolerar altas concentraciones de sal y sobreviven en agua congelada
durante periodos prolongados (Jawetz et al. 2005).
Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella sp. son relativamente

estándar, sin embargo puede haber variaciones en los medios de cultivo y algunas
pruebas bioquímicas, por lo cual como alternativa se están introduciendo cada vez más
los métodos moleculares que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más
simples de realizar, pero tienen como desventaja que son de costo elevado (Terragno et al,
2003).
21
2.2.2. Clasificación taxonómica
La más reciente clasificación del género Salmonella está basada en estudios realizados
sobre la base de técnicas de hibridación del DNA de la bacteria y se ha concluido que
éste está conformado por dos especies:
1) Salmonella enterica, dividida en seis subespecies aisladas de:
a. Subepecie I. S. enterica subsp. enterica: Humanos y Animales de sangre caliente

b. Subespecie II. S. enterica subsp. salamae: Animales de sangre fría y del ambiente.
c. Subsespecie III a. S. enterica subsp. arizonae: Animales de sangre fría y del
ambiente.
d. Subespecie III b: S. enterica subsp. diarizonae. Animales de sangre fría y del
ambiente.
e. Subespecie IV. S. enterica subsp. houtenae. Animales de sangre fría y del
ambiente.
f. Subespecie VI. S. enterica subsp. indica. Animales de sangre fría y del ambiente.
2) Salmonella bongori. Subespecie V: No constituye un patógeno para los humanos,

pero si ha sido implicada en ciertas patologías en animales (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y
Weill; 2007; Stanchi 2007; Farmer 2003 y Terragno et al 2003)
Es de suma importancia aclarar que, aunque existan solo dos especies de salmonelas
según su hibridación de DNA, tanto las especies como las subespecies mencionadas se
encuentran constituidas por más de 2400 variedades serológicas, determinadas según
las distintas asociaciones de los antígenos somáticos O y flagelares H (Stanchi, 2007).
También puede hacerse una clasificación de las salmonelas desde el punto de vista
epidemiológico en tres grupos:
1) Sin ninguna afinidad por hospedador

2) Afectan únicamente al ser humano
3) Adaptadas a un hospedador animal únicamente (Stanchi 2007; Terragno et al 2003).
2.2.3. Estructura antigénica

La estructura antigénica de Salmonella sp. es similar a la de otras enterobacterias,
contando con la presencia de dos clases de antígenos principales: Antígenos O
(somáticos) y Antígenos H (flagelares). En algunas cepas se encuentra un tercer tipo de
Antígeno de superficie, análogo funcionalmente a los Antígenos K (capsulares) de otros
22
géneros. Al estar este antígeno relacionado con la virulencia de las cepas se le
denomina Antígeno Vi (Koneman y Allen. 1999), que puede interferir con la aglutinación por
antisueros O y que se relacionan con invasividad (Jawetz et al, 2005).
a. Ag Somático (O de pared celular): Es un polisacárido, termostable, tipo-

especifico, que se halla en todas las especies (Stanchi 2007). Se distinguen dos clases:
mayores (determinantes del serogrupo) y menores (se hallan en algunas
Salmonelas y serogrupos de éstas), son compartidos por diferentes serovares y no
determinan los serogrupos (Stanchi 2007), aunque existen numerosos antígenos O, son
los factores O principales los que sirven para caracterizar los diferentes tipos
antigénicos. (Por ejemplo O4: se refiere al grupo B, O9: Grupo D, entre otros) (Muñoz et
al. 2002). El complejo de antígenos O determina el subgrupo somático al que

pertenecen los géneros de Salmonella, sp., Arizona sp., Citrobacter sp., Escherichia
sp., Providencia spp. Serratia sp. entre otros (Bayley y Schott, 1982).
b. Ag Flagelar (H): Es proteico y termolábil, constituido por flagelina, cuya

composición en aminoácidos es constante para un tipo antigénico determinado (Bayley
y Schott, 1982). Por lo general, los microorganismos que tienen este antígeno, poseen
dos fases diferenciables por medio de aglutinación en tubo de ensayo (Stanchi 2007; y
Terragno et al, 2003); esto depende de dos genes estructurales que corresponden a la fase
1 y a la fase 2 que hacen referencia a estados motiles y no motiles de la bacteria.
En el primer caso (H1), lo más relevante es que se trata de un Ag específico de
especie (según Kauffmann y White) y su síntesis reside en el gen hag1, que sólo se
expresa durante las primeras 24 h del crecimiento, en lo que se refiere al H2, es
compartido por varias especies de Salmonella y el gen que codifica para su
producción es el Hag2, el cmismo que se manifiesta a partir de las 24 h posteriores
al inicio del desarrollo. La mayoría de las cepas del género Salmonella pueden
expresar las dos especificidades de su antígeno H (difásicos), sin embargo existen
algunas que logran expresar solamente uno (monofásicos) (Parra et al. 2002). Cada
Salmonella sp. expresa alternativamente estos dos tipos de antígenos mediante un
mecanismo denominado “cambio de fase” (Quinn et al., 2002, Smith et al., 1952).
c. Ag capsular (K): Es un antígeno termolábil aunque existen pocas excepciones

(Bayley y Schott, 1982); es llamado en Salmonella el Ag (Vi), que protege a la bacteria
dándole resistencia antifagocìtica. La presencia de este antígeno hace imposible la
aglutinación de sueros anti O, debido a que recubre toda la bacteria; en este caso,
la cepa en estudio debe ser sometida a un calentamiento a 100oC durante 30
23
minutos, a fin de desnaturalizar dicha cubierta y luego poder realizar la prueba de
aglutinación con el Ag somático correspondiente (Stanchi 2007; Terragno et al, 2003). De allí
que la expresión de este factor depende de al menos dos genes (ViA + ViB), siendo
necesario que existan los dos en la bacteria para que la expresión tenga lugar (Parra et
al. 2002).
2.2.4. Factores de virulencia

Para Salmonella sp. se conocen varios factores de virulencia, uno de ellos es la
producción de al menos tres toxinas: las enterotoxinas que son sustancias liberadas al
intestino y que ocasionan síntomas gastrointestinales como cólico y diarrea, las
endotoxinas que hacen parte de la membrana externa de la bacteria y cuya actividad
biológica está asociada con los lipopolisacáridos (LPS) y por último, las citotoxinas que
están asociadas con la superficie celular, las cuales inhiben la síntesis proteica en la
célula hospedadora y pueden estar implicadas en la adherencia a las células epiteliales,
constituyendo esta última un segundo factor de virulencia de Salmonella sp.(Madigan et al 1997;
Salyers y Whitt 2002). También se ha descrito en algunas subespecies de Salmonella (S.
typhimurium) la formación de pseudópodos en la célula hospedera, lo que trae como
resultado la internalización de la bacteria en vesículas endocíticas; adicionalmente, la
producción de adhesinas que incluyen fimbrias codificadas por el plásmido de virulencia
pSLT, permiten la unión de la bacteria a las microvellosidades de los enterocitos,
fimbrias polares largas que se encargan de la unión de la bacteria a las placas de Peyer,
y las fimbrias agregativas delgadas llamadas curli que también pueden estar implicadas
en la unión a las vellosidades de los enterocitos (Madigan et al 1997, Salyers y Whitt 2002).
Otros factores relacionados con la adherencia son los polisacáridos de superficie celular
(O) y el antígeno Vi, un polisacárido capsular compuesto de ácido N-acetilglucosamin-
urónico el cual ayuda a prevenir la fagocitosis y puede proteger la bacteria de las formas
reactivas de oxígeno al interior de los fagocitos, las cepas negativas para el antígeno Vi
son menos infecciosas y virulentas que las positivas para este antígeno (Parry et al. 2002).
La respuesta de tolerancia al ácido, es otro aspecto importante de la virulencia de

Salmonella sp. lo que le permite a la bacteria atravesar el ambiente ácido del estómago,
requisito necesario para la infección (Salyers y Whitt 2002).
2.2.5. Patogénesis y patogenicidad

Todos los serotipos de Salmonella sp. conocidos son patogénicos para el hombre y los
animales (Parker y Collier, 1990). La virulencia de la bacteria se relaciona con su capacidad de
invadir las células hospedadoras, replicarse en su interior y resistir tanto la digestión por
24
los fagocitos como la destrucción por la acción del complemento, lo cual facilita la
difusión de las salmonelas en el organismo del hospedador (Henrici 1999, Quinn et al. 2002; Smith et al.,
1952).
El complejo proceso de invasión es mediado por los productos de la expresión de varios

genes cromosómicos, mientras que la capacidad de crecer en el interior de las células
hospedadoras depende de la presencia de plásmidos de virulencia (Vadillo et al 2002, Smith et al
1952. y Quinn et al, 2002). Algunos factores que determinan el carácter patógeno de ciertas
especies del género Salmonella se conocen, al menos parcialmente, y se encuadran en
las que se denominan genéricamente Islas de Patogenicidad (o grupos de genes
relacionados con la virulencia) que se encuentran en organismos patógenos pero que
están ausentes o solo presentes de forma esporádica en las especies saprófitas (Vadillo et al
2002; Terragno et al 2003).
La Salmonella sp. cuenta con 5 islas de patogenicicidad, tres de ellas conteniendo genes
de virulencia (Salyers y Whitt, 2002):
 Isla SPI1: Contiene genes inv responsables de la internalización de las células,

estos genes así como otros de la misma isla de patogenicidad (spa, prg y org)
codifican para un sistema de secreción tipo III; también contienen genes que
codifican proteínas que son inyectadas en la célula eucariótica por este tipo de
sistema de secreción, como por ejemplo el gen sptP que codifica para una
tirosina fosfatasa que altera las señales de transducción en células de la
mucosa, produciendo diarrea. De igual forma posee genes involucrados en la
regulación de genes de virulencia (hila, invF, sira y phoPQ), algunos de los
cuales controlan la expresión de genes localizados en otras partes del
cromosoma de la bacteria. Los genes contenidos en esta isla parecen ser
importantes en las etapas iniciales de la infección en la cual las bacterias
invaden las células de la mucosa.
 Isla SPI2: Codifica un sistema de secreción tipo III, diferente al codificado por la
isla SPI1, usado por la bacteria al interior del fagosoma para evitar la fusión
fagosoma-lisosoma; también codifica las proteínas que inyecta a la célula
eucariótica. Esta isla de patogenicidad parece tener mayor importancia en la
fase sistémica de la infección.
 Isla SPI3: Codifica un trasportador de Mg2+ de alta afinidad, el cual puede ser de
importancia en la supervivencia de la célula al interior de fagosomas. No codifica
sistema de secreción.
 Islas SPI4 y SPI5: No se conoce su función, no codifican sistemas de secreción.
25
Las células blanco revisten el último tramo del intestino delgado y el primer tramo del
intestino grueso; si la célula blanco está “libre” con respecto al número de salmonelas, es
posible que se produzca una enfermedad. Los microorganismos del género Salmonella
segregan exotoxinas, las cuales una vez ha tenido lugar la adherencia, determinan que
la enfermedad generada sea diarreica o septicémica. Las cepas que producen diarrea se
multiplican, segregan una toxina semejante a la toxina LT (termolábil) que altera la
síntesis de los nucleótidos cíclicos, haciendo que el microorganismo invada la célula, ya
en el interior, las Salmonelas segregan la citotoxina que provoca la muerte celular y su
desprendimiento de la mucosa intestinal, desencadenando un flujo de iones y líquido
hacia la luz intestinal, lo que a su vez ocasiona diarrea. (Hirsh 2006, Biberstein y Chung Zee, 1990) La
gravedad de la enfermedad depende del número de células blanco afectadas (Blaser y
Newman 1982, y Biberstein y Chung Zee 1990). Aproximadamente 107 organismos viables son
requeridos normalmente para el inicio de una gastroenteritis en humanos; en animales,
se desconoce la dosis infectiva pero depende de la especie (Blaser y Newman 1982); en
animales, los síntomas de la enfermedad son dolor abdominal y diarrea acompañada de
señales de muerte celular (sangre, restos de células y células inflamatorias) (Biberstein y Chung
Zee 1990).
Adicionalmente, es posible que las cepas que producen septicemia provoquen o no

diarrea, destrucción de las células blanco, o ambas cosas. La acción de la enterotoxina
se basa en la interrupción de la síntesis de proteínas provocando la muerte celular
(Biberstein y Chung Zee 1990). Los síntomas que se presentan, aunque no siempre, suelen ser
septicemia y shock; las cepas que producen esta forma clínica de enfermedad eluden la
destrucción por parte del hospedador y se multiplican en el interior de los macrófagos del
hígado, bazo y también en el interior de los vasos sanguíneos (Hinton, 1971). Su destrucción
en la corriente sanguínea se encuentra obstaculizada en parte por las unidades
repetitivas del antígeno O del LPS, posiblemente porque se impide la unión entre el
complejo de ataque a la membrana del sistema del complemento y la membrana externa
de la bacteria (Barrow y Lovely 1991).
Las cepas de Salmonella sp. son relativamente hidrófilas, debido en parte a la fracción
de carbohidratos del LPS que provoca su repulsión de la membrana de las células
fagocitarias, la cual es relativamente hidrófoba; las salmonelas que son fagocitadas no
son destruidas fácilmente porque en el animal el contenido de los lisosomas del
macrófago no atacará con facilidad a las salmonelas que se encuentran en el interior del
fagosoma, debido a que las bacterias sintetizan enzimas que tienen la capacidad de
26
neutralizar las que son producidas por el fagosoma (Blaser y Newman 1982, Biberstein y Chung Zee 1990 y
Quinn et al 2002). La multiplicación del microorganismo origina una endotoxemia, la cual

explica la mayoría de los síntomas y el curso de la enfermedad (Stanchi, 2007).
2.2.6. Salmonelosis
Constituye un grupo de infecciones producidas por microorganismos del género
Salmonella sp. adquiridas por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas y
caracterizadas por presentar síndromes febriles asociados a manifestaciones
gastrointestinales sistémicas, con frecuencia severas (Saravia 2008). Las manifestaciones
clínicas de las salmonelosis en humanos y animales se presentan básicamente bajo tres
modalidades las denominadas fiebres entéricas, entre las cuales la más común es la
fiebre tifoidea producida por la S. typhi, las gastroenteritis producidas por varias
subespecies y la forma septicémica, caracterizada por la bacteremia asociada a lesiones
focales (Saravia 2008). Dentro de las manifestaciones clínicas comunes está la fiebre
acompañada de dolor abdominal, evacuaciones intestinales líquidas frecuentes, de
aspecto verdoso, fétidas, mucoides y en ocasiones con estrías de sangre (Saravia 2008, Report,
1989,1993).
2.2.7. Diagnóstico
Existe un gran número de métodos diagnósticos diferentes que pueden realizarse para la
determinación de Salmonella sp., sin embargo, según la mayor parte de estudios
realizados, el cultivo microbiológico es la prueba más comúnmente empleada para el
aislamiento de la bacteria a partir de tejidos y excrementos. El método ideal debe tener
una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rápido y económico.
Ningún método cumple con todos los criterios y ninguno es óptimo para todas las
condiciones, dado que pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y
algunas pruebas bioquímicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse también en los
nuevos métodos de diagnóstico que están innovando para el aislamiento de Salmonella
sp. mediante el uso de pruebas serológicas y moleculares como ELISA y PCR
respectivamente; esta última tiene la capacidad de detectar un pequeño número de
organismos del género Salmonella (102 a 104). Estos métodos arrojan resultados
favorables y confiables en menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos (Ward
et al 2005 y Terragno et al 2003).
Ante la sospecha de salmonelosis, el material que debe remitirse al laboratorio es

variado: se enviará en caso de infección intestinal, muestra de heces; en enfermedad
sistémica, se recoge una muestra de sangre para realizar un cultivo estándar (Biberstein y
Chung Zee, 1990 y Stanchi 2007). Además, es posible determinar la contaminación de alimentos y
27
agua con esta enterobacteria, para lo cual se requiere la remisión de una muestra al
laboratorio para ser analizada convenientemente (Stanchi 2007); el diagnóstico incluye
aislamiento, identificación bioquímica y serotipificación de las cepas aisladas (Stanchi 2007,
Luna 1991).
2.2.7.1. Métodos para el aislamiento de Salmonella sp.

Los métodos para el aislamiento de la bacteria están divididos en tres etapas sucesivas
las cuales son: (1) Enriquecimiento No Selectivo, (2) Enriquecimiento Selectivo, (3)
Siembra en Placa con medios sólidos selectivos y diferenciales. Posteriormente se lleva
a cabo el estudio de las características Bioquímicas de las colonias sospechosas en los
medios adecuados para su identificación, y finalmente el Análisis Antigénico (Luna, 1991).
1) Preenriquecimiento en medio no selectivo: Se utiliza cuando la muestra en

estudio ha sufrido un proceso de desecación o irradiación, cuando ha estado
congelada por mucho tiempo o si el pH del medio es muy bajo, este tratamiento
puede determinar que las bacterias presentes en la muestra se encuentren en un
estado semilatente y tiene como finalidad la revitalización de los microorganismos
afectados por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de
almacenamiento, permitiendo que las células bacterianas comiencen el proceso de
multiplicación normal sin estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas que
puedan llegar a ser tóxicas para estas bacterias “debilitadas”, sustancias que si
están presentes en los medios selectivos de enriquecimiento. Se realiza en caldo
peptonado bufferado o lactosado al 0,2%, para incrementar la recuperación de
especies de salmonelas deterioradas por técnicas de elaboración, preservación,
preservantes, presión osmótica alta, cambios bruscos de pH, etc. (Luna 1991; Hurtado 2001).
2) Medios de enriquecimiento selectivo: Se realiza en caldos de enriquecimiento,

los cuales estimulan el crecimiento de formas compatibles con Salmonella sp, e
inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y coliformes. Entre los caldos
mayormente usados para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp. se
encuentran:
 Caldo selenito: En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable y el
mecanismo de acción del selenito, es inhibir el crecimiento de bacterias intestinales,
coliformes y Enterococos, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de
incubación. Salmonella sp., Proteus sp., y Pseudomona sp., no son inhibidos (Merck,
1994).
28
 Caldo Rappaport - Vassiliadis: Medio para el enriquecimiento selectivo de
salmonelas con excepción de S. typhi y S. paratyphi A, en alimentos y otros
materiales. Mediante la utilización de este caldo, es posible obtener algunas
ventajas sobre otros medios nutritivos de enriquecimiento, obteniéndose un
rendimiento de alrededor del 100%, especialmente a una temperatura de 43oC y
previo enriquecimiento (Van Schothorst et al, 2004). El medio cuenta con una baja
concentración de verde de malaquita, cloruro de magnesio, y harina de soya para
así obtener un mayor porcentaje de recuperación de Salmonella sp. Además la
reducción del pH a 5,2 mejora la selectividad (Trichopoulos 1972; Iveson 1964).
 Caldo tetrationato: Medio que junto con el tiosulfato excedente, inhibe de igual forma
coliformes y otras bacterias acompañantes, sin alterar las bacterias reductoras de
tetrationato como Salmonella sp. y Proteus sp. Adicionalmente, las sales biliares
que contiene inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia
obligatoria en el intestino (Palumbo y Alford, 1970)
 Caldo de enriquecimiento Gram negativos (GN) según Hajna: Favorece la
recuperación de los organismos Gram negativos, especialmente Shigella y
Salmonella sp., pues en su composición tiene triptona que actúa como nutriente en
el medio, citrato y desoxicolato de sodio, con acción bactericida para organismos
Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo de bacilos
esporulantes e inhiben el desarrollo de coliformes. Los fosfatos sirven de buffer,
evitando la acidificación precoz del medio de cultivo a cargo de productos
metabólicos ácidos. Adicionalmente, la elevada concentración de manitol sobre la
dextrosa ayuda a limitar el crecimiento de Proteus y acelera el de Shigella y
Salmonella sp. (Hurtado, 2001)
Es necesario tener en cuenta que el caldo de enriquecimiento usado puede afectar
la recuperación de algunos serotipos de Salmonella sp., por ejemplo, ciertos
serotipos pueden ser inhibidos por el tetrationato si el inóculo es pequeño (S.
paratyphi A, S. houten, S. uccle, S. luton, S. gallinarum, S. meleagridis y S.
treforest, entre otras)(Van Schothorst, et al, 1977).
3) Medios de cultivo selectivos y diferenciales
 Medios de cultivo selectivos: Son aquellos que permiten seleccionar ciertos

microorganismos deteniendo el desarrollo de otros; esto se logra con el agregado
de sustancias inhibidoras como antibióticos, ciertos colorantes, sales biliares, etc.
Los medios EMB (a), MacConkey (b), desoxicolato (c) o CHROMagar Orientación
(d), permiten detectar con rapidez los microorganismos No fermentadores de
29
lactosa como Salmonella sp. y Shigella sp. El agente inhibidor en estos medios son
sales biliares (Stanchi, 2007).
a. Agar eosina azul de metileno (EMB), permite demostrar la presencia de

enterobacterias patógenas y propiciar su aislamiento, sin embargo, no es
confirmativo, solo permite una orientación al diagnóstico. El modo de acción del
medio se basa en que sus componentes lactosa y sacarosa permiten diferenciar las
enterobacterias de acuerdo con su capacidad de fermentarlos y por el aspecto y el
color de sus colonias. Los colorantes empleados inhiben notablemente el desarrollo
de gérmenes Gram Positivos. Las colonias de Salmonella sp. se observan en el
medio incoloras o con tonalidad ambar (Bonnie, 2001).
b. Agar MacConkey (McK), las sales biliares y el cristal violeta ejercen una inhibición
significativa sobre las bacterias Gram Positivas. La lactosa y el indicador rojo neutro
permiten comprobar la degradación de ese disacárido; las colonias lactosa positivas
(Escherichia coli) aparecen rojas con halo turbio; las lactosa negativas (Salmonella
spp.) son incoloras (Stanchi, 2007).
c. Agar desoxicolato, es un medio altamente selectivo por ser el desoxicolato sódico
supresor del crecimiento de coliformes y Gram positivos. Las colonias típicas de la
Salmonella sp. son pequeñas, incoloras, elevadas y opacas; algunas cepas
producen precipitado negro en el centro (Stanchi, 2007).
d. BD BBLTM CHROMagarTM Orientacion®: Medio de cultivo para el aislamiento e
identificación de patógenos del tracto urinario. Pemite la identificación de
Escherichia coli, Enterococcus, grupos KES (Klebsiella - Enterobacter . Serratia) y
PMP (Proteus – Morganella - Providencia), Staphylococcus saprophyticus y
Streptococcus agalactiae aunque requiere de pruebas confirmatorias. Algunos de
estos microorganismos producen enzimas para el metabolismo de lactosa,
glucósidos o ambos. Otros organismos no producen ningún tipo de enzima, por
ejemplo E. coli contiene enzimas para el metabolismo de lactosa pero es β
glucosidasa negativo; algunos miembros de la familia Enterobacteriacea, como
Salmonella sp. y algunos cocos Gram positivos son β glucosidasa positivo pero no
poseen las enzimas para la fermentación de la lactosa. Adicionalmente, la enzima
triptófano deaminasa es típicamente encontrada en el grupo PMP.
El medio contiene sustratos cromógenos que pemiten la diferenciación de los
microorganismos mediante la degradación de enzimas especificas de cada uno
(Bonnie, 2001; ISO, 2002) (Anexo Nº 2).
30
 Medios de cultivo diferenciales: Permiten diferenciar bioquímicamente las
bacterias por su actividad metabólica. Poseen un sustrato, sobre el cual actúa o no
la bacteria, y esa actividad se revela por variación del pH del medio o por alguna
actividad enzimática que modifica su aspecto. En el proceso de recuperación de
Salmonella sp., los aislamientos sospechosos por ser No fermentadores de lactosa
en el Medio Selectivo, son sembrados en medios diferenciales que permiten la
observación de colonias características y propias de la bacteria (Stanchi, 2007). Los
medios más reconocidos para el aislamiento de Salmonella sp. son:
a. Agar Hektoen entérico: Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para la

demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas, a partir de los más
diversos materiales tales como heces y alimentos entre otros (Merck, 1994). Las colonias
del género Salmonella se desarrollan con producción de ácido sulfhídrico (H 2S) y un
halo trasparente alrededor dando características de un “ojo de pescado” (Merck,1994 ,
Murray y Shea 2004). Frente a otros medios de cultivo selectivos, el agar para
enterobacterias Hektoen aún cuando posee suficiente efecto supresor de la flora
acompañante, ejerce escasa inhibición de Salmonella sp. y Shigella sp. y por lo
tanto, permite la obtención de altos rendimientos en estos gérmenes (King y Meztger 1968,
Taylor y Schelhart 1971).
Debido a los dos indicadores, Azul de bromotimol y Fucsina ácida, las colonias
lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias
lactosa negativas; de igual forma ocurre en el caso de colonias que fermentan
lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias
reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos
falsamente positivos. La combinación de tiosulfato, como sustancia reaccionante y
una sal de hierro como indicador, da una coloración negra a las colonias H2S
positivas. Una mezcla de sales biliares inhibe la flora acompañante (Merck,1994, Murray y
Shea 2004).
b. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): Medio para el aislamiento y diferenciación de

enterobacteriáceas patógenas, especialmente especies de Shigella sp. y
Salmonella sp. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil; el desoxicolato
genera la inhibición de bacterias coliformes y permite la dispersión de cepas de
Proteus que puede llegar a confundirse con las colonias producidas por Salmonella;
adicionalmente, la diferenciación entre Salmonella sp. y Shigella sp. se da porque la
primera produce fermentación de Xilosa, descarboxilación de Lisina y genera ácido
sulfhídrico (Hurtado, 2001). La forma de acción del medio se basa en que la degradación
a ácido de la xilosa, lactosa y sacarosa produce un viraje del medio a amarillo, por
31
el indicador rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro, revelan la formación de
ácido sulfhídrico por la precipitación de sulfuro de hierro (negro) en las colonias. Las
bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por la presencia de un color rojo
– purpúreo, debido al aumento del pH alrededor de sus colonias (Merck,1994, Murray y Shea
2004). Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o

suscesivamente, lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de
pH, ó a un viraje de amarillo a rojo en el transcurso de una incubación más
prolongada. Las colonias de Salmonella sp. se observan con pigmentación rosa o
roja, algunas veces transparentes con o sin centro negro y/o completamente negras
(Murray y Shea 2004). Las colonias sospechosas de Shigella son transparentes y del
mismo color que el medio de cultivo. Este género bacteriano al no fermentar la
xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol; como
tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las
colonias, al no haberse producido cadaverina (Murray y Shea 2004).
c. Agar Salmonella – Shigella (SS): Es un medio selectivo y diferencial. La

selectividad está dada por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de coliformes y el desarrollo
invasor del Proteus sp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa y la
formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Salmonella sp,
desarrolla colonias traslúcidas ocasionalmente opacas, algunas con centro negro a
causa de la producción de ácido sulfhídrico (Meljem, 1995, Murray y Shea 2004). ). Las colonias
sospechosas de Shigella son transparentes, translúcidas u opacas y suelen ser lisas
(Murray y Shea 2004).
d. Agar verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo y diferencial para

el aislamiento de enterobacterias patógenas como Salmonella sp. a excepción de
S. enterica serovar typhi y paratyphi A. En el medio la pluripeptona y el extracto de
levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la
sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo de fenol es el indicador
de pH, que vira a amarillo cuando hay producción de acido a partir de la
fermentación de azúcares; el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el
verde brillante actúa como agente selectivo. Las colonias de Salmonella sp. se
observan con coloración rosa, blanca o transparente sobre un fondo rojo (Murray y Shea,
2004)
e. Agar bismuto sulfito: Es un medio diferencial y selectivo, usado para el aislamiento e

identificación de Salmonella enterica serovar typhi y otras bacterias entéricas. El
medio contiene peptona y tejidos animales, extracto de carne, glucosa, sulfato
férrico y sulfito bismuto que actúa como inhibidor de la mayoría de organismos
32
comensales. Las colonias típicas de Salmonella sp. pueden ser café, gris o negras
con o sin brillo metálico, generalmente el medio circundante (halo) es café que
posteriormente se torna negro; algunas cepas producen colonias verdes sin la
formación del halo oscuro (Murray y Shea 2004).
f. AGAR XLT4®(DIFCO
tm : Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para el
)
aislamiento e identificación de microorganismos del género Salmonella excepto S.

enterica serovar typhi (Dush y Altwegg, 1955). El medio contiene peptona como fuente de
nitrógeno, extracto de levadura como fuente de vitaminas y otros cofactores; la
diferenciación de Salmonella sp. de otros microorganismos se basa en la
fermentación de la xilosa, lactosa y sucrosa; decarboxilación de la lisina y la
producción de sulfuro de hidrógeno, la cual es detectada por la adición de iones
férricos. Por su parte, el tiosulfato de sodio es adicionado al medio como fuente de
sulfuro inorgánico, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio y el
rojo fenol es adicionado como indicador de los cambios de pH resultantes de las
reacciones de fermentación y decarboxilación. Al medio base, es adicionado
suplemento de agar XLT4, con el fin de inhibir el crecimiento de organismos
diferentes a la Salmonella sp. Las colonias típicas de la bacteria (H2S positivas),
aparecen negras o con tonalidad amarilla con centro negro después de 18 – 24
horas de incubación. A medida que pasa el tiempo, las colonias se recubren de
pigmento negro por completo o toman una tonalidad rosada hacia la periferia, con
centro negro; las colonias de Salmonella sp. de las cepas H2S negativas, aparecen
de color Rosado amarillento. Por su parte, la mayoría de las colonias de Citrobacter
sp. que crecen en este medio son amarillas sin evidencia de ennegrecimiento. El
crecimiento de Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus, Pseudomona,
Providencia, Alteromonas putrefaciens, Yersinia enterocolitica y Acinetobacter
calcoaceticus está completamente inhibido, mientras que las especies de Shigella
son parcialmente inhibidas; las colonias que aparecen son de tonalidad roja (Becton
Dickinson).
g. BD BBLTM CHROMagarTM Salmonella®: Es un medio selectivo y diferencial para el

aislamiento e identificación presuntiva de especies de Salmonella sp, permitiendo la
diferenciación de la enterobacteria de la flora acompañante dada la presencia de
sustratos cromógenos en el medio. Los organismos Gram positivos son inhibidos
como resultado de un medio base selectivo; adicionalmente cuenta con un agente
antifúngico que previene el crecimiento de especies de Candida; otros agentes
antimicrobianos presentes en el medio de cultivo inhiben el crecimiento de Gram
negativos, microorganismos no fermentadores de lactosa y especies de Proteus.
Debido a diferencias metabólicas en la presencia de cromógenos seleccionados, las
33
colonias de Salmonella sp. se observan de color rosa – púrpura, mientras que los
microorganismos pertenecientes a otros géneros se observan con pigmento verde
– azulado, ó son completamente inhibidos (Gaillot, et al; 1999)
2.2.7.2. Identificación bioquímica

Los microorganismos para crecer requieren de polimerización de proteínas, ácidos
nucléicos, polisacáridos y lípidos; estos elementos deben encontrarse preformados en el
medio donde se encuentra el microorganismo o deben ser sintetizados por la propia
célula. Para realizar el metabolismo se requiere además la maquinaria biosintética para
transformar los substratos en materiales básicos o compuestos utilizables para la célula,
y la energía para realizar las reacciones químicas (Escobar, 2004).
En la identificación final de Salmonella sp. las colonias sospechosas observadas en el

medio de cultivo diferencial se someten a pruebas de reacción bioquímica con el fin
confirmar la presencia de la bacteria. En general a Salmonella sp. se le realiza un
conjunto de pruebas que incluyen producción de indol, rojo de metilo, Voges- Proskauer,
Citrato, TSI, hidrólisis de la urea, deaminación de la fenilalanina, decarboxilación de
lisina, arginina y ornitina, motilidad, hidrólisis de gelatina, utilización de malonato,
fermentación de glucosa con producción de acido y gas, fermentación de lactosa,
sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa,
maltosa, xilosa, trehalosa, celobiosa, eritritol, hidrolisis de esculina, fermentación de
melibiosa, de arabitol, de glicerol, utilización de acetato, lipasa, ADNasa, transformación
nitrato-nitrito, oxidasa y fermentación de manosa (Farmer, 2003, Forbes et al, 1998). (Tabla 1).
Tabla Nº 1. Propiedades Bioquímicas Diferenciales de las Subespecies de Salmonella sp.

Fuente: Instituto Nacional de Salud. 2003.
d
d
34
2.2.7.2.1. Diagnóstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp.
A. Pruebas bioquímicas: En la tabla Nº 2 es posible observar las reacciones

producidas en la batería de bioquímicas utilizada normalmente para la identificación de
enterobacterias pertenecientes al género Salmonella (Koneman y Allen, 1999), la cual consta de
las pruebas descritas a continuación:
TSI (triple azúcar hierro): es un agar diferencial basado en la fermentación de azúcares y

la producción de H2S y gas. Contiene glucosa, sacarosa y lactosa; estas últimas en una
concentración 10 veces mayor a la glucosa. El indicador de pH es el rojo de fenol, el cual
vira a amarillo por formación de ácido a partir del carbohidrato, el sulfato ferroso es un
detector de la producción de ácido sulfhídrico. Por lo general Salmonella sp. da como
resultado de esta prueba una reacción alcalina/acido con producción de H 2S que se
evidencia por el fondo negro del tubo (K/A H2S++); en ocasiones, como resultado de la
fermentación de glucosa también hay producción de gas (Instituto Nacional de Salud, 2003, MacFaddin,
2000).
LIA (agar lisina hierro): El fundamento de esta prueba es que los procesos de
decarboxilación y deaminación en el medio de cultivo tienen lugar con la previa
fermentación del carbohidrato que contiene el medio (glucosa) y la acidez producida por
esta reacción, si el microorganismo posee las descarboxilasas necesarias, se produce la
decarboxilación liberándose como producto final las aminas que alcalinizan el medio de
cultivo, por otro lado si el microorganismo posee las deaminasas se efectúa la
deaminación y el producto final son ácidos orgánicos que acidifican el medio de cultivo.
Salmonella sp. por lo general da como resultado tendido púrpura y fondo púrpura, (K/K),
con producción de H2S y gas, es decir, posee la enzima lisina-decarboxilasa (Instituto Nacional
de Salud, 2003).
Utilización del citrato: El principio de esta prueba es determinar la capacidad de los

organismos para usar el citrato de sodio como fuente de carbono para el metabolismo y
el crecimiento. El medio contiene fosfato sódico de amonio, fosfato de monopotasio,
sulfato de magnesio, citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador de pH. Si el
carbono del citrato de sodio es utilizado, el nitrógeno también es extraído del fosfato de
amonio contenido en el medio, liberando amonio, lo cual alcaliniza el medio que vira de
verde a azul. Salmonella sp. por lo general utiliza el citrato como fuente de carbono, por
lo cual se produce una variación en el color del medio (Koneman et al, 1997; Farmer, 2003).
35
Producción de indol: Esta prueba se desarrolla para determinar si la bacteria en estudio
está en capacidad de desdoblar el indol de la molécula de triptófano; el indol es uno de
los componentes de la degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias
que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con
producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco. La prueba se basa en la formación de un
complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-
dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y
Ehrlich, utilizados para la identificación de producción de indol por parte de los
microorganismos. Salmonella sp. no tiene la capacidad de generar el indol por lo cual no
se presenta ninguna reacción en el medio (MacFaddin 2000).
Prueba de motilidad: Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. La

movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos que se
encuentran principalmente entre los bacilos, aunque algunas formas de cocos son
móviles. Esta prueba es llevada a cabo en un medio de cultivo semisólido (SIM), donde
a su vez es evaluada la producción de indol y de ácido sulfhídrico por los
microorganismos. Las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del
medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario las
bacterias inmóviles permanecerán en la misma picadura donde se sembraron (MacFaddin,
2000). La mayoría de las salmonelas son motiles a excepción de S. pullorum y S.

gallinarum, huéspedes específicas de aves, responsables además de las enfermedades
pulorosis y tifoidea aviar respectivamente (Infante et al, 1991).
Hidrólisis de urea: La urea es un compuesto orgánico nitrogenado que es transformado

por algunos microorganismos, los cuales producen la enzima ureasa. Como resultado de
esta actividad microbiana, el nitrógeno es liberado en forma inorgánica como moléculas
de amoniaco. Cuando esta reacción ocurre, el medio de cultivo se alcaliniza y el
indicador de pH permite percibir visualmente el cambio de coloración en el medio debido
a la acidificación producida en el mismo. Salmonella sp.no tiene la capacidad de
hidrolizar la urea, por lo tanto la prueba es negativa. Esta prueba se considera vital en la
diferenciación bioquímica entre Salmonella sp. y Proteus sp. (MacFaddin, 2000).
36
Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de
microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. Fuente: Manual de pruebas
bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica (MacFaddin 2000)
PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADO PARA Salmonella sp.

TSI K/A H2S++
LIA K/K H2S++
UREA -
MOTILIDAD +
INDOL -
CITRATO +
B. Sistemas BBL Crystal de identificación (Patógenos entéricos/No fermentantes) ®:
El sistema de identificación BBL Crystal de bacterias entéricas/no fermentadoras (E/NF) ®

sirve para lel reconocimiento de bacterias gram negativas que pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae así como también de los bacilos Gram negativos fermentadores y
no fermentadores de glucosa aislados con más frecuencia (Muytjens et al, 1984).
Los análisis utilizados en el sistema BBL Crystal E/NF ® están basados en la utilización y
degradación de sustratos específicos por parte de los microorganismos detectados por
distintos sistemas indicadores. Las reacciones de fermentación detectan la capacidad de
un aislado para metabolizar los carbohidratos en ausencia de oxígeno atmosférico, y las
reacciones de oxidación están basadas en la capacidad de un organismo para
metabolizar el sustrato siendo el oxígeno el aceptor final de electrones, ambas
reacciones se detectan normalmente mediante el uso de un indicador de pH en el
sustrato del análisis (Murray et al, 1999). Los sustratos cromógenos al sufrir hidrólisis producen
cambios de color que pueden ser detectados visualmente. Además, existen otros análisis
que detectan la capacidad de un organismo para hidrolizar, degradar, reducir o utilizar de
otro modo un sustrato en el sistema BBL Crystal® (Manafi et al, 1991). (Anexo Nº 3)
2.2.7.3. Serotipificación
La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica
y desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una
serovariedad en distintas zonas geográficas, también es de utilidad para el estudio de
brotes y para conocer la fuente de infección y las vías de transmisión (Terragno et al, 2003).
Desde el punto de vista genético, el género Salmonella sp. constituye una sola especie
siendo el grupo más complejo de la familia Enterobacteriaceae (Biberstein y Chung Zee, 1990;
Crawford et al, 1971) dado que los representantes del género Salmonella sp. han sido objeto de
37
sucesivas modificaciones, a través de los años, en lo que respecta a su nomenclatura y
taxonomía. Sin embargo, todavía siguen vigentes las ideas desarrolladas por Edwards y
Ewing, en la década del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del
género Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae (Stanchi, 2007).
Las técnicas serológicas son comúnmente empleadas para identificar cultivos

desconocidos con sueros conocidos (Smith et al.1952); Salmonella sp. está serotipificada de
acuerdo a sus antígenos somáticos de superficie (LPS, antígenos O), antígenos
flagelares (proteínas, antígenos H) y antígeno capsular (Vi) (Terragno et al, 2003). Los antígenos
se identifican con anticuerpos monovalentes y polivalentes disponibles comercialmente,
mediante pruebas de aglutinación en lámina. Para identificar los antígenos O, se hace
una prueba con antisueros contra los grupos del O1 (A) al O67, luego se prueba el
antisuero Vi para antígeno capsular, y por último se incluyen los antisueros contra los
antígenos flagelares H (Farmer 2003, Brooks et al., 2000, Forbes et al., 1998, Jawetz et al .2005, Smith et al.1952).
En el género Salmonella existe un solo tipo capsular, el tipo Vi (de virulencia), aunque la
mayoría de las salmonelas no producen cápsula (Hirsh 2006). La constitución antigénica de
la fracción polisacarídica del lipopolisacarido (LPS) define en gran parte la especie;
asímismo, la clase y el número de azúcares junto con los enlaces existentes entre los
mismos, definen los determinantes antigénicos que contienen los antígenos O de un
determinado aislamiento; dichos antígenos O, junto con los determinantes antigénicos
existentes en la superficie de los flagelos (antígenos H), que poseen la mayoría de las
salmonelas, contribuyen, desde el punto de vista serológico, a definir como especie un
determinado aislamiento. Este esquema de clasificación se le denomina de Kauffmann-
White (Biberstein y Chung Zee, 1990)
2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann – White

La identificación de los serotipos sobre la combinación antigénica está dada en el
“Esquema de Kauffmann-White”, publicado por el Centro Colaborador de la
Organización Mundial de la Salud (OMS) de Referencia e Investigación de Salmonella
del Instituto Pasteur en Paris el cual agrupa todas las serovariedades de Salmonella sp.
conocidas (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill; 2007) (Anexo Nº 4). Ambos investigadores diseñaron
su clasificación considerando ciertas determinantes antigénicas presentes en el AgO,
que determinan la existencia de grupos o serogrupos -de la A a la I- y a los antígenos
flagelares en fase 1, que hoy en día establecen el serotipo (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill;
2007).
38
Este esquema plantea las diferencias mediante la identificación de los antígenos de
superficie que se producen en la bacteria. La especificidad del factor “O” (somático) de
Salmonella sp. se determina por la composición y la estructura de la cadena polisacárida
O del lipopolisacárido. Al antígeno O, se lo designa con números; Salmonella sp. se
clasifica en serogrupos que surgen del antígeno somático O; a estos grupos se los
designa con letras mayúsculas, por ejemplo, A, B, C1, C2, D1, D2, E1, E2, etc. (Basualdo et
al.,1996). El antígeno flagelar representado por letras minúsculas y números, caracteriza a

los serotipos dentro de cada grupo, rara vez se hace referencia al antígeno Vi que es
asociado a la cápsula bacteriana.
2.2.8. Sensibilidad frente a agentes antimicrobianos

Los agentes antimicrobianos evalúan las diferencias de estructura o de función
bioquímica existentes entre el hospedador y el parásito (Biberstein y Chung Zee, 1990).
Durante los últimos 25 años, la investigación quimioterapéutica se ha centrado

fundamentalmente alrededor de las sustancias antibacteriales de origen microbiano
llamadas antibióticos (Jawetz et al., 2005); los cuales son compuestos químicos producidos por
microorganismos, que inhiben o matan otros microorganismos (Escobar, 2004). Sin embargo,
es de tener presente que ningún agente químico antimicrobiano tiene la capacidad para
actuar eficazmente sobre todo tipo de microorganismos, debido a la diferente actividad
del químico y las variadas características de sensibilidad y resistencia que presenta cada
bacteria, ante la sustancia (Escobar, 2004). La selectividad se explica por las diferencias
estructurales y bioquímicas entre las células eucariotas y procariotas (Gentilini 2007); lo cual
ofrece mayor oportunidad para que, en comparación con los agentes antifúngicos, los
agentes antibacterianos manifiesten su toxicidad selectiva ya que las células fúngicas, al
igual que en mamíferos, son eucariotas (Prescott 1988).
Los mecanismos de acción de los agentes antimicrobianos se encuadran en cuatro tipos;

(1) Inhibición de la Síntesis de Pared, (2) Alteración de la función de la Membrana
celular, (3) Inhibición de la Síntesis o de la Función del Ácido Nucléico y (4), Inhibición de
la Síntesis de Proteínas (Prescott, 1988). Sin embargo, el antibiótico ideal empleado con fin
terapéuticos, debe reunir una serie de condiciones.
a. Tener una toxicidad selectiva para el agente infeccioso, lo que implica escasa o
nula toxicidad para las células del huésped y alta para el patógeno.
b. Penetrar en los tejidos y las células del organismo para ejercer su acción sobre
el agente infeccioso.
39
c. Alcanzar la concentración adecuada para ejercer su efecto en el foco de la
infección y que se excrete lentamente.
d. Poseer una acción más bactericida que bacteriostática. Los agentes bactericidas
matan a los microorganismos, y los bacteriostáticos inhiben el desarrollo,
interviniendo los mecanismos de defensa del huésped en la erradicación final de
la infección.
e. No alterar los mecanismos de defensa naturales del hospedador (fagocitosis,
producción de anticuerpos, entre otros).
f. No generar aparición rápida de resistencia.
g. Poseer un amplio espectro de acción sobre los microorganismos que con mayor
frecuencia se aíslan.
h. Permanecer activo en presencia de plasma, líquidos corporales, exudados.
i. Poseer actividad antibacteriana in vitro.
j. Ser estable para garantizar un periodo razonable de almacenamiento.
k. Ser económicamente accesibles.
l. No producir efectos colaterales indeseables en el huésped (Stanchi, 2007).
2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos.

El desarrollo de cepas resistentes hace necesaria la determinación de la susceptibilidad
a los antimicrobianos de aislamientos provenientes de muestras biológicas. Esta se lleva
a cabo mediante pruebas in vitro de susceptibilidad, que permiten seleccionar los
quimioterapéuticos según la sensibilidad demostrada por el microorganismo causal
(Gentinili et al, 2002).
Los métodos empleados, son entre otros, la difusión con monodiscos de antibióticos,
método estandarizado por Kirby-Bauer, en el cual se emplea el agar Mueller Hinton,
único medio validado por el NCCLS (Comité Nacional para la Normatización de
Laboratorios Clínicos) para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, dado que existen
suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad
realizadas en este medio (NCCLS, 1996). Otro método realizado en laboratorio es la
determinación de la concentración mínima inhibitoria del antibiótico (CMI), el cual se
realiza mediante la técnica de dilución en tubo, donde se preparan una serie de tubos
con medio de cultivo, cada uno a una concentración diferente de antibióticos sembrados
con el microorganismo. Después de la incubación, se observa la mínima concentración
de antibiótico que inhibe el crecimiento del microorganismo (Escobar 2004 y Stanchi 2007). Estas
pruebas están cuidadosamente estandarizadas con el objeto de mejorar el valor
predictivo clínico de los resultados. Desde 1958, el Comité Nacional de Estandarización
de Laboratorios Clínicos (NCCLS) estableció un Subcomité de Pruebas de
40
Susceptibilidad Antimicrobiana Veterinaria (VAST). Gracias al desarrollo de NCCLS-
VAST, se están generando los criterios interpretativos de los agentes antimicrobianos
veterinarios específicos con el empleo de aislamientos animales (Stanchi 2007, Gentilini 2007).
2.2.8.2. Prueba de sensibilidad a los antimicrobianos

Las pruebas de sensibilidad deben realizarse sobre microorganismos asociados a
infecciones cuando su sensibilidad no se pueda predecir a partir de su identificación. La
determinación de la sensibilidad está indicada en los casos en que el microorganismo
causal de la infección pertenezca a una especie capaz de exhibir resistencia a los
antibióticos de uso clínico. Los mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos
incluyen: producción de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de acción y
modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas (Pasteran et al.,2003).
Para realizar pruebas de sensibilidad e identificación se debe partir de un cultivo primario

en medio sólido y se debe procesar colonias aisladas de cada tipo de microorganismo
que pueda tener rol patógeno. No es aconsejable la realización de pruebas de
sensibilidad cuando no es clara la naturaleza de la infección y la muestra contiene flora
normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aislados probablemente
tengan poca relación con el proceso infeccioso, ya que en estos casos los resultados
obtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento (Pasteran et al.,2003).
2.2.8.2.1. Principios del método de difusión en agar (Kirby – Bauer)
El principio del método involucra la aplicación de una cantidad determinada de

antimicrobiano en un reservorio (disco de papel, pastillas con drogas en estado cristalino,
etc.) en la superficie del agar sobre la cual se ha distribuido un inoculo del
microorganismo en cuestión; se formará así, por difusión, un gradiente de concentración
de antimicrobiano alrededor del reservorio y la sensibilidad del microorganismo estará
indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano. El diámetro
obtenido dependerá no sólo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco,
sino también del espesor de la capa de agar Mueller Hinton, su pH y composición, de la
capacidad de difusión de la droga en ese medio, de la temperatura y atmósfera de
incubación, de la velocidad de duplicación bacteriana, del tamaño del inoculo y la fase de
crecimiento de la bacteria, etc, todas estas son las variables más importantes que
afectan el resultado del antibiograma (Pasteran, et al. 2003).
Una vez colocado el disco en la superficie del agar, la difusión del antibiótico que
contiene comienza instantáneamente y sigue hasta alcanzarse un gradiente continuo de
concentraciones alrededor del reservorio. Este gradiente se alcanza aproximadamente a
las 6 hs. El tamaño de la zona de inhibición dependerá del equilibrio entre la difusión del
41
antibiótico y la velocidad de crecimiento del microorganismo. Las recomendaciones del
NCCLS son: colocar los discos dentro de los 15 minutos de inoculada la placa y proceder
a la incubación de la misma dentro de los 15 minutos posteriores a la colocación de los
discos. Cualquier variación en estos tiempos ocasionará un desplazamiento del equilibrio
antes mencionado que se traduce en errores en el tamaño de la zona de inhibición.
Como la difusión del disco comienza instantáneamente después de apoyado sobre el
agar, estos nunca deben levantarse para cambiarlos de lugar en el antibiograma porque
seguramente ya no tendrán la carga de antibiótico original (Pasteran et al.,2003).
2.2.8.2.2. Interpretación de las pruebas de sensibilidad a los

antimicrobianos por el método de difusión en agar
Para cada antimicrobiano se establecen "concentraciones críticas" o "puntos de corte"
que permiten separar a los microorganismos en tres categorías, sensibles, resistentes o
de sensibilidad intermedia (Anexo Nº 5). Estas categorías se establecen para cada
bacteria frente a cada antibiótico comparando la CMI en cada caso con los puntos de
corte establecidos (Pasteran et al.,2003).
 Sensible: Un microorganismo se considera "sensible" a un antibiótico cuando se
puede esperar que una infección causada por el mismo responda al tratamiento
con dicho fármaco a la dosis recomendada.
 Resistente: este término indica que no es probable que la infección causada por
el microorganismo responda al antibiótico en cuestión, cualesquiera que sean la
dosis y la localización de la infección.
 Sensibilidad Intermedia: Esta categoría se aplica a dos situaciones. Por un lado,
se incluyen en ella las cepas con sensibilidad disminuida a un antibiótico que
puede utilizarse con éxito, para el tratamiento en dosis más altas, por ser poco
tóxico o porque se concentra en el foco de infección (por ejemplo, antibióticos ß-
lactámicos o quinolonas en la orina). En esta categoría se incluyen asimismo las
cepas de "sensibilidad intermedia" a antibióticos que, por ser más tóxicos, no
puede usarse en dosis más altas. En este caso, la categoría intermedia sirve
como una zona de transición entre las cepas sensibles y las resistentes y
previene pequeños errores causados por factores técnicos. Muchas veces un
resultado intermedio requiere la definición de la sensibilidad mediante el uso de
un método cuantitativo como la CMI (Escobar, 2004).
2.2.8.2.3. Selección de los agentes antimicrobianos

Para la selección de los antimicrobianos a ensayar en las pruebas de sensibilidad se
deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: eficacia clínica, prevalencia de
42
resistencia, costo, indicaciones del FDA (Administración de alimentos y Fármacos),
recomendaciones consenso para drogas de primera elección y alternativos (Pasteran et
al.,2003). Entre los antibióticos con actividad frente a Salmonella sp. se encuentran:
 Aminopenicilinas (Ampicilina).
 Cloranfenicol (sólo para aislamientos de infección sistémica).
 Tetraciclinas (Tetraciclina)
 Trimetoprim/sulfametoxazol
 Fosfomicina
 Nitrofuranos
 Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina)
 Cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima/ceftriaxona solo para
aislamientos de infección sistémica)
2.3. El género Salmonella asociado a los reptiles

En general, la clase Reptilia, consta de más de 6000 especies que incluyen serpientes,
lagartos, tortugas y cocodrilos, muchos están clasificados por la UICN (Unión
Internacional para la Conservación de la Naturaleza) dentro de las categorías de
amenaza, por enfrentar un alto riesgo de extinción, principalmente a causa de
actividades antrópicas, y hoy en día se están viendo afectados por microorganismos
patógenos que los han llevado a un estado máximo de riesgo (Chatfield, et al 2007).
La herpetofauna (particularmente reptiles), ha estado frecuentemente relacionada con

casos de enfermedades asociadas a salmonelosis, por lo cual se reconoce que estas
especies son una vía directa de transmisión de Salmonella sp. a los seres humanos (Center
for Disease Control and Prevention -CDC- 1999); esta bacteria se considera de carácter zoonótico, por
generar cuadros patológicos de gran importancia en salud pública (Selbitz et al, 1995; Turnbull
1979) de esta manera, los reservorios animales tienen un importante papel en la

determinación de los factores epidemiológicos de la infección (Turnbull 1979).
Numerosos investigadores han reportado el aislamiento de Salmonella sp. a partir de los

excrementos de reptiles tales como las tortugas y cocodrilos en varias partes del mundo
(Bovre y Sandbu, 1959, Cohen et al, 1980, Chiodini y Sundberg, 1981, Shane et al, 1990. Woodward et al, 1997. Passmans et al, 2000)
y se ha establecido que el hábitat natural de los miembros del género Salmonella es el

intestino de vertebrados de sangre caliente y sangre fría; siendo posteriormente
dispersados en el ambiente, donde a su vez pueden sobrevivir y multiplicarse (Cohen, et al
1980). En los reptiles, Salmonella sp. es un microorganismo natural de la flora intestinal,
43
sin embargo, estos animales son catalogados como portadores asintomáticos de la
bacteria (Chiodini y Sulberg, 1981; Millan et al, 1997,; Mitchel y Shane, 2000; Abalem de Sá y Sorari, 2001; Geue y Löschner, 2002;
Corrente et al, 2004; Mermin et al, 2004), ya que según estudios realizados, ésta se ha encontrado en
90% o más de la población de reptiles evaluada (Chiodini y Suldberg, 1981, Woodward et al, 1997), pero
son relativamente pocos los reportes de cuadros patológicos en estas especies silvestres
(Boever y Williams, 1975; Isaza et al, 2000; Oros et al, 1996; Oros et al, 1997).
El primer reporte de aislamiento de Salmonella sp. en reptiles aparece en 1930 en

Indiana County, a partir del excremento de iguanas y desde este momento, se han
realizado numerosos estudios que determinan la presencia de la enterobacteria
Salmonella sp. en estas especies, además del hallazgo de microorganismos como
Arizona sp. Citrobacter sp., y Edwarsiella sp. a partir de animales silvestres y en
cautiverio (Jackson, et al, 1969; Jackson y Jackson, 1971., Kennedy, 1973., Mann y Bjotvedt, 1967, McNeil y Hinshaw, 1946,
Nasasai et al, 2005., Vadillo, et al, 2002), lo cual ha aumentado el interés de investigación, por
representar grandes relaciones con la enfermedad diarreica aguda (EDA), puesto que
según las estadísticas, para el año 2000 (de acuerdo con un estudio realizado a partir de
muestras de aves y humanos) se presentó en el país una tasa superior a los 1500 casos
de EDA por cada 100.000 habitantes, siendo aproximadamente el 50% de los casos,
relacionados con enterobacterias de los géneros Salmonella sp. y Shigella sp. (Jimenez y
Mayorga, 2000).
Dado que la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de los animales, la ruta de

infección puede ser por contacto directo con las heces del animal o indirectamente con la
piel contaminada con el excremento (Mahajan et al., 2003 y Minette 1984). En los reptiles, la
transmisión puede darse perinatalmente, por ingestión de presas contaminadas o por
contacto directo con la materia fecal de otros reptiles; las altas tasas de ejemplares
portadores de Salmonella sp. se relacionan con el comportamiento de coprofagia por
parte de las crias, lo que asegura la transmisión prematura de dichos microorganismos
(Mader 1996; Schröter et al. 2004).
El primer riesgo real de contraer la enfermedad es para niños menores de 5 años y

personas inmunosuprimidas donde las septicemias por especies prevalentes de
Salmonella sp. se observan cada vez con mayor frecuencia. En segunda instancia, sólo
de 3 a 5% de los casos de salmonelosis son a causa de los reptiles; sin embargo, el
95% de estos casos están asociados con animales mantenidos en cautiverio como
mascotas, lo cual hace que desde 1975 se consideren los reptiles como importante vía
44
de transmisión de Salmonella sp. dado el gran incremento de la adopción de estos
animales como mascotas (CDC, 1999: Schröter et al, 2004).
Los caimanes (Orden Crocodylia) y tortugas (Orden Testudinata) son reservorios de

enterobacterias como Salmonella sp. y son ampliamente reconocidos como fuentes de
transmisión del microorganismo hacia los humanos demostrando su papel zoonótico (Ebani
et al, 2005)
En todas sus fases de desarrollo, las tortugas, como consecuencia de su amplia

distribución geográfica, sus hábitos y características biológicas, son altamente
vulnerables a la depredación natural, captura comercial, saqueo de nidos, matanza de
hembras anidadoras, comercio ilícito de subproductos de tortugas y pérdida del hábitat
entre otras, lo que ha disminuido la población de manera crítica (Bayley y Scott,1882; Boede y
Hernandez, 2004) .
Adicionalmente, existen otros factores que afectan de manera negativa las especies
silvestres anteriormente mencionadas al estar implicados en la disminución de la
población a causa de alteraciones físicas y/o patológicas que se pueden presentar.
Centros de cría, protección y preservación de la fauna silvestre (como la Estación de
Biología Tropical Roberto Franco) han dado a conocer las principales afecciones que
pueden presentarse en este tipo de animales siendo entre otras: daño renal por exceso
en la ingesta de proteínas; fracturas de huesos mandibulares y maxilares por golpes en
peleas territoriales, mordeduras cuando toman el alimento y errores en la manipulación
al ser capturados, alteraciones a nivel ocular, posiblemente por aguas contaminadas con
desinfectantes como hipoclorito, entre otras (Rodríguez y Ramírez 2000).
Existen numerosos reportes de infecciones por Salmonella sp. en animales

poiquilotermos, y las condiciones para que se presente enfermedad en estas especies,
están sujetas a la inmunosupresión debida al estrés por cautiverio, variación en las
temperaturas medioambientales, número de microorganismos presentes, edad y estado
nutricional del animal (Pasmans et al, 2002; Bäumler et al, 1998; Blanc et al, 1960; Cambre et al.1980, Dimow, 1996.)
Generalmente se presentan cuadros en el tracto gastrointestinal, aunque las condiciones

asociadas a salmonelosis en los reptiles incluyen gastroenteritis, meningitis,
osteomielitis, peritonitis, pleuritis (Figura Nº1) y bacteremia (Figura Nº 2) (Mahajan et al., 2003 y
Minette 1984); se ha reportado que en reptiles, la invasión de las células del epitelio intestinal
y subsecuente colonización de los órganos internos parece no ser necesaria para el
establecimiento de una infección por Salmonella sp. (Pasmans et al, 2002). Aunque los reptiles
45
son portadores asintomáticos y por consiguiente los casos clínicos de salmonelosis son
reportados con menor frecuencia, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos
niveles de mortalidad en serpientes y tortugas (CDC 1999, Chatfield et al, 2007; Durango et al, 2004; Muñoz et
al, 2000; Muñoz et al, 2002, Ramsay et al, 2002).
Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia. Fuente: Shotts, (2001)
Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudines. Fuente: Shotts, (2001)
Las infecciones por Salmonella sp. son comunes tanto en animales homotérmicos como
en poiquilotermos entre los cuales existen diferencias significativas en el curso de la
infección. Mientras que en aves y mamíferos las patologías son causadas por serotipos
de Salmonella entérica subespecie entérica, un gran número de serotipos de Salmonella
sp. han sido reportados asociados a los reptiles; entre ellos se incluye S. enterica
subsp. enterica, S. bongori, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S.
enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. Indica (Pignato et
al, 1998); siendo todas las especies causantes de infecciones persistentes pero sin producir
signos de salmonelosis clínica en la mayoría de los casos (Zwart et al, 1970; Greenberd y Sechter, 1992).
Sin embargo, en Colombia no se han desarrollado investigaciones específicas de

aislamiento e identificación de salmonelas en reptiles y tan solo se ha reportado su
46
importancia zoonótica con respecto al mantenimiento como especies silvestres en
cautiverio en calidad de mascotas o por medio de su comercialización (Hernandez 2004).
2.4. ESPECIES EN ESTUDIO
2.4.1. Caimán del Orinoco

El caimán llanero, cocodrilo del Orinoco ó Crocodylus intermedius (Figura Nº 3), es
nativo de la región Orinoquía Colombo-Venezolana, es uno de los cocodrilos de mayor
tamaño de América y actualmente se encuentra catalogado como una de las principales
especies de reptiles en peligro de extinción en el mundo, debido a que la
sobreexplotación para el comercio de las pieles entre los años 1930 a 1960, diezmó las
poblaciones silvestres y su recuperación no ha sido evidente desde ese tiempo (Ross, 1998).
En Colombia, según Medem (1981), el cocodrilo del Orinoco ocupaba un área de

253.530 Km2, entre los ríos Arauca al Oriente y Guayabero – Guaviare al occidente, el
límite occidental lo forma el rio Duda, tributario del Alto Guayabero. Censos realizados
por diferentes investigadores (Ardila et al, 1998, Ardila et al, 1999, Barahona et al., 1996a, Barahona et al., 1996b)
reportan que existen menos de 100 individuos distribuidos de forma natural. Todas estas
investigaciones le permitieron al gobierno nacional declararla en peligro de extinción;
actualmente la especie se encuentra protegida por un marco normativo a nivel nacional e
internacional. Rodríguez y Ramírez (2002) en el Libro Rojo de Reptiles de Colombia,
catalogan la especie en categoría global CR (peligro crítico), como una población
pequeña y en disminución con menos de 250 individuos maduros, con una rápida
reducción en su tamaño poblacional en extensión de presencia o área de ocupación
(Bejarano, 2001; Ramírez y Burbano, 2002). Tras la veda de la caza comercial las principales amenazas
para C. intermedius las constituyen: la fragmentación de las poblaciones, la pérdida de
hábitat, la caza que para protegerse de los animales ejercen los lugareños y, finalmente,
el asalto de los nidos para consumo humano de los huevos o para el comercio ilegal de
las crías (Ardila et al, 1999, Lugo, 1995). Además, según Boede y Sogbe (2000), la especie es
afectada por las siguientes enfermedades en individuos mantenidos en cautiverio en
zoocriaderos: anomalías congénitas e intoxicaciones en neonatos, avitaminosis por
deficiencias nutricionales, escoliosis, osteodistrofia, infecciones bacterianas, micóticas,
virales, parasitismo, traumatismos y estados de shock en crías y juveniles, traumatismos
e hiperparasitoidismo nutricional secundario en adultos. En ocasiones se ha visto que
por ingesta de trozos de caucho y telas, se han producido muertes por ahogamiento.
47
Figura Nº 3. Caiman del Orinoco o Caiman Llanero (C. intermedius)
2.4.2. Testudinos
Colombia con sus 25 especies de tortugas continentales, dentro de las que se
encuentran las tortugas acuáticas, semiacuáticas y terrestres (Figura Nº 4), constituye
uno de los países más ricos en Testudinata de la Región Neotropical, ya que posee casi
la mitad de las 53 especies de tortugas de la región (Ceballos, 2000). Sin embargo, la situación
de estas tortugas es altamente preocupante dado que al menos 14 especies enfrentan
un alto riesgo de extinción y se encuentran incluidas dentro de las categorías de
amenaza de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (2000) debido
a la sobreexplotación de manera intensiva, degradación de hábitats a tal punto que
muchas de ellas han desaparecido en vastos sectores de distribución natural o se hallan
confinadas en hábitats incapaces de sustentar poblaciones saludables(Boyer y Boyer, 1996).
Durante muchos años las especies de tortugas continentales han sufrido una fuerte
disminución en sus poblaciones por varias causas, principalmente antrópicas: consumo
de huevos y carne, uso del caparazón para la fabricación de artesanías, captura
accidental en redes de pesca y palangres, contaminación y destrucción del hábitat de
alimentación y de desove (National Research Council, 1990). Poco se conoce sobre el impacto de
las enfermedades infecciosas bacterianas en las poblaciones de tortugas en estado
natural y sobre el papel que varios microorganismos puedan desarrollar como agentes
patógenos (Glazebrook y Campbell 1990b).
48
Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F (Morroco
Amar – Geochelone denticulata)
2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles

Muchas bacterias han sido identificadas como las causantes de enfermedades en
reptiles mantenidos en cautiverio (Keymer 1978, Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook y Campbell 1990b,
Glazebrook et al. 1993). Sin embargo, se conoce que muchos microorganismos pueden ser
causa de elevada mortalidad en otras especies de animales acuáticos de vida libre (Medway
1980, Ghittino et al. 1984, Gulland 1999). Además, muchas de estas bacterias son patógenas para los
humanos. Según Santoro et al (2006); Aeromonas sp. es el microorganismo más
frecuentemente aislado, seguido de Citrobacter freundi, Salmonella sp, Acinetobacter sp.
y Pseudomona aeruginosa .
Aeromonas sp., Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus sp.,
Acinetobacter sp., Citrobacter sp., son bacterias potencialmente patógenas, que pueden
portarse como oportunistas, ingresar en los tejidos dañados por traumas o aprovechar
las condiciones de estrés causando enfermedades graves. Estas bacterias en reptiles en
cautividad, han sido asociadas a enfermedad cutánea septicémica ulcerativa, dermatitis
papilar, dermatitis focal erosiva, dermatitis ulcerosa traumática, dermatitis necrosante,
estomatitis ulcerosa, rinitis obstructiva, queratoconjuntivitis, septicemia, bronconeumonía
y osteomielitis (Draper et al, 1981, Lauckner, 1985; Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook et al.1993, Dickinson et al, 2001).
Por su parte, existen más de 2300 serotipos de Salmonella sp. , muchos de los cuales
fueron encontrados en reptiles silvestres y en cautiverio (Mermin et al. 1997), y algunos de estos
en quelonios marinos (Keymer et al. 1968; Keymer 1978; Glazebrook y Campbell 1990a; Raidal et al. 1998; O’Grady y
Krause 1999). Estos microorganismos son conocidos como oportunistas principalmente por
49
generar cuadros de enfermedad cuando los hospederos están debilitados y
ocasionalmente son identificados como agentes causales de gastroenteritis en los seres
humanos por consumo de carne de los animales portadores o contacto directo con heces
de los mismos (O’Grady y Krause 1999). Se considera actualmente que los reptiles son fuente de
transmisión de Salmonella sp. (Johnson-Delaney 1996). En reptiles terrestres, coliformes y
Enterobacter sp. son asociados a enfermedades locales y generales (Hoff et al. 1984; Glazebrook y
Campbell 1990a). Proteus mirabilis y Bacillus sp. son considerados saprófitas y parte de la
flora normal que se encuentra sobre la piel de los reptiles (Glazebrook y Campbell 1990a, Shotts, 2001).
Los estudios de la flora bacteriana en animales de vida libre son de fundamental

importancia pues permiten conocer el papel que tienen estos microorganismos en las
enfermedades infecciosas y como afectan la supervivencia de las poblaciones de
tortugas en condiciones naturales dentro del equilibrio biológico de estos vertebrados.
Considerando que el número de los microorganismos resulta mayor en reptiles con
inestable estado de salud, este aspecto puede ser utilizado como un importante índice
para identificar grupos de animales inmunosuprimidos o enfermos, evaluando la flora
bacteriana de una población durante varios años. En fin, el conocimiento de la flora
normal de animales silvestres es importante para entender los riesgos potenciales de la
zoonosis (Santoro et al., 2006).
50
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
En los reptiles, Salmonella sp. hace parte de la flora intestinal normal, por lo cual estos
animales son catalogados como portadores asintomáticos del microorganismo. Sin
embargo, la enterobacteria al tener un comportamiento de parásito intracelular, es
oportunista y puede llegar a causar afecciones en los ejemplares donde se presentan
altos niveles de inmunosupresión debido a las condiciones del cautiverio, situación que
es aprovechada por el microorganismo para la colonización de órganos internos
causando serias patologías en los animales incluso bajo ciertas condiciones llegando a
producir la muerte de los mismos. (Chiodini y Sulberg 1981; Millan et al. 1997; Mitchel y Shane 2000; Boever y
Williams 1975; Isaza et al. 2000; Oros et al. 1997).
Teniendo en cuenta lo anterior es indispensable conocer la implicación que puede tener

esta bacteria en los cuadros patológicos presentados por estos animales y además
reconocer el potencial riesgo zoonótico para las personas que trabajan en la E.B.T.R.F y
que están en contacto directo con los ejemplares de C. intermedius y Testudinos que
son preservados allí. Para tal fin, es necesario conocer la carga de Salmonella sp. que
se presente en la población animal, para poder involucrarla directamente con procesos
de enfermedad en los individuos y en el personal. Esto es de vital importancia, dado que
en el país no se ha realizado ninguna investigación que abarque todos los objetivos
propuestos para este estudio, relacionando la presencia de Salmonella sp. en la
predisposición de los animales a presentar patologías asociadas al microorganismo.
Teniendo en cuenta que todos los ejemplares muestreados se encuentran “ex situ” y el
objetivo de la Estación es la reintroducción de los mismos a su hábitat natural, el
proyecto sirve de guía hacia la preservación y disminución de los riesgos para las
poblaciones de éstas especies silvestres encontradas “in situ”, garantizando que los
ejemplares que salen de la Estación se encuentren completamente sanos, todo en
búsqueda de implementar estrategias que a su vez permitan conservar la integridad de
los últimos ejemplares que habitan el planeta en condiciones in situ.
51
3.2. JUSTIFICACIÓN
El caimán llanero (Crocodylus intermedius) es una especie declarada en peligro de
extinción; a partir de la resolución 0676 del 21 de julio de 1.997 emitida por el Ministerio
del Medio Ambiente, las acciones se han dirigido a la elaboración de un programa
general de conservación producto de la concertación de todas las Instituciones públicas
o mixtas con incidencia directa y/o indirecta tanto en los relictos poblacionales existentes
como en los territorios señalados como hábitats tradicionales de la especie. Por su parte,
las tortugas constituyen el segundo grupo de vertebrados tetrápodos más amenazados
en Colombia, ya que de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas
publicadas por la UICN, mas de la mitad de las especies registradas en nuestro país (19
de 32 (taxones), poseen algún riesgo de desaparecer en un futuro cercano, si no se
adoptan medidas efectivas para su protección, manejo y conservación. Es por ello que
esta investigación pretende en primer lugar y con una visión conservacionista, establecer
científicamente si la Salmonella sp. puede estar afectando a los últimos ejemplares en
cautiverio que existen en Colombia y que son el soporte genético con el que cuenta
nuestro país para evitar su extinción; en segundo lugar y dada la implicación que tiene
esta bacteria en la salud pública, se busca establecer con precisión la presencia de este
enteropatógeno en tortugas que también se investigan en la Estación Roberto Franco,
ejemplares donde la literatura reporta que esta bacteria puede hacer parte de la flora
normal, constituyéndose en una fuente potencial de contagio para los caimanes y el
personal que labora en la Estación. Una vez conocida la situación real de la presencia
de este patógeno en los reptiles será posible establecer medidas de control más
pertinentes, enfocadas al establecimiento de la buena salud animal y humana.
La salmonelosis permanece como un importante problema de salud pública alrededor del

mundo y pese a los grandes esfuerzos en investigación, muchos detalles de su patogénesis
son aún desconocidos (Lax, et al 1995) y continúa siendo la principal enfermedad gastrointestinal
en los seres humanos. En Colombia, las investigaciones acerca de la enterobacteria
Salmonella sp. se han centrado en la implicación de la misma en las enfermedades
transmitidas por agua y alimentos (ETA) y son escasos los estudios llevados a cabo acerca
de los posibles contagios producidos por especies de reptiles, aunque se reconoce su gran
poder zoonótico; no se ha tenido muy en cuenta el porcentaje de casos de la enfermedad
que pueden ser generados a partir del contacto con especies cautivas, aunque, según
datos estadísticos, el aumento de la popularidad de esos animales como mascotas,
coincide con el número de casos de salmonelosis en humanos asociadas a reptiles, por lo
cual este problema ha sido en los últimos años de gran importancia a nivel de salud pública.
52
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar e identificar mediante diversos análisis microbiológicos, la presencia de
enterobacterias del género Salmonella en ejemplares de caimán llanero (Crocodylus
intermedius) y tortugas de diferentes géneros (Orden Testudinata); animales mantenidos
en cautiverio en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco (EBTRF), determinando
las serovariedades de mayor prevalencia en estos animales.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Determinar mediante pruebas microbiológicas, la presencia de enterobacterias del
género Salmonella aisladas a partir de muestras de hisopado cloacal, de diferentes
especies de tortugas de Orden Testudinata y Crocodylus intermedius neonatos.
 Establecer las especies del Orden Testudinata en las que hay mayor prevalencia de
la enterobacteria en estudio.
 Realizar un análisis indirecto de los ejemplares pertenecientes a la especie
Crocodylus intermedius, estableciendo la presencia de la enterobacteria Salmonella
sp. en el agua y sedimento de los estanques donde permanecen los animales.
 Aislar enteropatógenos del género Salmonella en las muestras de materia fecal
encontrada en los encierros de los ejemplares de caimán llanero en estudio.
 Realizar un análisis antigénico de todas las cepas compatibles con Salmonella sp.
para determinar el/los grupos predominantes en las especies en estudio.
 Establecer mediante pruebas estadísticas descriptivas, el porcentaje de presentación
de la bacteria tanto en Tortugas como en Crocodylia, para así mismo reportar el
grado de infestación en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco.
 Realizar los primeros aportes en Colombia acerca de la descripción de los serotipos
de Salmonella sp. encontrados en diferentes especies de tortugas y la presencia de
la bacteria en el caimán llanero (Crocodylus intermedius).
53
5. METODOLOGÍA
5.1 ÁREA DE ESTUDIO

Esta investigación se llevó a cabo en La Estación de Biología Tropical Roberto Franco
(E.B.T.R.F.) ubicada en la ciudad de Villavicencio - Meta, centro de investigación de la
Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia.
Las condiciones climáticas muestran un régimen de lluvias unimodal con una
precipitación media anual de 4085mm; temperatura promedio de 27 oC y una humedad
relativa de 77,8% (Rodríguez y Ramírez, 2000).
La E.B.T.R.F, cuenta actualmente con una colección viva que supera los 300 ejemplares
de tortugas terrestres nativas del país, distribuidas en más de 20 especies y,
adicionalmente un número mayor a 200 ejemplares de Crocodylus intermedius
distribuidos en diferentes grupos etáreos entre los que se encuentra una gran cantidad
de neonatos y juveniles (80%), producto de investigaciones en el área reproductiva.
El estudio de esta colección permite el desarrollo de un sinnúmero de investigaciones y
proyectos que contribuyen a la conservación de estos individuos y asimismo avanzar en
el conocimiento de estas especies que constituyen el grupo de vertebrados tetrápodos
más amenazado de Colombia, de acuerdo con las listas oficiales de especies
amenazadas publicadas por la Unión Internacional para la Conservación de la
Naturaleza (UICN)
5.2 POBLACIÓN MUESTRAL:

El muestreo fue realizado sobre la totalidad de los ejemplares encontrados en la
Estación distribuidos en 52 estanques (Anexo Nº 1) así: 29 caimanes adultos (4 años en
adelante) ubicados en 8 estanques, 118 animales juveniles (3 – 4 años) encontrados en
8 estanques y 80 neonatos (1 – 2 años) distribuidos en 9 estanques; los ejemplares del
Orden Testudines se encontraban distribuidos en 27 estanques en cada uno de los
cuales se encuentran animales de diferentes especies en peligro de extinción (Tabla Nº
3).
5.3 TOMA DE MUESTRAS

Se realizaron tres muestreos seriados con un intervalo de 15 días entre cada uno. Se
obtuvieron muestras de arena encontrada alrededor de los estanques donde están
alojados los ejemplares en estudio procurando que en la muestra se incluyera materia
fecal; simultáneamente se muestreó el agua y sedimento de cada uno de estos
encierros. Adicionalmente, en cada uno de los estanques se obtuvo hisopado cloacal del
54
Tabla Nº 3: Especies de Testudines y Crocodylia muestreadas y número estanques y
ejemplares muestreados para cada caso
Especies Nº Nº
Nombre Cientifico Nombre común Estanques Ejemplares
Muestreados Muestreados
Caimanes 25 227
Crocodylus intermedius Caiman del Orinoco / 24 226

Caiman Llanero
Caiman crocodilus Babilla 1 2
Tortugas 27 342
Rhinoclemmys melanosterna Palmera 2 72
Rhinoclemmys diademata Inguensa 2 32
Rhinoclemmys nasuta Sabaletera 1 2
Híbrido Rhinoclemmys Híbrido 2 115
Geochelone denticulata Morroco Amar 1 4
Geochelone carbonaria Morroco Negro 1 15
Rhinoclemmys funerea 1 1
Phrynos gibbus Hedionda 1 4
Kinosternon sp Tapaculo 1 3
Phrynos geoffroanus Bachala 1 1
Peltocephalus dumerilianus Cabezon 1 1
Chekus fimbriatus Mata Mata 1 2
Podochnemis unifilis Terecay 1 20
Podochnemis expansa Charapa 1 8
Podochnemis vogli Sabanera 1 26
Podochnemis lewyana Lewyana 1 2
Trachemys scripta ornata Pecho carey 1 3
Trachemys scripta callirostris Icotea 1 31
25% de los ejemplares de la colección de Crocodylia neonatos y Testudines de todas las

edades presentes en la E.B.T.R.F y las muestras se trabajaron como un grupo por cada
estanque.Teniendo en cuenta que la obtención de muestras se realizó de forma
aleatoria, cabe aclarar que en cada muestreo las muestras remitidas eran diferentes a
las procesadas en el muestreo anterior.
55
5.3.1. Obtención de muestras por hisopado cloacal
Testudines: Se muestreó el 25% de la población total encontrada en cada estanque,

para lo cual se introdujo a través de la cloaca un hisopo estéril, haciendo movimientos
de rotación contra las paredes cloacales se garantizó la obtención de suficiente muestra
(Figura Nº 5); inmediatamente el hisopo se depositó en una bolsa de cierre hermético
que contenía caldo lactosado esteril (2%), con el fin de evitar la deshidratación y
contaminación (Saelinger y Lewbart 2006, Crawford et al,1971; Chambers y Hulse, 2006) Las bolsas que
contenían las muestras se remitieron al laboratorio debidamente etiquetadas con el
número de estanque y tipo de muestra; fueron transportadas en refrigeración por un
periodo menor de 6 horas (Luna, 1991) para inmediatamente ser procesadas en el
laboratorio de microbiología veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria y de
Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá.
Figura Nº 5. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Testudines.
Caimanes neonatos: Se muestreó el 25% de la totalidad de los ejemplares neonatos

(menores de 1 año) encontrados en cada estanque (Figura Nº 6). De igual forma que en
los individuos de tortugas, las muestras se transportaron en bolsas de cierre hermético
que contenían caldo lactosado en un lapso menor de 6 horas (Luna, 1991) hasta su
procesamiento en el laboratorio de microbiología veterinaria de la Universidad Nacional
de Colombia.
56
Figura Nº 6. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Crocodylus intermedius
neonatos.
5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques:
Tortugas y Caimanes Neonatos: Una vez se homogenizaba el agua contenida en los

estanques, se introdujo una jeringa de 20cc a la cual previamente se le había colocado
una sonda estéril de 50 cm de longitud y se realizaba aspirado del fondo del estanque
hasta obtener una muestra de 250 ml de agua y sedimento; ésta se depositó en bolsas
de cierre hermético (Figura Nº 7 A y B). Se empleó una jeringa y una sonda por cada
estanque.
Caimanes adultos y juveniles:

La toma de muestras se realizó a partir de los canales de desagüe, se hizo apertura de
los sistemas de evacuación y se tomaron aproximadamente 250 ml de agua junto con
sedimento directamente en la bolsa de cierre hermético (Figura Nº 7 C).
Todas las muestras fueron transportadas en condiciones de refrigeración, debidamente

identificadas (Rodriguez, et al,1980) para posteriormente ser procesadas en el laboratorio de
microbiología veterinaria en la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá en un
periodo menor de 6 horas desde el momento de la toma.
57
A. B.
C.
FIGURA Nº 7. Muestreo de Agua y Sedimento de los Estanques. A y B. Muestreo en los
estanques de Tortugas y Crocodylia neonatos. C. Muestreo en estanques de Crocodylia
Adultos y Juveniles
5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques: Se abarcó la

totalidad de la playa de cada estanque, llevando a cabo un muestreo significativo en 5
puntos del terreno conformando la letra Z (Petersen y Calvin, 2006), se realizó una excavación
hasta aproximadamente 10 cm de profundidad y a partir de este punto se obtuvo una
muestra de 250g de arena, se procuró que el sitio de toma de la misma se encontrara
contaminado con restos de materia fecal; la muestras se depositaron en bolsas de cierre
hermético y se transportaron a la ciudad de Bogotá igualmente en un lapso menor a 6
horas (Figura Nº 8).
58
Figura Nº 8. Toma de muestra: Arena y materia fecal encontrada en los encierros de los
ejemplares en estudio.
5.4. FASE ANALÍTICA
5.4.1. Aislamiento e identificación de Salmonella sp.

El cultivo de la bacteria fue realizado de acuerdo con la norma ISO 6579: 2002, con
adición de algunos medios de cultivo que han demostrado buenos resultados en la
recuperación del microorganismo (Chambers, y Hulse, 2006; Gaillot et al, 1999 Bonnie, 2001)
5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo

Las muestras de hisopado cloacal fueron enriquecidas con 20 ml de caldo lactosado
estéril, a las muestras de agua/sedimento y materia fecal/arena, se les adicionaron 250
ml de caldo lactosado esteril. Se llevaron a incubar a 37ºC, durante un periodo de 24
horas (Mann y Bjotvedt, 1967; Luna, 1991; Corrente et al 2004).
5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo

Se recuperaron 10 ml del caldo de preenriquecimiento y se adicionaron a un tubo de
ensayo con 10 ml de caldo tetrationatoBD®, el cual se incubó en baño serológico a
43±0,5oC por 24 horas (Luna, 1991)
5.4.1.3. Aislamiento primario en medios selectivos y diferenciales

Las muestras enriquecidas en caldo tetrationato, fueron inoculadas en medios de cultivo
selectivos como Agar MacConkeyBD® (Mck) y CHROMagar OrientaciónBD®
respectivamente mediante técnica de aislamiento o agotamiento con una incubación a
370C durante 24 - 48 horas. (Gaillot et al;1999) y a partir de los aislamientos realizados en los
59
medios de cultivo selectivos, se llevó a cabo la identificación de las colonias
“sospechosas” de Salmonella sp; el CHROMagar Orientación BD® permite la
identificación de microorganismos mediante reacciones de sustratos cromógenos
artificiales y Salmonella sp. no tiene la capacidad de reaccionar con ningún sustrato
cromógeno del medio, por lo cual las colonias sospechosas se identifican por no producir
ningún tipo de coloración; son de bordes definidos y tamaño regular (2 - 5µ) (Hengstler et al,
1997) (Figura Nº 9 A); en agar MacConkeyBD® Salmonella sp. no tiene la capacidad de

degradar la lactosa presente en el medio, por lo cual las colonias se consideraban
sospechosas cuando no presentaban ninguna coloración y se identificaban como
colonias Lactosa Negativas (Figura Nº 9 B) (Aguilar y Escolástica, 2001)
A B
Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de
cultivo selectivos. A. CRHOMagar Orientación, B. Agar MacConkey
Una vez detectadas las “colonias sospechosas” de Salmonella sp., fueron recuperadas y
aisladas en los medios de cultivo diferenciales CHROMagar Salmonella BD® y Agar
Hektoen Entérico, trabajados en el estudio para confirmar la pureza del cultivo y
determinar si la morfología y característica de las colonias eran efectivamente
pertenecientes a Salmonella sp..
En Agar Hektoen Entérico la identificación de microorganismos del género Salmonella
está determinada por el crecimiento de colonias con una coloración negra en su parte
central debida a la producción y precipitación de ácido sulfhídrico y presentan un halo
transparente alrededor que ha permitido en el dialecto común definir que los
microorganismos del género Salmonella en agar Hektoen crecen con apariencia de “ojo
de pescado” (Figura Nº 10 A) (Luna, 1991; Richards, et al, 2004; Gaillot et al, 1999; Dusch y Altwegg, 1993; 1995;
Monnery et al, 1994). Adicionalmente, en CHROMagar SalmonellaBD® las colonias

pertenecientes a este género crecen con una coloración rosa – púrpura (Figura Nº 10 B),
60
mientras que los microorganismos no deseados son inhibidos o aparecen como colonias
con pigmento verde – azul (Bonnie, 2001; ISO, 2002; Dusch y Altwegg, 1993; 1995; Monnery, et al , 1994; Poisson et al,
1993; Ruiz et al, 1996).
A B
Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género Salmonella

aisladas en los medios de cultivo diferenciales. A. Agar Hektoen.
B. CHROMagar Salmonella.
Los medios cromogénicos permitieron el hallazgo de otros microorganismos aunque no

era un objetivo propuesto para el trabajo, lo cual es de gran importancia, dado que
permite conocer la microbiología cloacal de las especies y de esta forma identificar si
existe alguna alteración a nivel de la flora gastrointestinal normal. En CHROMagar
OrientacionBD® se observaron colonias de coloración púrpura y opacas características de
Staphylococcus saprophyticus (Figura Nº 11 A), Escherichia coli se reconoce por crecer
con apariencia rosa – transparente de tamaño medio con o sin halos alrededor (Figura
Nº 11 B); Enterococcus sp. crece con pigmentación verde azulada y colonias de tamaño
pequeño (Figura Nº 11 C),. Simultáneamente fue posible identificar enterobacterias del
género Klebsiella sp. por presentar un tamaño medio y coloración azul oscuro; (Figura Nº
11 D), Proteus presentó morfología asimétrica en las colonias con una pigmentación
crema rodeada de halos marrón. Finalmente, Citrobacter sp. produce colonias azul –
violeta en el medio (Figura Nº 11 E).
61
A B
C D
Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en las muestras. A:

Staphylococcus saprophyticus. B: Escherichia coli. C. Enterococcus sp. D. Klebsiella sp.
E. Citrobacter sp.
62
5.4.1.4. Identificación Bioquímica
El reconocimiento de acuerdo con el metabolismo de los microorganismos
pertenecientes al género Salmonella sp. se llevó a cabo mediante el sistema de
identificación BBL cristal BD® para bacterias entéricas/no fermentadoras realizando el
montaje y lectura de las placas según las indicaciones, recomendaciones e instrucciones
del productor (Figura Nº 12) (Anexo Nº 3).
A B
Figura Nº 12. Lectura de pruebas de identificación Crystal® para microorganismos
entéricos/no fermentadores. A. Identificación a partir de agua y sedimento del estanque
de Testudines número 21. B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimán neonato
en el estanque número 47
Para la lectura del perfil del microorganismo por parte del Software fue necesario realizar
a las colonias “sospechosas” en los medios de cultivo diferenciales, un nuevo
aislamiento en agar tripticasa soya BD® enriquecido con 5% de sangre ovina y luego de
una incubación por 24 horas a 37ºC (Murray, 1999) se realizó prueba de indol en medio SIM y
simultáneamente se llevó a cabo prueba de oxidasa, Salmonella muestra un
comportamiento negativo para las dos pruebas.
5.4.1.5. Serotipificación
Una vez los aislamientos fueron identificados como Salmonella sp. por el método de
Crystal BD®, las cepas fueron recuperadas nuevamente a partir de Agar TSA con Sangre.
Los aislamientos de Salmonella sp. fueron expuestos a antisueros mono y polivalentes
específicos como lo indica la metodología de Kauffmann White (Grimont y Weill, 2007). En una
lámina hemoclasificadora se rotuló el primer cuadrante de forma vertical con el antisuero
a evaluar y cada recuadro horizontal con la identificación de la cepa a serotipificar
(Figura Nº 13). En la primera sección de la lámina (Grupo B/2 A+S) se depositaron 50µl
63
de solución salina 0,85% y se tomó una asada de la colonia a evaluar a partir del TSA
con sangre, se homogenizó la solución y posteriormente se adicionó una gota de 50µl
del antisuero correspondiente y se mezcló; se esperó la formación macroscópica de
agregados finos o grandes aglutinados que indicaba la positividad de la reacción; en
caso de no haber evidencia de aglutinación, se procedía a evaluar el antisuero siguiente
(Grupo D) y así sucesivamente hasta establecer el serogrupo del aislamiento (Anexo Nº
4). Para cada reacción positiva se realizaba un control positivo y negativo con el fin de
garantizar la inexistencia de falsos positivos (Bayley y Scott, 1982, Chatfield, et al., 2007. Luna, 1991, Winkle y
Rhode, 1961)
Cepa
2 A+S 7A+S 14 HC 24 A+S 31 A+S 38 A+S 44 HC 49 A + S
Antisuero
Grupo B + +
Grupo D1 +
Grupo C1 +
Grupo C2 + +
Poli B +
Poli C +
Figura Nº 13. Esquema de una lámina hemoclasificadora utilizada para la serotipificación
de las cepas de Salmonella sp. (+: Reacción positiva de aglutinación).
Para la serotipificación se emplearon los antisueros comerciales Polivalentes B DIFCO ®

(grupos C1,C2, F, G y H) y Polivalente C DIFCO ® (Grupos I, J, K, M, N, O) y antisueros
monovalentes para Grupo B DIFCO® (Factor 1, 4, 5, 12), Grupo C1 DIFCO® (Factor 6,7),
Grupo C2 DIFCO® (Factor 6,8), y Grupo D1 DIFCO® (factor 1,9, 12).
5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibióticos

La prueba de sensibilidad a antimicrobianos se realizó (mediante el método de Kirby –
Bauer o prueba de difusión por disco) a las cepas de Salmonella sp. identificadas por el
sistema de identificación BBL CrystalBD®.
A partir de los aislamientos en el medio de cultivo agar TSA + Sangre BD® se tomaron
aproximadamente 2 o 3 colonias y se inocularon en un tubo con solución salina esteril,
garantizando una total dilución de las colonias hasta alcanzar una turbidez
correspondiente al patrón 0,5 de McFarland, con una concentración aproximada de 1,5
x 108 UFC/ml. (Chambers y Hulse, 2006 y Smith et al, 1952).
La suspensión anterior, se depositó sobre una caja de agar Mueller HintonBD®, medio de
cultivo validado por la NCCLS (Chambers y Hulse, 2006); se garantizó que toda la suspensión
entró en contacto directo con el agar y pasado un lapso de 2 minutos aproximadamente,
64
el exceso de solución se descartó e inmediatamente se ubicaron los discos
comercialesBD® impregnados con el agente antimicrobiano a enfrentar con la bacteria
haciendo una leve presión sobre el agar; las placas se llevaron a incubación durante un
lapso de 16 – 18 horas a una temperatura de 37oC. Los antibióticos evaluados fueron
Sulfatrimetoprim (25µg), Norfloxacina (10µg), Ampicilina (10µg), Cloranfenicol (20µg),
Cefoxitin (20µg), y Tetraciclina (30µg) BD® (Passmans, 2005).
et al,
Posterior a la incubación, los halos inhibitorios fueron medidos en milímetros (Figura Nº

14) y de esta forma se clasificó el tipo de respuesta según las tablas de interpretación
provistas por la NCCLS. donde se evalúa la acción de antimicrobianos frente a
microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, estableciendo, la
sensibilidad total, sensibilidad moderada y/o resistencia a este tipo de agentes (Anexo Nº
5)
.
Figura Nº 14. Antibiograma
65
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Análisis de datos

Todos los datos obtenidos durante el proyecto fueron analizados mediante estadística
descriptiva y se representaron con tablas, histogramas, gráficos circulares, entre otros.
6.2. Identificación de microorganismos del género Salmonella por

técnica BBL Crystal®
Mediante esta técnica de identificación fue posible confirmar los aislamientos que se
habían identificado como “sospechosos” de Salmonella en los medios de cultivo
diferenciales. Se obtuvieron en total 36 aislamientos sospechosos, de los cuales 31
fueron identificados por el software (Libro electrónico de códigos BBL Crystal ®) como
Salmonella sp. con un nivel de confianza promedio de 0.9908. De los 5 aislamientos
restantes, en tres se descartó la presencia de Salmonella sp. puesto que en uno se
obtuvo Escherichia coli con un nivel de confianza de 0,9029; en otro se aisló
Flavimonas oryzihabitans antes clasificada como Pseudomonas oryzihabitans la cual
según reportes bibliográficos es frecuentemente recuperada de ambientes tales como
plantaciones de arroz, suelos y agua estancada; y no tiene ninguna significancia clínica
(Treviño, et al 2001); finalmente, se aisló Providencia rustigianii, con un nivel de confianza de
0,7766. Dos de los aislamientos no pudieron ser identificados por el kit para la
evaluación de microorganismos Entéricos/No Fermentadores, por lo cual se reportaron
como negativos para Salmonella sp.
Adicionalmente, es necesario tener en cuenta que el sistema identificó dos de los
aislamientos como Salmonella cholerae suis subsp. arizonae, serovariedad encontrada a
partir de una muestra de origen ambiental la cual no ha sido reportada en especies de
reptiles, hecho que permitió plantear una hipótesis sobre la posible contaminación de la
arena en el encierro mediante fómites (botas, herramientas) que hubiesen sido utilizados
previamente en alguna granja donde se mantienen cerdos puesto que la serovariedad
aislada ha sido reconocida como agente causal de salmonelosis porcina (Thomas, 1997; Mc
Caughey et al, 2005). Sin embargo, mediante las indagaciones realizadas acerca del manejo en
la E.B.T.R.F. y las medidas de bioseguridad establecidas allí, esta hipótesis fue
descartada.
66
6.3. Positividad a Salmonella sp. en estanques de Crocodylia y
Testudinea
Entre los ejemplares de Crocodylia se encuentran especies de Crocodylus intermedius
en su mayoría, distribuidos en 24 estanques, en 15 de éstos se encontró la bacteria; el
estanque restante es ocupado por ejemplares de Caiman crocodylus (Babillas) donde
igualmente se encontró el microorganismo, lo cual permite concluir que el 64% de los
estanques de caimán se encontraban positivos a la bacteria. Por otro lado, de los 27
estanques de tortugas evaluados, 12 (44,4%) son positivos para Salmonella sp;
encontrándose la presencia del microorganismo en 7 de las 18 especies que conforman
la colección viva de la E.B.T.R.F; estos resultados son de gran preocupación puesto que
de acuerdo a los resultados obtenidos y haciendo un análisis general que reúne los
datos globales colectados en la Estación, para las dos especies evaluadas, se pudo
establecer que en 27 de los estanques (52%) fue posible recuperar microorganismos del
género Salmonella; mientras que los 25 (48%) restantes se encuentran negativos para la
bacteria (Figura Nº 14). Según el volumen de muestras remitidas al laboratorio, de un
total de 129 muestras, 30 fueron positivas para el microorganismo, lo cual equivale a un
24% . Es necesario aclarar que en el primer muestreo se remitieron al laboratorio 129
muestras, en el segundo muestreo 96 y en el tercero 73; debido a que si en alguno de
los estanques evaluados se reportaba el hallazgo de Salmonella en cualquiera de las
muestras procesadas, no era relevante muestrear nuevamente dicho estanque ya que el
proyecto estaba condicionado a la evaluación de la presencia/ausencia de la bacteria.
N = 52
Figura Nº 15.
Es de vital importancia tener en cuenta que es muy poco lo que se ha investigado a nivel
mundial y mucho menos Nacional, con respecto a la presencia de la enterobacteria en
este tipo de reptiles, ya que por muchos años se han encaminado los estudios a las
67
especies que son criadas como mascotas, tales como iguanas, lagartos, tortugas y
serpientes (Hidalgo et al, 2008; Corrente, et al, 2004; Kourany y Telford, 1982; Ebani et al; 2005; Mitchell y Shane, 2001), pero
en animales que se encuentran en via de extinción y que son el objetivo principal de los
centros de conservación y recuperación de las especies mediante programas de
reproducción, los ensayos acerca de la presencia de Salmonella sp. tanto en los
animales como en su hábitat natural son insuficientes. Adicionalmente, si bien es cierto
que el microorganismo hace parte de la flora comensal de los reptiles y que su
aislamiento en tortugas de diferentes familias ha sido reportado con mayor frecuencia
(Hidalgo, et al 2007,2008; Siebeling et al, 1975; Passmans et al, 2002; Saelinger y Lewbart 2006), no se puede ignorar el
hecho de que para todos los individuos evaluados, las condiciones de cautiverio donde
son mantenidos crean cuadros de inmunosupresión marcada donde la enterobacteria es
excretada de manera intermitente (Chiodini y Sundberg, 1981; Bradley et al, 2001; Ebani et al 2005) y puede
llegar a producir estados patológicos caracterizados por letargia, anorexia, septicemia,
pneumonia, celomitis, abscesos, shock hipovolémico y, bajo circunstancias extremas, la
muerte del ejemplar (Onderka and Finlayson, 1985; Frye, 1991).
Aunque todos los reptiles son considerados portadores naturales de Salmonella sp.,
lagartos, serpientes y tortugas en particular, son reservorios de dicha bacteria (Baümler et al,
1998) y no es claro cómo frecuentemente las especies de reptiles son colonizadas por
serovariedades de Salmonella; en algunos estudios realizados se ha evaluado la
capacidad de colonización de la bacteria en útero, contaminación perinatal, por ingestión
de presas contaminadas y/o contacto con heces de otros reptiles (Schöter, et al , 2004). Según
Kourany y Telford (1982), la predisposición a condiciones de estrés y escases de
alimento hacen que la bacteria atraviese la barrera sanguínea y linfática, llegando a
oviducto, causando la contaminación de los huevos; aunque Mitchell y Shane (2000),
sugieren que la contaminación de los huevos se da por abrasión del mismo cuando entra
en contacto con el suelo y cáscaras remanentes, en su ensayo descartan la transmisión
vertical puesto que no lograron el aislamiento del microorganismo a partir de ovarios,
oviducto y saco embrionario. Sin embargo, la mayor parte de investigaciones en esta
área concluyen que la ingestión de agua contaminada con heces es la principal vía de
infección considerándose el medio acuático favorable para la transmisión (Hidalgo, et al, 2007)
sin llegar a subestimar que el alimento y el contacto con otros reptiles también son una
importante vía de contaminación; además las altas tasas de ejemplares portadores de
Salmonella se relacionan con el comportamiento de coprofagia por parte de las crías, lo
que a su vez asegura la transmisión prematura de dichos microorganismos (Mader, 1996) La
importancia de las infecciones por Salmonella sp. es su potencial zoonótico y los
aislamientos de la bacteria a partir de reptiles se han considerado como patógenos para
humanos, ya que poseen factores de virulencia cruciales para el desarrollo de una
68
gastroenteritis (Pasmans et al., 2005). Estos factores demuestran la importancia en la obtención
de los resultados ya que se ha informado a la Estación de Biología Tropical Roberto
Franco acerca de la presencia de la enterobacteria Salmonella sp. tanto en los animales
como en su hábitat natural, con el fin de concientizar al personal que labora en sus
instalaciones y que se encuentra en un potencial riesgo de contraer salmonelosis
asociada a reptiles.
6.4. Presencia de Salmonella sp. según la especie
En la Estación de Biología Tropical Roberto Franco se encuentra una colección que

supera los 400 ejemplares de tortugas distribuidos en más de 18 especies y más de 200
ejemplares de Crocodylus intermedius. Es una población que se encuentra en buenas
condiciones de salud, a pesar de haberse obtenido aislamientos de Salmonella sp. en
un 46% de los estanques de tortugas (Figura Nº 16) y 60% de C. intermedius (Figura Nº
17). Cabe resaltar que ninguno de los animales presentaba sintomatología asociada con
Salmonelosis, lo cual puede ser compatible con varias investigaciones que se han
realizado en este tipo de ejemplares estableciéndose de esta forma que son portadores
aisntomáticos de la enterobacteria (Chambers y Hulse, 2006; Mitchell y Shane, 2000; Pasmans, et al 2005; Geue y
Lôschner, 2002; Chiodini y Sundberg, 1981; Millán et al, 1997; Abadem de Sá y Solari; 2001)
N = 27
Figura Nº 16.
69
N = 25
Figura Nº 17.
Saelinger y Lewbart (2006) plantearon dos hipótesis de acuerdo con los resultados que
obtuvieron en el aislamiento de Salmonella sp. en ejemplares de tortugas silvestres; ellos
postulan que no lograron recuperar ningúna cepa, posiblemente porque las tortugas
excretan Salmonella sp. únicamente bajo condiciones de estrés como el cautiverio y/o
porque las tortugas silvestres no son portadores naturales de Salmonella sp. sino que la
adquieren cuando son incluidas en ambientes “ex situ”; de esta forma proponen que las
tortugas “salvajes” no pueden ser portadores de los organismos antes de la captura; sin
embargo tanto el análisis experimental llevado a cabo en la Estación Roberto Franco,
como el realizado por Chambers and Hulse (2006), contradice por completo el hallazgo
de dichos investigadores quienes a partir de ejemplares silvestres, reportaron que el 85%
de la muestras procesadas eran positivas para Salmonella sp. Nuestra investigación en
la Estación, soporta la primera hipótesis planteada por Saelinger y Lewbart (2006)
puesto que el porcentaje de recuperación de Salmonella sp. en los Testudines cautivos
en la E.B.T.R.F (Figura Nº 16), fue de 46% y se plantea que los resultados inesperados
obtenidos por dichos autores posiblemente se dieron por una errada metodología de
muestreo al haber empleado únicamente hisopado cloacal en la toma de las muestras
dado que la cantidad que se obtiene de esta manera es insuficiente y se conoce que la
concentración de Salmonella sp. frente a la flora acompañante es muy baja, lo cual hace
que su recuperación sea más difícil ó posiblemente al igual que Richards et al (2004), no
obtuvieron resultados favorables seguramente por no realizar previo enriquecimiento de
la muestra.
Por otra parte, el porcentaje de aislamiento de Salmonella sp. en C. intermedius

observado en la Figura Nº 17 fue mayor que el obtenido para ejemplares de Orden
Testudinata, lo cual concuerda con lo reportado por Geue y Löschner (2002) quienes
70
obtuvieron un porcentaje de recuperación de la bacteria solo de 2,6% (una muestra) en -
Testudines, mientras que en lagartos obtuvieron un porcentaje de aislamiento de 47,4 %;
(36 muestras); de igual manera en un estudio realizado por Corrente et al (2004) se
obtuvo 50% de recuperación en lagartos y 10,3% en tortugas. Los resultados obtenidos
en la estación fueron mayores a lo esperado puesto que existen muchos más reportes
de aislamientos a partir de muestras provenientes de tortugas que de caimanes (Richards.
et. al 2004; Mitchell and Shane. 2001; Pasmans, et al 2005; Hidalgo, et al 2007, Lane, 1996).
Es importante destacar que estos resultados apoyarán bibliográficamente a muchos

investigadores en esta área pues no se conocen datos acerca del comportamiento de la
bacteria en ejemplares de Caimán y como se puede deducir, es de vital importancia
determinar la presencia de Salmonella en este tipo de animales puesto que la
prevalencia en los individuos ex situ es altísima y teniendo en cuenta que generalmente
se encuentran incluidos en programas de recuperación y repoblación de la especie es
necesaria la implementación de medidas que eviten la predisposición de los animales a
inmunosupresión extrema y adicionalmente mantener las medidas de bioseguridad
apropiadas que garanticen condiciones sanitarias ideales para los animales y el personal
que labora con los mismos.
Cabe resaltar que para animales mantenidos en cautiverio, es de vital importancia

conocer que Salmonella sp. es altamente resistente fuera de su hospedero y permanece
viable después de 89 días en suelo y/o agua y 30 meses en Materia Fecal, lo que
permite asegurar que todo el ambiente del encierro puede ser fuente para aislamientos
positivos para Salmonella sp. (Warwick, et al 2001). Adicionalmente, teniendo en cuenta que la
excreción de la bacteria no es constante y que el muestreo por hisopado cloacal no es lo
suficientemente sensible, se optó por llevar a cabo un muestreo mucho más amplio que
permitiera aumentar las probabilidades de recuperación del microorganismo a partir de
muestras de origen ambiental puesto que según reportes bibliográficos, han generado
resultados satisfactorios en el aislamiento del microorganismo (Hidalgo, et al 2007) siempre y
cuando el muestreo sea continuo y repetitivo (Woodward et al., 1997; Mermin et al., 2004).
6.5. Aislamientos de Salmonella sp. según el tipo de muestra para

ejemplares de Crocodylia y Testudinos
Las muestras de tipo ambiental obtenidas para el aislamiento de Salmonella sp. en este
ensayo han permitido una buena recuperación de la bacteria, consiguiéndose un mayor
índice de recuperación de la bacteria a partir de muestras de agua y sedimento de los
estanques donde se aisló el microorganismo en 7 (50%) de las 14 muestras positivas en
71
Testudines y 10 (71,4%) de 14 muestras igualmente positivas en Crocodylia; a diferencia
de los hisopados cloacales donde la recuperación del microorganismo fue menor.
Las figuras Nº 18 y 19 muestran claramente los resultados obtenidos de acuerdo al tipo

de muestras procesadas para el aislamiento de Salmonella en los ejemplares evaluados
y analizando los datos es posible afirmar que cualquier metodología que se emplee para
el aislamiento de la bacteria no es lo suficientemente sensible y específica por si sola;
deben emplearse diferentes muestras para garantizar la recuperación del
microorganismo; es así como es posible corroborar los resultados de ensayos previos
donde el aislamiento del enteropatógeno a partir de hisopado cloacal en muchos casos
no ha permitido la obtención de la bacteria (Geue y Löschner, 2002; Richards. et al .2004; Pasmans et al. 2002;
Saelinger y Lewbart, 2006) y refutar aquellos donde se ha obtenido un altísimo porcentaje de

aislamiento tal como Schröter et al (2004) quienes mediante hisopado cloacal obtuvieron
Figura Nº 18.
Figura Nº 19.
72
81% de recuperación de Salmonella sp. en serpientes y Pasmans et al (2005), con 25
aislamientos positivos para Salmonella sp. (75,8%) de 33 muestras obtenidas a partir de
hisopados cloacales en lagartos, aunque igual establecen que el muestreo único por
hisopado cloacal no es altamente sensible. Según los resultados obtenidos en este
trabajo, no es recomendable realizar hisopados cloacales en los animales porque el
estrés generado durante el procedimiento es muy alto y el porcentaje de recuperación
de la bacteria muy bajo; además, conociendo que la excreción de la bacteria es
intermitente, el aislamiento del microorganismo mediante hisopado cloacal va a
depender no solo de llevar a cabo una buena metodología diagnóstica, sino del factor
“azar” que garantice que en el momento del muestreo la bacteria este siendo excretada
por el animal (Hidalgo, et al 2007; Saelinger y Lewbart 2006; Pfleger,. et al, 2003; Warwick, et al 2001; Woodward et al, 1997;
Mermin et al. 2004).
Los datos sugieren que el agua, junto con el sedimento, es una fuente de transmisión
importante para los ejemplares que se encuentran alojados en cada estanque; a
diferencia de Mitchell y Shane (2000), quienes no obtuvieron resultados en las muestras
de agua procesadas, en su trabajo de investigación, al igual que en este lograron aislar
el microorganismo en la arena de los estanques contaminada con heces de los animales,
la cual según los resultados obtenidos, también puede ser tomada como una muestra
apropiada para el aislamiento de la bacteria aunque debe estar acompañada de otra
metodología de aislamiento. En nuestra investigación se realizaba una excavación
aproximada de 15 cm de profundidad y a partir de allí se obtenía la muestra, lográndose
un porcentaje de recuperación de 12,5% en Testudinea y 8% en Crocodylia aunque se
debe aclarar que el lugar de elección para la toma de la muestra era aquel contaminado
con excremento del animal en los estanques de Testudinea puesto que en ninguno de
los 3 muestreos realizados se encontró materia fecal sobre la arena de los encierros en
Crocodylia. Algunos reportes soportan la metodología empleada en este estudio; han
establecido que a profundidades de 5 – 50 cm hay una mayor supervivencia de
Salmonella sp. en la arena en comparación con la superficie (Platz, 1980; Purvis, et al, 2002), a
pesar de ser un ambiente más inestable expuesto a temperaturas extremas (Mitscherlich y
Marth. 1984; Bicudo y Goyal, 2003), desecación (Purvis, et al, 2002; Zibilske y Weaver, 1978) y rayos Ultra Violeta
(Schlundt, 1984). Aunque se expone que la persistencia de Salmonella sp. en la profundidad
puede verse afectada por el grado de infiltración de la columna de arena, lo cual a su
vez depende de las propiedades físico químicas del suelo tal como la textura, porcentaje
de arena, limo y arcilla que la compone, porcentaje de materia orgánica en la superficie,
pH, el movimiento y dirección del agua (Winfield y Groisman, 2003) .
73
Es claro que tanto para tortugas como para caimanes, la frecuencia de aislamiento de
Salmonella sp. en el ambiente de la Estación (19,2% n =10 en tortugas y 24 % n = 12 en
caimanes) indica la habilidad del microorganismo para sobrevivir fuera del hospedero, lo
cual favorece la contaminación de los otros animales que permanecen en contacto
constante con el estanque infectado (Winfield y Groisman, 2003); sin embargo, las propiedades
físico químicas del ambiente externo influyen fuertemente en la supervivencia de
Salmonella sp. y por consiguiente en el riesgo de infección asociado para los otros
ejemplares. Según Jensen et al (2006) es posible disminuir la carga bacteriana en el
suelo realizando tratamientos sobre la arena, como lo es el arado; sugirieron que el
hecho de recoger el excremento periódicamente podrá reducir la concentración del
microorganismo.
6.5.1. Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia

según grupos etáreos
En la figura Nº 20 se observa el porcentaje de aislamiento de Salmonella en cada uno de
los grupos, es notable que en caimanes adultos y juveniles el aislamiento de esta
bacteria en los estanques no varió de manera significativa puesto que se obtuvieron
porcentajes de 29% (n = 4) y 21% (n = 9) respectivamente. Estos resultados concuerdan
con los obtenidos por Geüe y Löschner (2002), donde la prevalencia de Salmonella sp.
fue calculada como 63,3% (12 de 19 muestras) en lagartos juveniles y 63,6% (14 de 22
muestras) en lagartos adultos aunque los resultados que obtuvieron en lagartos
neonatos difieren los obtenidos en este estudio ya que en este grupo encontraron el
menor porcentaje de prevalencia de Salmonella sp. (17,4%) a diferencia del 50%de
presentación de la bacteria en este experimento.
Figura Nº 20.
74
El hecho de que en caimanes neonatos se halla encontrado el mayor porcentaje de
aislamiento permite el planteamiento de varias hipótesis teniendo conocimiento de la
posible transmisión vertical del microorganismo que ha sido evaluada en varios estudios
reportados previamente. En esta instancia es posible citar a Kourany y Telford (1982),
quienes evaluaron la presencia de Salmonella sp. en oviducto y huevos a partir de
lagartos hembras, encontrando Salmonella rubislaw y S. sandiego en todas las muestras
a pesar de que los animales procedían de diferentes sitios; ellos plantearon que en
animales saludables la enterobacteria permanece en el tracto gastrointestinal pero bajo
condiciones adversas como estrés y/o escases de alimento atraviesa la barrera linfoide y
coloniza el contenido interno de los huevos y el oviducto. Por el hecho de haber aislado
los mismos serotipos en muestras de diferente orígen, sugirieron que la bacteria estaba
presente en oviducto y que los huevos son infectados en estadíos tempranos de
formación en el mismo. Por otra parte, también existen reportes en que los caimanes
neonatos pueden adquirir Salmonella sp. cuando se encuentran en estadío de huevo y
este se encuentra enterrado en arena o suelo húmedo contaminado con la bacteria o
también puede contaminarse con el microorganismo durante el pasaje a través de la
cloaca. Se ha reportado que Salmonella sp. está en capacidad de contaminar el
contenido interno de los huevos dentro de una hora post exposición (Austin y Wilkins, 1998).
Como medida de prevención, Mitchell and Shane (2001) plantean que el uso de
oxitetraciclina y cloranfenicol puede eliminar la Salmonella en huevos eclosionados antes
de 24 horas por metodología de inmersión; en huevos con 48 horas después de la
oviposición ya no surge ningún efecto el empleo de los antibióticos (Siebeling et al, 1975) .
6.6. Serotipificación
De los 31 aislamientos identificados mediante método de CrystalBD® como Salmonella sp.

29 se lograron clasificar con los antisueros comerciales DIFCO ® empleados,
identificando 6 serogrupos prevalentes en la Estación. En la figura Nº 21 se observa que
el 40% de las cepas de Salmonella sp. halladas en la Estación pertenecen al serogrupo
C2; mientras que la prevalencia de bacterias clasificadas como pertenecientes al Grupo
B y Grupo C1 fue la misma, obteniendose un porcentaje de 20% para cada caso. En esta
instancia, se debe mencionar que hubo correlación entre las cepas de Salmonella
cholerae suis identificadas por el sistema BBL crystal y la serotipificación ya que las
cepas “sospechosas” son pertenecientes al serogrupo C1 donde se encuentra incluida S.
cholerae suis según el esquema de Kauffmann White (Anexo Nº 4).
El 20% restante de las cepas pertenecen a serotipos incluidos en los Grupos que abarca
el antisuero polivalente B (14%), Grupo D1 y serogrupos pertenecientes al Polivalente C.
75
Figura Nº 21.
Los serogrupos de Salmonella sp. que se han identificado en la E.B.T.R.F. mediante

antígeno somático han sido frecuentemente reportados en reptiles; teniendo en cuenta
que el grupo C2 fue el de mayor ocurrencia, según Grimont y Weill (2007) y Popoff y Le
Minor (1992); en este se encuentran incluidas serovariedades como S. newport y S.
muenchen; las cuales son agente causal de salmonelosis en humanos, reptiles y
caprinos entre otras especies (Passman, et al 2002; Simmons, 2002). Adicionalmente, los antisueros
polivalentes B y C, incluyen serovariedades de Salmonella sp. que han sido aisladas
constantemente a partir de muestras de reptiles; entre estas se encuentran S.
oranienburg, S. berta, S. panama, S. rubislaw entre otras, muchas de las cuales se han
reportado como agentes causales de patologías gastrointestinales en los reptiles y
algunas veces asociadas a salmonelosis en humanos producida por contacto directo con
el animal asintomático (Kourany y Telford, 1982; Ebani, et al 2005; Geue y Löschner, 2002; Saelinger, et al; 2006).
S. cholerae suis nunca ha sido reportada para reptiles, por lo cual es necesario realizar
una investigación profunda en la E.B.T.R.F. que permita determinar la causa o el origen
del hallazgo de esta serovariedad “específica” de porcinos, teniendo en cuenta que este
tipo de alimento no es suministrado a los animales y que las personas que manejan los
ejemplares aseguran no estar en contacto con porcinos, es probable que los individuos
introducidos recientemente a la Estación, hayan traido consigo el microorganismo y que
éste se encuentre establecido en el hábitat.
El hecho de que en la Estación se encontraran cepas de Salmonella sp. incluidas en los

Grupos B (20%) y Grupo D1 (3 %) permite inferir en la posibilidad de encontrar
serovariedades con alto potencial de transmisión a los humanos puesto que en estos
serogrupos se encuentran incluidas cepas como Salmonella typhimurium y S. enterididis,
dos de los serovares más comunes en Estados Unidos, implicados en aproximadamente
76
el 50% de los casos de Salmonelosis en humanos (Mermin et al, 2004), lo cual permite plantear
que el personal de la Estación se encuentra en riesgo de contraer el microorganismo
debido a su comportamiento zoonótico. Cabe resaltar que sin una serotipificación
completa de todos los microorganismos recuperados en la Estación Roberto Franco, no
es pertinente asegurar que el personal que labora allí se encuentre en inminente riesgo
de contraer salmonelosis, antes se debe evaluar su estado inmunológico pues, de la
misma manera que en reptiles, si los humanos se encuentran inmunosuprimidos podrían
desarrollar un cuadro clínico severo.
Como método de prevención es necesario el seguimiento de las normas de

bioseguridad establecidas en la Estación para el manejo de las poblaciones allí
mantenidas.
6.7. Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
Los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad a antibióticos a partir de los

aislamientos obtenidos en la E.B.T.R.F. se encuentran consignados en las tablas Nº 5 y
Nº 6 donde se puede analizar el comportamiento de las cepas frente a los diferentes
antibióticos a los cuales se enfrentaron los aislamientos recuperados tanto a partir de
tortugas como de Crocodylia. Existen diferencias notables para cada una de las especies
puesto que las cepas aisladas de muestras provenientes de caimán son mucho mas
sensibles a los antimicrobianos que las de tortugas, donde varios de los aislamientos
eran resistentes a los antibióticos utilizados; por ejemplo, para cloranfenicol todas las
cepas provenientes de caimán fueron sensibles mientras que en tortugas 6 generaron
resistencia al antibiótico.

aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los
antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS EN TESTUDINES
Sensibles (n) Moderados (n) Resistentes(n)

Ampicilina 8 - 5
Cefoxitin 7 1 5
Cloranfenicol 7 - 6
Norfloxacina 13 -
Sulfatrimetoprim 8 - 6
Tetraciclina 1 10 2
77
Tabla Nº 5: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados
a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los antibióticos
utilizados mediante el método de Kirby – Bauer.
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS EN CROCODYLIA
Sensibles (n) Moderados (n) Resistentes(n)

Ampicilina 10 1 1
Cefoxitin 11 1 1
Cloranfenicol 13 - -
Norfloxacina 13 - -
Sulfatrimetoprim 11 2
Tetraciclina - 9 4
Simultáneamente se puede asegurar que el antibiótico de elección para emplear en la

estación Roberto Franco es Norfloxacina debido a que todas las cepas de Salmonella
enfrentadas a este antimicrobiano tienen un alto grado de sensibilidad, de igual manera,
se establece que Tetraciclina tiene un comportamiento de sensibilidad intermedia para
todos los aislamientos. Cloranfenicol es un antimicrobiano que tendría alto rendimiento
contra los microorganismos del género Salmonella aislados a partir de ejemplares de
caimán; sin embargo, es un antibiótico que tiene restricciones para ser suministrado por
generar alteraciones y degeneraciones a nivel de médula ósea (Ebani. et al. 2005)
Figura Nº 22.
La resistencia a antimicrobianos en aislamientos de Salmonella sp. a partir de muestras

de origen animal es un problema emergente; estas cepas pueden ser una fuente de
plásmidos de resistencia para otras bacterias y producir alteraciones en el tratamiento
antimicrobiano clave para combatir enfermedades en medicina humana y veterinaria (Ebani
et al 2001).
78
El porcentaje de sensibilidad, resistencia y sensibilidad moderada para todas las cepas
aisladas en las muestras de la E.B.T.R.F se observa en la figura Nº 22. Como ya se
habia mencionado, el 100% de las cepas fueron sensibles a la Norfloxacina; resultado
que se puede extrapolar para ser soportado por Mitchell et al (1999) quienes obtuvieron
100% (N = 20) de sensibilidad frente a cepas de Salmonella sp. aisladas a partir de
muestras de hisopados cloacales en tortugas a las cuales se les administró durante un
periodo de 14 días Enrofloxacina [10 mg/Kg] lapso en el cual se realizó un nuevo
aislamiento del microorganismo, obteniendo una totalidad de negativos a la bacteria.
Norfloxacina y Enrofloxacina son antibióticos pertenecientes a la familia de
Fluoroquinolonas que tienen actividad bactericida, propiedad que es indispensable en un
antibiótico ideal (Gentilini, 2007)
De igual forma, en la figura Nº 22 es posible observar que en general todos los

antibióticos empleados en los antibiogramas tienen un buen porcentaje de efectividad a
excepción de tetraciclina, antibiótico que para la mayoría de aislamientos producen
grados de sensibilidad intermedia a diferencia de varios reportes donde las cepas
exhiben un alto porcentaje de resistencia a este antimicrobiano (Corrente, et al, 2004; Mitchell y
Shane, 2001; CDC,1999); adicionalmente se debe aclarar que la elección de los antibióticos a
utilizar en este ensayo se basó en los resultados obtenidos en antibiogramas realizados
a distintos ejemplares de reptiles con patologías asociadas a algunas bacterias
diferentes a Salmonella sp.; casos que eran remitidos al laboratorio de Microbiología de
la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia en la Universidad Nacional de Colombia,
los datos se colectaron mediante un estudio retrospectivo realizado a los archivos de
resultados obtenidos durante el año 2003 a 2007.
Es necesario tener presente que cuando el tratamiento antibiótico es incapaz de eliminar

las bacterias del intestino de los reptiles y en cambio promueve la persistencia de cepas
resistentes a antibióticos, el tratamiento de los portadores del Salmonella sp. debe
evitarse y se recomendarían las buenas prácticas de higiene a los propietarios del reptil
o al personal que labora en el centro de recuperación para minimizar el riesgo de
infección (Bradley et al 1998). Adicionalmente no se puede olvidar que el uso de antibióticos de
amplio espectro como las quinolonas (Norfloxacina) que mostraron un 100% de
efectividad para combatir las cepas aisladas en la estación (Figura 22), son ampliamente
utilizados en medicina herpetológica y pueden ser causa de alteración momentánea
grave de la flora tan rica de Gram Negativos y Gram Positivos que se encuentra en el
tracto gastrointestinal de estas especies. Existen datos bibliográficos que demuestran
79
una cierta tendencia a la anorexia o a alteraciones digestivas en reptiles herbívoros tras
terapias prolongadas de antibióticos (Jacobson, 1980;1999; Kaufman, 1998)
6.8. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en los

estanques de la Estación
Aunque la identificación de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. no era un
objetivo propuesto para el trabajo, el medio de cultivo utilizado CHROMagar
OrientaciónBD®, permitió la identificación de los otros microorganismos presentes en cada
una de las muestras trabajadas de acuerdo a las reacciones de cada bacteria con los
sustratos cromógenos presentes en el medio (Anexo Nº 2).
Figura Nº 23.
De acuerdo con la Figura Nº 23, se puede establecer que en este estudio hay un
predominio de flora Gram negativa, lo que concuerda con lo reportado por Sunderland y
Veal (2001), sin embargo, Enterococcus sp. microorganismo Gram Positivo, fue el que
estuvo en un mayor porcentaje (33%) en todas las muestras trabajadas sin importar el
origen de las mismas.
Por su parte; en las figura Nº 24 y 25 es posible observar el porcentaje de presentación

de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. en las muestras de agua y
sedimento y arena junto con materia fecal respectivamente en los estanques de
Testudines muestreados y se puede notar que en los dos tipos de muestra evaluados
hubo una mayor prevalencia de microorganismos del género Enterococcus sp;
Eschericha coli y Klebsiella sp. Sin embargo se observa que en las muestras de agua y
sedimento se recuperaron más microorganismos que en las de arena y materia fecal
80
aunque los porcentajes de presentación no variaron significativamente entre las
muestras.
Figura Nº 24.
Figura 25.
Adicionalmente, se tuvieron en cuenta los microorganismos encontrados a partir de

muestras de hisopados cloacales de animales de Orden Testudinata, datos que se
pueden observar en la figura Nº 26; donde a su vez puede establecerse que la
recuperación de microorganismos fue menor para este tipo de muestra.
81
Figura 26.
Para los ejemplares de Crocodylus intermedius la prevalencia de los microorganismos

diferentes a Salmonella sp. fue muy similar a los aislamientos obtenidos en tortugas; sin
embargo, tal como se puede observar en la figura Nº 27 existe una marcada variación en
los porcentajes de microorganismos aislados a partir de agua y sedimento con respecto
al comportamiento presentado en las muestras de tortugas evaluadas previamente y los
resultados obtenidos en arena y materia fecal (Figura Nº 28) e hisopado cloacal (Figura
Nº 29) en ejemplares de caimán. Es así como en las muestras de agua y sedimento
obtenidas a partir de estanques de caimán, hubo una mayor prevalencia de
microorganismos del género Klebsiella sp. (31%) y contrario a lo encontrado en el resto
de las muestras se obtuvo 23% de aislamientos de Enterococcus sp.
Figura Nº 27.
Proc. Alligator Production Conference, La composición y diversidad de especies de

enterococos en las heces de animales silvestres parece depender sobre todo de la
82
alimentación y condiciones del ambiente en el que se desarrolla el ciclo vital del
hospedador. Así, los animales en cautiverio o de hábitats periurbanos o que tienen una
dieta oportunista son los que presentan una mayor diversidad de enterococcos, lo cual
explica los hallazgos del presente experimento. Por el contrario, cuando existe una
especialización en un alimento y/o habitan en ambientes con menor influencia de la
actividad humana se encuentra una menor diversidad del microorganismo (Ballesteros, 2003).
Figura Nº 28.
Figura 29.
De igual forma, en un estudio realizado por Mundt (1963), se obtuvo un 85,7% de

recuperación de Enterococcus sp. a partir de muestras fecales de reptiles, el alto
porcentaje de recuperación de estos microorganismos es interesante debido a la
marcada diferencia en temperatura corporal entre reptiles y mamíferos, y en
consecuencia se puede decir que las bacterias aisladas a pesar de ser mesófilas;
83
pueden tener una adaptación a la temperatura llegando a desarrollarse a temperaturas
inferiores de lo esperado (Boyer, 1992) Se han aislado también, Citrobacter, Klebsiella, y
Proteus, las cuales aunque son flora normal, bajo ciertas condiciones pueden llegar a
producir septicemias, enterocolitis y diarreas; Escherichia coli puede producir dolor
abdominal, diarrea, vómito y fiebre; Klebsiella produce enfermedades respiratorias y
Citrobacter alteraciones a nivel del colon (Martínez, et al, 2003).
Es necesario conocer la particular población saprofita en los reptiles debido a que
cualquier causa que altere este equilibrio puede desencadenar diarrea u otras patologías
digestivas (Martínez, et al, 2003). Adicionalmente, hasta el momento se han realizado análisis
como este en otras especies de reptiles, como serpientes y tortugas; sin embargo, la
información que se ofrece en este trabajo es la primera descripción microbiológica
realizada hasta la fecha en las especies de Crocodylus intermedius manejadas en
Colombia.
La población bacteriana estudiada refleja, por tanto, la normalidad de la flora digestiva en

este grupo de reptiles y no pueden establecerse conclusiones evolutivas o adaptativas
sin la realización de estudios adicionales. Por lo tanto, el conocimiento de la
microbiología cloacal de estas especies es fundamental para diagnosticar desordenes de
la flora digestiva así como prevenir procesos secundarios a estrés e inmunosupresión,
todo ello dirigido a optimizar programas de conservación como los implementados a
diario en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco.
84
7. CONCLUSIONES
 Se logró aislar e identificar mediante análisis microbiológicos la presencia de

enterobacterias del género Salmonella en ejemplares de tortugas y Crocodylus
intermedius mantenidos en cautiverio en la Estación de Biología Tropical Roberto
en la Ciudad de Villavicencio; estableciendo su ocurrencia en el 52% de los
estanques
 Se comprueba que ninguna metodología para el aislamiento de Salmonella es
por sí sola suficientemente efectiva para la recuperación del microorganismo; se
debe emplear más de un tipo de muestra para obtener mayor porcentaje de
resultados positivos.
 Los ejemplares de la E.B.T.R.F son portadores asintomáticos de Salmonella sp.
, sin embargo, se deben implementar medidas de prevención que minimicen su
potencial como patógeno oportunista, desencadenando cuadros clínicos de
salmonelosis.
 La Norfloxacina es el antibiótico ideal para tratar los ejemplares de la Estación
Roberto Franco que puedan presentar sintomatología asociada a salmonelosis,
aunque su administración debe ser cuidadosa con el fin de evitar alteraciones en
la flora digestiva natural de los reptiles.
 Las muestras obtenidas a partir del hábitat (agua, lodos y sedimento)
proporcionan mayor sensibilidad en la búsqueda de Salmonella sp que el
hisopado cloacal.
 La mayor presencia de Salmonella sp. se obtuvo a partir de la población neonatal
de caimán, aspecto que puede deberse a una transmisión vertical.
 Teniendo en cuenta la presencia de aislamientos de Salmonella sp.
pertenecientes a los serogrupos B, C1, C2, D1 y otros atípicos, se hace
necesario implementar medidas de bioseguridad que disminuyan su riesgo
zoonótico.
 Este documento es el primer reporte sobre microbiología entérica en ejemplares
de Crocodylus intermedius en Colombia, siendo un aporte básico para los
programas de conservación, reproducción y repoblamiento de la especie.
85
8. RECOMENDACIONES
 Realizar muchas más investigaciones acerca de la microbiología cloacal de

animales de la Clase Reptilia puesto que muchos se encuentran en peligro de
extinción y estos microorganismos bajo ciertas condiciones pueden llegar a
causar serios cuadros patológicos e incluso la muerte de los ejemplares
 Se recomienda realizar los aislamientos de Salmonella en reptiles a partir de

muestras de origen ambiental puesto que se obtiene mayor porcentaje de
aislamientos en relación a hisopado cloacal y no se genera estrés en los
animales
 Se plantea el uso de quinolonas como terapia antimicrobiana al encontrarse

100% de senbilidad a norfloxacina
 Los medios de cultivo CHROMagar Orientación BD® y CHROMagar

SalmonellaBD® son altamente selectivos y diferenciales para el aislamiento e
identificación de los microorganismos.
 Se recomienda la implementación de medidas de bioseguridad en la estación

que disminuyan los factores de riesgo zoonótico; incluso recoger periódicamente
el excremento de los animales y realizar prácticas de arado en los encierros
puede reducir la concentración del microorganismo.
86
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WINKLE, S. y RHODE, R. 1965. Salmonelosis in imported tortoises. Desinnfektion und

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WOODWARD, D.L; KHAKHRIA, R y JHONSON, W.M. 1997. Human salmonellosis

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ZIBILSKE, L. M., y WEAVER, R. W. 1978. Effect of environmental factors on survival of

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ZWART, P; POELMA, F.G y STRINK, W.J. 1970. The distribution of various types of
Salmonellae and Arizonas in reptiles. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr
Hygiene. 213: 201-212.
105
10. ANEXOS
ANEXO Nº 1: Plano de la E.B.T.R.F
106
ANEXO Nº 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar Orientación
MICROORGANISMO APARIENCIA DE LAS PRUEBAS

COLONIAS CONFIRMATORIAS
E. coli Colonias rosadas –
transparentes de tamaño medio
con o sin halos alrededor
Grupo KES Colonias de tamaño medio y BBL Crystal E/NF ,
pigmento azul oscuro Indol
Grupo PMP Colonias Beige o crema BBL Crystal E/NF ,

redondeadas por halos marrón Indol
Enterococcus sp. Colonias verde azul de tamaño

pequeño
S. agalactiae Colonias pequeñas , con
pigmento vede azul claro,
S. saprophyticus Colonias pequeñas color Disco de 5 µg
purpura opacas con o sin halos novobiocina
Otros (Incluyendo Colonias sin pigmento, color Identificación
Salmonella sp.) crema bioquímica y
serologíca.
107
ANEXO Nº 3. Sistema de Identificación BBL Crystal para Entericos/NoFermentadores.
Anexo 3.1. Procedimiento para la identificación de los microorganismos por sistema BBL
Crystal.
A. Sacar las tapas de la bolsa

B. Tomar un tubo de inoculo y etiquetarlo con el número de muestra. Asépticamente
con un asa estéril tomar una colonia grande bien aislada o 4 – 5 colonias
pequeñas a partir de una placa de agar Tripticasa soya con 5% de sangre de
cordero. Suspender las colonias en un tubo de fluido de inoculo BBL Crystal,
taparlo y agitarlo en un vortex durante 10 – 15 segundos. Posteriormente, marcar
la base con el número de muestra y verter todo el contenido del tubo fluido en el
área objetivo de la base
C. Sostener la base con las dos manos y mover el inoculo de un lado a otro a lo
largo de las pistas hasta que se hallan llenado todos los pocillos. Descartar el
sobrenadante.
D. Alinear la tapa de forma que el extremo marcado de la tapa esté en la parte
superior del objetivo de la base.
E. Apretar hasta percibir una ligera resistencia. Colocar el pulgar en el borde de la
tapa hacia la parte media del panel y hacer presión simultáneamente hasta que
la tapa encaje.
F. Colocar los paneles en las bandejas y llevar a incubación por 18 – 20 horas.
108
Anexo 3.2. Ficha técnica de reacciones de color para Lectura de Resultados.
Anexo 3.3. Calculo del Número de Perfil
109
ANEXO Nº 4. Esquema de Kauffmann - White
Simplificación del Esquema de Kauffmann – White para identificación de antígenos

somáticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp.
ORGANISMO GRUPO ANTÍGENO ANTIGENO FLAGELAR

SOMÁTICO FASE 1 FASE 2
S. enteritidis
bioser Paratyphi A A 1,2,12 a -
ser Paratyphi B B 1,3,5,12 b 1,2
variante Odense B 1,4,12 b 1,2
bioser Java B 1,4,5,12 b [1,2]
ser Stanley B 4,5,12 d 1,2
ser Schwarzengrund B 1,4,12,27 d 1,7
ser Saintpaul B 1,4, [5],12 e, h 1,2
ser Reading B 4,5,12 e, h 1,5
ser Chester B 4,5,12 e, h e, n, x
ser Sandiego * B 4,5,12 e, h e, n, z
ser Derby B 1,4,5,12 f, g [1,2]
ser California B 4,5,12 m, t -
ser Typhimurium B 1,4,5,12 i 1,2
variante B 1,4,12 i 1,2
Copenhagen B 1,4,12,27 i,v 1,7
ser Bredaney B [1],4,[5],12 r 1,2
ser Heilderberg
C1 6,7 c 1,5
S. choleraesuis C1 6,7 [c] 1,5
bioser Kunzendorf
S. enteritidis C1 6,7 e, h e, n, z15

ser Braenderup C1 6,7 g, m, s -
ser Montevideo C1 6,7 m, t -
ser Oranienburg C1 6,7 [14] k 1,5
ser Thompson C1 6,7 [14] r 1,5
ser Infantis C1 6,7 [14] y 1,5
ser Othmarseenn * C1 6,7 z29 -
ser Tennessee C2 6,8 d 1,2
ser Muenchen C2 6,8 d 1,5
ser Manhattan C2 6,8 e, h 1,2
ser Newport * C2 6,8 k 1,5
ser Blockley C2 6,8 l, v 1,2
ser Litchfield C2 6,8 z4, z32 -
ser Tallahassee C3 (8), 20 i Z6
ser Kentucky D1 1,9,12 a 1,5
bioser Miami
S. typhi D1 9,12, Vi d
110
Cont. Simplificación del Esquema de Kauffmann – White para identificación de antígenos
somáticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp
ORGANISMO GRUPO ANTÍGENO ANTÍGENO FLAGELAR

SOMÁTICO FASE 1 FASE 2
S. enteritidis
ser Berta D1 9,12 f, g, t -
ser Enteritidis * D1 1,9,12 g, m -
ser Dublin D1 1,9,12 g, p -
ser Panama D1 1,9,12 l,v 1,5
ser Javiana D1 1,9,12 l, z28 1,5
bioser Pullorum D1 9,12 - -
ser Anatum E1 3,10 e, h 1,6
ser Meleagridis E1 3,10 e, h l, w
ser Give E1 3,10 l,v 1,7
ser Newington E2 3,15 e, h 1,6
ser Illinois E3 (3), (15), 34 z10 1,5
ser Senftenberg E4 1,3,19 g, s, t -
ser Simsbury E4 1,3,19 z27 -
ser Rubislaw F 11 [d], r [d], e, n, x
ser Poona G1 [1], 13,22, [36] z 1,6
ser Worthington G2 1,13,23 z l, w
ser Cubana G2 1,13,23 z29 -
ser Florida H 1,6,14,25 d 1,7
ser Madelia H 1,6,14,25 y 1,7
ser Nottingham * I 16 d e ,n, z15
ser Cerro K 18 z4, z23 [z45]
ser Siegburg K 6,14,18 z4, z23 [1,5]
ser Minnesota L 21 b e, n, x
ser Urbana N 30 b e, n, x
Nota: La primera columna indica el nombre de la serovariedad, en la segunda columna indica el serogrupo del
Ag O, en la tercera, están consignados los Ags somáticos (O). Los números indican el o los factores del Ag O y
se escriben separados por una coma. En las últimas columnas, se observan los Ags flagelares (H),
estableciendo los factores pertenecientes a la fase 1 (motil) denominados con letras minúsculas y en la fase 2
(no motil) se usan números. El signo (-) indica que la fase está ausente. Los factores entre paréntesis
aglutinan débilmente. Los factores somáticos determinados por conversión fágica están subrayados y los que
están entre corchetes pueden estar presentes o ausentes.
* Serovariedades encontradas en reptiles
Fuente: Laboratorios DIFCO®
111
ANEXO Nº 5: Interpretación de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
TABLA DE INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Metodo de Difusión en Agar (Normas CLSI – NCCLS Año 2005)
AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
(mm) (mm) (mm)
AMICACINA 30µg 14 15 - 16 17
AMOXICILINA/CLAVULANICO
Estafilococos – Haemofilus 20/10 µg 19 - 20
Enterobacterias 20/10 µg 13 14-17 18
AMPICILINA
Entericos Gram Negativos 10 µg 13 14 -16 17
Estafilococos 10 µg 28 29
Enterococos 10 µg 16 17
Haemofilus sp. 10 µg 18 19-21 22
AMPICILINA/SULBACTAM
Entericos Gram Negativos y 10 µg 11 12-14 15
Estafilococos
Haemofilus sp. 10 µg 19 20
CARBENICILINA
P. aeruginosa 100µg 13 14-16 17
Enterobacterias y Acinetobacter 100µg 19 20-22 23
CEFACLOR 14 15-17 18
Haemofilus 30µg 16 17-19 20
CEFALOTINA 30µg 14 15-17 18
CEFAMANDOLE 30µg 14 15-17 18
CEFAZOLINA 30µg 14 15-17 18
CEFEPIME 30µg 14 15-17 18
N. gonorrea 30µg 31
Grupo Viridans 30µg 21 22-23 24
CEFETAMET 10µg 18
N. gonorrea 10µg 14 15-17 29
CEFIXIMA 5µg 19
N. gonorrea 5µg 15 16-18 31
CEFMETAZOLE 30µg 12 13-15 16
N. gonorrea 30µg 27 28-32 33
CEFONICID 30µg 14 15-17 18
CEFOPERAZONA 75 µg 15 16-20 21
CEFOTAXIMA 30µg 14 15-22 23
N. gonorrea 30µg 31
Estreptococos Beta Hemoliticos 30µg 24
Grupo Viridans 30µg 25 26-27 28
112
TABLA DE INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Metodo de Difusión en Agar (Normas CLSI – NCCLS Año 2005)
AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
(mm) (mm) (mm)
CEFOXITINA 30µg 14 15 – 17 18
N. gonorrea 30µg 23 24-27 28
E. aureus y lugdunensis 30µg 19 20
E. coagulasa negativo excepto 30µg 24 25
lugdunensis
CIPROFLOXACINA 5µg 21
N. gonorrea 5µg 15 16-20 41
Haemofilus 5 µg 27 28-40 21
CLORAMFENICOL 30µg 12 13-17 18
E.pneumoniae 30µg 20 21
DOXICICLINA 30µg 12 13-15 16
ENROFLOXACINA 5µg 15 16-20 21
ERITROMICINA 15µg 13 14-22 23
E.pneumoniae 15µg 15 16-20 21
ESTREPTOMICINA
Enterococos (alta resistencia) 300µg 6 7-9 10
Otros microorganismos 10µg 11 12-14 15
FLORFENICOL 30µg 16 17-20 21
GENTAMICINA
Enterococos (alta resistencia) 120µg 6 7-9 10
Otros microorganismos 10µg 12 13-14 15
KANAMICINA 30µg 14 14-17 18
NALIDIXICO ACIDO 30µg 13 14-18 19
NITROFURANTOINA 10µg 14 15-16 17
NORFLOXACINA 10µg 12 13-16 17
PENICILINA G
Estafilococos 29
Enterococos 10U 28 15
Estreptococos (- E. pneumoniae) 10U 26 27-46 24
N. gonorrea 10U 14 47
RIFAMPICINA
Estafilococos – Enterococos y
E . pneumoniae 5µg 16 17-18 19
TETRACICLINA
Estafilococos 30µg 14 15-18 19
Estreptococos 30µg 18 19-22 23
SULFATRIMETOPRIM 1,25/23,75 10 11-15 16
µg
VANCOMICINA 30µg 14 15-16 17
113
ANEXO Nº 6. Muestras positivas para Salmonella sp. en cada estanque según cada
muestreo.
 Muestreo Nº 1 (N = 129)
MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE

TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N = 76 )
ORIGEN DE LA MUESTRA
Nº ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL / HISOPADO
SEDIMENTO ARENA CLOACAL
2 X
5 X
6 X X
7 X
14 x
21 X
22 X
25 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 9 (12,3 %)

Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 53)
30 X
31 X
34 X
38 X
43 X
45 X
46 X
47 X
48 X
51 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 10 (18,8%)
Caiman Adulto: 2 / Caiman Neonato: 6 / Caiman Juvenil: 2

TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N = 60)
11 X X
12 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (5%)
114
Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 34)
42 X
44 X
49 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (8,8 %)
Caiman Juvenil: 1 Caiman Neonato: 2

TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N =48)
Nº ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL/ HISOPADO
8 X
24 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 2 (4,2%)

Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N= 28)
33 X
36 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 2 (7.14 %)
Caiman Adulto: 2
115

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AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y

TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA

TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS –

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META

DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y

TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA

TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS –

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META

DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS

Microbiólogo Agrícola y Veterinario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946

DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y

TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA

TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS –

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META

DIANA ALEXANDRA PACHON CUBILLOS

DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y

TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA

TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS –

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META

DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS

A mi madre por ser el mayor ejemplo de fortaleza, constancia, dedicación y superación;

Al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la

Agradecimiento especial a Becton Dickinson LTDA por la dotación de medios de cultivo,

A todo el personal de la Estación de Biología Tropical Roberto Franco por toda su

Tabla Nº 1. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de

Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de

Tabla Nº 3: Especies de Crocodylia y Testudines muestreadas y número de cepas

Tabla Nº 4: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp.

Tabla Nº 5: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp.

Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia 46

Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudinos 46

Figura Nº 3. Caimán del Orinoco o Caimán Llanero (C. intermedius) 48

Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la

Figura Nº 5. Toma de muestras: hisopados cloacales en Testudinos. 56

Figura Nº 6. Muestreo de ejemplares neonatos de Crocodylus intermedius

Figura Nº 7. Muestreo de agua y sedimento de los estanques. 58

Figura Nº 7A y 7B. Muestreo en los estanques de Crocodylia neonatos

Figura Nº 7C Muestreo en estanques de Crocodylia Adultos y Juveniles 58

Figura Nº 8. Muestreo de arena y materia fecal encontrada en los encierros

Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios

Figura Nº 9 A. CRHOMagar Orientación 60

Figura Nº 9 B. Agar MacConkey 60

Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género

Figura Nº 10 A. CHROMagar Salmonella. 61

Figura Nº 10 B. Agar Hektoen Entérico. 61

Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en

Figura Nº 11 A. Staphylococcus saprophyticus. 62

Figura Nº 12. Lectura de pruebas de identificación Crystal® para

Figura Nº 12 A. Identificación a partir de agua y sedimento del estanque

Figura Nº 12 B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimán

Figura Nº 13. Esquema de una lámina hemoclasificadora utilizada para

Figura Nº 14. Antibiograma 65

Figura Nº 15. Porcentaje de presentación de Salmonella sp. en los

Figura Nº 16. Estanques de Tortugas positivos y negativos

Figura Nº 17. Estanques de C. intermedius positivos y negativos a

Figura Nº 18. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen

Figura Nº 19. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen de la muestra

Figura Nº 20. Porcentaje de aislamientos positivos a Salmonella sp.

Figura Nº 21. Serotipificación de Salmonella sp. aislada en la E.B.T.R.F 76