·药物研发·

紫苏方胶囊微生物限度检查方法的研究
张媛媛 1,2* 曹苋恺 2 李晓波 1**
(1. 上海交通大学药学院 上海 200240 ；2. 上海绿谷生命园医药有限公司 上海 201707）

摘 要 目的 ：建立中药抗菌药物紫苏方胶囊微生物限度检查方法并对其进行验证。方法 ：参照 2015 年版《中国

药典》四部通则，利用卵磷脂、L 组氨酸、聚山梨酯 80 的中和作用，采用薄膜过滤法和平皿法测定紫苏方胶囊对金黄
色葡萄球菌等 5 种试验菌种的回收率，并对其进行了控制菌适用性试验。结果 ：5 种试验菌回收率均在 0.5 ～ 2.0 范围，
控制菌可检出。结论 ：本试验所建立方法可用于紫苏方胶囊的微生物限度检查。
关键词 紫苏方 验证 微生物限度试验
中图分类号 ：R286; R927.11 文献标志码 ：A 文章编号 ：1006-1533(2018)13-0080-04

Verification of microbial limit test method for Zisu Fang

ZHANG Yuanyuan1,2*, CAO Xiankai2, LI Xiaobo1**
(1. Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
2. Shanghai Lvgushengmingyuan Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201707, China)

ABSTRACT Objective: To establish and verify the microbial limit test method for the traditional Chinese medicine of
Zisu Fang capsule. Methods: According to the fourth part of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia principles, the recovery
rates of Zisu Fang capsule against 5 kinds of test microorganisms including Staphylococcus aureus were measured by membrane
filtration and Petri dish methods and using the neutralization of lecithin, L-histidine and polysorbate 80, and the applicability test
of E.coli as the control bacterium was also performed. Results: The recovery rates of the 5 kinds of experimental microorganisms
were in the range of 0.5~2, and the control bacterium could be detected. Conclusion: The methods established in this experiment
can be used for the microbial limit test of Zisu Fang capsule.
KEY WORDS Zisu Fang; verification; microbial limit test

紫苏方为王永炎院士的临床经验方并由上海绿谷生 菌成分均可影响微生物限度检查的准确性 [3]。所以，对

命园医药有限公司开发为胶囊剂。该方具有清热燥湿、 于此类药物，单用稀释和加中和剂的方法很难使试验菌
化痰止咳的功效，用于治疗感冒后余邪未净，低热咳嗽， （金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、白色
周身不适，食欲不振。该方由紫苏子、紫苏梗、丹参、黄芩、 假丝酵母、黑曲霉）的比值都达到药典标准。为保障患
苦参五味药组成，主要药效成分为丹参酮Ⅱ A、丹酚酸 B、 者的用药安全，确立可靠的微生物限度检验方法，本试
迷迭香酸、黄芩苷、苦参碱和氧化苦参碱。药效研究已 验参照 2015 年版《中国药典》四部通则 1105、1106 非
发现该方具有较强的抗菌活性，其提取物对大肠埃希菌 无菌产品微生物限度检查微生物计数法、控制菌检查法，
和金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性显著，与头孢克洛联 对紫苏方胶囊微生物限度检查方法进行了摸索与验证 [4]，
用，能增强多种病原微生物对抗生素的敏感度 [1-2]。紫苏 利用卵磷脂、L- 组氨酸、聚山梨酯 80 的中和作用去除
方微生物限度检查包括需氧菌、霉菌和酵母，控制菌选 紫苏方胶囊的抑菌性，并采用薄膜过滤法中加入中和剂
取大肠埃希菌。中成药组方具有复杂性，任何成分的抑 的方法有效去除抑菌成分。
*
作者简介 ：张媛媛（1979—），女，高级工程师， 1 材料和方法
执业中药师，硕士研究生在读。从事中药质量标准研究、
中药现代化研究。E-mail: zhangyuanyuan1227@163.com 1.1 药品与试剂
**
通信作者 ：李晓波（1963—），女，教授，博士生 紫 苏 方 胶 囊（ 规 格 0.3 g， 批 号 161102、161103、
导师。主要从事天然药物研究。E-mail: xbli@sjtu.edu.cn

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161105，上海绿谷生命园医药有限公司）。 使菌落数不大于 100 cfu/ml。
pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液（批号 160829，上海
1.4.2 中和剂的制备
中科昆虫生物技术开发有限公司）；大豆卵磷脂、L- 组
氨酸、聚山梨酯 80（批号分别为 20160701、20160901、 取 30 g 胰酪大豆胨液体培养基，3 g 大豆卵磷脂，1
20161201，润捷化学试剂有限公司）。 g L- 组氨酸，970 ml 纯化水加热溶解后，加入 30 g 聚山
梨酯 80 混合均匀，121 ℃、15 min 灭菌后备用（临用新配）。
1.2 培养基与菌种
1.4.3 供试液的制备
胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体
培养基（TSB）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、沙氏 取紫苏方胶囊 10 g，加中和剂 90 ml，于不超过 45
葡萄糖液体培养基（SDB）、麦康凯琼脂培养基、麦康 ℃的水浴中放置，混匀，作为 1 ∶ 10 供试液。用中和剂
凯液体培养基（批号分别为 151130、151223、150821、 继续稀释，制备 1 ∶ 100 供试液。
150210、151217、151109，上海中科昆虫生物技术开发
1.4.4 计算公式及接受标准
有限公司）。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, CMCC(B) 试验组比值 =（试验组菌落数 - 供试品对照组菌落
26003)、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, 数）/ 菌液对照组菌落数。
CMCC(B)10104）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis, 中和剂比值 =（中和剂对照组菌落数 - 供试品对照
CMCC(B)-63501)、白色假丝酵母（Candida albicans, 组菌落数）/ 菌液对照组菌落数。
C M C C ( F ) - 9 8 0 0 1 ） 、 黑 曲 霉 （ A s p e rg i l l u s n i g e r, 所得比值均应在 0.5 ～ 2.0 范围内。
CMCC(F)-98003）和大肠埃希菌（Escherichia coli,
1.4.5 需氧菌总数计数方法验证
CMCC(B)44102）均来自于中国食品药品检定研究院。
1）需氧菌计数方法的确定（预试验） 以金黄色葡
1.3 实验仪器
萄球菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌为试验菌。分别
DHG-BH9243Ш 电 热 恒 温 鼓 风 干 燥 箱、SPX- 采用 a，b，c 3 种方法对供试品进行处理。①方法 a ：供
150BS- Ⅱ生化培养箱、MJ-160BS- Ⅱ霉菌培养箱（上海 试品采用 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液 1 000 ml（最后冲
新苗医疗器械有限公司）；Testo 206-pH2 酸度计（上海 洗 100 ml 时加入菌悬液）；②方法 b ：供试品加入中和
佑科仪器仪表有限公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（国华 剂（30 g 胰酪大豆胨液体培养基，3 g 大豆卵磷脂，1 g
电气有限公司）；YP1002N 电子天平（上海精密科学仪 L- 组氨酸，15 g 聚山梨酯 80），pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓
器有限公司）；YXQ-LS-50S Ⅱ立式压力蒸汽灭菌器（上 冲液 600 ml（最后冲洗 100 ml 时加入菌悬液）；③方法 c：
海博讯实业有限公司医疗设备厂）；BSC-1000 Ⅱ A2 生 方法 b 中聚山梨酯 80 改为 30 g，于 45 ℃水浴保温，其
物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；YX940D 电动 余条件不变。
吸引器（上海医疗器械公司医用吸引器厂） 2）方法验证 分别取三批供试品按方法 c 进行处理，
采用薄膜过滤法进行检查。①试验组 ：取 1 ∶ 100 供试
1.4 实验方法
液 10 ml，按方法 c 操作，冲洗时加入 0.1 ml 菌液，滤干，
[4]
参照 2015 年版《中国药典》四部通则 对紫苏方 于 TSA 上培养 ；②供试品对照组 ：不加入菌液的供试液，
胶囊进行需氧菌总数、真菌总数、控制菌检查方法的确认， 测定供试品微生物数 ；③菌液对照组 ；取稀释液替代供
其中需氧菌总数采用薄膜过滤法，真菌总数及控制菌检 试液，按试验组操作加入试验菌液并进行回收试验 ；④
查采用平皿法。 中和剂对照组 ：用中和剂替代供试液，按试验组操作加
入试验菌液并进行回收试验 ；⑤阴性对照组 ：取中和剂
1.4.1 菌液的制备
10 ml，不加入菌液。
[4]
参照 2015 年版《中国药典》四部通则 1105 微生
1.4.6 真菌总数计数验证
物计数法项下方法制备。
对阳性菌菌液浓度进行稀释，浓度为 10-4 ～ 10-6， 取三批供试品采用平皿法进行真菌计数的方法学验

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证及菌落计数。①试验组 ：取制备好的供试液，加入试 2 结果
验菌液，取 1 ml 供试液等量分注 5 个无菌平皿，分别倾
2.1 需氧菌总数计数方法的预实验
注 15 ～ 20 ml 沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养 ；②供试品
对照组 ：取制备好的供试液，不加入菌液。测定供试品 三种预实验方法试验结果表明，方法 c 可用于需氧
微生物数 ；③菌液对照组 ：取稀释液替代供试液，按试 菌总数计数（表 1）。
验组操作加入试验菌液并进行回收试验 ；④中和剂对照
表1 需氧菌计数方法的预实验
组 ：用中和剂替代供试液，按试验组操作加入试验菌液
回收率（试验组比值）
并进行回收试验 ；⑤阴性对照组 ：平皿中加入 1 ml 中和 方法 金黄色葡 枯草芽胞 铜绿假单 备注
剂，培养。 萄球菌 杆菌 胞菌
a 0.6 0.2 0.5 供试品难溶解
1.4.7 控制菌验证试验
b 0.7 0.4 0.6 供试品较难溶解
以大肠埃希菌作为控制菌采用平皿法进行操作，。① c 0.8 0.9 0.7 供试品易溶解

试验组 ：取 1 ∶ 10 供试液 10 ml 置 100 ml TSB 中，混

2.2 需氧菌总数计数方法验证
匀，同时加入大肠埃希菌菌悬液 1 ml 混合均匀 ；②阴性
对照组 ：取 TSB 100 ml，不加入样品和菌悬液 ；③菌液 按照方法 c 对三批供试品进行验证实验，结果表明
组：取 TSB 100 ml 加入大肠埃希菌菌悬液 1 ml 混合均匀。 采用方法 c 可用于紫苏方需氧菌总数计数（表 2）。
均按药典方法培养，以接入试验组的大肠埃希菌被检出
为接受标准。

表2 需氧菌总数计数验证/cfu
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽胞杆菌 白色假丝酵母 黑曲霉
分组
1a) 2b) 3c) 1a) 2b) 3c) 1a) 2b) 3c) 1a) 2b) 3c) 1a) 2b) 3c)
试验组 77 62 17 101 56 72 32 26 29 65 59 67 41 42 38
供试品对照组 1 3 2 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1
菌液组 106 94 23 115 62 86 44 32 44 72 72 71 47 47 48
稀释液对照组 106 96 23 115 61 85 47 50 47 58 58 59 47 47 47
阴性对照组 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
试验组比值 0.7 0.6 0.7 0.9 0.9 0.8 0.7 0.7 0.6 0.9 0.8 0.9 0.9 0.8 0.8
中和剂比值 1 1 1 1 1 1 1.1 1 1.1 0.8 0.8 0.8 1 1.2 1
注 ：a) 供试品批号 161102 ；b) 供试品批号 161103 ；c) 供试品批号 161105

2.3 真菌总数验证试验 2.4 控制菌验证试验

采用平皿法对三批供试品进行真菌总数验证，结果 控制菌选用稀释 10-4 倍的大肠埃希菌，3 批供试品

表明，可用于紫苏方真菌总数计数（表 3）。 试验结果表明，适用性试验符合标准（表 4）。

表3 平皿法真菌总数计数/cfu 表4 控制菌大肠埃希菌实验
白色假丝酵母 黑曲霉菌 供试品批号
分组 分组
161102 161103 161105 161102 161103 161105 161102 161103 161105
试验组 68 94 73 44 60 52 试验组 检出 检出 检出
供试品对照组 1 17 9 1 17 9 阳性组 检出 检出 检出
菌液组 73 78 73 47 44 44 阴性组 未检出 未检出 未检出
稀释液对照组 71 77 73 44 44 44
阴性对照组 0 0 0 0 0 0 3 讨论
试验组比值 0.9 0.9 1 0.9 0.9 1
通过上述一系列试验，成功摸索出了适合于具有抑
中和剂比值 1 1 1 1 1 1

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菌作用的紫苏方胶囊的微生物限度控制方法，本次验证 [4] 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典 2015 版四部 [M].
试验中需要注意的两点 ：①中和剂一定要临用现配 ；② 北京 : 中国医药科技出版社 , 2015: 140-144.
[5] 黄诺嘉 . 浅谈中成药微生物限度检查法方法验证存在的几
铜绿假单胞菌的计数须在培养 24 h 内完成，而且试验中
点问题与思考 [C]// 全国药物质量分析学术研讨会 . 北京 :
贴膜时要用无菌棉花吸干滤膜水分，否则培养后菌落会
中国药学会药物分析杂志 , 2006.
连成片，无法计数，从而无法对回收率做出判断。
[6] 丁勃 , 徐晓洁 , 刘广桢 , 等 双滤膜过滤方法在药品微生物
微生物限度检查是判断药品受到微生物污染的程 限度检查中的应用研究 [J]. 药物分析杂志 , 2014, 34(12):
度，是企业从原料到成品生产全过程进行微生物评价的 2229-2234.
主要依据，同时也是药品安全性检查的重要项目 [5-7]。检 [7] 易巧 , 刘绪平 , 张银花 . 药用辅料苯甲醇新版药典微生物
查方法中干扰因素较多，易影响计数结果，如培养条件、 限度检查适用性实验 [J]. 中国医学创新 , 2017, 14(4): 48-
培养基、加菌浓度及加菌量等 [8-9]
。在新药的研究和开发 52.
[8] 陈伟盛 , 关倩明 , 朱荣峰 , 等 . 药品微生物限度检查中微生
过程中，建立适当的检验方法学验证必不可少，而且不
物污染的鉴定和溯源分析 [J]. 药物分析杂志 , 2014, 34(1):
能简单照搬，需经验证确认试验方法和检测系统的有效
58-63.
性 [10-12]。微生物限度检查方法常用的方法有薄膜过滤法
[9] 殷建国 . 微生物限度检查应注意的若干问题 [J]. 中国药事 ,
（必要时可加入中和剂或稀释培养基）和平皿法。薄膜过 2004, 18(7): 456.
滤法是液体类制剂和抑菌作用较强的水溶性药品进行微 [10] 曹晓云 , 郭艳娟 . 药品微生物限度检查方法学验证试验及
生物限度试验的首选方法 [13-14]。由于本次试验中紫苏方 其相关的技术问题 [J]. 天津药学 , 2006, 18(6): 49-51.
胶囊具有较强的抑菌作用，本文在薄膜过滤法中加入中 [11] 刘文 , 张广求 , 朱立刚 . 2 种含碘制剂《中华人民共和国
和剂，摸索了中和剂的比例及对供试液加温等方法，成 药典》(2015 年版 ) 微生物限度检查方法的建立 [J]. 中国
合理用药探索 , 2017, 14(2): 14-17.
功去除了供试品的抑菌成分，建立了检查方法，为中药
[12] 杨晓莉 , 李辉 , 马英英 , 等 .《中国药典》2015 年版非无菌
抑菌药物的微生物限度检查方法的建立提供了参考。
产品微生物限度检查 : 控制菌检查法解读与对策 [J]. 中国
参考文献
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征及其关联分析 [J]. 北京中医药大学学报 , 2014, 37(6):
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（收稿日期 ：2018-01-17）
[3] 马越 , 特玉香 , 杜平华 , 等 . 16 种中成药微生物限度检查
法方法验证 [J]. 中国药品标准 , 2005, 6(6): 12-15.

2018年SCI影响因子报告正式发布
6月26日，Clarivate Analytics正式发布2018年《期刊引证报告（Journal Citation Reports，JCR）》。据悉，
最新版的JCR共涵盖了来自80个国家/地区、234个学科的11 655种期刊；其中，共有276种期刊第一次被收录。
第1~10名依次为：CA - Cancer J Clin，影响因子244.585（去年同期187.040）；NEJM，影响因子79.258（去年
同期72.406）；Lancet较去年上升2个名次，影响因子达53.254（去年同期为47.831）；Chemical Reviews，影响因子
52.613；Nature Reviews Materials新晋10强，影响因子51.941；Nature Reviews Drug Discovery较去年名次下降3
位，影响因子50.167；JAMA，影响因子47.661；Nature Energy新晋10强，影响因子46.859；Nature Reviews Cancer新
晋10强，影响因子42.784；Nature Reviews Immunology新晋10强，影响因子41.982。
Nature、Science、Cell分别排在第11、13和25位，对应的影响因子为41.577、41.058、31.398。2017年进入
TOP100的中国期刊Cell Research，今年影响因子为15.393，较去年相比有所下滑，排在第108位。
（摘自生物探索）

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