海峡药学 2018 年 第 30 卷 第 6 期

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2005，

注射液的无菌检查方法验证的研究概况
项 玮（ 安徽省黄山市食品药品检验中心 黄山 242700）

摘要： 通过对注射液无菌检查方法验证的研究概况（ 包括注射液无菌检查方法验证的关键点、常见问题和影响因素） 进行分析，提高注射液无菌

实验方法验证结果的准确性使药品质量得到保证。
关键词： 注射液无菌检查方法验证； 关键点； 常见问题； 影响因素
中图分类号： R927 文献标识码： B 文章编号： 1006-3765（ 2018） -06-08188-0068-03

为使无菌检查方法更加科学、完整，2010 年版《中国药 1. 3 方法学验证的必要性 不同企业生产的相同品种，特别

典》指出： 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗 是中成药，因原料来源、工艺、辅料的不同，药品可能表现出不
器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品 同的抑菌特性； 同一个企业生产的相同品种，因原料来源不
符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未 同、工艺改变或不同实验室等原因，也可能导致检测结果的差
发现微生物污染。 异。因此，不同企业生产的相同品种进行微生物限度检查或
无菌检查应在环境洁净度 10000 级下的局部洁净度 100 无菌检查时，其具体试验方法如冲洗量等不能简单照搬，需通
〔3〕
级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格 过验证试验核实该试验方法和检测系统是否适宜 。
遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供 2 无菌检查验证的关键点
试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定 2. 1 验证的类型 前验证： 建立药品的微生物限度检查法和
期按《医药工业洁净室（ 区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测 无菌检查法时（ 当建立药品的无菌或微生物限度检查法时，
试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关 应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无
要求进行验证，其内部环境的洁净度需符合无菌检查的要求。 菌检查） 。
日常检查还需对环境进行监控。 再验证： 修订的检验方法； 供试品的组分或原检验条件发
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技 生改变可能影响检验的结果时； 定期的方法学验证（ 若药品
〔1〕
术的培训 。 的组分或原检验条件发生改变时，检验方法应重新验证） 。
1 相关规定 2. 2 无菌检查验证用菌株 金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus
药品无菌检查方法学验证作为中国药典 2005 年版增订 aureus） 〔CMCC（ B） 26003 〕； 枯草芽孢杆菌 （ Bacillus subtilis）
的一项重要内容对促进我国药品微生物检验的标准化是十分 〔CMCC（ B） 63501〕； 大肠埃希菌（ Escherichia coli） 〔CMCC（ B）
重要和必要的，方法学验证时促使我国药品无菌和微生物限 44102〕； 铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa） 〔CMCC（ B）
度检查方法更加合理、科学和严谨的重要途径。 10104 〕； 生 孢 梭 菌 （ Clostridium sporogenes） 〔CMCC （ B ）
1. 1 方法学验证的目的 为了确认试验中供试品应选择药 64941〕； 白色念珠菌（ Candida albicans） 〔CMCC（ F） 98001〕； 黑
典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定方法及确定的 曲霉（ Aspergillus niger） 〔CMCC（ F） 98003〕。
检测系统是否适用于该供试品的检验，即只有通过方法验证， 2. 3 菌株选择的原则 代表性，普遍性，易存活、低或非致病
才能确定供试品的检验条件和方法，保证微生物限度检查或 性，标准菌株（ 或该药品中常见的污染菌） 。
无菌检查方法的科学性和检验结果的准确性。 表1 实验所用菌株
1. 2 方法学验证的意义 保证检验结果的准确、可靠及检验 菌名 分类 芽孢 对氧需求
方法的完整性
〔2〕
。 铜绿假单胞菌 革兰氏阴性杆菌 无芽孢 需氧
枯草芽孢杆菌 革兰氏阳性杆菌 有芽孢 需氧
金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性球菌 无芽孢 需氧
作者简介： 项 玮，男（ 1984. 5 － ） 。本科，主管药师。研究方向： 药品 大肠埃希菌 革兰氏阴性短杆菌 无芽孢 需氧

检验。E-mail： 181520209@ qq. com 生孢梭菌 梭菌 有芽孢 厌氧

· 68·
Strait Pharmaceutical Journal Vol 30 No. 6 2018

2. 4 菌种的要求
传代次数不得超过 5 代（ 从菌种保存中心 证滤膜在过滤前后的完整性； 采用全封闭过滤器注意观察膜
获得的冷冻干燥菌种为第 0 代） ，并采用适宜的菌种保藏技 的状态，某些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供试品
〔9〕
术，以保证试验菌株的生物学特性。 可以损伤普通滤膜 。
2. 5 加菌量 ＜ 100cfu 验证时，按“供试品的无菌检查”的规 3. 3 验证试验与无菌检查培养观察时间是不同的，不加区分
定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。 影响对阳性菌生长缓慢的判断 验证试验： 按照规定的温度
2. 6 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草 培养 3 ～ 5 天。无菌检查： 阳性对照培养 48 ～ 72h 应生长良
芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或琼脂培养基中，接种生 好。
孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中， 30 ～ 35℃ 3. 4 敏感菌株与阳性对照菌不一致，降低了阳性对照菌的意
培养 18 ～ 24h； 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培 义 阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌株实际工作中抑
养基或改良马丁琼脂培养基中， 23 ～ 28℃ 培养 24 ～ 48h，上述 制枯草芽孢杆菌的样品很多（ 敏感菌株） ，但阳性对照只能选
〔10〕
培养物用 0. 9% 无 菌 氯 化 钠 溶 液 制 成 每 1mL 含 菌 数 小 于 择金黄色葡萄球菌 。
100cfu（ 菌落形成单位） 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物 关于大肠埃希菌的问题 供试品无菌检查中规定“抗革
3. 5
至改良马丁琼脂斜面培养基上， 23 ～ 28℃ 培养 5 ～ 7 天，加入 3 兰氏阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌”。但在方
～ 5mL0. 9% 无菌氧化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬 法学验证中所用菌株没有大肠埃希菌。解决措施： 抗革兰氏
液（ 用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细 阴性菌的抗菌药物进行方法学验证时增加大肠埃希菌。
管） 至无菌试管内，用 0. 9% 无菌氧化钠溶液制成每 1mL 含孢 3. 6 方法选择错误，不符合 CP2005 版要求 薄膜过滤法和
〔4〕
子数小于 100cfu 的孢子悬液 。 直接接种法。如： 一般供试品（ 无特殊说明） ，完全可以采用
2. 7 验证方法 直接接种法〔5〕，薄膜过滤法〔5〕。 薄膜过滤法，而生产单位进行的无菌检查验证法为直接接种
薄膜过滤法： 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，
2. 7. 1 法。也有的厂家把两种方法的验证都写上，结论中也没有说
〔11〕
冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于 100cfu 的试验菌，过 明采用哪种方法 。CP2005： 无菌检查法包括薄膜过滤法和
滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养 直接接种法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的 3. 7 检验数量和检验量与验证的量不同 进行供试品无菌
容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养 3 ～ 5 天。 检查时，所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。
各试验菌同法操作。 结合无菌检查检验数量和检验量确定验证时取样量。如同时
2. 7. 2 直接接种法： 取符合直接接种法培养基用量要求的硫 进行无菌检查一定要按照规定的检验数量和检验量取样。无
乙醇酸盐流体培养基 8 管，分别接入小于 100cfu 的金黄色葡 菌检查中规定： 只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部
萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 2 管； 取符合 内容物过滤。因此，验证试验中检验量就多不就少，如 10mL
直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基 4 管，分别接 注射液，虽然每个滤膜每容器取 2mL 也符合要点规定， 10 支
入小于 100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各 2 管。其中一管接入 分配至 3 个或更多滤筒也可，但建议取 15 支分 3 个滤筒（ 贵
规定量的供试品，另一管作为对照，按规定 温 度 培 养 3 ～ 5 重药品和抗生素可灵活掌握，但不能低于最少量。对检验数
〔5〕
天 。 量和检验量的把握应考虑便于实际操作，比如处理 100mL / 袋
2. 8 结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验 的样品，取 9 袋样品一次分配到一组三联滤器，检验数量大于
菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌 药典规定的 6 个，但检验量似乎不符合药典规定的每袋样品
作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进 取半量检验的规定，仅为 1 /3，但根据药典检验量即为一次试
行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长 验所用供试品总量（ g 或 mL） 的解释，这与先将 6 袋分配两个
微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有 滤筒，再将剩下 3 袋抽入一个滤筒作为样定对照的方法一样，
〔12〕
抑菌作用。 却更节省时间 。
2. 9 消除供试品抑菌的方法 增加冲洗量，增加培养基的用 3. 8 冲洗条件、冲洗量的选择盲目 有些厂家提供的验证资
量，使用中和剂或灭火剂： β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸，更换滤 料中，对非抑菌性供试品也采用了大量的冲洗，1 次 100mL /
〔6〕
膜品种 。 （ 10 次·膜） ，增加了出现误差的机会。对膜会造成损伤。检
3 验证中的常见问题 验方法繁琐，大大增加检验人员的工作量（ 检验要按照已经
3. 1 薄膜过滤法加菌的时机不一致（ 供试品中和阳性对照 验证的方法进行） 。验 证 试 验 方 法 选 择 的 总 原 则 是 由 易 到
中） 按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，而验证 难。冲洗不一定为 1 次 100mL，可少量多次，如 1 次 50mL，注
试验主要考虑滤膜 / 滤器残留抗菌物质对阳性菌的生长的影 意充分振摇。对于抑菌性较强的供试品，可以先用适宜的稀
响，可以与对照滤器比较而作出判断，所以验证试验中加菌时 释液稀释后再过滤，以减少膜的吸附，减少冲洗量。如： 抗生
〔7〕
机要与对照一致 。 素品种取规定量，混合至含适宜稀释液（ 如 500mL 等） 的无菌
3. 2 滤膜过滤法滤膜材质选择不正确，直接影响试验结果 容器中，然后再过滤。对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或
〔8〕
滤膜分为普通滤膜，有机膜，低吸附滤膜 。滤膜的选择应 固体原料，一定要充分溶解，混合均匀。抗菌药可以根据其抗
遵循的原则： 根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质； 应保 菌谱选择敏感菌先进行预试验，找到合适的条件再进行其他
· 69·
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菌的实验。采用开放式薄膜过滤器： 滤膜分成几份与取样量、 容易造成供试品和器皿的再次污染。因此，每一个操作者都

冲洗条件的选择有关，建议尽量与无菌检查法一致。
3. 9 方法描述不够详细，没有可操作性 如某产品验证资料
“将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲
洗液中加入小于 100cfu 的试验菌，过 滤。取 出 滤 膜 接 种 至
……中，或将培养基加至滤筒中”。验证的目的是为了“照此
检查法和检查条件进行供试品的无菌检查”，方法确立后，以
后该产品就可以采用该方法进行检验。应记录取样量、（ 稀
〔13〕
释方法） 、冲洗液、冲洗量（ 冲洗条件） 等 。
4 无菌检查验证的影响因素
4. 1 操作环境的影响实验室周边应无粉尘、无垃圾、无公
厕、无露土； 无菌室应达到室内环境洁净度 10000 级，局部操
要牢固树立严格的无菌操作观念，检验的全过程必须符合无
菌操作技术要求。进入无菌室前，应洗手消毒，更换经过消毒
灭菌的无菌衣帽，在实验过程中不要在室内来回走动和进出
无菌室； 不要边操作边讲话，不能咳嗽和打喷嚏，以减少室内
〔16〕
空气污染 。
5 小结
总之，我们应以高度的责任心和严谨的工作态度认真对
待注射液无菌检查方法验证的每一个细小的操作环节，以保
证检验结果的科学、准确、从而保证临床用药的安全。
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级的培养基平板细菌菌落生长太多无法点计，或者高稀释级
（ 10） ： 14.
平均菌落数大于或等于低稀释级的平均菌落数时，应按《中
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· 70·