Manual Viro

BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
LICENCIATURA: QUIMICO FARMACOBIÓLOGO
MANUAL DE LABORATORIO DE VIROLOGIA
Profesores que lo elaboraron

MC. Juan Carlos Benítez Serrano
MC. Gloria León Tello
Dra. Marta Lobo Sánchez
MC. Laura Martínez Pérez
MC. Nidia Gary Pazos Salazar
MSP. Claudy Lorena Villagrán Padilla
2012
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ÍNDICE
NÚMERO DE LA TÍTULO DE LA PRÁCTICA PÁGINA

PRÁCTICA
Práctica 1 Seminario: Pruebas de hemaglutinación (HA) e 4

inhibición de la hemglutinación (IHA).
Fundamentos y aplicaciones.
Práctica 2 Pruebas de hemaglutinación (HA) para el 9
diagnóstico preliminar del virus de la enfermedad
de Newcastle.
Práctica 3 Prueba de inhibición de la hemaglutinación (IHA) 12
para el diagnóstico definitivo del virus de la
enfermedad del Newcastle.
Práctica 4 Seminario: Modelos biológicos para el cultivo e 15
identificación de virus. Huevo fértil de pollo,
animales de laboratorio y cultivos celulares.
Práctica 5 Ensayos de las vías de inoculación en huevo fértil 21
de pollo.
Práctica 6 Replicación del virus de la enfermedad de 25
Newcastle en huevo fértil de pollo.
Práctica 7 Titulación (DI50) del virus de la enfermedad de 28
Newcastle en huevo fértil de pollo.
Práctica 8 Preparación de un medio mínimo para el cultivo y 31
propagación de células.
Práctica 9 Taller demostrativo de proliferación de cultivos 35
celulares mediante subcultivo o pase 1:2
Práctica 10 Seminario: Pruebas para el diagnóstico clínico de 38

virus (ELISA, Inmunofluorescencia y Western
blot). Fundamentos, aplicaciones y limitaciones.
2
Práctica 11 Ensayos inmunoenzimáticos para el diagnóstico de 45
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
antígeno de superficie del virus de la hepatitis B
(Ag HBs).
Práctica 12 Replicación de bacteriófagos líticos en 50

Escherichia coli.
Práctica 13 Seminario de preubas moleculares para el análisis. 54
PCR y sus variantes; retrotranscripción, múltiple,
anidada, tiempo real, RFLP, Souther blot,
Northern blot.
Práctica 14 Taller demostrativo para el diagnótico molecular 59

de virus: PCR, electroforesis, restricción enzimática.
3
PRACTICA No. 1
SEMINARIO: PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E
INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) FUNDAMENTOS Y
APLICACIONES
Introducción
Desde el descubrimiento de los virus se estableció que de acuerdo con sus propiedades
moleculares, estos agentes infecciosos requieren del empleo de sistemas biológicos para su
reproducción; esta condición hace particularmente difícil emplear sistemas adecuados tales como
los animales de laboratorio o cultivos celulares. De esta manera se tuvieron que buscar
alternativas para el estudio de virus en el laboratorio que eliminasen la necesidad de emplear
células vivas.
Prueba de Hemaglutinación (HA)
Inicialmente, la HA se aplicó para el análisis del virus Influenza, sin embargo, se puede aplicar
para otros viriones que posean proteínas estructurales con capacidad hemaglutinante. El nombre
de hemaglutinación se debe al hallazgo de que los virus Influenza podían aglutinar eritrocitos;
posteriormente se determinó que el origen de esta propiedad se debía a la existencia de una
glicoproteína presente en la envoltura viral a la cual se le denominó hemaglutinina.
Esta proteína actúa como el ligando viral que reconoce a su receptor en células blanco. En
términos generales, este receptor corresponde a moléculas de ácido siálico presentes sobre la
superficie de diversos tipos celulares, organizadas en diferentes enlaces químicos con otros
carbohidratos.
4
Fig. 1 Ilustración del virus Influenza
La función de la hemaglutinina viral no es simplemente aglutinar eritrocitos, sino mediar
la adsorción en la replicación viral, pero sus propiedades son empleadas para desarrollar pruebas
de selección tal como la hemaglutinación. Esta prueba de presenta algunas ventajas, pero también
limitaciones que se enlistan a continuación:
Ventajas:
 Desarrollo sencillo.
 No requiere de una infraestructura elaborada.
 Económica.
 Ideal cuando se emplean muestras con alta concentración de viriones.
 Aplicación en ensayos que orientan sobre la naturaleza química de receptores celulares.
Limitaciones:
 Empleada sólo como diagnóstico presuntivo.
 Especificidad limitada por agentes no virales que pueden hemaglutinar
 Poca sensibilidad.
 Riesgo de obtención de resultados falsos negativos.
El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la presencia de viriones con
proteínas hemaglutinantes que reconocen receptores celulares. De esta manera, los virus se unirán
5
a los eritrocitos de diferentes especies siempre que posean en su superficie moléculas de ácido
siálico (fig.2).
Fig. 2. Representación de la reacción de HA

Esta prueba requiere contar con muestras que contengan un número elevado de viriones,
tales como suspensiones virales provenientes de lotes vacunales, cosechas virales obtenidas de
células en cultivo, o bien, muestras clínicas tomadas durante la fase aguda de la enfermedad.
Para procesar las muestras se preparan diluciones seriadas al doble, desde una dilución
1:10 hasta 1:1280 empleando como diluyente solución reguladora de fosfatos. Posteriormente a
cada dilución se le adiciona la misma cantidad de una suspensión de eritrocitos preparada al 1%,
incluyendo un control de reacción que solo contendrá solución reguladora de fosfatos y
eritrocitos.
El soporte para llevar a cabo este ensayo son microplacas de 96 pozos con fondo en U, de
tal manera que los eritrocitos aglutinados forman una “red o malla” en el fondo del pozo,
mientras que los no aglutinados sedimentan por gravedad formando un “botón” homogéneo (fig.
3).
Fig. 3. Sedimentos en la prueba de HA
6
Una prueba de HA positiva sugiere la presencia de un virus con capacidad hemaglutinante
en la muestra, sin embargo la identificación final del virus debe establecerse con un ensayo
complementario.
Prueba de Inhibición de la Hemaglutinación (IHA)
Para realizar un diagnóstico viral definitivo debe llevarse a cabo una prueba que demuestre un
tipo de respuesta específica del huésped hacia un virus en particular, tal como la producción de
anticuerpos que se pone de manifiesto en pruebas del tipo de la Inhibición de la Hemaglutinación
(IHA).
Este ensayo se basa inicialmente en la unión de anticuerpos específicos con la
hemaglutinina viral, tal que se impida en una reacción posterior, la formación de puentes entre los
ligandos virales y los receptores presentes sobre la superficie de los eritrocitos que darían lugar a
una reacción de hemaglutinación.
La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera:
Primera etapa: Reconocimiento Ag viral – Ac
Viriones con Anticuerpos anti-HA Neutralización

proteínas de proteínas
hemaglutinantes hemaglutinantes
7
Segunda etapa: Reacción de complejos Ag-Ac con eritrocitos
No se lleva a cabo
la interacción
virus-eritrocito
La presencia de anticuerpos que puedan reconocer aislamientos virales, permite realizar

un diagnóstico específico, tomando como base un principio fundamental en inmunología el cual
establece que la presencia de anticuerpos en un hospedero, es la consecuencia de una exposición
previa al antígeno que originó su producción.
En esta prueba se realizan diluciones seriadas al doble de un suero que contenga
anticuerpos contra un virus hemaglutinante, iniciando con una dilución 1:2 y hasta alcanzar
1:256. A cada dilución del suero se le agregan 4 unidades hemaglutinantes (concentración que se
conoce a través de un ensayo preliminar de hemaglutinación) de un virus determinado, incubando
durante 10 minutos para permitir el reconocimiento Ag-Ac. Finalmente se adiciona una
suspensión de eritrocitos al 1%. Al igual que en la prueba de hemaglutinación, se incluye un
control de reacción que solo contendrá solución reguladora de fosfatos y eritrocitos. Si el ensayo
se realiza en microplacas de 96 pozos con fondo en U, los resultados esperados serán los
siguientes:
Fig.4. Sedimentos correspondientes a las pruebas de IHA+ e IHA –
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PRACTICA No. 2
PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO
PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE
Introducción
Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el genoma viral
capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar puentes entre los glóbulos
para constituir una red. Este fenómeno conocido como Hemaglutinación fue primeramente
descrito para el análisis del virus Influenza. En este caso la proteína hemaglutinante
(Hemaglutinina) en la superficie del virión es una glicoproteína que en adición de la
Neuraminidasa se proyecta en la envoltura viral. El virión se unirá a cualquier eritrocito de la
especie que sea siempre que lleve los receptores complementarios que en este caso son moléculas
de Acido N-Acetil-Neuramínico.
El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro de la familia Paramyxoviridae; es
un patógeno primario de aves en quienes produce infecciones respiratorias y digestivas con
trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a parálisis y muerte; en el humano puede
ocasionalmente producir conjuntivitis autolimitada.
Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar aglutinación, por lo
que la Hemaglutinación no es un indicador sensible de la presencia de pequeñas cantidades de
viriones pero por su simplicidad constituye un ensayo conveniente si se dispone de grandes
cantidades de viriones.
Objetivos
1. El alumno dominará el manejo de la técnica de la reacción de Hemaglutinación (HA).
2. El estudiante determinará la concentración de viriones presentes en una suspensión, la cual
expresará en Unidades Hemaglutinantes (UHA).
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Material
 Solución reguladora de fosfatos (SRF) de Dulbecco con pH = 7.2
 Microplacas de poliestrireno con fondo en U.
 Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 l.
 Puntillas para micropipeta.
 Vacuna viral (viriones atenuados, cepa La Sota)
 Suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1% en solución reguladora de fosfatos con pH =
7.2.
 Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.
 Solución de Hipoclorito de Sodio 1:10 en agua destilada.
 Algodón alcohol al 70%.
 Recipiente para recolectar desechos.
Metodología
1. Empleando solución reguladora de fosfatos con pH = 7.2, realizar una serie de diluciones
seriadas al doble de la vacuna viral, desde 1:10 hasta 1:1280 (Esquema No. 1); es muy
importante incluir un pozo control que no contendrá virus.
a. En un frasco con tapón de rosca preparar una dilución 1:10 de la vacuna viral. Agregar al
pozo A1 de la microplaca 200 l de la dilución anterior.
b. Agregar 100 l de solución reguladora de fosfatos con pH = 7.2 de los pozos A2 hasta el
A9.
c. Transferir 100 l de la dilución 1:10 al pozo A2, homogenizar por pipeteo suave.
d. Nuevamente transferir 100 l de ésta dilución (1:20) al pozo A3 mezclando en forma
homogenea como en el paso c; de esta manera se obtendrá ahora una dilución 1:40.
e. Repetir este procedimiento hasta el pozo A8 que corresponderá a una dilución 1:1280.
f. Desechar 100 l de la suspensión viral del pozo A8, tranfiriéndolos al pozo A12 y
teniendo cuidado en no agregar dilución viral al pozo A9 que sirve como control de la
reacción.
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Esquema No. 1
2. Agregar a todos los pozos 100 l de una suspensión al 1% de glóbulos rojos de pollo.
3. Rotar la microplaca sobre la mesa de trabajo e incubar a temperatura ambiente hasta que los
eritrocitos del pozo A9 hayan sedimentado.
4.- Identificar la última dilución en que se presente una reacción positiva de hemaglutinación, la
cual corresponderá a 1 unidad hemaglutinante (1 UHA), es decir, la concentración mínima de
viriones que es capaz de aglutinar una suspensión de referencia de eritrocitos de pollo al 1% en
solución reguladora de fosfatos con pH = 7.2.
5.- Reconocer la dilución del virus vacunal que contenga 4 UHA.
Cuestionario
1.- Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA.
2.- Anote dos razones por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba de
HA.
3.- De que otra especie animal se pueden emplear eritrocitos para la prueba de HA.
4.- Porque la prueba de HA no se considera confirmatoria.
5.- Cuál sería la muestra clínica para diagnosticar infección por virus del Newcastle aplicando la
prueba de HA.
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PRACTICA No. 3
PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA EL
DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL
NEWCASTLE
Introducción
La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico preliminar de enfermedad por virus Newcastle,
de manera que si resulta positiva, no permite concluir que este virus sea el agente causal del
cuadro clínico en el ave con enferma.
Con base en lo anterior, para realizar un diagnóstico definitivo se debe demostrar una
respuesta específica del huésped hacia este virus, determinando la presencia de anticuerpos por
medio de la reacción de Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina del
virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este hecho
permite identificar completamente a virus hemaglutinantes y se conoce también como
neutralización vírica.
Objetivos
1. El estudiante desarrollará la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación para determinar el
título de un suero problema.
2. El alumno será capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar esta prueba de
identificación viral.
Material
 Solución reguladora de fosfatos (SRF) de Dulbecco con pH = 7.2.
 Microplaca de poliestireno de 96 pozos con fondo en U.
 Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 l.
 Puntillas para micropipeta.
 Vacuna viral (viriones atenuados, cepa La Sota).
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 Suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1%.
 Suero problema.
 Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.
 Solución de Hipoclorito de Sodio 1:10 en agua destilada.
 Algodón y alcohol al 70%.
 Recipiente para recolectar desechos.
Metodología
Con base en los resultados de la práctica anterior, preparar en un frasco con tapón de rosca una
dilución del virus de la enfermedad de Newcastle que contenga 4 UHA, empleando solución
reguladora de fosfatos; considerar un volumen suficiente para realizar la prueba de IHA.
De esta manera, si el resultado de la práctica de HA hubiese sido:
Dilución 1:40 de la vacuna viral = 1 UHA, Por lo tanto:
Dilución 1:10 de la vacuna viral = 4 UHA
Volúmen suficiente para realizar la prueba de IHA = 2 ml. Entonces:
Vacuna viral concentrada 200 l
+
SRF 1800 l
_________
Volúmen final 2000 ml de una dilución viral con 4 UHA
1. Hacer diluciones seriadas al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo al
esquema No. 2; incluir un pozo control que no contendrá antisuero ni suspensión viral:
 Agregar 100 l de una dilución 1:2 del suero problema al pozo A1.
 Adicionar 50 l de SRF de los pozos A2 al A8; en el pozo A9 colocar 100 l de la misma
solución.
 Transferir 50 l del pozo A1 al pozo A2, homogenizar por pipeteo suave para obtener una
dilución del suero problema de 1:4.
 Nuevamente transferir 50 l ahora del pozo A2 al A3 (para obtener una dilución 1:8),
homogenizar y repetir el procedimiento hasta el pozo A8 que corresponderá a una
dilución 1:256.
 Desechar 50 l del pozo A8 colocándolos en el pozo A12, teniendo cuidado en no agregar
ninguna dilución del suero al pozo A9 ya que sirve como control de la reacción.
13
Esquema No. 2
2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del virus vacunal en un
volumen de 50 l.
3. Rotar la microplaca sobre la mesa de trabajo para que haya reacción antígeno-anticuerpo e
incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Agregar 100 l de la suspensión de glóbulos rojos al 1% a todos los pozos, desde A1 hasta A9;
nuevamente rotar la microplaca e incubar a temperatura ambiente hasta que los glóbulos rojos del
pozo A9 que sirven como control hayan sedimentado.
5. Determinar el título del suero problema identificando la última dilución en que se observe
inhibición de la hemaglutinación.
Cuestionario
1. ¿Cuál es la interpretación que debe darse a un resultado negativo en la prueba de IHA?
2. ¿Qué interpretación diagnóstica debe señalarse para un resultado positivo en la prueba de
IHA?
3. Combinando los resultados de las pruebas de HA e IHA, cuál es la interpretación diagnóstica
en los siguientes casos: a) HA: positiva, IHA: negativa; b) HA: negativa, IHA: positiva; c)
HA: positiva, IHA: positiva
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PRACTICA No. 4
SEMINARIO: MODELOS BIOLÓGICOS PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIÓN
DE VIRUS. HUEVO FÉRTIL DE POLLO, ANIMALES DE LABORATORIO Y
CULTIVOS CELULARES.
Introducción
Gran parte de nuestro conocimiento sobre la herencia, el desarrollo, la fisiología y los
procesos celulares y moleculares subyacentes se derivan de los estudios de un modelo u
organismos de referencia; a pesar de la gran diversidad de formas de vida y su alto grado de
complejidad, algunas características compartidas entre los seres vivos ha permitido la búsqueda
de respuestas ante las interrogantes planteadas por los investigadores.
Se cree que Gregor Mendel fue el primero que eligió cuidadosamente un organismo para
responder experimentalmente preguntas universales relacionadas con la herencia. Mendel fue
muy cuidadoso con las características filogenéticas y la susceptibilidad a la investigación
experimental que debía tener un organismo modelo para evitar obtener resultados dudosos; estas
características siguen siendo actualmente la base para la selección de un modelo biológico.
Los modelos biológicos representan sólo una ínfima fracción de la biodiversidad que
existe en el planeta por lo que podría ser una muestra sesgada de los seres vivos, por lo que se
asume que el conocimiento de estos organismos permite extrapolar la información obtenida al
resto de organismos considerando un origen común de las especies. Sin embargo, queda la
interrogante de si el corto ciclo vital de la mayoría de los modelos biológicos y la facilidad de
manipulación, son representativos de todos los seres vivos o si sus caracteres excepcionales
permiten hacer generalizaciones del mundo vivo (figura 1).
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Fig. 5 Árbol de la vida, mostrando una selección de varios organismos. Los organismos
utilizados con mayor frecuencia en la investigación como modelos biológicos se indican en color
rojo (Ciccarelli et al., 2006; Letunic et al., 2007)
Criterios de selección
En la actualidad los criterios utilizados para seleccionar un modelo biológico para
experimentación es su posición filogenética, ya que cualquier organismo seleccionado para un
estudio es un modelo si es tomado como representante de algunas características de un grupo
mayor (género, familia, orden o phylum) o de un taxón inaccesible y la disponibilidad
experimental, pues estos organismos son seleccionados de acuerdo a características muy
específicas de la investigación que se realiza, siendo importante controlar su pureza y evitar su
contaminación biótica, por lo que se requiere que su producción sea estandarizada, que tengan
características genéticas y sanitarias definidas, que sean criados o cultivados en ambientes
16
controlados, que respeten los requerimientos de la especie y que se cumplan los principios éticos
para su bienestar.
Ejemplos de algunas especies utilizadas como modelos biológicos en virología
Drosophila
Fue adoptada como animal de experimentación genética por Thomas Morgan a principios
del siglo XX. También llamada mosca del vinagre o mosca de la fruta, es una especie de díptero
braquícero de la familia Drosophilidae. Recibe su nombre debido a
que se alimenta de frutas en proceso de fermentación. Es una especie
utilizada frecuentemente en experimentación genética, dado que
posee un reducido número de cromosomas (4 pares), breve ciclo de
vida (15-21 días) y aproximadamente el 61% de los genes de
enfermedades humanas que se conocen tienen una contrapartida identificable en el genoma de las
moscas de la fruta y el 50% de las secuencias proteínicas de la mosca tiene análogos en los
mamíferos. Para propósitos de investigación, fácilmente pueden reemplazar a los humanos.
Actualmente se utiliza como modelo para estudiar numerosos procesos biológicos incluyendo la
respuesta inmunológica a más de 20 virus de RNA diferentes como el VIH, virus del dengue,
Fiebre amarilla, etc.
Neurospora
Es un género de hongos Ascomyceto. La especie más conocida de este género es
Neurospora crassa. The National Institute of Health lo reconoció
como uno de los 12 organismos eucariotes modelo para la
investigación en Genética y Biología Molecular, debido a que es fácil
de cultivar y tiene un ciclo de vida haploide que simplifica el análisis
genético ya que los rasgos recesivos se mostrarán en la descendencia;
el análisis de la recombinación genética es facilitado por el arreglo ordenado de los productos de
la meiosis. Este hongo es utilizado para expresar los genes de herpes virus thymidine-kinase,
permitiendo el estudio de drogas anticancerígenas y antivirales.
Bacteria
Entre los organismos modelo más utilizados se encuentra la bacteria Escherichia coli, una
bacteria Gram-negativa, anaerobia facultativa y no esporulada, con un genoma de
aproximadamente 4'6 kb. Algunas cepas de esta bacteria son enormemente versátiles en
17
laboratorio, tolerando muy bien la manipulación genética e incluso
perdiendo su capacidad patogénica. Se ha observado que gran parte de
sus estructuras y funciones son extrapolables en cierta medida a un
gran número de microorganismos, incluida la célula eucariota.
También se utiliza como almacén de material genético, fábrica de
virus, vector de plásmidos, etc.
Bacteriofagos
Los fagos o virus que infectan bacterias, se establecieron como modelos biológicos por la
iniciativa de Max Delbrück. Los fagos cumplen un papel de gran
importancia en la Biología Molecular al ser utilizados como vectores
de clonación para insertar ADN dentro de las bacterias y obtener como
resultado bibliotecas genómicas. Los fagos más utilizados con este fin
son el Fago λ y el Fago T4. Algunos estudios realizados en los
bacteriófagos son: Proteínas involucradas en la síntesis de ADN, ARN y proteínas Regulación
génica; Cáncer y control de la proliferación celular, Transporte de proteínas y organelos dentro de
las células; Infección e inmunidad; Posible vía de acceso para terapia génica. En la actualidad
están siendo utilizados como modelos biológicos para inducir la respuesta inmunológica.
Caenorhabditis elegans
Es un nemátodo con una longitud aproximada de 1 mm, estructura bilateral simétrica y
ciertos precursores de órganos superiores, a saber, boca (estoma),
faringe, intestino y gónadas principalmente. Es un nemátodo
transparente por lo que permite diferenciar visualmente todas sus
estructuras, es hermafrodita, facilitando la transmisión de mutaciones.
Su genoma de 97 Mb está estructurado en 5 pares de cromosomas más
dos cromosomas X en hermafroditas y un sólo X en machos (un
0'05% del total de una descendencia). Si juntamos las características anteriores con su ciclo vital
de dos o tres semanas en laboratorio y la implicación de larvas en el desarrollo se consigue un
organismo modelo con nuevas perspectivas en investigación. El estudio de este organismo aporta
gran cantidad de información sobre diferenciación celular y apoptosis, especialmente útil en la
rama conocida como biología del desarrollo. Los investigadores de la Universidad de California
en Riverside (UCR), han desarrollado de C. elegans como modelo para estudiar la repñroducción
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de virus altamente peligrosos como el virus del Ebola, VIH, Hepatitis C, Fiebre del Nilo, etc.;
permitiendo trazar un mapa de la delicada interacción entre virus y anfitrión; Demostrado que la
copia del virus en el gusano provoca una respuesta antiviral conocida como ARN silenciador o
ARN interferencia (ARNi) que destruye el ARN viral.
Ratón
El ratón común (Mus musculus), es una especie de roedor miomorfo de la familia
Muridae. Es la especie más frecuente de ratón. Se cree que es la segunda especie de mamíferos
con mayor número de individuos, después del Homo sapiens. Habita
siempre cerca a los humanos, con los que mantiene una relación de
comensalismo. Es también el mamífero más utilizado en experimentos
de laboratorio y existen multitud de variantes transgénicas que simulan
enfermedades genéticas humanas. Los principales estudios realizados en
el ratón común son: desarrollo de tejidos corporales, función del sistema inmune de los
mamíferos, formación y función del cerebro y del sistema nervioso, modelos de cánceres y de
otras enfermedades humanas, regulación génica y herencia, enfermedades infecciosas virales y la
respuesta inmunológica.
Huevo Fértil de Ave
El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible
para el cultivo, titulación e identificación de virus. En
comparación con los animales de laboratorio empleados para
otros ensayos virales, el modelo de huevo fértil ofrece
diversas ventajas tales como: desarrollo en condiciones de
esterilidad; no poseen funciones inmunológicas desarrolladas;
bajo costo; manipulación relativamente sencilla; no requieren
de una infraestructura compleja. El huevo fértil empleado para
el cultivo de virus, debe obtenerse de aves libres de patógenos específicos (ALPES), para evitar
la presencia de virus que comúnmente afectan a las aves, en especial Adenovirus, Coronavirus,
Bronquitis Infecciosa Aviar, etc., o bien, bacterias de los géneros Salmonella, Pseudomonas,
Pasteurella, etc. Para el cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la viabilidad del
embrión, así como tener destreza en el dominio de las técnicas de inoculación, todo ello debido a
la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas células o tejidos.
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Cultivos Celulares
En 1949 John Enders, Thomas Weller y Frederick Robbins describieron las condiciones
bajo las cuales Poliovirus podía cultivarse en células eucarióticas de origen no neuronal, lo que
les permitió ganar años más tarde el premio Nobel en Fisiología y
Medicina. A partir de entonces, los cultivos de células reemplazaron a
los animales de laboratorio como modelo de reproducción de virus y en
nuestros días son utilizados en muchos campos del área biomédica.
Este modelo biológico está conformado por conjuntos de células con
características definidas que se mantienen en condiciones de laboratorio sobre soportes inertes (in
vitro), pero mantienen capacidad de proliferar a través de divisiones mitóticas requiriendo de
medios de cultivo con una composición compleja que les provea de los nutrientes necesarios para
su preservación y desarrollo. Las células se obtienen inicialmente de tejidos sanos o tumorales y
se disocian mediante diferentes métodos hasta obtener fragmentos más pequeños que pueden ser
disgregados con enzimas proteolíticas para formar suspensiones celulares.
Cuestionario
1. ¿Cuáles son las limitantes del uso de huevo fértil para la propagación de virus?
2. Mencione las ventajas y desventajas del empleo de animales de laboratorio para el análisis de
virus.
3. Que virus se propagan únicamente en animales de laboratorio
4. Cite las desventajas del modelo de Cultivos celulares.
5. Mencione ejemplos de bacterias, diferentes de Escherichia coli, en las que se pueden propagar
bacteriófagos y cite ejemplos de éstos.
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PRACTICA No. 5
ENSAYOS DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO FÉRTIL DE
POLLO
Introducción
El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para el
cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con los animales de laboratorio
empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo fértil ofrece diversas ventajas tales como:
 Son estériles.
 No tienen funciones inmunológicas desarrolladas.
 No son costosos.
 Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica en
comparación con otros sistemas biológicos, tales como el mantenimiento y
reproducción de Cultivos Celulares.
El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves sanas ALPES,
aves libres de patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés, para de esta manera eliminar
la presencia de virus que comúnmente afectan a las aves como Adenovirus o Bronquitis
Infecciosa Aviar, etc.
Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la
viabilidad del embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de inoculación
debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas células o tejidos. En la
figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que conforman a un huevo fértil.
Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto del huevo
fértil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biológico empleado.
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3 4 1 Cavidad Alantoidea
5 2 Saco de Aire
2 3 Saco Amniótico
4 Saco Vitelino
5 Membrana Corioalantoidea
Fig. 6. Compartimentos del huevo fértil de ave.

Objetivos:
Al finalizar la sesión, el alumno:
1. Determinará al ovoscopio la viabilidad del embrión.
2. Dominará las técnicas comúnmente utilizadas para la inoculación de huevos fértiles de ave.
3. Diferenciara las estructuras embrionarias observando la organización de los tejidos fuera de
su cutícula.
Material:
 Huevos fértiles de ave de 10 días de inoculación (+/- 1 día), calidad ALPES.
 Ovoscopio y pinzas de disección
 Recipiente para recibir desechos
 Charola porta embriones
 Perforadores, bulbos y lápiz.
 Jeringas de insulina
 Agujas de 20 x 38 mm.
 Colorantes
 Guantes
22
Desarrollo:
I.- Confirmación de la viabilidad del embrión
Transluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio. Un embrión
no viable puede reconocerse a través de:
 Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutícula.
 Falta de irrigación.
 Falta de movimiento.
 Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general contaminación bacteriana.
II.- Técnicas de inoculación
A Cavidad alantoidea
a Transluminar el huevo fértil con ayuda del ovoscopio.
b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del límite de la cámara de aire del lado
contrario al embrión y en una zona escasamente irrigada.
c Perforar la marca señalada.
d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ángulo de 45
grados con respecto al huevo fértil de ave.
B Saco vitelino
a Localizar la parte más alta del embrión sobre la cámara de aire y marcar con un punto o
cruz.
b Marcar otro punto o guía que indicara la localización del embrión.
c Perforar la marca señalada
d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinación opuesta a la localización
del embrión
C Membrana corioalantoidea
a Localizar la parte más alta de la cámara de aire y marcar un punto o cruz (*).
b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localización del embrión en un área con
la menor irrigación posible.
c Perforar ambas marcas.
d Succionar con un bulbo de goma a través del punto marcado en la primera posición (*),
creando así una cámara de aire falsa en la parte media del embrión.
23
e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina o tuberculina en el lugar que se
desarrolló la cámara de aire falsa.
En estos ensayos, se emplearan colorantes para las diferentes inoculaciones con el objetivo de
facilitar la visualización del sitio donde se pretendió depositar un volumen determinado de
colorante. Una vez realizada la técnica, se abrirán los huevos fértiles de ave para analizar si la
vía elegida fue efectivamente inoculada, vertiendo el contenido del embrión sobre cajas de Petri.
Cuestionario
1. De acuerdo con lo observado después de abrir los embriones de pollo y según la vía de
inoculación empleada; esquematice para cada vía, cuales zonas deben quedar teñidas y cuáles
no, si la inoculación se realizó correctamente.
2. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por vía saco vitelino, mencionando las
lesiones que causan.
3. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por vía membrana corioalantoidea
mencionando las lesiones que causan.
4. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por vía cavidad alantoidea, mencionando las
lesiones que causan.
5. ¿Qué otras aplicaciones tiene el huevo fértil además de la propagación de virus?
24
PRÁCTICA No. 6
REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE EN
HUEVO FÉRTIL DE POLLO
Introducción
Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamíferos daños
severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta interacción induzca
una protección inmunológica al individuo como consecuencia del reconocimiento de antígenos
específicos tanto en forma natural como artificial. En el caso de medidas profilácticas, con el
empleo de vacunas se procura inducir una Inmunidad Adquirida Artificial.
Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la vacuna.
Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede efectuar en sistemas
biológicos tales como huevos fértiles de ave que pueden responder a la infección viral dando
lesiones características del virión inoculado que afecte directamente al embrión y le produce
signos tales como músculos distróficos, enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y líquidos
extraembrionarios donde se pueden observar hemorragias, formación de placas o pústulas así
como determinar la presencia de hemaglutininas virales.
Los virus vacunales o de campo pueden titularse en huevos fértiles de ave cuando
producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP50) o en el caso de virus
hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al 50% (DIEP50) empleando la reacción de
Hemaglutinación de los fluidos cosechados.
Objetivos
1. El alumno desarrollara la técnica para propagar una cepa vacunal de virus. atenuados de la
enfermedad de newcastle
2. El alumno determinará la DIEP50 para la vacuna del Virus de laenfermedad de newcastle ,
calculando sus concentración por unidad de volumen.
25
Material
 Huevo fértil de ave de 10 dias de incubación (+/- 1 dia) calidad ALPES.
 Vacuna con viriones atenuados de la enfermedad de newcastle
 Solucion reguladora de fosfatos (srf) de dulbecco con ph 7.2 o solucion salina
 Suspensión de eritrocitos de pollo al 1%
 Lápiz, pegamento blanco y perforadores
 Hisopos estériles, tintura de yodo.
 Estufa a 37°C.
 Ovoscopio.
 Jeringas para aplicacion de insulina.
 Mechero.
 Recipiente para desechos.
Desarrollo:
1. Realizar con solucion salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna viral desde 10 -1
hasta 10-8 a partir de una suspensión concentrada.
2. Trasluminar el huevo fértil de ave y seguir la técnica de inoculación para cavidad
alantoidea
3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculación con tintura de yodo antes
y después de perforar
4. Inocular 0.1 ml de las cuatro ultimas diluciones en cada uno de 5 embriones de 9 a 11 días
de incubación (20 embriones en total), vía cavidad alantoidea.
5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforación con una gota de pegamento blanco
6. Marcar con lápiz sobre cada embrión la dilución y vacuna inoculada
7. Incubar a 37°C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los embriones al
ovoscopio, señalando en el primer dia los embriones que resulten muertos por
traumatismo
1. Cuestionario
2. ¿Que es una vacuna?
3. ¿Qué parametros deben tomarse en cuenta para evaluar la calidad de una vacuna?
4. ¿Para que es importante tener una vacuna de calidad?
26
5. Mencione al menos cinco vacunas que en la actualidad sean producidas en huevo fértil de ave
6. ¿Mencione vacunas elaboradas con virus atenuados de uso humano?
27
PRÁCTICA No. 7
TITULACIÓN (DI50) DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE
NEWCASTLE EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO
Introducción
Uno de los procedimientos importantes en virología es medir la concentración de un virus en una
muestra, o el título viral.
Las técnicas de titulación viral son en muchos casos un paso previo y necesario para
desarrollar otros tipos de estudios tales como: ensayos de neutralización, determinación de actividad
antiviral de un extracto dado, ensayos de identificación viral como en el caso de virus influenza
(ensayo de inhibición de la hemaglutinación), etc.
La cantidad de virus presente en una muestra se calcula por diversos métodos entre los
cuales se encuentra la dosis infectante al 50% (DI50). Para llevar a cabo este ensayo, diluciones
seriadas de virus son inoculadas en cultivos celulares, huevos embrionados o animales. Los
resultados son observados después de dejar el tiempo apropiado para que la infección y replicación
viral se lleve a cabo.
El título viral es definido como aquella dilución de virus que infecta (o mata) el 50% de la
población inoculada.
En éstos análisis para determinar el título viral, se utiliza el método de Reed y Muench, el
cual es relativamente simple. Se basa en la suposición de que el número de unidades de prueba
afectadas varía proporcionalmente al log10 de la dilución, es decir que a diluciones menores (mayor
concentración de virus) el porcentaje de efecto será mayor que a diluciones mayores (menor
concentración de virus). Además, considera que en la zona cercana al 50% de efecto éste varía
linealmente con la dosis. Es muy importante no omitir ninguna dilución intermedia.
28
Objetivo
1. El alumno titulará la vacuna del Virus de la enfermedad de newcastle, determinando la
DLEP50 calculando sus concentración por unidad de volumen.
Desarrollo:
1. Al termino de la incubación, de los embriones de la práctica anterior, cosechar un poco de
fluido alantoideo de cada uno de los 20 huevos inoculados, para efectuar hemaglutinaciones .
2. Anotar los resultados obtenidos y realizar los cálculos para determinar la DIEP 50 / 0.1 ml
empleando el metodo de Reed & Muench, con base en el siguiente ejemplo
Resultados de las pruebas de hemaglutinacion
DILUCION EMBRIONES HA+ HA-
INOCULADOS
10-3 5 4 1
10-4 5 3 2
10-5 5 2 3
10-6 5 1 4
Calculos
1) ACUMULADOS 2) ACUMULADOS 3) RADIO DE 4) PORCENTAJE
POSITIVOS NEGATIVOS POSITIVIDAD
10 1 10 / 11 90.9
6 3 6/9 66.6
3 6 3/9 33.3
1 10 1 / 11 9.09
Para una mejor explicación, se desgloza a continuación la realización de los cálculos para cada
columna:
Columna 1: Realizar la suma acumulada de pruebas HA+, desde la dilución mas alta hasta la mas
baja.
Columna 2: Realizar la suma acumulada de pruebas HA- desde la dilución mas baja a la mas alta.
Columna 3: Para cada dilución anotar el cociente dado por los acumulados con HA+ sobre la
suma de acumulados con HA+ y HA-.
29
Columna 4: Expresar el cociente anterior como porcentaje
Calcular el valor de interpolación (VI.) con la siguiente fórmula:
% Positividad  50% - 50% 66.6 – 50.0 16.6

V.I. = =
% Positividad  50% - % Positividad  50% 66.6 – 33.3 33.3
V.I. = 0.49
Multiplicar el logaritmo negativo del factor de dilución por el valor de interpretación para así
calcular el valor de interpolación corregido.
Para este caso:
V.I.C.= log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49
Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de positividad

En el ejemplo: 10-6 y 10-7
Estimar la DIEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor del 50% de
positividad, en este ejemplo.
DIEP50 = 10-6 + (-0.49) = 10-6.49
El titulo se obtiene con el inverso del valor de la DIEP50.
Finalmente el resultado sera:
Titulo = 106.49 /0.1ml , que es la concentración de viriones presentes en 100 microlitros de
la vacuna original
Cuestionario
1. Además de la titulación viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote vacunal antes de
salir al mercado.
2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra viral.
3. En esta práctica que nos indica una HA+
4. Porque emplear el metodo de Reed & Muench.
5. ¿Qué otros métodos se utilizan para titular una muestra viral?
30
PRÁCTICA No. 8
PREPARACIÓN DE UN MEDIO MÍNIMO PARA EL CULTIVO
Y PROPAGACIÓN DE CÉLULAS
Introducción
En el organismo, las células y los tejidos constantemente son alimentados con fluidos circulantes
en el cuerpo, los cuales proveen nutrientes y oxígeno además remueven los productos de desecho
del metabolismo celular. De la misma forma cuando las células son cultivadas in vitro, dependen
completamente de fluidos de cultivo para sus requerimientos nutricionales. Las primeras
soluciones utilizadas para cultivos celulares consistían en suero sanguíneo, coagulos de plasma y
linfa. Durante la década de los 30, se establecieron los requerimientos nutricionales para el
crecimiento de células en cultivo y de ahí se desarrollaron los nuevos medios sintéticos. En 1950
Morgan formuló el “Medio 199”, que permite el crecimiento de células primarias de embrión de
pollo. Este medio contiene 61 nutrientes sintéticos además de 5-10% suero bovino fetal (SBF).
En 1955, Eagle realiza la primera investigación sistemática de los requerimientos nutritivos de las
células en cultivo e identifiva 28 sustencias esenciales para el crecimiento celular y la necesidad
de soluciones corporales complejas en el medio de cultivo como el suero, desarrollando el Medio
Basal de Eagle (MBE) que incluye glucosa como fuente de energía, 13 aminoácidos como
precursores de proteínas, 8 vitaminas como cofactores y seis sales que proveen cofactores
metabólicos que controlan el pH y regulan el balance electrolítico. Eagle desarrolló
posteriormente el Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEME) el cual contiene concentraciones
mayores de aminoácidos y vitaminas; este es el medio más común en los laboratorios y su mayor
ventaja es que permite mantener los cultivos por más tiempo sin necesidad frecuente de cambio
de medio.
En 1965, Ham introduce el primer medio definido, libre de suero y capaz de mantener
indefinidamente algunas células de mamífero en cultivo. Basicamente, un medio de cultivo
celular debe de contener:
 Iones como Na, K, Ca, Mg, Cl y P
31
 Elementos trazas como Fe, Zn y Se
 Fuentes de energía como glucosa
 Aminoácidos que son 13 aminoácidos esenciales en los cultivos celulares
 Vitaminas
 Proteínas, péptidos, lípidos
 Antibióticos y antimicóticos
 Suero como soporte para el crecimiento de la mayoría de las células
Los medios para cultivo celular se pueden clasificar como medios de mantenimiento o
crecimiento, medios de congelación (que contienen hasta el 20% de SFB como crioprotector),
medios selectivos que favorecen el crecimiento de cierto tipo de células y los medios definidos
donde se conocen todos y cada uno de los componentes y sus concentraciones exactas.
Para la elección de un medio de cultivo se debe tener en cuenta el tipo de celula que se va
a cultivar y los requerimientos esenciales que la célula necesita para su desarrollo. Actualmente
se comercializan un gran número de medios de cultivo, siendo la unica diferencia la cantidad de
los componentes nutritivos en ellos ya que la composicion no varia. Algunos ejemplos de los
medios utilizados con mayor frecuencia son:
 Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se
necesita siempre la suplementación con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de
fibroblastos de ratón y células HeLa.
 Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso más común, contiene más
aminoácidos y en mayor concentración que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de
cultivos y requiere la adición de suero (10%).
 RPMI 1640. Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares
leucémicas en suspensión. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos
adecuados.
 Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentración
de aminoácidos y vitaminas que el BME. Se usa para la selección de hibridomas.
 Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que
incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, selenito, etc. Es muy útil para el
cultivo de linfocitos en medio libre de suero. También sirve para otros tipos celulares,
pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.
32
 McCoy 5A. Medio diseñado para el crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata
como humanas.
 Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de líneas celulares humanas, debe ser
suplementado con proteínas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es útil para
el cultivo de células amnióticas.
 Medio F-12 de Ham. Útil para el crecimiento de líneas celulares con suplementos
proteínicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero.
 Medio 199. Muy usado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de
cromosomopatías
Objetivos
1. Establecer los fundamentos teóricos para la preparación de medios de cultivo.
2. Preparar un medio de cultivo que permita propagar células.
Material y reactivos
 2 frascos de vidrio de 1 litro.
 1 probeta de 1000 mL.
 1 balanza analítica.
 1 parilla con agitación
 Gabinete de seguridad biológica
 1 pH-metro
 1 vaso de precipitados de 50 mL.
 2 filtro con membrana con un poro de (0.22µm de diámetro).
 2 jeringas de 50mL
 1 sobre de Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM)
 2.2 g de NaHC03
 Solución de HC11 N
 1000 ml de agua inyectable.
 Suero fetal de bovino
 Penicilina G y estreptomicina
Desarrollo
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1. Disolver el contenido del sobre de medio MEM de una presentación comercial con agua
inyectable en aproximadamente el 80% del volumen final a preparar.
2. Añadir 2.2 g de NaHC03 (se observa un cambio de color de un naranja a un rojo
intenso).
3. Adicionar el antimicrobiano 100UI/ml de penicilina G y 100 µg/ml de estreptomicina
4. Utilizando un pH- metro calibrado, y manteniendo el medio en agitación, adicionar poco
a poco HC1 1 N al medio, de manera que se ajuste el pH a 7.1.
5. Aforar al volumen final con agua inyectable.
6. El medio se esteriliza por filtración através de membrana con diámetro de poro de
0.22µm, utilizando una jeringa de 50ml para hacer pasar la solucion.
7. Para verificar la esterilidad del medio, se incuba un día a 37 °C y luego se almacena a
4°C.
8. Complementar el medio con 5 % de suero fetal bovino.
9. Someter nuevamente a prueba de esterilidad y almacenar a 4°C hasta su uso.
Cuestionario
1. ¿Cuál es el indicador utilizado en la formulación y cuál es su importancia?
2. ¿Por qué es necesario esterilizar por filtracion?
3. ¿Que función tiene el suero de ternera adicionado al medio de cultivo para células?
4. ¿Por qué es necesario agregar NaHC03 ?
5. ¿Qué otros antibióticos se pueden adicionar a un medio para cultivar células y cuál es su
espectro de acción?
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PRÁCTICA No. 9
TALLER DEMOSTRATIVO DE PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES
MEDIANTE SUBCULTIVO O PASE 1:2
Introducción
Los cultivos celulares son el modelo biológico que más se utiliza para el aislamiento y
propagación de virus. Permite realizar ensayos de infección en condiciones controladas por lo
que representan el método de referencia en el estudio de virus.
Estos ensayos pueden servir para la propagación de un virus como es el caso de la
producción de vacunas, o bien para analizar si el efecto de un virus en un determinado tipo
celular se presenta de forma reproducible, lo cual requiere además incluir monocapas de
controles positivos y negativos. En cualquier caso es necesario contar con una cantidad suficiente
de células. La manera de aumentar las células disponibles es por la propagación de un cultivo
inicial mediante un subcultivo o pase.
El subcultivo se realiza a partir de una monocapa confluente que se disgrega mediante la
acción enzimática de una proteasa preparada en solución con un agente quelante, una vez
disgregadas, las células se resuspenden en el medio de cultivo correspondiente hasta lograr una
suspensión homogénea. El volúmen de dicha suspensión se divide partes que se depositan en
recipientes adecuados para que las células se adhieran. Cuando la suspensión se divide en partes
iguales, se denomina como subcultivo o pase 1:2. Cada parte proliferará hasta formar nuevamente
una monocapa confluente, que puede propagarse bajo el mismo procedimiento. Los subcultivos
se realizan subsecuentemente hasta satisfacer las necesidades de trabajo.
Objetivo
1. Realizar un subcultivo de células eucarióticas en relación 1:2 para promover su proliferación y
obtener monoestratos celulares.
Material y equipo
 Gabinete de bioseguridad
 Incubadora con fuente de CO2
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 Pipeteador automático
 Etanol al 70%
 Cultivo celular confluente.
 Recipientes para cultivo celular
 Medio de cultivo complementado con 5% de Suero fetal bovino (SFB) adecuado para el
tipo celular de trabajo.
 Solución de tripsina en regulador de pH.
 Solución reguladora de fosfatos (SRF)
 Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml
 Frasco de desecho
Desarrollo
1. Desinfectar el área de trabajo en el interior del gabinete de bioseguridad con etanol al
70%.
2. Introducir todo el material y equipo que se empleara en el proceso previamente limpiado
con etanol al 70% y encender la luz ultravioleta por espacio de 15 minutos, evitando
observar en forma directa la fuente de radiación.
3. Apagar la luz ultravioleta y encender la iluminación convencional del gabinete de
bioseguridad.
4. Observar la confluencia del cultivo original
5. Decantar el medio del frasco que contiene células.
6. Lavar suavemente las células con 5 ml de (SRF)
7. Agregar 1.0 ml de solución de tripsina y dejar interaccionar con las células durante 1 min;
retirar el exceso de la solución de tripsina.
8. Incubar a 37° C durante 5 a 10 minutos; observar al microscopio que las células se hayan
redondeado (disgregación celular).
9. Agregar al frasco de cultivo, 14 ml de medio complementado con SFB y homogenizar por
pipeteo hasta formar una suspensión celular homogénea. Evite la formación de espuma.
10. Dispensar 7 ml de la suspensión celular obtenida a cada uno de dos recipientes estériles
para cultivo celular.
11. Incubar a 37° C en la incubadora con una concentración de 5% de CO2, durante 24 a 48
horas.
36
12. Observar al microscopio que en ambos frascos de cultivo se tenga una confluencia del
100% (monoestrato celular).
13. Cambiar el medio de cultivo celular, por un medio de mantenimiento que solo contenga
0.5 % de SFB, hasta el momento de emplear el cultivo para la reproducción de virus.
Cuestionario
1. ¿Qué significa confluencia?
2. ¿Qué función tiene el SFB adicionado al medio de cultivo para células?
3. ¿Explique el efecto que produce la adición de tripsina a la monocapa celular?
4. ¿De qué materiales están hechos los recipientes para el cultivo de celulas?
5. Mencione 5 tipos de cultivos celulares y los medios de cultivo adecuados para su
propagación.
37
PRÁCTICA No. 10
SEMINARIO: PRUEBAS PARA EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE
VIRUS (ELISA, INMUNOFLUORESCENCIA Y WESTERN BLOT).
FUNDAMENTOS APLICACIONES Y LIMITACIONES
Introducción
El diagnóstico viral es uno de los retos importantes a los que se enfrenta la medicina actual, ya
que durante las últimas décadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores herramientas hace
posible que estos agentes infecciosos se puedan estudiar no sólo a nivel de laboratorios
especializados, sino también en los de análisis clínicos.
Idealmente se busca identificar plenamente al virus asociado con una enfermedad en corto
tiempo y a través de una sola prueba, pero en forma práctica, en la mayoría de ocasiones no se
realiza diagnóstico diferencial, no hay comunicación entre el diagnóstico clínico y el de
laboratorio, así como difícilmente los pacientes aceptan realizarse estudios con muestras de suero
sanguíneo pareadas, es decir, recolectadas tanto en la fase aguda de la enfermedad como en la
fase convaleciente.
Diagnosticar si una infección es de etiología viral es muy importante porque determina las
acciones terapéuticas del paciente y elimina los tratamientos inadecuados, además de ayudar al
pronóstico y seguimiento de la enfermedad.
Esto tiene repercusiones sociales y económicas, puesto que la administración oportuna de
un tratamiento correcto puede reducir el tiempo y costo de atención hospitalaria.
En general, el contacto con virus puede ser analizado de forma directa o indirecta. Las
pruebas directas son las que evidencian al virus o alguno de sus antígenos presentes en células o
tejidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se utilizan con mayor frecuencia y
básicamente demuestran un contacto del huésped con el agente viral mediante la determinación
de anticuerpos específicos hacia un virus en particular.
38
En estos ensayos se aprovechan las características fisicoquímicas de los virus o los
anticuerpos producidos hacia ellos para tener especificidad en las reacciones. Dentro de las
principales utilidades diagnósticas pueden mencionarse:
 Detección de antígenos virales.
 Determinación de anticuerpos antivirales.
 Obtención de datos epidemiológicos y pronóstico de enfermedades efectuando análisis de
sueros pares; en muestras tomadas con una separación de al menos 2 semanas, un
incremento en 4 veces o más en el título de la segunda muestra con respecto a la primera,
es considerado significativo para una enfermedad viral en convalecencia o en el peor de
los escenarios activa.
 Diferenciación entre infecciones primarias, persistentes o crónicas. La presencia de IgM
específica se puede detectar en los primeros días del inicio de la enfermedad.
Las pruebas serológicas con mayor aplicación en el diagnóstico viral son:

1. Ensayos inmunoenzimáticos (ELISA)
a) Directo (detección de antígenos)
b) Indirecto (detección de anticuerpos de respuesta inmunológica)
2. Inmunofluorescencia
a) Directa (detección de antígenos virales)
b) Indirecta (detección de anticuerpos de respuesta)
3. Western-blot
ELISA (enzyme linked inmuno sorbent assay).

Se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática.
Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará
inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato
especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Pasos generales de un ELISA.
39
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el
pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del substrato
9. Unión del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color
Tipos de ELISA
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo
los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con
anticuerpos marcados.
ELISA 'sandwich'. (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se
trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se
encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un
segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un
anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo
tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el
segundo anticuerpo.
ELISA con anticuerpo de captura (sándwich) para el diagnóstico de virus:
Es una prueba en fase sólida donde se fijan anticuerpos específicos (monoclonales o policlonales
obtenidos en ratón) para un virus determinado sobre una superficie inerte como las microplacas
de poliestireno; sobre estos de adiciona el suero o muestra que contiene el antígeno que se quiere
demostrar y una vez que ocurre la reacción antígeno-anticuerpo, se hace una serie de lavados para
eliminar todo lo que no haya reaccionado. Finalmente, se agrega un segundo anticuerpo que
40
también reconoce al antígeno viral pero obtenido en un huésped distinto (por ejemplo cabra)
conjugado a una enzima.
Pueden ser utilizadas enzimas como la fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rábano
picante (PR) y para el revelado final de la reacción, se coloca el sustrato específico para la
enzima, el cual es hidrolizado por ésta para producir un complejo coloreado. En el caso de la FA
el sustrato es paranitrofenilfosfato y para PR es ortofenilendiamina (OPD) en solución de
peróxido de hidrógeno, los cuales permiten visualizar la reacción.
Para cuantificar el color producido, se mide la absorbancia en un espectrofotómetro, cuya
lectura será directamente proporcional a la concentración de antígeno presente en la muestra. Esta
técnica se utiliza ampliamente para el diagnóstico de antígenos de la Hepatitis A, B y C,
Rotavirus, VIH, agente Norwalk, virus Parainfluenza e Influenza A y B. Para la hepatitis B la
demostración del antígeno de superficie (HBsAg) diagnóstica la infección activa así como el
estado de portador; el diagnóstico de rotavirus con este método ayuda a obtener un resultado
rápido en niños menores de dos años con cuadros diarreicos, donde este virus es el principal
agente causal.
Por otra parte, para VIH la demostración del antígeno p24 es útil en el diagnóstico de la
infección en niños y en pacientes que se encuentran en periodo de ventana inmunológica; es
además de gran utilidad en el pronóstico y la progresión de la infección así como en el control de
la terapia antirretroviral.
ELISA Indirecto para el diagnóstico de virus:
Esta técnica serológica determina la presencia de anticuerpos contra agentes infecciosos
como los viriones, considerando que la exposición a ellos produce una respuesta por parte del
sistema inmune, entre otros mecanismos, a través de la producción de anticuerpos específicos.
La prueba de ELISA indirecto tiene un principio semejante al de ELISA directo, pero en
este caso, un antígeno viral específico está unido a la fase sólida, a la cual se añade el suero del
paciente que presumiblemente posee anticuerpos antivirales y después se adiciona un conjugado
constituido por anti-anticuerpos IgG o IgM unidos a una enzima. Finalmente se adiciona un
sustrato específico, que desarrollara un color cuya intensidad es proporcional a la concentración
de anticuerpos presentes en el suero del paciente.
Este método se utiliza comúnmente en laboratorios clínicos y si se automatiza puede
efectuarse en un tiempo menor a 2 horas. Su utilidad en virología está dirigida hacia la
41
determinación de anticuerpos contra antígenos específicos de virus Dengue, Herpesvirus, VIH,
Citomegalovirus, Rubéola, Hepatitis A, B y C, así como en infecciones por Virus Epstein-Bar
para demostrar marcadores serológicos tempranos de la enfermedad
La especificidad de las pruebas de ELISA depende en buena medida de la calidad de los
reactivos adsorbidos en la fase sólida, lo cual ha permitido la generación de diferentes ensayos a
través del tiempo, cada vez con mejores propiedades:
a) De primera generación
Pruebas donde inicialmente se utilizaron antígenos crudos sin mayores procesos de
purificación, tales como el virión completo inactivado (caso de las primeras técnicas de ELISA
para VIH), sin embargo, estos ensayos presentaban reacciones inespecíficas (falsos positivos), en
particular se obtenían reacciones cruzadas con virus Herpes.
b) De segunda generación
En este caso los antígenos son proteínas recombinantes, que se producen mediante
ingeniería genética en bacterias y son sometidas a procesos de purificación, lo cual confiere
mayor especificidad a la prueba, pues se identifican anticuerpos particulares contra las proteínas
consideradas más inmunogénicas.
c) De tercera generación
Son las más utilizadas actualmente, ya que presentan una alta especificidad. En ellas se
emplean péptidos sintéticos (fabricados siguiendo un diseño específico en el laboratorio) con
secuencias particulares para cada virus, como es el caso de las pruebas diseñadas para determinar
anticuerpos contra VIH 1 y VIH 2.
En adición, los métodos más recientes de ELISA emplean en su proceso final el sistema
de anticuerpos-biotinilados / estreptavidina-enzima, que amplifica la lectura en unidades de
densidad óptica para ganar sensibilidad en los casos en que la concentración de anticuerpos
antivirales está muy reducida.
Inmunofluorescencia (IF)
La fluorescencia es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a
radiaciones de baja longitud de onda y alta energía (UV-Rx). Las radiaciones absorbidas
(invisibles al ojo), son transformadas en luz visible, o sea de una longitud de onda mayor a la
incidente.
42
La absorción de luz por parte de la molécula de fluorocromo la eleva a un estado de
excitación en el cual contiene mayor energía. La molécula permanece en el estado de excitación
por un período de tiempo muy corto. El retorno a un nivel de energía menor es acompañado por
emisión de luz (fluorescencia)
La IF es una técnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos (como
isotiocianato de fluoresceína).
La visualización de la cantidad de Ag-Ac formado se hace con la ayuda de un
microscopio de fluorescencia
Inmunofluorescencia Directa
Esta técnica utiliza muestras clínicas recolectadas apropiadamente que deben ser colocadas sobre
portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos específicos marcados con
isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los
antígenos víricos en el interior de las células. La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el
microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.
Esta técnica es útil para la identificación de virus como: Herpes Simple, Virus
Respiratorio Sincitial (VRS), Rabia, Influenza A, entre otros.
Inmunofluorescencia Indirecta
Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el
sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado
con fluorocromo (anti-anticuerpo marcado).
El proceso consta de dos etapas:
Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato
conocido específico (células que contiene virus.) sobre él se coloca el suero de quien se sospecha
la presencia de anticuerpos específicos, si la reacción es positiva se dará formación de complejo
antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado.
Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará
con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa.
Western blot
El término “blotting” hace referencia a la transferencia de macromoléculas biológicas
desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma. Este
proceso es necesario ya que todas estas macromoléculas están embebidas dentro de la matriz que
43
forma el gel, lo que imposibilita realizar su detección, mientras que en la membrana, se
encuentran accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma.
El método para proteínas más potente es el denominado Western blot en el que las
proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y posteriormente se transfieren a una membrana,
mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel (electroblotting). Una vez
completada esta operación la proteínas de interés son reveladas por el agregado de un anticuerpo
específico.
La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo permite la detección de una única
proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas. En la actualidad se utiliza como
criterio de identificación positivo de una proteína especifica en una mezcla compleja y para
obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.
El primer paso de todo Western Blot es la separación de las macromoléculas mediante
geles de electroforesis; después de la misma, las macromoléculas ya separadas en función de su
diferente peso molecular se transfieren a una segunda matriz, generalmente una membrana de
nitrocelulosa o PVDF. Posteriormente, se bloquea la membrana para evitar la unión inespecífica a
su superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la detección de la proteína de interés.
En el siguiente paso, se une a dicha proteína transferida un anticuerpo específico marcado con
una enzima y, finalmente, se añade un sustrato apropiado para dicha enzima con lo que se
produce un producto detectable como, por ejemplo, un precipitado cromogénico o fluorogénico
en la membrana. En la actualidad, los métodos más sensibles emplean sustratos
quimioluminiscentes que cuando se combinan con la enzima correspondiente, producen luz como
producto final, que puede detectarse mediante una película o una cámara CCD. En todos los
casos y sea cual sea el sustrato que se utilice, la intensidad de la señal se correlaciona con la
cantidad del antígeno en la superficie de la membrana.
44
PRÁCTICA No. 11
ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE VIRUS DE
LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) Y ANTÍGENO DE SUPERFICIE DEL
VIRUS DE LA HEPATITIS B (Ag HBs).
Introducción
Virus de inmunodeficiencia humana (HIV por sus siglas en inglés)
Es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente etiológico del Síndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Aunque se trata de un síndrome, es decir, un conjunto de
signos y síntomas y no de una sola enfermedad, por ser valido y más sencillo de aquí en adelante
nos referimos al SIDA como enfermedad. No existe vacuna contra el virus, por lo que una vez
que se desarrolla, casi inexorablemente lleva a la muerte en un tiempo muy corto.
En nuestro país, el informe, descripción y análisis de esta singular enfermedad, ha sido
objeto de múltiples actividades académicas, clínicas, e incluso culturales. A partir de abril de
1987, el SIDA se convirtió en una enfermedad sujeta a vigilancia epidemiológica; la notificación
de los casos tiene carácter de obligatoria e inmediata.
Hasta ahora se conocen dos variables genéticas del virus, en función del antígeno de
superficie que los clasifica en VIH-1 y VIH-2. Para el VIH-1 la glicoproteína externa es la gp120
y la de transmembrana es la gp41; para el VIH-2 la gp externa es la 140 y la de transmembrana es
la gp36.
Desde que se reconocieron los primeros casos de SIDA, una de las primeras líneas de
investigación ha sido lo referente a la transmisión del virus; conociéndose hasta el momento las
siguientes vías:
1. Sexual: homosexual, heterosexual.
2. Sanguínea: transfusión de sangre y/o hemoderivados.
3. Perinatal: durante el embarazo, en el parto, después del parto (leche materna).
Para el diagnostico de VIH se cuenta con:
45
Métodos directos (determinan estructuras de los virus), como:
 Aislamiento del virus en cultivos celulares
 Detección de antígenos virales con anticuerpos monoclonales
 Reacción en cadena de la polimerasa
 Hibridización con sonda de DNA marcadas
Métodos indirectos (donde se valoran anticuerpos contra el virus), como:
 Pruebas de Inmunoenzayo enzimatico (ELISA)
 Aglutinación pasiva con partículas de látex
 Inmunoelectrotransferencia (Western-Blot)
Hepatitis viral.
Es una enfermedad generalizada que afecta principalmente al hígado. Es causada por los
siguientes agentes:
1. Virus de la Hepatitis A (agente causal de la hepatitis infecciosa)
2. Virus de la Hepatitis B (asociado a la hepatitis sérica)
3. Virus de la Hepatitis C (causa de muchos casos de hepatitis postranfucional)
4. Virus de la Hepatitis D requiere de la presencia de del VHB. Asimismo, se ha identificado el
agente causal de otra de las formadas de la antes llamada hepatitis no A-no B
5. Virus de la Hepatitis E
Otros virus que tambien pueden ser agentes causales de la Hepatitis se encuentran: virus
Epstein Bar, rubéola, citomegalovirus, coxsakie, varicela zoster entre otros.
El virus de la Hepatitis B pertenece al grupo hepadnavirus y su transmisión es vía parenteral
(sangre y derivados, fomites contaminados por el virus). Al virus se le conoce como partícula
DANE, presente diversos antigenos que estimulas anticuerpos, lo cual se utiliza en el diagnostico
de la enfermedad, este puede detectarse de manera completa (virión completo) o en partes del
mismo, la cubierta proteínica determina el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y la
partícula interna antígeno core (o central) de la hepatitis B (HBcAg). Resiste la temperatura a
37ºC por 1 hora, 60ºC por 10 horas, 25ºC por una semana, 100ºC un minuto y 20ºC por 5 años. El
hipoclorito de sodio al 0.5 % lo inactiva en 3 minutos.
La infección tiene un periodo de incubación de 60 a 180 días; su comienzo es insidioso, con
poca o ninguna fiebre. Pudiendo presentarse a cualquier edad.
46
Objetivo
1. El alumno aprenderá el manejo de la técnica de Ensayo inmunoenzimático de fase sólida
(EIA), empleado para el diagnostico de HIV y Antígeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg).
Material y reactivos:
 Equipo Inmuno Comb HIV 1+2 PBS-Orgenics
 Equipo Inmuno Comb II para AgHBs
 Micropipetas con puntillas para 25, 50 y 100 l
 Tijeras
 Perforador
 Reloj
 Papel desechable
 Sueros problema
 Sueros control positivo y negativo
 Solución de hipoclorito de Sodio
Metodología
o Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de los sueros
problema, control positivo y negativo tanto para HIV y HBsAg
o Deposito de muestra. Compartimiento A.
Para HIV deposite por separado 50 l de los sueros problema, control positivo y negativo
dentro de cada pozo del compartimiento A perforando la cubierta de papel aluminio y
descargando la muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente
contenido en el compartimiento A mediante carga y descarga de la solución con la pipeta
en varias ocasiones. Utilice una puntilla por cada muestra y deséchela
Para Hepatitis B, deposite 75 l de los sueros ( problema, control positivo y negativo)
dentro de cada pozo del compartimiento A y continue el procedimiento antes mencionado
Desarrollo de la prueba
o Reacción antígeno-anticuerpo.
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Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa apuntando
hacia usted. Reinserte el peine varias veces para mover las burbujas de aire. Incube
durante 10 min a temperatura ambiente en el caso de HIV y para HBsAg se incubará 30
minutos a 37°C
Al final de la incubación extraiga el peine del compartimiento y seque el líquido
sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y perfore con las pinzas
el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento.
NOTA: Este último procedimiento se repetirá siempre antes de pasar de un
compartimiento a otro.
Lavado. Compartimiento B
Inserte el peine en el compartimiento B, para lograr un lavado adecuado mueva el peine
hacia atrás y adelante durante un periodo 2 min.
o Conjugado. Compartimiento C.
Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces. Para HIV Incube
durante 10 min a temperatura ambiente; para HBsAg incubar por 20 minutos a 37°C
Para el caso de HIV se continua de la siguiente manera:
o Lavado. Compartimiento D.
Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.
o Lavado. Compartimiento E.
Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.
o Reacción de color. Compartimiento F
Inserte el peine dentro del compartimiento F; Reinserte el peine varias veces durante 10
min. a temperatura ambiente.
o Detección de la reacción. Compartimiento E.
Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E, después de 1 min. retire el peine y
séquelo al aire completamente.
Para HBsAg del compartimiento D en adelante se procede de la manera siguiente :

 Reacción con fosfatasa alcalina. Compartimiento D.
Inserte el peine en el compartimiento D. Reinserte el peine varias veces para remover las
burbujas de aire. Incube durante 20 minutos a 37ºC.
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 Lavado. Compartimiento E.
Inserte el peine en el compartimiento E y agite vigorosamente por 2 minutos, moviendo el
peine hacia atrás y adelante.
 Reacción de color. Compartimiento F.
Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte varias veces igual que en A, e incube
durante 10 minutos a 37ºC.
 Detección de la reacción. Compartimiento E
Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E. Después de un minuto retire el peine y
séquelo al aire completamente.
Cuestionario
1. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de ELISA
2. ¿Cuándo se dice que el paciente es seropositivo a VIH?
3. ¿Cuál es la diferencia entre un paciente seropositivo y uno con SIDA?
4. ¿Cómo se puede prevenir el SIDA?
5. ¿Cómo se trata la enfermedad del VIH?
6. ¿Cuál es la diferencia entre los tipos de hepatitis?
7. ¿Cuáles son las formas de transmisión de los diferentes tipos de hepatitis y cuáles serían los
mecanismos de prevención?
8. Describa otros métodos para diagnosticar hepatitis, diferente a la hepatitis B.
49
PRÁCTICA No. 12
REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN
Escherichia coli
Introducción
Las bacterias son huéspedes de un grupo particular de virus denominados bacteriófagos o
simplemente fagos. Los fagos constituyen modelos ideales para estudios sobre la infección a
nivel celular, la relación huésped parásito, la multiplicación viral y estudios de ingeniería
genética. Por otro lado, también son muy útiles en la tipificación de cepas bacterianas.
En los bacteriófagos lisogénicos, también denominados temperados, el genoma del fago
se replica sincrónicamente con el genóforo bacteriano, pasando a la progenie cada vez que la
bacteria se divide por fisión binaria. En este estado lisógenico, los fagos integrados al genóforo
bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su separación. Estos genes permiten a la
bacteria lisógenica expresar nuevas actividades y producir diferentes proteínas.
El genoma del fago lisógenico puede modificar la estructura del polisacárido bacteriano y
su antigenicidad, así como codificar para la producción de toxinas bacterianas que causan
enfermedades tales como difteria, cólera, botulismo y síndrome urémico hemolítico.
Por otra parte, los bacteriófagos líticos o virulentos se replican dentro de la bacteria
huésped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos líticos más extensamente
estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con la letra T y diferentes
números (bacteriófagos de la serie T). Los fagos virulentos al destruir a las bacterias producen
placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en cultivos sobre placas de agar.
Objetivo
El alumno aprenderá a cultivar bacteriófagos en el laboratorio y conocerá su importancia en la
Microbiología.
Material y equipo
 Incubadora bacteriológica
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 Centrifuga
 Tubos para centrifuga
 2 filtros de nitrocelulosa de 0.45μm de espesor (adaptable a jeringa)
 1 jeringa de 20 a 40 mL
 Hisopos estériles o varilla de vidrio.
 1 asa bacteriológica
 Mecheros
 2 tubo de 5mL de caldo nutritivo o soya tripticaseína
 Cepa aislada de Escherichia coli
 2 frascos o tubos estériles de al menos 5mL
 1 pipeta pasteur o 1 micropipeta.
 Placas de agar nutritivo o STC (Soya Tripticaseína)
 1 muestra de aguas residuales o estancadas (aguas negras)
 Alcohol etílico al 70%
 Sanitas y/o algodón
 1 maskingtape o diurex
 1 marcador permanente de punto fino
Desarrollo
a. Tomar una colonia de la cepa de E. coli y sembrarla en un tubo con caldo nutritivo o soya
tripticaseína e incubar a 37°C por 24 horas en agitación a 200 rpm (un día antes de la
práctica).
b. En un frasco limpio colectar aproximadamente 10 mL de agua residual o estancada.
Tomar 5mL de esta agua y centrifugar a 3000 rpm durante 10 min y colectar el
sobrenadante con una jeringa estéril. Adaptar el filtro de nitrocelulosa de 0.45μm a la
jeringa y colectar el eluído en un tubo o frasco estéril en el cual se contendrá la muestra
presuntiva de fagos (cuidando de no romper el filtro con la presión que se ejerce con el
émbolo de la jeringa).
c. En condiciones de esterilidad, tomar una alícuota del cultivo en caldo de E. coli
(aproximadamente 100μL) y colocarlo en la placa con agar nutritivo. Extender la alícuota
sobre el agar mediante la técnica de arrastre con varilla de vidrio (extensión en
51
superficie), o si se prefiere sustituir ésta técnica mediante el uso de hisopos estériles para
hacer un sembrado masivo hasta que se absorba el cultivo.
d. Una vez absorbida la alícuota en el agar, se hace un goteo del filtrado con una pipeta
Pasteur o una micropipeta sobre la superficie del agar y nuevamente se deja secar.
e. Voltear la placa y una vez rotulada, dejar incubar 37°C durante 24 ó 48h.
f. Leer las placas a contra luz para observar las placas de lisis (unidades formadoras de
placa, UFP).
Nota: En muchos casos es recomendable hacer una previa propagación de los fagos,
como a continuación se describe:
Para la propagación de los fagos se requiere un caldo nutritivo o soya de tripticaseína
previamente crecido de E. coli a 37°C por 24 horas en agitación a 200 rpm.
A este caldo colocarle un volumen igual (1:1) del filtrado del agua residual descrita
anteriormente y dejarlo incubar por 24 o 48 horas más a 37°C, sin agitación.
Pasado el tiempo de incubación centrifugar el cultivo a 3000 rpm 10 min. Y recuperar el
sobrenadante con una jeringa estéril y posteriormente adaptar el filtro de nitrocelulosa de 0.45μm
y colectar el eluido en un tubo o frasco estéril en el cual se contendrá la muestra concentrada de
fagos.
La muestra es viable aproximadamente por 3 meses si se mantiene en refrigeración (aunque
pueden llegar a formarse cristales).
Observación
En las placas se deben observar zonas translúcidas (llamadas calvas de lisis) como se muestra en
la siguiente figura:
52
Fig. 7. Placas de replicación de bacteriófagos líticos. Placa de la izquierda: ausencia de calvas.
Placa de la derecha: presencia de calvas de lisis.
Resultados e interpretación
La presencia de calvas de lisis indica la actividad replicativa del bacteriófago con la consecuente
muerte del modelo bacteriano usado. Así mismo, su ausencia indica que no hay actividad de
bacteriófagos líticos.
Cuestionario
1. Anote usted un ejemplo de bacteriófago temperado.
2. ¿En qué mecanismo de recombinación genética entre bacterias se involucra la participación de
bacteriófagos?
3. Realice un esquema en donde se representen los principales componentes estructurales de los
bacteriófagos de la serie T.
4. Investigar ¿por qué ciertas cepas de E. coli son capaces de producir colitis hemorrágica?
5. Escriba otros ejemplos de géneros bacterianos susceptibles a bacteriófagos e indique el nombre
del bacteriófago.
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PRÁCTICA No.13
SEMINARIO DE PRUEBAS MOLECULARES PARA EL ANÁLISIS.

PCR Y SUS VARIANTES; RETROTRANSCRIPCIÓN, MÚLTIPLE,
ANIDADA, TIEMPO REAL, RFLP, SOUTHERN-BLOT, NORTHERN-
BLOT.
La incorporación de técnicas antes reservadas a la investigación básica es, probablemente, una de las
características más sobresalientes en la medicina actual. Una de ellas es la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), que permite copiar de forma exponencial una zona concreta de un genoma y que de
todas las técnicas disponibles para la amplificación de ácidos nucleicos es la más utilizada.
La amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es
otra técnica alternativa a los cultivos. Primero se realiza la amplificación de los fragmentos de ADN a
hibridar, con la reacción en cadena de la polimerasa que aumenta notablemente la sensibilidad de las
técnicas de detección de ADN.
La Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener más de 10 millones de copias de
una cadena de ADN de interés a partir de pocas moléculas de ésta. La sensibilidad de esta técnica requiere
de cuidados para que la muestra no esté contaminada previamente con otras cadenas de ADN que
pudieran generar amplificados.
Existen numerosas técnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR) con diferentes
aplicaciones en campos de diagnóstico, criminología, e investigación.
La PCR fue desarrollada por Kary Mullis para aumentar el número de moléculas de ADN blanco
en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una única molécula de ADN y una
sola copia de genes puede ser extraída de mezclas complejas de secuencias genómicas y visualizada como
bandas diferentes en geles de agarosa. El proceso se lleva a cabo de forma cíclica en un termociclador.
Esta técnica consiste, en una amplificación de secuencias específicas del ADN. Se basa en el uso de
secuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados primers o cebadores, que se hibridan específicamente
con cada una de las cadenas de ADN previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para
54
que la reacción se produzca se usa una enzima llamada Taq pol (ADN polimerasa termoestable obtenida
de la bacteria Thermus aquaticus) y desoxinucleótidos trifosfatos. La función natural de la ADN
polimerasa consiste en reparar y replicar el ADN. Los desoxinucleótidos trifosfatos se necesitan como
ladrillos para la construcción. El nucleótido al cual se une la polimerasa será complementario al de la base
en la posición correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza así una cadena simple de ADN,
complementaria y alineada a cada cebador.
Se realiza una serie repetida de ciclos, cada uno compuesto por tres pasos básicos:
desnaturalización a altas temperaturas (95°C) del ADN de doble cadena; alineamiento de los cebadores,
la temperatura se desciende a 55 – 72ºC y elongación del cebador, aquí se eleva la temperatura a 72ºC
permitiendo la incorporación de los desoxinucleótidos. Mientras tanto se van seleccionando los cebadores
y los desoxinucleótidos y se van sintetizando nuevas cadenas de ADN. Al final se consiguen miles de
copias de ADN del fragmento de ADN limitado por los cebadores. Los fragmentos de ADN obtenidos se
pueden identificar por varias técnicas: visualización en geles de agarosa o poliacrilamida con tinción con
bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta o hibridación con una sonda marcada. La combinación de
la PCR y las sondas de ácidos nucleicos marcadas promete ser el método más sensible para la detección e
identificación de los virus.
Variantes de la reacción en cadena de la polimerasa
Desde 1983, cuando se llevó a cabo por vez primera la reacción en cadena de la polimerasa, hasta
hoy se han desarrollado diversas variantes de dicha técnica para aumentar el potencial de ésta. En la PCR
multiplex se coamplifican en un mismo ensayo distintas zonas del ADN diana o distintos ADN diana con
los mismos o con distintos cebadores, de tal manera que se obtienen varios productos de la reacción. En la
PCR nested (PCR anidada) se lleva a cabo una amplificación doble debido a que se utiliza como «ADN
molde» de una segunda PCR el producto de una PCR inicial, en la que se ha amplificado una secuencia
dada. Esto aumenta la sensibilidad y la especificidad de la PCR, pero su principal problema es la fácil
contaminación de la muestra en el proceso. Finalmente, en la PCR reversa el ácido nucleico diana es un
molde de ARN del que por medio de una transcriptasa reversa se sintetiza una copia de ADN
complementario que se amplifica mediante una PCR estándar, esta reacción se conoce comúnmente como
RT-PCR (Retrotranscripción acoplada PCR). Además de amplificar el ácido nucleico de diversos
retrovirus, como el virus de la inmunodeficiencia humana o el virus de la hepatitis C, permite también
distinguir una infección activa de una latente debido a que se amplifica una copia en ADN de un ARN
mensajero, responsable de la expresión activa de proteínas por parte de un patógeno.
Frente a las limitaciones que presentan métodos diagnósticos convencionales como el cultivo, la
serología o el estudio histopatológico de las muestras, la amplificación de ácidos nucleicos por medio de
la PCR aporta grandes ventajas, como son una gran sensibilidad diagnóstica, así como una elevada
55
especificidad. Asimismo, uno de sus puntos fuertes es la rapidez diagnóstica, dado que permite obtener en
minutos u horas lo que antes precisaba días e incluso semanas. No obstante, no está exenta de
inconvenientes que no conviene olvidar a la hora de interpretar los resultados.
Uno de ellos es su elevada sensibilidad, que es también su mayor debilidad, dado que al igual que
amplifica exponencialmente el genoma diana también lo hace con cualquier genoma producto de una
contaminación de la muestra. Además, dada su capacidad para amplificar cantidades insignificantes de
ácidos nucleicos, no siempre es posible distinguir un resultado clínicamente significativo de aquel que no
lo es, y tampoco distingue aquellos casos de infección activa de una latente. Por ello, previo a la
interpretación de la PCR, es preciso establecer la cifra a partir de la cual un resultado es relevante desde el
punto de vista práctico.
Por otro lado, cierto tipo de muestras como orina, medios de hemocultivo, secreciones vaginales,
etc., contienen diversas sustancias que degradan la polimerasa con lo que inhiben la PCR, dando lugar a
falsos negativos. Otro inconveniente de la PCR es su alto costo, no sólo a causa de la técnica en sí y del
carísimo equipamiento que exige, sino también debido a la necesidad de una gran disponibilidad de
espacio en el laboratorio, porque para prevenir la contaminación de la muestra es preciso que las distintas
fases del proceso tengan lugar en lugares físicamente separados entre sí.
Actualmente hay disponible un amplio número de protocolos de PCR para la identificación de
diversos patógenos, pero sólo parte de ellos están disponibles comercialmente como la PCR frente a virus
del grupo herpes, papovavirus, flavivirus y retrovirus.
La PCR ha ayudado a establecer el pronóstico de distintas infecciones por medio de la
determinación cuali/cuantitativa del virus de la hepatitis C o por medio de la determinación de la viremia
plasmática en la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, en la que está reconocida la
importancia de la determinación de la carga vírica en sangre en el pronóstico de la infección y también en
la evaluación del tratamiento.
Para elegir un método de diagnóstico, además de la sensibilidad y la especificidad, hay que
considerar aspectos operativos de las técnicas a usar tales como el costo, la complejidad técnica del
ensayo, el volumen necesario y preparación de la muestra, el tiempo que requiere el proceso y la
disponibilidad comercial de los reactivos de calidad reconocida. Además, se debe considerar el nivel de
complejidad del laboratorio y la disponibilidad tecnológica y de recursos que requiere cada técnica.
RFLP (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción)
Esta técnica permite diferenciar distintos microorganismos mediante el análisis de patrones de
bandas, derivados de la rotura de su respectivo DNA, fue una de las primeras técnicas que se usó
ampliamente para detectar variaciones a nivel de la secuencia del ADN. Esta tecnología se basa en el
principio de que es posible comparar patrones de bandas generados a partir de moléculas de ADN de
56
diferentes virus que han sido sometidas a digestión con enzimas de restricción. Las diversas mutaciones
que afectan a las moléculas de ADN de muchas maneras producen fragmentos de longitud variable. Estas
diferencias de longitud de los fragmentos pueden observarse una vez realizadas la electroforesis, la
hibridación y la visualización.
El aislamiento del ADN es el primer paso en las tecnologías moleculares. El ADN extraído es
digerido con enzimas de restricción específicos, cuidadosamente elegidos. Cada enzima de restricción, en
condiciones apropiadas, reconocerá el ADN y lo cortará de manera predecible, dando lugar a un conjunto
reproducible de fragmentos de ADN (‘fragmentos de restricción') de diferentes longitudes.
Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia de ADN entre 4-8 bp. El
sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace fosfodiester en la hebra
de arriba (sentido) y otro enlace fosfodiester en la hebra complementaria (antisentido). Las endonucleasas
de restricción se denominan con tres o cuatro letras que proceden del nombre de la bacteria en la que se
han aislado (p. ej., la enzima Eco procede de Escherichia coli) y además se le añade un número romano
(Eco RI, Eco RII), debido a que se pueden encontrar varias enzimas de restricción diferentes, que
reconocen distintas secuencias nucleotídicas en la misma bacteria.
Existen diferentes tipos de enzimas de restricción, para los ensayos de tipificación genética se
emplean las de Tipo II, puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos. Se han identificado más
de 2300 endonucleasas de restricción de tipo II. Se denominan Isoschizomeros a aquellas enzimas que han
sido obtenidas de diferentes especies de bacterias, pero que reconocen la misma secuencia de DNA.
Los millones de fragmentos de restricción así obtenidos son separados comúnmente mediante
electroforesis en geles de agarosa. Dado que los fragmentos se verían como un rastro continuo si el gel se
tiñera con bromuro de etidio, la sola tinción no puede detectar los polimorfismos. Por consiguiente, debe
recurrirse a técnicas de hibridación como Southern-blot o Northern-Blot para detectar fragmentos
específicos.
Southern-blot
La transferencia del ADN se realiza por el método Southern, nombre tomado de E.M. Southern
(1975), quién inventó la técnica. En este método, primero se desnaturaliza el gel en una solución básica y
se pone en una bandeja. Se coloca sobre el gel una membrana porosa de nylon o de nitrocelulosa y al
conjunto se le superpone un peso. Todos los fragmentos de restricción de ADN que estaban en el gel se
transfieren, como cadenas simples a la membrana por acción capilar. Todos los fragmentos conservan en
la membrana el mismo patrón que tenían en el gel.
La membrana con el ADN patrón se incuba con la sonda de ADN. Las condiciones de incubación son
tales que si las cadenas de ADN de la membrana son complementarias a las de la sonda, se dará la
57
hibridación y se formarán duplos marcados. En condiciones muy rigurosas, no ocurrirá la hibridación con
un ADN que no sea homólogo o no emparentado. De este modo, la sonda reconoce las secuencias
complementarias e “idealmente” homólogas entre los miles o millones de fragmentos no detectados que
migran a través del gel.
Los fragmentos deseados se pueden detectar después de que haya una exposición simultánea de la
membrana hibridada y una película fotográfica.
Para detectar el subconjunto de fragmentos de ADN que interesan, de entre todos los fragmentos
generados por la digestión con restricción, se necesita una sonda, que es una molécula de cadena simple,
se marca convenientemente usando cualquier método estándar (por ejemplo un radioisótopo o
digoxigenina), y se hibrida con el ADN patrón que está adherido a la membrana.
Northern blot
El «northern blot» es el método más usado para el estudio de la expresión génica. Para realizar un
northern blot, una vez extraído el RNA, debe ser fraccionado en función de sus tamaños en gel
desnaturalizante de agarosa, transferido a un filtro de nitrocelulosa y sondado.
El gel de agarosa/formaldehído es un sistema sencillo de electroforesis desnaturalizante que
permite, con buena resolución, la separación por tamaños del RNA de cadena simple. Para proteger las
muestras de las RNAsas debemos mantener el material para su realización en agua con DEPC al 1 %
durante unas horas; esto incluye el aparato de electroforesis horizontal, peines y material auxiliar.
Se cargan entre 5 y 20 microgramos de RNA por pocillo, a los que previamente se les ha añadido
el tampón de carga con formamida, formaldehído, bromuro de etidio, colorante para seguir la
electroforesis y glicerol o sacarosa que aumente la viscosidad de la muestra y evite su difusión en el
tampón de electroforesis. Antes de cargar la muestra debe ser calentada (hervida un minuto, por ejemplo)
para separar las distintas hebras de RNA que aleatoriamente pudieran haber hibridado parcialmente entre
sí. El gel se «corre» a bajo voltaje (unos 40-50 voltios) durante las horas que sea necesario y que,
obviamente, dependen del tamaño del gel. Un procedimiento alternativo usa concentraciones más bajas de
formaldehído y la electroforesis se lleva a cabo en menos de dos horas.
Una vez obtenido el gel, se enjuaga, para eliminar el formaldehído, y a continuación se realiza la
transferencia en condiciones de humedad y se lleva a cabo por capilaridad. Posteriormente se incuba con
la sonda marcada radiactivamente por cualquiera de los métodos conocidos no habiendo diferencias
esenciales entre los procedimientos de hibridación de Northern y Southern.
Con el northern blot podemos saber si un gen se expresa o no, cuántos mensajes tiene (especies de
mRNA), qué tamaño tiene cada especie y con qué intensidad se expresa (abundancia de mRNA).
58
PRÁCTICA 14
TALLER DEMOSTRATIVO PARA EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE
VIRUS: PCR, ELECTROFORESIS, RESTRICCIÓN ENZIMÁTICA
Introducción
La dependencia que los virus tienen de una célula para su replicación dificulta su manejo en las
condiciones de cultivo que convencionalmente se emplean en el caso de otros agentes de
importancia infecciosa como bacterias, parásitos y hongos. Las técnicas moleculares ofrecen una
alternativa útil que se han aplicado para el análisis viral en diferentes áreas como la
epidemiológica, de investigación, taxonómica, desarrollo de vacunas, diagnóstico clínico, sólo
por mencionar algunas.
Podemos encontrar una amplia gama de técnicas, y los avances tecnológicos hacen que la
lista de opciones crezca velozmente cada día. Para incursionar en este terreno, vale la pena
conocer algunas de las técnicas que iniciaron el despliegue que la biotecnología ha alcanzado en
la actualidad. El taller considera tres técnicas, Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por
sus siglas en inglés) de punto final, Electroforesis en gel de agarosa (EGA) y Restricción
enzimática.
PCR de punto final
La PCR simula algunas de las condiciones que ocurren en la replicación natural del
DNA. El principio se basa en la amplificación enzimática de fragmentos de DNA limitados por
dos secuencias iniciadoras de oligonucleótidos o primers que por complementación, hibridizan
con hebras opuestas de la secuencia blanco. La PCR se constituye de varios ciclos, cada ciclo se
forma de tres etapas; inicialmente una desnaturalización térmica del DNA original, seguida de
un alineamiento de los iniciadores que encuentran su secuencia blanco por complementariedad
entre bases nitrogenadas y finalmente la extensión, que se da por la acción de una DNA
polimerasa termoestable que incorpora bases nitrogenadas complementarias a la hebra en la que
59
se ha alineado el iniciador a partir del extremo 3’ de éste. El ciclo se debe repetir en forma
continua durante unas 30 ocasiones, para amplificar un segmento de DNA con un tamaño
definido por la distancia entre los extremos 5´ de las secuencias iniciadoras. El funcionamiento
de la enzima depende de Mg+2 como cofactor y requiere de un ambiente amortiguador de pH. El
producto generado se denomina amplicón, en la PCR de punto final el amplicón se observa
mediante la electroforesis en gel de agarosa y se compara contra un patrón de bandas de ADN de
tamaño conocido.
Restricción enzimática
Uno de los avances más importante en los inicios de la biología molecular, fue el descubrimiento
de las endonucleasas de restricción, es decir de enzimas que pueden cortar el ADN y que tienen
la ventaja de que lo cortan en sitios concretos. Fueron descubiertas en bacterias, y son enzimas
que estas bacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus
bacteriófagos (fago lambda), DNA plasmídico y genómico. Con las enzimas, la bacteria puede
degradar este ADN foráneo sin degradar su propio ADN.
La ventaja de estas enzimas es que reconocen secuencias de DNA cortos, específicos y a
menudo palindromicos, un sitio para cortar, puede ser de 4, 6 u 8 pares de bases, pero tienen que
estar organizadas con una secuencia exacta y no otra. Por ejemplo, la enzima que se llama EcoR1
(porque se aisló de la bacteria Escherichia coli, que reside normalmente en el intestino), solo
corta si encuentra la secuencia GAATTC. Si hay una base que está cambiada ya no corta.
Estas enzimas de restricción, entonces permiten cortar el ADN en sitios específicos.
Algunas de ellas cortan dejando extremos cohesivos que se pueden pegar nada más por
complementariedad de bases. Esto quiere decir que un extremo que generó una enzima y otro que
generó la misma enzima aunque provengan de moléculas de ADN diferentes, se pueden unir y
generar lo que se llamó inicialmente un ADN recombinante. Este hito de los años 70 de poder
recombinar, es decir hacer construcciones genéticas, hacer ingeniería en genética fue la base de
una enormidad de otros avances.
Cada enzima de restricción tiene requerimientos específicos para su actividad óptima.
Condiciones tales como temperatura, pH, cofactores enzimáticos, composición de sales y fuerza
ioniza afectan la estabilidad y actividad de la enzima
Electroforesis en gel de agarosa (EGA).
60
La electroforesis es una técnica de separación de macromoléculas (proteínas o ácidos
nucleícos: ADN y ARN) la cual utiliza una un campo eléctrico para separar las moléculas
cargadas eléctricamente. La velocidad de separación de una molécula dada depende tanto de la
carga como de su tamaño. La electroforesis puede llevarse a cabo utilizando una amplia variedad
de medios de soportes porosos, tales como papel, acetato de celulosa, almidón, poliacrilamida o
agarosa (un polisacárido obtenido de las algas marinas). De todos estos medios, los geles de
poliacrilamida y los de agarosa son los más utilizados debido a que proporcionan mejor
resolución y son empleados habitualmente en las electroforesis para la separación de ácidos
nucleicos.
La electroforesis de ácidos nucleicos es mucho más simple que la separación de
proteínas debido a que estas moléculas (ADN o/y ARN) están cargadas negativamente debido a
los grupos fosfatos que conforman su estructura. Los fragmentos más pequeños normalmente se
separan en geles de poliacrilamida, mientras que los fragmentos más grandes se separan en geles
más porosos como los de agarosa.
Las muestras a separar son colocadas en un extremo del gel de agarosa en compartimentos
separados llamados “pocillos”. El gel debe estar sumergido en una solución buffer contenida en
una “cámara de electroforesis”. Los buffers permiten que se conduzca la corriente eléctrica
emitida por la cámara al mismo tiempo que ayudan a mantener la integridad de los ácidos
nucleicos (los buffers más utilizados con este fin son TAE (TRIS base + Ácido Acético Glacial
+ EDTA) y TBE (TRIS base + Ácido Bórico + EDTA)). Posteriormente, y con el ánodo situado
en el extremo opuesto de donde se encuentras las muestras, se aplica el potencial eléctrico.
Debido a la carga negativa de los ácidos nucleicos estos migraran hacia el ánodo. Los fragmentos
más pequeños (es decir aquellos con el peso molecular más bajo) se moverán en el gel con
relativa facilidad y por tanto migraran rápidamente, mientras que los fragmentos más grande se
moverán más lentamente.
El resultado final son una serie de fragmentos de ácidos nucleicos que se han separado
basándose en su diferencia de tamaño. Los fragmentos separados se visualizan o se tiñen
sumergiendo el gel en un colorante llamado bromuro de etidio, que se une al ácido nucleico y
fluorece en naranja cuando se expone a la luz ultravioleta revelando así un conjunto de
fragmentos fluorescentes llamados “bandas”.
61
Fig.8. Esquema representativo de la electroforesis en gel de agarosa EGA
Objetivo
Que el alumno conozca los requerimientos necesarios para realizar las técnicas de PCR,
EGA y Restricción enzimática y que participe en el montaje de estas técnicas en el laboratorio de
virología.
Técnica de PCR
Material
 Tubos para Reacción de PCR.
 Puntillas estériles para micropipetas.
 Micropipetas de volúmenes variables.
 Baño de hielo.
 Gradilla para tubos de PCR.
 Guantes de látex.
 Microcentrífuga.
 Termociclador.
 Cámara de electroforesis horizontal.
62
 Transiluminador.
 Marcadores de pares de bases.
 Buffer de corrida.
 Buffer de muestra.
 Agarosa al 1% con bromuro de etidio.
 MgCl2 50 Mm.
 Buffer para PCR 10X.
 dNTP´s.
 Iniciadores (primers).
 ADN plantilla.
 Enzima Taq DNA polimerasa.
 Agua inyectable.
Desarrollo
1. Limpiar con alcohol al 70% el área de trabajo.
2. Colocarse los guantes de latex.
3. Marcar los tubos para PCR con un patrón que permita identificar las muestra problema y
controles.
4. Sacar los reactivos del congelador; mantenerlos en el baño de hielo durante todo el proceso.
5. Realizar la mezcla de reacción de PCR por separado para cada prueba de acuerdo a al
siguiente tabla, teniendo cuidado de respetar el orden de colocación de los reactivos. Se puede
guiar en el esquema para realizar una PCR individual.
Reactivo Volúmen (l)

1. MgCl2 50 Mm 0.5
2. Buffer Taq 10X 2.5
3. dNTP´s 10 mM 0.5
4. Iniciador 1 (50 pmol/l) 0.4
5. Iniciador 2 (50 pmol/l) 0.4
6. Taq polimerasa 5U/l 0.2
63
7. ADN plantilla* 5.0
8. Agua inyectable 15.5
Volúmen final 25.0

*El ADN plantilla es diferente para controles y muestra.
La prueba se puede agilizar, preparando una mezcla maestra que contenga todos los
reactivos, excepto el ADN plantilla, considerando una reacción extra del número de reacciones a
realizar. Por ejemplo si se tienen dos controles y una muestra problema, se calcula el volúmen
total de cada reactivo para cuatro reacciones. Basándose en la tabla anterior, la mezcla maestra se
prepararía como sigue:
Reactivo Vol. (l) Reacciones a Vol. total (l)

Por preparar
reacción 4
1. MgCl2 50 Mm 0.5 X4 2.0
2. Buffer Taq 10X 2.5 X4 10.0
3. dNTP´s 10 mM 0.5 X4 2.0
4. Iniciador 1 (50 0.4 X4 1.6
pmol/l)
5. Iniciador 2 (50 0.4 X4 1.6
pmol/l)
6. Taq polimerasa 5U/l 0.2 X4 0.8
7. Agua inyectable 15.5 X4 62.0
Vol. total/ Vol. total de la

Reacción mezcla
20 80
64
Descongelar todos los reactivos, dar un spin en la microcentrífuga y
mantenerlos en baño de hielo
Mgcl2
Buffer Taq 10X
dNTP’s
Iniciador 1
Iniciador 2
Taq Polimerasa
ADN plantilla
Agua inyectable
Mezclar en vortex, dar un spin en la microcentrífuga, colocar en el termociclador y aplicar el

programa para los productos deseados
Esquema para la realización de una reacción de PCR individual
65
De la mezcla maestra se toma el volumen por reacción individual y se transfiere a cada
uno de los tubos para PCR. Para este caso sería un volumen de 20.0 l que contiene todos los
reactivos, excepto ADN plantilla. Posteriormente se prepara la mezcla de reacción de PCR para
cada prueba:
Mezcla maestra 20.0 l
ADN 5.0 l
25.0 l
Descongelar todos los reactivos, dar un spin en la microcentrífuga y

mantenerlos en baño de hielo
Calcular las cantidades de cada reactivo (excepto el ADN plantilla) en un volumen suficiente
para el número de reacciones a realizar, considerando una reacción más de las necesarias
Pasar al vortex y dar un spin

de la mezcla maestra en la
microcentrífuga
Distribuir en cada tubo el

volumen de una reacción
individual
Adicionar el ADN plantilla a cada tubo, mezclar en vortex, dar un spin en la microcentrífuga,
colocar en el termociclador y aplicar el programa para los productos deseados
Esquema 2. Realización de PCR preparando una mezcla maestra
66
Guardar los reactivos en congelación una vez hecha la mezcla.
6. Tapar los tubos de reactivos perfectamente y dar un spin en la microcentrífuga.
7. Colocar los tubos de PCR en el termociclador en el programa necesario para obtener los
productos.
8. Correr 5 l de cada producto mediante EGA al 1% con bromuro de etidio en condiciones de
corrimiento adecuadas para el amplicón. Terminado el tiempo de corrida el gel se coloca en el
transiluminador y los productos de PCR se identifican por comparación con los marcadores
de pares de bases.
Técnica de Restricción enzimática

Material, reactivos y equipo
 Tubos para Reacción de 0.5 ml (eppendorf)
 Baño de hielo.
 Gradilla para tubos de 0.5 ml
 Guantes de látex.
 Microcentrífuga.
 Buffer 10X/enzimas de restricción
 ADN
Desarrollo
1. Limpiar con alcohol al 70% el área de trabajo.
2. Colocarse los guantes de látex.
3. Marcar los tubos con un patrón que permita identificar la muestra problema.
4. Sacar los reactivos del congelador; mantenerlos en el baño de hielo durante todo el
proceso.
5. Realizar la mezcla de reacción por separado de acuerdo a la siguiente tabla, teniendo
cuidado de respetar el orden de colocación de los reactivos.
67
Reactivo Volúmen (l)
Agua esteril desionizada 16.3
Buffer 10X 2.0
BSA acetilada , 10 g/l 0.2
DNA, 1g/l 1.0
Mezclar perfectamente bien y
agregar:
Enzima de restricción 0.5
_______
Volumen final 20.0
6. Mezclar suavemente por pipeteo, cerrar el tubo y centrifugar por pocos segundos en una
microcentrífuga
7. Incubar entre 1 a 4 horas a 37°C
8. Adicionar el buffer a una concentración final 1X y proceder a un análisis en gel de
agarosa de los fragmentos obtenidos.
Técnica de EGA.
Material, reactivos y equipo
 Cámara de electroforesis horizontal.
 Transiluminador de luz UV.
 Marcadores de peso molecular para ácidos nucleicos.
 Buffer de carga para la muestra.
 Buffer de corrida TAE o TBE.
 Agarosa
 Bromuro de etidio.
 Microondas o parilla de calentamiento.
 Matraz Erlenmeyer de 100ml
68
Desarrollo
1. En un matraz Erlenmeyer pesar 0.3g de agarosa e hidratarla con 30 ml de buffer TAE o TBE
(esto para geles al 1%).
2. Disolver por calentamiento la agarosa hasta que esta quede traslucida (sin presencia de
ningún cristal).
3. Dejar enfriar unos minutos la agarosa (hasta que no haya emisión de vapores); agregar 1.2µl
de bromuro de etidio y agitar para mezclar.
4. Verter en el soporte para geles colocando el peine a utilizar (este depende de la cantidad y
volumen de muestras a trabajar).
5. Dejar enfriar hasta gelificar.
6. Una vez gelificado retirar cuidadosamente el peine y colocar el gel (con todo y soporte) en la
cámara de electroforesis y agregar buffer de corrida (esto dependerá, entre otras cosas, del
buffer con que se haya hidratado el gel) hasta cubrir completamente el gel.
7. Con la ayuda de la micropipeta mezcle 1µl de buffer de carga por cada 5µl de muestra y
deposítelos en un pocillo.
8. Repita la operación con cada una de las muestras (teniendo cuidado de no colocar las
muestras en el mismo pocillo). Es recomendable colocar en un pocillo de los extremos
marcador de peso molecular (para ADN o ARN según sea el caso) como referencia.
9. Cierre la cámara de electroforesis y conecte a la fuente de poder para que inicie el potencial
eléctrico (el voltaje, el amperaje y el tiempo de corrida dependen del tipo de muestras que se
esté analizando).
10. Transcurrido el tiempo de corrimiento eléctrico retire el gel (cuidando de no romperlo) y
colóquelo en el transiluminador para su visualización.
11. Analizar.
Observación
Con la exposición del gel a una fuente de luz ultravioleta lograran distinguirse “bandas”
de color naranja en los diferentes carriles del gel donde se haya depositado muestra, como se
muestra en la figura siguiente:
69
Fig. 9. Gel de agarosa expuesto a luz UV. Las bandas naranjas emitidas indican ADN o
ARN unido a bromuro de etidio.
Interpretación y resultados
La visualización de bandas en el gen debe ser comparadas con el marcador de peso
molecular que convenga. La interpretación está en función de la muestra a analizar.
Cuestionario
1. Definir una enzima de restricción
2. Que hace una enzima de restricción
3. A partir de cuales organismos se aíslan enzimas de restricción
4. Definir “una unidad” para las enzimas de restricción
5. Que significa Eco RI
6. ¿Qué ventaja y/o desventajas tiene usar buffer TAE sobre TBE?
7. ¿Cómo se ve afectada la porosidad del gel por su concentración?
70
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BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MANUAL DE LABORATORIO DE VIROLOGIA

Profesores que lo elaboraron

NÚMERO DE LA TÍTULO DE LA PRÁCTICA PÁGINA

Práctica 1 Seminario: Pruebas de hemaglutinación (HA) e 4

Práctica 10 Seminario: Pruebas para el diagnóstico clínico de 38

Práctica 12 Replicación de bacteriófagos líticos en 50

PCR y sus variantes; retrotranscripción, múltiple,

anidada, tiempo real, RFLP, Souther blot,

Práctica 14 Taller demostrativo para el diagnótico molecular 59

Fig. 2. Representación de la reacción de HA

Fig. 3. Sedimentos en la prueba de HA

Primera etapa: Reconocimiento Ag viral – Ac

Viriones con Anticuerpos anti-HA Neutralización

La presencia de anticuerpos que puedan reconocer aislamientos virales, permite realizar

Fig.4. Sedimentos correspondientes a las pruebas de IHA+ e IHA –

Fig. 6. Compartimentos del huevo fértil de ave.

% Positividad  50% - 50% 66.6 – 50.0 16.6

V.I.C.= log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49

Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de positividad

Las pruebas serológicas con mayor aplicación en el diagnóstico viral son:

ELISA (enzyme linked inmuno sorbent assay).

Para HBsAg del compartimiento D en adelante se procede de la manera siguiente :

SEMINARIO DE PRUEBAS MOLECULARES PARA EL ANÁLISIS.

Reactivo Volúmen (l)

Volúmen final 25.0

Reactivo Vol. (l) Reacciones a Vol. total (l)

7. Agua inyectable 15.5 X4 62.0

Vol. total/ Vol. total de la

Buffer Taq 10X

Mezclar en vortex, dar un spin en la microcentrífuga, colocar en el termociclador y aplicar el

Esquema para la realización de una reacción de PCR individual

Descongelar todos los reactivos, dar un spin en la microcentrífuga y

Pasar al vortex y dar un spin

Distribuir en cada tubo el

Esquema 2. Realización de PCR preparando una mezcla maestra

Técnica de Restricción enzimática

Müller, B., Grossniklaus, U. 2010. Model organisms--A historical perspective. J Proteomics.

Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud ambiental-

Pazos-Salazar, N., Briones-Rojas, R. y León-Tello, G. 2007. Virología Básica y Clínica. Ed.

Ramos G. Milagros, Martínez S. Alberto. Curso de cultivos celulares. Universidad Autónoma de

Rev Clin Esp 2002;202(5):272-4 273

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