FACULTAD DE CIENCIAS 

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA 
 
 
 
TESIS DOCTORAL 
 
 

Avances en el control de la contaminación por 
metales: nuevas metodologías de análisis y 
especiación metálica en sistemas acuáticos.   
Estudios en la Bahía de Algeciras 
 
 
 
 
MARGARITA ISABEL DÍAZ DE ALBA 
Cádiz, 2013 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Los trabajos de investigación presentados en esta Tesis Doctoral han sido realizados
gracias a la financiación recibida del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte a través de
la concesión de la beca de investigación del programa de Formación de Profesorado
Universitario, de duración 1/05/2007-30/04/2011, con referencia AP2006-03906. Además,
parte de la investigación de esta Tesis (Capítulo 4) se engloba dentro del Proyecto de
Investigación de Excelencia del Plan Andaluz de Investigación denominado “Evaluación del
efecto de la contaminación por actividades antropogénicas crónicas sobre el medio litoral”
(PAI 2006: P06-FQM-02075) concedido por la Junta de Andalucía. Asimismo, durante la
estancia en la Universidade do Algarve (Portugal), bajo la dirección del profesor Dr. D. Jose
Paulo Soares Pinheiro, se realizó un estudio sobre especiación metálica que se encuentra
detallado en el Capítulo 3.

Los estudios descritos en la presente Memoria se encuentran recogidos en las

siguientes publicaciones y comunicaciones a congresos:

Publicaciones

 M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño, M.J. Casanueva-Marenco, M. García-Vargas, C.

M. Kosore, Assessment of the metal pollution, potential toxicity and speciation of
sediment from Algeciras Bay (South of Spain) using chemometric tools, Journal of
Hazardous Materials, 190 (2011) 177-187.

 M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño, M. García-Vargas, Solid phase extraction of

copper traces using poly(styrene-divinylbenzene) membrane disks modified with
pyridoxal salicyloylhydrazone in water samples, Talanta, 100 (2012) 432-438.
 M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño, M. García-Vargas, J.P. Pinheiro, Lead
electrochemical speciation analysis in seawater by using AGNES and SSCP
techniques. En preparación.
 M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño, M. García-Vargas, A. Taye, Assessment of the
metal pollution in Algeciras Bay: studies in water, sediment and fish. En preparación.
 C.M. Kosore, M.D., Galindo-Riano, M. Díaz-de Alba, M. García-Vargas, The Effects of
Acetic Acid and DTPA on the Mobility of Sediment-Bound Heavy Metals in Algeciras
Bay, Southern Spain. En preparación.
Congresos

 M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño, M. Separation and

García-Vargas,
preconcentration of Cu(II) traces by solid-phase extraction with modified SDB
membrane disks using pyridoxal salicyloylhydrazone, 2nd EuChems Chemistry
Congress, Turín (Italia), Septiembre 2008.

 A.I. Pérez Cordovés, M.D. Galindo-Riaño, M.J. Casanueva-Marenco, M. Díaz-de

Alba, H. El Mai, F. Domínguez Lledó, M. García-Vargas, Metodología y validación del
análisis y la especiación de metales pesados en muestras de sedimentos acuáticos,
VII Congreso Internacional de Química e Ingeniería Química, La Habana (Cuba),
Octubre 2009.

 M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño, J.J. Vicente-Martorell, M.J. Casanueva-

Marenco, M. García-Vargas, A. Taye Assefa, Assessment of bioaccumulation and
bioavailability of Ni and Cr in fish species from Algeciras Bay (Spain), SETAC
Europe Annual Meeting, Science and Technology for Environmental Protection,
Sevilla (España), Mayo 2010.

 C. Mitto Kosore, M.D. Galindo-Riaño, M.J. Casanueva-Marenco, M. García-Vargas,

M. Díaz-de Alba, Assessment of the metal pollution, potential toxicity and
speciation of sediment from Algeciras Bay (South of Spain) using chemometric
tools, VII Colloquium Chemiometricum Mediterraneum, Granada (España), Junio
2010.

 M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño, M. García-Vargas, Metal speciation in

seawater: links to bioaccumulation in fish tissues, 2as Jornadas de Electroquímica
e Inovacão, Faro (Portugal), Febrero 2011.

 M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño, M. García-Vargas, J.P. Pinheiro, Lead

speciation in seawater by AGNES and SSCP, 2as Jornadas de Electroquímica e
Inovacão, Faro (Portugal), Febrero 2011.
 I promise myself...

To be strong that nothing can disturb my peace of mind.

To talk health, happiness, and prosperity to every person I meet.
To make all my friends feel that there is something worthwhile in them.
To look at the sunny side of everything and make my optimism come true.
To be just as enthusiastic about the success of others as I am about my own.
To think only of the best, to work only for the best, and to expect only the best.
To forget the mistakes of the past and press on to the greater achievements of the future.

Christian D. Larson
The Optimist Creed
 Ha sido un largo camino recorrido lleno de esfuerzo y dedicación. Camino durante el
cual he tenido la suerte de sentir el apoyo y colaboración de muchas personas, que tal vez
ni siquiera sepan lo que han significado para mí en esta etapa de la vida. Por todo ello, es
un verdadero placer utilizar este espacio para expresar mi más sincero agradecimiento a
todas ellas.

En primer lugar, me gustaría agradecer a mis directoras de Tesis, Dra. Dña. María
Dolores Galindo Riaño y Dra. Dña. María Dolores Granado Castro, por haber confiado en mí
desde un principio, por su gran dedicación, ayuda y orientación en este proyecto, así como
su incansable espíritu de trabajo y, en especial, sus maravillosos consejos que me han
impulsado a seguir adelante.

Por supuesto, un gran y sincero agradecimiento va dirigido al Profesor Dr. D. Manuel

García Vargas, por su constante apoyo y confianza en mi formación investigadora en la
Universidad de Cádiz desde los inicios de este trabajo.

A mis compañeros de Geoquímica Marina, Pilar, Carlos, Manuel Pedro, Carolina, Juan
Pinto, Jose, Mostapha, Mirella, Vicky y Juanjo, que siempre han estado dispuestos a
resolverme cuantas dudas he tenido; y a Clara, Estrella, Abdellah, Hafida y Bahija porque
de compañeros pasaron a ser amigos, por ofrecerme su apoyo en esos días que todo
parece salir del revés, y porque juntos hemos pasado buenísimos momentos tanto en el
laboratorio como fuera del mismo.

A los colaboradores Adrián, Antonio, Nico, Pedro y Eva, por su ayuda brindada, así
como por las risas que nos hemos echado en el laboratorio, a José María, Laura y al resto
del Departamento de Química Analítica, por ser una fuente inagotable de amistad y
compañerismo, y por hacer tan grata la convivencia.

A Cristina, María José, y Marta, por todas las palabras de ánimo que me han prestado,
por todos los buenos y no tan buenos momentos que hemos vivido juntas desde que
empezamos la carrera, y por estar siempre ahí, cuidándonos unas a otras.

No se me olvida la gente que he ido conociendo durante el transcurso de este trabajo,

además de los que han estado desde siempre a mi alrededor mostrando su afecto y cariño
y que de una forma u otra han aportado su granito de arena: Charles, Anteneh, Ana Isa,
Joaquín, Luís, María del Mar, Khadija, Ilyas, María Jesús, Manu, Ana y Fran.
 Asimismo, me gustaría expresar desde estas líneas un fuerte agradecimiento al
Profesor D. José Paulo Soares Pinheiro por su acogida en la Universidade do Algarve y su
dirección durante mi estancia allí. Ha sido un inmenso placer conocerle y haber tenido la
oportunidad de aprender de él. En Faro conocí a gente estupenda, entre las que destacan
Nataliya y Shubhanchi que fueron mi máximo apoyo y a las cuales les debo muchísimo por
hacerme sentir como en casa, aun estando lejos de ella. Gracias por aquella experiencia
inolvidable.
A Angel, que tuve la gran suerte de conocerlo antes del final de este camino, y que me
brindó toda su confianza y apoyo incondicional. Por hacerme ver que el vaso siempre
estará lleno y conseguir que todos los días me levante con una sonrisa. A él le debo mucho
de lo que soy ahora y de cómo seremos en un futuro. Gracias por aguantarme, escucharme
y amarme.

Y por último, pero no por ello menos importante, deseo expresar mis más profundo
agradecimiento a mi familia: a mis abuelos, aunque algunos estén un poquito más lejos, a
mis padres, por su intenso apoyo y cariño, por aguantar mis nervios y agobios, y por
supuesto, por dedicarme siempre unas palabras de aliento que mantenían mi ilusión por
seguir avanzando en el mundo de la investigación; y a mi hermana y a Roby por estar
siempre cuando los he necesitado y sonsacarme miles de sonrisas.

A todos y cada uno de vosotros, ¡GRACIAS!

 A mi familia,
por ser fuente de inspiración para mi superación
 Índice

Índice

Objetivos ……………………………………………………………………………………………………….. 1

Capítulo 1. Introducción: Metales pesados en el medio ambiente ..................... 7

1.1. El agua y su contaminación por metales pesados ..…………………………………. 7
1.2. Fuentes de contaminación por metales pesados …………………………………….. 23
1.3. Distribución de metales pesados en ecosistemas acuáticos ……………………… 27
1.3.1. Sumideros de metales en ecosistemas acuáticos …………………………… 31
1.4. Especiación de metales en ecosistemas acuáticos …………………………………… 34
1.4.1. Especiación de metales en aguas ………………………………………………… 38
1.4.2. Especiación de metales en sedimentos …………………………………………. 40
1.5. Legislación ambiental ……………………………………………………..…………………... 44

Capítulo 2. Análisis por extracción en fase sólida del contenido de cobre en

aguas naturales ……………………………………………………………………….….…..…........... 55
2.1. El cobre en la naturaleza ……………………………………………………………………… 56
2.2. Extracción en fase sólida aplicada al análisis de metales pesados en aguas . 58
2.2.1. Fundamento de la SPE ……………………………………………………………….. 60
2.2.2. Tipos de formato ……………………………………………………………………….. 60
2.2.3. Tipos de adsorbentes y selección adecuada de discos ……………………. 63
2.3. Determinación de metales pesados en aguas naturales por extracción en
fase sólida SPE…………………………………………………………………………………….. 69
2.4. Aplicabilidad de las hidrazonas en extracción en fase sólida con discos de
membrana ………………………………………………………………………………………….. 74

i
Índice

2.5. Un nuevo método de análisis de Cu(II) por extracción en fase sólida ………. 76
2.5.1. Estudios previos para la elección del reactivo orgánico para SPE …….. 77
2.5.2. Piridoxal Saliciloilhidrazona ……………………………………………………….... 82
2.5.2.1 Estabilidad de la disolución metanólica de PSH ………………….. 85
2.5.3. Estequiometría del complejo Cu-PSH ……………………………………………. 85
2.5.3.1. Método de la razón molar ………………………………………………. 87
2.5.3.2. Método de las variaciones continuas ……………………………….. 90
2.5.4. Constante de formación del complejo Cu(II)-PSH ………………………….. 92
2.5.5. Equipos y metodología de análisis de Cu(II) utilizando extracción en
fase sólida …………………………………………………………………………………. 95
2.5.5.1. Equipos utilizados …………………………………………………………… 95
2.5.5.2. Metodología de análisis de Cu(II) utilizando extracción en
fase sólida ……………………………………………………………….……. 96
2.5.6. Optimización de la metodología de análisis de Cu(II) por SPE
mediante el empleo de PSH ………………………………………………………… 99
2.5.6.1. Estudio de la influencia de la naturaleza del eluyente ………... 101
2.5.6.2. Estudio del volumen de eluyente en la recuperación del
metal ……………………………………………………………………………. 104
2.5.6.3. Estudio de la influencia del pH de la muestra sobre la
eficacia de la SPE …………………………………….……………………. 105
2.5.6.4. Estudio de la influencia de la cantidad de reactivo
inmovilizado en el disco de membrana SDB ……………………… 106
2.5.6.5. Estudio de la influencia de la velocidad de flujo de la
muestra y del eluyente durante el proceso de
preconcentración del metal……………………………………………… 107
2.5.6.6. Optimización de las variables más significativas: Diseño de
experimento factorial fraccionario 33-1 ……………………………… 108
2.5.7. Características analíticas del método propuesto para la extracción en
fase sólida de iones Cu(II) en aguas naturales ……………………………… 113
2.5.7.1. Reutilización y capacidad máxima del disco ………………………. 113
2.5.7.2. Volumen máximo de muestra ………………………………………….. 114
2.5.7.3. Curva de calibrado …………………………………………………………. 115
2.5.7.4. Límite de detección y cuantificación …………………………………. 116
2.5.7.5. Reproducibilidad del método …………………………………………… 116

ii
 Índice

2.5.7.6. Interferencias del método de separación y preconcentración

de Cu(II) por SPE con discos modificados con PSH .......…….. 119
2.5.7.6.1. Efecto de los iones mayoritarios y minoritarios
presentes en agua de mar ………………………………. 119
2.5.7.6.2. Efecto de la presencia de iones de metales
pesados presentes en agua de mar ………………….. 121
2.5.8. Validación del método de extracción en fase sólida ….……………………. 123
2.5.9. Comparación del método propuesto con otros descritos en la
bibliografía ………………………………………………………………………………… 126
2.6. Conclusiones …………………………………..………………………………………………….. 129

Capítulo 3. Estudio de especiación de plomo en agua de mar mediante

AGNES y SSCP …………………………………………………………………………….…..…........... 133
3.1. El plomo en la naturaleza …………………………………………………………………….. 133
3.2. Técnicas electroanalíticas aplicadas al análisis y especiación de metales
pesados ……………………………………………………………………………………………………. 137
3.2.1. Voltamperometría de redisolución ………………………………………………… 140
3.2.2. Cronopotenciometría de redisolución de barrido (SSCP) …………………. 146
3.2.3. Redisolución en ausencia de gradiente y en equilibrio Nernstiano
(AGNES) …………………………………………………………………………….……… 148
3.3. Fundamentos teóricos de las técnicas SCP y SSCP …………………………………. 151
3.3.1. Fundamentos de la Cronopotenciometría de Redisolución (SCP) ……… 151
3.3.2. Fundamentos de la Cronopotenciometría de Redisolución de Barrido . 159
3.3.2.1. Expresión para la curva SSCP en el caso de una muestra que
solo contenga metal ………………………………………………………. 160
3.3.2.2. Expresión para la curva SSCP en el caso de que existan
ligandos en la muestra …………………………………………………… 162
3.4. Fundamentos teóricos de la técnica AGNES …………………………………………… 174
3.5. Material y metodología de análisis de Pb en agua de mar utilizando AGNES
y SSCP ……………………………………………………………………………………………….. 182
3.5.1. Disoluciones y equipos utilizados .………………………………………………… 182
3.5.2. Metodología de análisis de Pb en agua de mar utilizando AGNES y
SSCP …………………………………………………………………………………………. 184
3.5.2.1. Metodología para el análisis del carbono orgánico ……………… 185
3.5.2.2. Experimentos de AGNES-SSCP ………………………………………… 186
3.5.2.2.1. Metodología para AGNES ……………………………….… 186

iii
Índice

3.5.2.2.2. Metodología para SSCP ……………………………………. 192

3.6. Resultados del análisis de especiación de Pb en agua de mar sintética y
real ……………………………………………………………………………………………………. 202
3.6.1. AGNES ……………………………………………………………………………………… 202
3.6.1.1. Determinación de Epeak a partir de una medida de DPP para
obtener el potencial de deposición E1 que se aplicará en
AGNES ………………………………………………………………………….. 202
3.6.1.2. Evaluación del parámetro h mediante calibración de una
disolución de metal sin ligando ……………………………………….. 203
3.6.1.3. Aplicación de AGNES a las muestras de estudio ………………… 204
3.6.2. SCP y SSCP ……………………………………………………………………………….. 211
3.6.2.1. Repetibilidad de la señal analítica en SCP ………………………. 211
3.6.2.2. Reproducibilidad de las curvas SSCP ……………………………….. 212
3.6.2.3. Aplicación de SSCP a muestras sintéticas de agua de mar …. 213
3.6.2.4. Aplicación de SSCP a muestras reales de agua de mar ………. 217
3.6.3. Comparación entre AGNES y SSCP ………………………………………………. 220
3.7. Conclusiones ………………………………………………………………………………………. 221

Capítulo 4. Evaluación de la contaminación metálica en la Bahía de Algeciras 225

4.1. Antecedentes y descripción de la zona de estudio ………………………………….. 226
4.1.1. Clasificación de las aguas de la Bahía de Algeciras ………………………… 229
4.1.2. Estudios previos de contaminación metálica en la Bahía de Algeciras 230
4.2. Metales estudiados en la Bahía de Algeciras ………………………………………….. 232
4.2.1. Arsénico ……………………………………………………………………………………. 232
4.2.2. Níquel ……………………………………………………………………………………….. 235
4.2.3. Cobalto ……………………………………………………………………………………… 236
4.2.4. Cromo .……………………………………………………………………………………… 238
4.3. Toma de muestra ……………………………………………………………………………….. 240
4.3.1. Muestras de agua ………………………………………………………………………. 242
4.3.2. Muestras de sedimento ………………………………………………………………. 243
4.3.3. Muestras de peces ……………………………………………………………………… 244
4.4. Protocolos de limpieza …………………………………………………………………………. 245
4.4.1. Procedimiento general de limpieza de material ……………………………… 246

iv
 Índice

4.4.2. Procedimiento de limpieza en la toma de muestra de aguas ..…………. 247

4.5. Equipos y metodología …………………………………………………..……………………. 249
4.5.1. Equipos utilizados ………………………………………………………………………. 249
4.5.2. Metodología ………………………………………………………………………………. 250
4.5.2.1. Análisis de parámetros generales …………………………………….. 250
4.5.2.2. Especiación de As en aguas …………………………………………….. 251
4.5.2.3. Especiación de Ni y Co en aguas ……………………………………… 253
4.5.2.4. Especiación de Cr en aguas …………………………………………….. 255
4.5.2.5. Análisis del contenido total de metales en sedimentos ……….. 259
4.5.2.6. Especiación de metales en sedimentos …………………………….. 260
4.5.2.7. Análisis del contenido total de metales en muestras
biológicas ……………………………………………………………………… 264
4.5.2.8. Tratamiento estadístico de los datos ……………………………….. 266
4.6. Análisis de blancos, límite de detección y validación de las técnicas
empleadas ………………………………………………………………………………………….. 267
4.6.1. Ni, Co y Cr en aguas por DPAdCSV ………………………………………………. 267
4.6.2. As en aguas por HGAAS ……………………………………………………………… 269
4.6.3. As, Ni, Co y Cr en sedimentos …………………………………………………….. 270
4.6.3.1. Contenido total de metales en sedimentos …………………….…. 270
4.6.3.2. Especiación de metales en sedimentos ………………………….…. 271
4.6.4. As, Ni, Co y Cr en muestras biológicas …………………………………………. 273
4.7. Estudios previos y selección de los puntos de muestreo ………………………….. 275
4.8. Estudio de los parámetros físico-químicos en la Bahía de Algeciras ………….. 284
4.8.1. Parámetros medidos in situ …………………………………………………………. 285
4.8.2. Parámetros generales …………………………………………………………………. 292
4.9. Distribución y biodisponibilidad de As, Ni, Co y Cr en la Bahía de Algeciras 297
4.9.1. Contenido metálico en agua ………………………………….……………………. 298
4.9.1.1. Concentración total en agua …………………………….…………….. 298
4.9.1.2. Distribución metálica entre la fase disuelta y particulada …... 303
4.9.1.3. Especiación metálica en aguas …………………………………..……. 310
4.9.2. Contenido metálico en sedimentos ……………………………………….….….. 319
4.9.2.1. Concentración total en sedimentos …………………….……….…… 320

v
Índice

4.9.2.2. Especiación metálica en sedimentos …………………….…….……. 323

4.9.3. Contenido metálico en muestras biológicas ……………………….….………. 330
4.10. Comparación del contenido metálico …………………………………………………… 343
4.10.1. Comparación entre los puntos de muestreo …………………………….….. 343
4.10.2. Comparación con valores de referencia ………………………………………. 359
4.10.2.1. Comparación con valores de referencia en las muestras de
agua ……………………………………………………………………….……. 359
4.10.2.2. Comparación con valores de referencia en las muestras de
sedimentos ……………………………………………………………………. 363
4.10.2.3. Comparación con valores de referencia en las muestras de
peces ……………………………………………………………………………. 368
4.11. Conclusiones …………………………………………………………………………………….. 368

Conclusiones generales ....…………………………………….………………………… 371

Anexos ………………………………………………………………………………………. 375

Referencias .………………………………………………………………………………… 411

English Summary .………………………………………………………………………… 445

Artículos derivados de la Tesis ….……………………………………………………… 523

vi
 Objetivos

Objetivos

La importancia de monitorizar y evaluar la contaminación metálica en muestras

acuáticas es incuestionable dado el efecto nocivo que supone su presencia a
determinadas concentraciones sobre la calidad medioambiental y sobre los organismos
vivos. De igual forma, la capacidad de algunos metales pesados de presentar el
fenómeno de la biomagnificación o bioacumulación, los convierten en sustancias
prioritarias en el ámbito de la política de aguas en la que se incluyen de forma explícita
estos elementos así como algunos de sus compuestos (Directiva 2008/105/CE del
Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, publicada en el DOUE
núm. L348/84, de 24 de diciembre de 2008).

La directiva Marco de Aguas de la Unión Europea (Directiva 2000/60/CE, de 23 de

octubre de 2000, publicada en el DOCE núm. L327/1, de 22 de diciembre de 2000)
establece un marco comunitario de actuación en el ámbito de la política de aguas por
medio de una estrategia combinada que comporta la formulación de normas
armonizadas de calidad del agua y el monitoreo o control de emisiones a escala
europea. El éxito de la implementación de esta normativa marco dependerá de la
disponibilidad de herramientas analíticas de bajo coste y de la tecnología capaz de
producir resultados de calidad.

1
Objetivos

El enfoque principal de esta tesis doctoral se centra en el estudio de nuevos

avances químico-analíticos aplicados al control de la contaminación por metales
pesados, principalmente en ecosistemas acuáticos. Para ello, se tendrá en cuenta el
concepto de especiación metálica, que define adecuadamente las especies
potencialmente más peligrosas y con mayor disponibilidad para los seres vivos.

Estos estudios se abordan tanto desde el punto de vista de investigación básica,

con el desarrollo de nuevas metodologías de análisis de metales pesados, como desde
un punto de vista de investigación aplicada mediante el estudio de la contaminación
metálica de origen antropogénico en aguas costeras andaluzas.

Para cada uno de estos aspectos se plantean diversos objetivos específicos:

1. Desarrollo y aplicación de nuevas metodologías de análisis de metales pesados en

muestras medioambientales con matriz compleja, como puede ser el agua de mar. En
este apartado se incluyen los siguientes estudios:

- Desarrollo de una nueva metodología de preconcentración mediante extracción

en fase sólida, utilizando discos de membrana previamente modificados con un
ligando orgánico quelatante. Esta técnica cuenta con la ventaja de que aísla el
analito y elimina la posible interferencia de la matriz en muestras con
propiedades desfavorables para el análisis directo, siendo novedoso su uso en la
preconcentración de trazas metálicas en muestras de aguas naturales.

- Estudio de la aplicabilidad de las técnicas de Redisolución en Ausencia de

Gradiente y en Equilibrio Nernstiano (AGNES), así como de la
Cronopotenciometría de Redisolución de Barrido (SSCP) para evaluar la
especiación de metales pesados en agua de mar.

2. Estudios de impacto medioambiental en aguas afectadas por una intensa actividad

antropogénica, mediante la evaluación de los niveles metálicos totales y su especiación
química. La zona seleccionada de estudio es la Bahía de Algeciras, caracterizada por
un impacto crónico persistente. En su entorno, existen industrias que de forma directa
o indirecta emplean diversos metales pesados, considerados, entre otros, como
contaminantes prioritarios. Estos contaminantes pueden llegar al medio ambiente que
rodea la zona y en concreto a los sistemas acuáticos próximos. Por ello, se pretende
realizar un estudio integrado de impacto de esta actividad sobre la Bahía de Algeciras,
para lo que se propone la evaluación del nivel de contaminación de algunos metales en
las aguas, los sedimentos y la biota. Estos tres compartimentos ambientales son los
referenciados en las estrategias de trabajo de la Directiva Marco de Aguas para la
monitorización de las aguas marinas. En concreto se proponen los siguientes estudios:
2
 Objetivos

- Establecer los niveles totales de metales (As, Cr, Ni y Co, metales muy
significativos de la industria siderúrgica y petroquímica) presentes en las aguas y
los sedimentos, así como evaluar su distribución en las distintas fracciones
químicas (especiación) en ambos compartimentos medioambientales.

- Cuantificar los niveles de concentración de metales en tejidos de hígado, músculo

y branquias en peces de interés comercial para estudiar el efecto que la
contaminación química ejerce sobre estas especies (especies biomonitoras de
contaminantes inorgánicos).

- Correlacionar los niveles metálicos en el medio biótico con el medio abiótico,

identificando las formas químicas más biodisponibles, y en consecuencia con
mayor potencial tóxico, para los metales estudiados.

3
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 1
Introducción: Metales pesados en el medio
ambiente
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

Introducción: Metales pesados en el

medio ambiente

1.1. El agua y su contaminación por metales pesados

El agua es un recurso vital para la alimentación, higiene y actividades del ser humano,
así como para la agricultura y la industria. Desde la antigüedad el hombre ha establecido
sus poblaciones en zonas próximas a los cursos de agua, no sólo porque ésta es
imprescindible para la vida, sino porque es útil para muchas de las actividades que
desarrolla. Debido a ello, los ríos han sido con frecuencia los receptores de muchos de los
residuos generados por el hombre.

El crecimiento de la industria, de la urbanización y de la población humana, junto con

el uso creciente de abonos y plaguicidas en agricultura influyen notablemente en el
deterioro de la calidad de las aguas naturales y acrecienta los problemas de contaminación
y en consecuencia, dificultan el suministro de agua potable.

Para poder adoptar soluciones, es necesario conocer las posibles causas y fuentes de
contaminación del medio hídrico. Pero en primer lugar, habría que definir el concepto de
contaminación. A pesar de que se trata de un concepto sujeto a revisión permanente por
parte de la comunidad científica, la mayoría de autores coinciden en definir la
contaminación del agua como la acción y el efecto de introducir materias o formas de
energía, o inducir condiciones en el agua que, de modo directo o indirecto impliquen una

7
Capítulo 1

alteración perjudicial de su calidad en relación con los usos posteriores, con la salud
humana, o con los ecosistemas acuáticos o terrestres directamente asociados a los
acuáticos; causen daños a los bienes; y deterioren o dificulten el disfrute y los usos del
medio ambiente (Real Decreto Legislativo 1/2001, de 20 de Julio, BOE núm. 176, de 24 de
julio de 2001). También se ha descrito recientemente el término polutante como cualquier
sustancia o efecto que altera adversamente el ecosistema acuático produciendo un cambio
en la tasa de crecimiento de especies, interfiere en la cadena alimentaria, es tóxico o
interfiere en la salud, bienestar, comodidades o en los valores de propiedad de la población
[Porteous, 2008; vanLoon y Duffy, 2011]. Aunque los conceptos de contaminante y
polutante han sido ampliamente utilizados como sinónimos, existen ciertos autores que los
diferencian, de manera que definen un contaminante como una sustancia presente en la
naturaleza en una concentración por encima de su nivel de fondo, independientemente de
que cause o no efectos adversos; mientras que un polutante es un contaminante que causa
efectos adversos [Chapman, 2007; Porteous, 2008]. Según estas definiciones, todos los
polutantes son contaminantes pero no todos los contaminantes se consideran polutantes,
puesto que las sustancias introducidas en la naturaleza pueden ser más o menos
biodisponibles para los organismos dependiendo de su forma química, de factores
intrínsecos al medio, del compartimento en el que se encuentran y de las reacciones tanto
fisiológicas como conductuales de la biota expuesta [Chapman, 2007].

Existen diferentes categorías de contaminación, entre las que se incluyen la

contaminación química, la física, la radioactiva, la biológica y la estética. La presente Tesis
Doctoral está centrada principalmente en los contaminantes químicos y su determinación
en matrices medioambientales.

La mayoría de las sustancias que se consideran contaminantes son, de hecho,

constituyentes naturales de la naturaleza, si bien es cierto que se encuentran en
concentraciones que por lo general no son nocivas. Es el incremento en la concentración de
estos constituyentes naturales, por lo general debido a actividades industriales, lo que
resulta preocupante. No obstante, existen algunos contaminantes que son enteramente
sintéticos y que no se encontrarían en la naturaleza de no ser por actividades humanas
(como por ejemplo, los clorofluorocarbonos, CFCs) [Radojevic y Bashkin, 2006].

La contaminación acuática puede ser puntual (en el caso de que se produzca por un
foco emisor determinado e identificable afectando a una zona concreta) o difusa (cuando el
origen no está claramente definido y se ven afectadas zonas amplias en las que coexisten
múltiples focos de emisión). En sentido general, se pueden considerar como principales
fuentes de contaminación del medio hídrico, las aguas residuales urbanas, las industriales,
las agrícolas y ganaderas, y la atmósfera.

8
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

Asimismo, los contaminantes básicos que se encuentran en la hidrosfera pueden

clasificarse en 5 grupos (Tabla 1.1): radioactividad, contaminantes orgánicos, metales
pesados, ácidos y nutrientes.

Tabla 1.1. Contaminantes presentes en la hidrosfera [Radojevic y Bashkin, 2006]

Contaminante Origen de la contaminación
Radioactividad Descargas accidentales de
industrias nucleares, transporte
de material nuclear y pruebas
nucleares
Contaminantes Uso de herbicidas y pesticidas
Orgánicos en agricultura. Contaminación
marina por accidentes de
tanques que contienen petróleo
Metales Agricultura, drenajes urbanos y
Pesados domésticos, así como desechos
de industrias y minerías
Ácidos Drenaje de minas, desechos de
industrias y deposición ácida
desde la atmósfera
Nutrientes Uso de fertilizantes en la
agricultura. Presencia en las
aguas residuales
Características
Los efectos sobre la salud humana
son materia de debate
Una gran cantidad de compuestos
químicos orgánicos se descargan
con frecuencia, como pesticidas,
hidrocarburos, detergentes, etc.
Son potencialmente dañinos para
los ecosistemas acuáticos y la
salud humana
Gran cantidad de metales pesados
pueden producir efectos tóxicos en
la salud humana y en los
ecosistemas acuáticos (ej. plomo,
mercurio, cadmio)
Pueden dañar los ecosistemas
acuáticos por producir movilización
de metales tóxicos (ej. ácido
sulfúrico, ácido nítrico)
Pueden causar eutrofización (ej.
fósforo y nitrógeno). Los nitratos
pueden afectar a la salud humana

Especial atención se debe prestar al grupo de contaminantes formados por los metales
pesados, que son aquellos elementos químicos que presentan una densidad superior a 5
g/cm3 [Berkowitz y col., 2008]. Prácticamente todos los metales de transición pueden
considerarse metales pesados. Excepciones a esta definición son el titanio, que se
3
considera metal pesado aun teniendo una densidad inferior (4,5 g/cm ), y el arsénico, que
a pesar de ser considerado como metaloide, por su elevada densidad (5,7 g/cm3) y por
algunas propiedades de carácter ambiental se suele clasificar también como metal pesado
[Domènech y Peral, 2006].

Los metales pesados presentan cinco aspectos fundamentales que los caracterizan y
los diferencian de otros elementos y compuestos químicos [Fairbrother y col., 2007]:
9
Capítulo 1

1. Son constituyentes naturales del medio ambiente y su concentración varía según el

área geográfica donde se encuentren.

2. Todos los ecosistemas contienen mezclas naturales de metales y éstos entran a

menudo en la naturaleza en forma de mezclas, con lo que se debe prestar especial
atención a los efectos sinérgicos, antagónicos o aditivos que pueden presentar.

3. Algunos metales son esenciales para la salud humana, de animales, plantas y

microorganismos. Tanto si existen deficiencias como excesos de estos metales
esenciales en organismos, se pueden producir efectos adversos nutricionales.

4. La química de los metales influye notablemente en su destino y en los efectos que

pueden causar en humanos y demás receptores ecológicos. A diferencia de los
contaminantes orgánicos, los metales no se crean ni se destruyen mediante
procesos químicos o biológicos. Sin embargo, estos procesos pueden transformar
los metales, bien modificando su estado de oxidación, o convirtiéndolos en
compuestos o derivados orgánicos o inorgánicos.

5. La toxicocinética y la toxicodinámica de los metales dependen del metal, de la

forma del metal o del compuesto metálico y la capacidad del organismo de regular
y/o acumular el metal. Son contaminantes biodisponibles para los organismos
vivos, se bioacumulan en éstos y pueden sufrir procesos de biomagnificación a
través de la cadena trófica.

Para la mayoría de los organismos la exposición a metales pesados, por encima de

una concentración umbral puede ser extremadamente tóxica. Los de mayor importancia
toxicológica y ecotoxicológica son: Hg, As, Cr, Pb, Cd, Ni y Zn [Castañé y col., 2003].

Los metales pueden ser liberados al medio ambiente en cantidades suficientes como
para constituir un riesgo para la salud humana. Estos elementos se enlazan fácilmente con
el material particulado o sedimentos, y de esta forma son relativamente menos tóxicos,
pero cambios en el tiempo o en las condiciones del medio u otros factores
medioambientales pueden provocar la movilización de los mismos, aumentando su
disponibilidad y toxicidad [Berkowitz y col., 2008; Namiesnik y Szefer, 2010].

Debido a su alto grado de persistencia en el medio, su tendencia a la bioacumulación

en la cadena trófica y, en ciertos casos, a su elevada toxicidad incluso a bajas
concentraciones, los metales pesados son considerados uno de los grupos de
contaminantes ambientales más peligrosos y por lo tanto, constituyen un riesgo importante
para los seres vivos.

Respecto a la potencial toxicidad de los metales pesados, hay que tener presente que
su comportamiento frente a los organismos vivos puede describirse de diversas maneras.
Así, en este sentido, se emplean frecuentemente ciertos términos que permiten describir la
10
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

conducta de los contaminantes en relación con los sistemas biológicos acuáticos:

bioacumulación, biomagnificación, bioconcentración y biodisponibilidad. Estos términos se
definen como [Nordberg y col., 2009]:

 Bioacumulación: Aumento progresivo de la cantidad de sustancia en un organismo o

parte de él, como consecuencia de que la velocidad de absorción supera la capacidad
del organismo para eliminar la sustancia.

 Biomagnificación: Secuencia de procesos por los cuales la concentración de una

sustancia se ve incrementada en los organismos situados en niveles superiores de la
cadena trófica con respecto a aquellos organismos que se encuentran en niveles
inferiores.

 Bioconcentración: Proceso por el cual la concentración de una sustancia en un

organismo aumenta con respecto a la que tiene en el ambiente al que está expuesto.

 Biodisponibilidad: Grado de absorción de una sustancia por un organismo vivo,

normalmente expresada como una fracción de la cantidad total de la sustancia
disponible en el ambiente al que está expuesto.

La bioacumulación hace referencia al balance entre la cantidad de metal incorporado a

los seres vivos y la cantidad que éstos son capaces de eliminar de su propio organismo.
Como consecuencia de dicho balance se puede producir un aumento o una disminución
neta del contenido metálico en el organismo. Este término tiene en cuenta el hecho de que
aunque la dosis puntual de metales pesados esté por debajo de valores que puedan
producir efectos adversos sobre los organismos, sin embargo, la continua acumulación en
situaciones en las que el balance metálico ingreso/excreción sea positivo puede hacer que
los niveles de los metales pesados en el organismo se incrementen con el tiempo hasta
valores en los que se manifiesten efectos adversos. De forma genérica, la bioacumulación
de metales pesados en organismos acuáticos aumenta bajo determinadas circunstancias,
entre las que destacan el menor peso corporal (estadios larvarios y juveniles), menor
salinidad, mayor temperatura del agua, ausencia de metales competidores (mayor
bioacumulación en aguas de baja dureza) y mayor proximidad a la superficie del agua
[Crompton, 2007]. Puesto que las concentraciones de metales pesados en las zonas
costeras, bahías y estuarios son notablemente mayores a las que se encuentran en aguas
oceánicas, el riesgo es consecuentemente mayor. Aunque las concentraciones de metales
pesados en la mayoría de los sistemas costeros y de estuario suelen encontrarse por
debajo de niveles en los que se han comprobado sus efectos tóxicos y letales sobre los
organismos acuáticos, en ensayos de laboratorio se han encontrado indicios de efectos a
medio-largo plazo de metales pesados sobre los organismos vivos a concentraciones
subletales debido, principalmente, a fenómenos de bioacumulación.

11
Capítulo 1

La biomagnificación se produce por el incremento en la concentración de un

contaminante en los organismos a medida que asciende en su posición en la cadena
trófica. Así, la cantidad de metal retenida por un organismo es asimilada directamente por
su depredador, que a su vez puede servir de alimento a otro organismo situado en un nivel
superior de la cadena trófica, con el consiguiente incremento en la cantidad de metal
acumulado por este último. Es difícil documentar los posibles casos de biomagnificación
debido a los inconvenientes que se tienen para disponer de todos los organismos que
componen la dieta del predador en la cadena trófica de un ecosistema en particular, y
además es difícil correlacionar diferentes especies situadas a distintos niveles con un
sistema idéntico de captación del contaminante, una distinta exposición (longevidad) y
diferente fisiología (desintoxicación).

El término bioconcentración tiene en consideración la relación existente entre la

incorporación de metales al organismo vivo y el medio abiótico en el que habita; este
parámetro es más fácil de determinar que el de bioacumulación. El grado en el cual un
metal se concentra en un organismo acuático viene dado por el factor de enriquecimiento
(FE), que se define como el cociente entre la concentración de metal en el material
biogénico y la concentración del metal en el agua o sedimento [Campbell y col., 2002]. Es
de destacar que tanto el fitoplancton como el zooplancton, base fundamental de la cadena
trófica en los sistemas acuáticos, presentan unos factores de enriquecimiento notables para
ciertos elementos. Otros organismos que sobresalen son los moluscos por sus altos niveles
de bioconcentración; los peces también concentran metales, aunque con factores de
enriquecimiento notablemente menores a los anteriores organismos [Kennish, 1996]. Así,
cada vez cobra más importancia la evaluación de la concentración de metales pesados en
organismos acuáticos a través del análisis químico del contenido metálico en sus tejidos,
con la doble intención de investigar la distribución y comportamiento de los metales en
relación con la biota acuática, además de preservar tanto las especies animales como la
salud humana, puesto que muchos de estos organismos sirven de alimento al hombre.

Se define biodisponibilidad como la afinidad de un contaminante para ser absorbido o

adsorbido por un organismo vivo, atravesando las barreras biológicas (membranas
celulares o epitelios compuestos por una doble membrana lipídica con moléculas proteicas
y canales cargados electroquímicamente), mediante procesos biológicos activos o procesos
pasivos de tipo físico o químico. No obstante, algunos científicos diferencian entre
disponibilidad externa o “bioaccesibilidad” y “biodisponibilidad interna” [Caussy y col.,
2003; Peijnenburg y Jager, 2003], considerándose una sustancia bioaccesible aquélla que
puede entrar en contacto con el organismo y ser absorbidas, y las sustancias
biodisponibles, aquéllas que tras ser absorbidas por el organismo pueden interactuar con
las moléculas u órganos diana. Factores fisicoquímicos como la temperatura, la salinidad, la
presencia o ausencia de agentes complejantes, la presencia o ausencia de otros metales y

12
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

factores propios de los organismos, como el grado de impermeabilidad superficial o la

etapa nutricional, entre otros, determinan la biodisponibilidad de los metales hacia los
organismos. En cualquier caso, la biodisponibilidad de los metales va a estar íntimamente
ligada y va a depender de su especiación química.

Los elementos metálicos están presentes en aguas naturales a muy baja

concentración, a niveles inferiores a 1 mg/L, y por ello se incluyen dentro del grupo
conocido como elementos traza, los cuales, a pesar de sus bajos niveles de concentración,
poseen importantes implicaciones a nivel químico y biológico en los sistemas acuáticos
naturales. En las últimas décadas la escala de componentes a nivel de traza se ha
subdividido en trazas y ultratrazas, denominándose estos últimos como analitos cuya
concentración se encuentra por debajo de 1 g/L. El concepto de traza en Química
Analítica ha ido evolucionando con los años, a medida que las técnicas y metodologías de
análisis han permitido detectar y cuantificar niveles de concentración cada vez menores. La
Tabla 1.2 muestra la evolución cronológica del término traza como sinónimo de baja
concentración de un determinado compuesto [Cámara y Pérez-Conde, 2011]:

Tabla 1.2. Evolución cronológica del término “traza” [Cámara y Pérez-Conde, 2011]
Año Descripción Concentración

1900 Traza <0,1-0,2% (1000 mg/L)

1940 Macroconstituyente >1%
Microconstituyente 0,01-1%
Traza <0,01% (<100 mg/L)
1970 Traza <100 mg/L
Ultratraza <1 mg/L
1980-2009 Ultratraza 1 g/L

En la Tabla 1.3 se resumen los elementos traza más importantes presentes en las
aguas naturales. Algunos de estos metales trazas pueden ser clasificados como elementos
esenciales, ya que suelen ser componentes de sistemas enzimáticos, los cuales catalizan
reacciones bioquímicas importantes como son glicólisis, fotosíntesis, formación de proteínas
y metabolismo. A pesar de ser esenciales, hay que tener en cuenta que pueden resultar
tóxicos a niveles más altos. Esta característica es común para muchas sustancias en el
ambiente acuático, y debe tenerse presente al juzgar la importancia ambiental y
toxicológica de un elemento particular.

13
Capítulo 1

Tabla 1.3. Elementos traza importantes en las aguas naturales [Orozco-Barrenetxea,

2008; http://www.epa.gov/safewater/contaminants/index.html]
Elemento Fuentes
Antimonio Descargas de petróleos de refinerías,
retardantes ignífugos, soldaduras,
electrónica, esmaltes, tipografía
Arsénico Medio geológico, pesticidas, residuos
químicos y subproductos mineros
Bario Medio geológico, efluentes de
refinerías, pinturas
Berilio Carbón, industria nuclear y espacial
Efectos e importancia
Tóxico, aumenta el colesterol en
sangre y disminuye el azúcar en
sangre
Tóxico, carcinogénico. Daños en la
piel y en el sistema nervioso
Tóxico. Aumenta la presión arterial
Tóxico. Daño en pulmones

Cadmio Medio geológico, tuberías, minería, Tóxico. Causa elevada presión en la

electrodeposición sangre, problemas renales, destruye
el tejido testicular. Acumulativo en
hígado, riñón y páncreas
Cobalto Medio geológico, minería, pinturas, Esencial, forma parte de la vitamina
tintes, metalurgia B-12. Tóxico para plantas a pH ácido
Cobre Medio geológico, recubrimientos Esencial, tóxico para plantas y algas
metálicos, residuos industriales, a niveles altos. Daños en el sistema
electrodeposición, minería digestivo
Cromo Recubrimientos metálicos, curtido, Esencial como Cr(III), tóxico como
efluentes de fábricas de acero y Cr(VI). Daños al sistema digestivo,
papel riñón e hígado
Hierro Medio geológico, corrosión, residuos Nutriente esencial, su deficiencia
industriales, aguas ácidas de minas, provoca anemia
acción microbiana
Manganeso Medio geológico, drenajes, residuos Elemento esencial, presenta baja
industriales, aguas ácidas de mina, toxicidad para animales. A altas
acción microbiana concentraciones, produce daños en
el sistema nervioso
Mercurio Medio geológico, minería, carbón y Toxicidad tanto aguda como crónica,
residuos industriales especialmente como organometal
Molibdeno Fuentes naturales, residuos de Esencial para plantas, tóxico para
industrias animales en altas concentraciones
Níquel Pigmentos, baterías, recubrimiento Cancerígeno en altas dosis, produce
de metales, aleaciones, catalizadores dermatitis y náuseas
Plomo Medio geológico, combustibles, Tóxico, acumulativo. Afecta a los
minería, residuos industriales riñones y al sistema nervioso.
Produce inhibición de la síntesis de
la hemoglobina
Selenio Fuentes naturales, carbón, tintes, Esencial a bajos niveles, tóxico a
aleaciones, catalizador, pinturas niveles superiores. Causa
hemorragias
Cinc Residuos industriales, recubrimientos Elemento esencial. Tóxico para las
de metales, pigmentos, pinturas plantas a altos niveles

14
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

De esta manera, los metales pesados pueden clasificarse en dos grupos: el primero
engloba a los denominados esenciales u oligoelementos, que son aquellos elementos que
resultan necesarios para que los organismos vivos completen su ciclo vital, siendo
requeridos en cantidades pequeñas, aunque pasado un cierto umbral, pueden ser tóxicos
(como Zn, Cu, Co, Se, Mo, Fe, Mn y el estado de oxidación III del Cr). Se dice que un metal
es esencial cuando su ausencia puede llegar a afectar a determinados procesos biológicos,
haciendo que no se desarrollen de manera correcta y provocando en situaciones límite
daños importantes en los organismos, incluso la muerte. No obstante, cuando la
concentración de estos metales supera el aporte nutricional pueden conllevar efectos
tóxicos e incluso letales. El segundo grupo está constituido por aquellos metales pesados
que no presentan una función biológica o metabólica conocida y son tóxicos a dosis
mínimas (como por ejemplo Pb, Hg, Cd, As y el estado de oxidación VI del Cr).

Cuando se superan los niveles máximos permitidos, todos los metales, tanto esenciales
como no esenciales, pueden afectar al metabolismo normal de un organismo, bien porque
se unan a biomoléculas no específicas o porque provoquen daños oxidativos debido a su
capacidad para catalizar reacciones redox. Esto puede acarrear una desactivación de
reacciones enzimáticas esenciales, dañar las estructuras celulares y modificar el ADN
(mutagénesis). En humanos, exposiciones cortas a altos niveles de metales pueden causar
síntomas de toxicidad aguda, mientras que exposiciones largas de ciertos metales a niveles
más bajos pueden provocar alergias o acabar incluso en cáncer [Berkowitz y col., 2008].

La toxicidad de los metales pesados sobre los organismos vivos depende no sólo de la
concentración en la que se encuentren presentes, sino también de otros factores tanto
bióticos o intrínsecos a la naturaleza del propio organismo (familia y especie a la que
pertenece, mecanismos de regulación de metales, edad, estrés, etc.) como abióticos o
relacionados con las características del hábitat, el tiempo al que hayan estado expuestos al
metal (efectos agudos o crónicos) y el grado de accesibilidad de éstos por parte de los
organismos vivos.

Normalmente, la toxicidad de un metal en organismos acuáticos, como peces,

invertebrados, algas o bacterias se evalúa mediante ensayos de toxicidad, en los cuales
dichos organismos se someten a una exposición, bajo condiciones estándares, a distintas
concentraciones de metales durante un cierto período de tiempo, transcurrido el cual se
comprueba el efecto producido sobre los organismos. Estos ensayos son la fuente de
información predominante para la evaluación ecológica de los efectos de los contaminantes
tóxicos. Con ellos, se consigue establecer los límites permitidos para los distintos
contaminantes, evaluar el impacto de mezclas sobre las comunidades de los ambientes que
las reciben, así como comparar la sensibilidad de una o más especies a distintos tóxicos o a
diferentes condiciones para el mismo tóxico [Crompton, 2007].

15
Capítulo 1

En las Tablas 1.4 y 1.5 se recogen las concentraciones en agua de algunos metales por
encima de las cuales diversos organismos acuáticos adultos no sobreviven a una exposición
aguda de corta duración, en condiciones de agua dulce y salada, respectivamente. Como se
aprecia, los niveles dependen del metal de que se trate, el tipo de organismo y las
condiciones de salinidad, entre otros factores. Entre los organismos más sensibles se
encuentran los moluscos bivalvos, ya que estos organismos filtran el agua, lo que facilita la
retención de metales, tales como cobre y cadmio.

Tabla 1.4. Concentración de metales (g/L) que causan mortalidad en organismos

adultos, para una exposición de corta duración (4-14 días) en agua dulce [Crompton, 2007]
Organismo As Cd Cr Cu Hg Ni Pb Zn

Anélidos - >100 - >100 >100 >1000 >10000 >1000

Moluscos bivalvos - - - >10 - - - -

Crustáceos >100 >0,1 - >1 >0,1 >10 >10 >10

Gasterópodos - - - >10 - >10000 >10 -

Peces >100 >10 >1000 >100 - >100 >10 >1000

Tabla 1.5. Concentración de metales (g/L) que causan mortalidad en organismos

adultos, para una exposición de corta duración (4-14 días) en agua de mar [Crompton,
2007]
Organismo As Cd Cr Cu Hg Ni Pb Zn

Anélidos - >1000 - >10 >100 >10000 >100 >1000

Moluscos bivalvos - >1 >10000 >1 >0,1 >10000 >1000 >10

Crustáceos >100 >10 >1000 >10 >10 >100 >1000 >100

Gasterópodos - - - >10 - >10000 >100 -

Peces >1000 >100 >10000 >10 >10 >100 >1000 >1000

Estos ensayos de toxicidad se realizan en el laboratorio bajo condiciones

cuidadosamente controladas, que permiten obtener resultados precisos. Sin embargo,
suelen ser poco representativos de las condiciones reales en las que se encuentran estos
organismos en el medio natural, tanto en lo referente a las concentraciones de agentes
16
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

potencialmente tóxicos presentes en el agua como a su periodo de exposición. Además, de

esta forma no se tienen en cuenta las interacciones entre sí de los distintos contaminantes,
ni las de éstos con el medio físico y químico. Es por ello que resulta más interesante
abordar estudios de contaminación en ecosistemas reales y el efecto que los metales
producen en los seres vivos, teniendo en cuenta estas circunstancias.

Además de producir efectos adversos sobre los organismos acuáticos, la presencia de

elevadas concentraciones de metales en el medio también afecta al medio ambiente y a la
salud humana. Tal es el caso de la toxicidad del mercurio, que fue ilustrada trágicamente
en el área de la Bahía de Minamata, en Japón, durante el período 1932-1968. A mediados
de 1950 se comenzaron a detectar algunos casos de degeneración del sistema nervioso en
animales, e inmediatamente después en las personas. Más tarde se llegó a la conclusión
que la empresa Chisso Corporation (planta química productora de plásticos, medicamentos
y perfumes) era la responsable del problema, debido a que había estado liberando
compuestos de mercurio desde 1932. Finalmente, en julio de 1959, se concluyó que el
2+
consumo de pescado y mariscos contaminados con metilmercurio, debido al paso de Hg a
metilmercurio por acción bacteriana, era la causa de la enfermedad de la bahía de
Minamata [Ekino y col., 2007; Tomiyasu y col., 2008; Murata y Sakamoto, 2011]. Se
observaron defectos congénitos en bebés cuyas madres habían consumido marisco
contaminado por mercurio (cuya concentración oscilaba entre 5 y 20 mg/L). Cerca de 3000
personas se vieron afectadas por envenenamiento con mercurio. Las personas afectadas
por la llamada enfermedad de Minamata sufrían de ataxia, alteración sensorial en manos y
pies, deterioro de los sentidos de la vista y el oído, debilidad y, en casos extremos, parálisis
y muerte.

Otro ejemplo de contaminación por metales pesados fue el envenenamiento causado

por Cd procedente de una mina que vertía directamente sus residuos al río Jinzu, en
Toyama (Japón) durante la 2ª Guerra Mundial. El brote epidémico de intoxicación, que se
comenzó a observar en 1947, fue ocasionado por la ingesta de arroz, el cual había sido
irrigado con agua contaminada del río. La enfermedad que afectó a los habitantes de las
aldeas cercanas se conocía como itai-itai, que significa literalmente ¡ay, ay!, y afectaba
principalmente al tejido óseo, produciendo deformaciones en los huesos [Inaba y col.,
2005; Nogawa y Suwazono, 2011].

Otro episodio contaminante, considerado el mayor envenenamiento masivo de una

población humana en la historia [Smith y col., 2000], causó que entre 28 y 35 millones de
personas de los 125 millones de habitantes de Bangladés fueran expuestas a niveles
potencialmente tóxicos de arsénico en el agua potable durante dos décadas [Niaz Asadullah
y Chaudhury, 2011]. Este catastrófico problema de salud pública fue el resultado de
programas bien intencionados, financiados inicialmente por el Fondo para la Infancia y la
Familia de Naciones Unidas (UNICEF) para instalar pozos poco profundos que
17
Capítulo 1

proporcionaran una fuente de agua potable, libre de patógenos causantes de

enfermedades. Ya en 1987, se observaron numerosos casos de lesiones epidérmicas
inducidas por el arsénico, caracterizadas por cambios de pigmentación,
predominantemente en la parte superior del pecho, los brazos, las piernas y queratosis de
las palmas de las manos y las plantas de los pies. Estos efectos eran característicos del
envenenamiento con arsénico, lo que llevó al descubrimiento de que el agua potable, con
altos niveles de arsénico de origen natural, procedente de los pozos construidos, fue la
responsable. El agua contenía concentraciones de arsénico superiores a la máxima
aceptada (10 g/L) por la Organización Mundial de la Salud (OMS) [Ahuja, 2008]. Desde
1990, se han llevado a cabo numerosos estudios con la finalidad de entender las causas de
la contaminación por arsénico de la cuenca de Bengala en Bangladés. Se ha demostrado
que los acuíferos contaminados de arsénico se encuentran en los deltas de los ríos Ganges,
Brahmaputra y Meghna que forman la cuenca. Estos acuíferos son de la era cuaternaria y
están formados por arenas micáceas, limos y arcillas procedentes del Himalaya [Henke,
2009]. El origen del arsénico en el agua subterránea de la cuenca todavía es incierto.
Existen varias hipótesis que intentan explicar el mecanismo por el cual el arsénico pasa de
su forma insoluble a especies solubles en agua. Según Polizzotto y col., los responsables de
la disolución de arsénico son unas bacterias que habitan en el suelo de la cuenca
hidrográfica. El arsénico, presente en los sedimentos que arrastran los ríos desde el
Himalaya, se encuentra asociados a partículas de óxidos de hierro. Al llegar al delta del río,
los sedimentos quedan enterrados a tal velocidad que las bacterias pasan a tener un
metabolismo anaeróbico. De esta manera, las bacterias realizan su respiración microbiana
utilizando los óxidos de hierro asociados al arsénico. Por tanto, el hierro y el arsénico son
metabolizados dando lugar a formas que se disuelven fácilmente en agua. Así, el arsénico
es lixiviado desde el sedimento hacia las aguas intersticiales, llegando finalmente a los
acuíferos. La contaminación por arsénico se produce cerca de la superficie y tarda al menos
100 años en alcanzar el acuífero. Este ciclo es un proceso natural que ha venido ocurriendo
durante miles de años, antes de cualquier influencia humana [Polizzotto y col., 2008].
Hasta el momento se han adoptado varias medidas para solucionar el problema, como el
uso de coagulantes, adsorbentes e intercambiadores iónicos, pero ninguno de ellos ha
tenido éxito. Estos métodos requieren equipos adicionales y en todos los casos la
eliminación del arsénico del agua produce un residuo tóxico. El remedio inmediato ha sido
identificar los pozos no seguros, pintándolos de rojo, mientras que los que aportan aguas
sin contaminación se han pintado de verde [vanLoon y Duffy, 2011].

Sin ir más lejos, otro caso de contaminación por metales pesados fue el accidente
minero de Aznalcóllar (Sevilla, España) en 1998, que, junto con la catástrofe del buque
Prestige en 2002, fue uno de los desastres ecológicos más importantes y de mayor
repercusión social que ha sufrido España en los últimos 100 años. El 25 de abril de 1998,
en Aznalcóllar (Sevilla), se produjo la rotura de una presa de contención que retenía la
18
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

balsa de decantación procedente de una mina de pirita. El resultado fue un importante

vertido de agua ácida y de lodos muy tóxicos, con alta concentraciones de metales
3 3
pesados. El volumen de vertido, estimado en unos 3,6 hm de agua y 0,9 hm de lodos, se
desbordó sobre las riberas de los ríos Agrio y Guadiamar, siendo la superficie afectada de
aproximadamente 40 km2. Aunque los lodos no llegaron a alcanzar el Parque Nacional de
Doñana, considerado el santuario más grande de aves acuáticas de Europa, las aguas sí
invadieron la región externa del Parque Nacional y desembocaron en el Guadalquivir en el
área del Coto de Doñana, alcanzando finalmente el Océano Atlántico, en Sanlúcar de
Barrameda (provincia de Cádiz) [Granado, 2005; Kraus y Wiegand, 2006].

Las administraciones central y autonómica no escatimaron medios para minimizar los

impactos ambientales y socioeconómicos generados por la riada tóxica. El Plan de Medidas
Urgentes permitió la retirada de la mayor parte de los lodos sedimentados y la vegetación
contaminada, la depuración de las aguas ácidas retenidas en la marisma y la expropiación
de todos los terrenos afectados. Posteriormente, la Junta de Andalucía, a través de su
Consejería de Medio Ambiente, puso en marcha un proyecto de gestión integrada de
cuenca denominado el Corredor Verde del Guadiamar, cuyos objetivos fundamentales eran,
por un lado, evitar la dispersión y remediar la contaminación producida por el vertido
minero sobre el río Guadiamar y la marisma afectada, y por otro, crear un corredor
ecológico que permitiera recuperar el flujo de especies y procesos naturales que existía
entre los ecosistemas de Sierra Morena y de los arenales del litoral de Doñana. Once años
después se ha demostrado que el corredor fue una medida apropiada para garantizar la
recuperación de la diversidad de la comunidad de aves [Ontiveros y col., 2012]. Los
niveles de contaminación de las aguas de ambos ríos por metales pesados disminuyeron
considerablemente los primeros 5 años después del accidente, gracias a las labores de
limpieza y el cese de la actividad minera. Sin embargo, todavía se encuentran altos niveles
de metales pesados en el río Guadiamar, así como en las aguas del acuífero del río Agrio.
Además, los suelos siguen teniendo altas concentraciones de los elementos traza presentes
en el lodo, si bien éstos se encuentran bastante inmovilizados en el suelo, en condiciones
de baja biodisponibilidad. Debido a la lenta dinámica de las aguas subterráneas, se predice
que la contaminación persistirá por muchos años, por lo que se deberían adoptar nuevas
medidas para contribuir a la recuperación definitiva de estos ríos [Delta y col., 2009; Olías
y col., 2012; Domínguez, 2012].

Otro episodio contaminante de gran importancia fue el ocasionado en Baia Mare

(Rumanía) en el año 2000. El 30 de enero de 2000, en el noroeste de Rumanía, se colapsó
el muro del dique de una planta de recuperación de desechos de la mina de oro de Aurul,
en las cercanías de Baia Mare, una ciudad de 130000 habitantes. La operación minera de
Aurul no se basaba en la explotación de nuevas reservas de oro, sino en el reciclado del
19
Capítulo 1

material de desecho que se había producido durante la explotación de otras minas

anteriores empleando cianuro. El derrumbe del dique provocó el derrame de 120 toneladas
de cianuro en el río Tisza, que luego llegaron al Danubio y finalmente, al Mar Negro,
momento en el cual ya se habían diluido considerablemente. La contaminación de los ríos
afectó al agua potable de 2,5 millones de personas, provocó la destrucción de muchas
especies acuáticas, así como impactos negativos en los ecosistemas de la zona. Es
considerado uno de los peores accidentes medioambientales ocurridos en Europa después
del de Chernobil. De hecho, se estableció un “Comité de Expertos Baia Mare” para
proponer correcciones y mejoras al marco regulador que existía en aquel momento
[Vierendeels y col., 2011].

En 2010 se detectó un caso de contaminación por metales pesados en cigarrillos

chinos. Un estudio realizado por O’Connor y col. en 2010 [O’Connor y col., 2010] descubrió
que los cigarrillos chinos contenían cantidades potencialmente peligrosas de metales
pesados, con niveles de plomo, arsénico y cadmio tres veces superiores a las detectadas en
los cigarrillos de Canadá. Según el estudio, los metales pesados provenían de la tierra
contaminada donde se cultivaba el tabaco y fueron absorbidos por esta planta. Se
analizaron 78 marcas populares de cigarrillos [O’Connor y col., 2010] y se encontraron
resultados especialmente preocupantes dada la cantidad de fumadores en China y dadas
las ambiciones de exportación de la empresa estatal China National Tobacco Corporation.

Otra catástrofe ecológica sucedió en Hungría, en octubre del 2010, cuando la rotura de
una balsa de la mina de aluminio de Kolontár, provocó el vertido de entre 600000 y 700000
m3 de barro rojo, residuo de la producción de aluminio, muy tóxico y corrosivo, que
contenía grandes cantidades de silicio, óxido ferroso (responsable del color rojizo del barro)
y metales pesados. Además, el pH del barro era muy básico, alrededor de 13, puesto que
contenía grandes cantidades de NaOH, utilizado en el proceso Bayer para extraer aluminio
de la bauxita. El lodo contaminado penetró en las riberas de los afluentes del Danubio y el
polvo afectó a los pulmones de cientos de ciudadanos de la región, que aún hoy sufren sus
efectos. La catástrofe dejó diez muertos, 150 heridos y contaminó gravemente más de 40
km2 de zonas destinadas a la agricultura [Ruyters y col., 2011; Gelencsér y col., 2011].

Más recientemente, en enero de 2012, las autoridades de recursos hídricos y

protección ambiental de la región autónoma de la etnia zhuang de Guangxi, en el sur de
China, detectaron cadmio en el cauce bajo de un río contaminado por una empresa minera,
obligando a reforzar los controles de la calidad del agua potable. La contaminación por
cadmio fue detectada en el río Liujiang en la ciudad de Liuzhou, más de 10 días después de
que los desechos industriales de la compañía minera local se vertieran al Longjiang, un
afluente en el curso superior del río Liujiang. Los compuestos de cadmio llegaron a la
estación hidroeléctrica de Luodong sobre el río Longjiang, constituyendo una amenaza para
la seguridad del agua potable. Se vertieron 20 toneladas de cadmio y según la
20
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

Organización Mundial de la Salud, se detectó en las aguas niveles de este metal 80 veces
superiores a los límites permitidos. En un intento por purificar el agua, el cuerpo de
bomberos local vertió varias toneladas de una disolución neutralizante a base de cloruro de
aluminio disuelto en el Longjiang. Las labores de limpieza han surtido efecto, y la
concentración de cadmio se ha reducido. Sin embargo, 27 de los efectivos policiales que
han participado en ellas han sufrido fiebres e infecciones en las vías respiratorias, y cinco
de ellos requirieron hospitalización, aunque pronto fueron dados de alta
[http://www.telegraph.co.uk/earth/environment/9053671/20-tons-of-cadmium-poisoning-
vital-Chinese-river.html; http://spanish.news.cn/tec/2012-01/30/c_131383091.htm].
De todos los elementos conocidos por el hombre hasta la fecha, alrededor del 75% son
metales y metaloides [vanLoon y Duffy, 2011], por lo que no es de extrañar que las
posibilidades de contaminación metálica en el ambiente sean numerosas. Hay que tener en
cuenta que los metales son materias naturales que, desde la edad de hierro, han
desempeñado un papel fundamental en el desarrollo de las civilizaciones.

La contaminación del medio ambiente por metales pesados se inició hace 6000 años, y
ha aumentado exponencialmente desde el comienzo del siglo XX, cuando proliferó su uso
industrial. De hecho, en un estudio reciente de las praderas de Posidonia oceánica (Delile,
1813), planta acuática endémica del Mar Mediterráneo, se ha podido descifrar la evolución
de la contaminación por metales en ese mar [Serrano y col., 2011]. Los primeros vestigios
de residuos son de hace unos 2800 años, coincidiendo con el desarrollo minero,
metalúrgico, tecnológico y cultural de los griegos y los romanos. A lo largo de los últimos
1200 años, el Mediterráneo ha experimentado un aumento gradual en la presencia de
metales que se aceleró notablemente en los últimos 350 años a partir de la revolución
industrial.

El empleo creciente de metales pesados en la vida cotidiana termina por afectar a la

salud. De hecho, el crecimiento demográfico en zonas urbanas y la rápida industrialización
han provocado serios problemas de contaminación y deterioro del ambiente, sobre todo, en
los países en vías de desarrollo. El resultado neto es que la humanidad se ha convertido en
el agente dominante del ciclo biogeoquímico global de los metales pesados. Actualmente,
quedan pocos países en el mundo en los que la contaminación metálica no se haya
convertido en objeto de debate.

En este sentido, diversos organismos internacionales como la UNESCO [Kuijper, 2003]

e investigadores científicos en el área de medioambiente [Yanagi y Ducrotoy, 2003;
Stachowitsch, 2003; Fleming y col., 2006; Pan y Wang, 2012] han manifestado su
preocupación por el creciente impacto que las actividades antropogénicas ejercen, por
ejemplo, sobre las áreas costeras. Cerca de la mitad de la población mundial está localizada
a menos de 60 kilómetros de la costa y podría llegar al 70% en el año 2020, según el
Programa 21 adoptado en la Conferencia de las Naciones Unidas sobre Medio Ambiente y
21
Capítulo 1

Desarrollo en 1992. Este Programa 21 fue un plan de acción global sin precedentes a favor
del desarrollo sostenible. En 2002, diez años después, la Cumbre de Johannesburgo
presentó una oportunidad magnífica para que los dirigentes de hoy en día adopten medidas
concretas e identifiquen objetivos cuantificables para una mejor ejecución del Programa 21.

La Organización para la Alimentación y la Agricultura (FAO) de las Naciones Unidas ya

pronosticó en 1998 que, de mantenerse las actuales tendencias, la población de las áreas
costeras del mundo podría llegar a duplicarse en los siguientes 20 a 30 años. Este rápido
incremento en la población conllevaría un aumento significativo en el desarrollo urbanístico,
así como en los caudales de los efluentes urbanos e industriales y, en consecuencia, en los
niveles de sustancias potencialmente tóxicas, produciendo, si no se toman las medidas
oportunas, un empeoramiento de la calidad medioambiental de estas áreas
extremadamente frágiles. En este sentido, resultan particularmente preocupantes las
previsiones para Europa, donde se encuentra el mayor porcentaje de zonas costeras con
alto riesgo de degradación (Figura 1.1).

Afortunadamente, y salvo en casos muy graves de polución, el carácter

fundamentalmente dinámico de este medio permite la renovación de las masas de agua
marina en las áreas costeras mediante su desplazamiento y mezcla con agua oceánica
procedente de áreas más alejadas de la costa, llegando así a facilitar la dispersión y, por
consiguiente, la atenuación espacial y temporal de episodios localizados de contaminación
antropogénica.

100%

80% 70%

60% 52%

38%
40%
26% 24%
17%
20%

0%
África Asia América América Europa Oceanía
(Norte y (Sur)
Central)

Figura 1.1. Riesgo de degradación de las áreas costeras a causa de actividades

antropogénicas según la Organización para la Alimentación y la Agricultura de las Naciones
Unidas (FAO, 1998)
22
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

1.2. Fuentes de contaminación por metales pesados

La corteza terrestre es la fuente principal de todos los elementos traza naturales en los
sistemas ambientales, geológicos, biológicos y marinos. A lo largo de los años, las rocas
han estado continuamente sujetas a varios procesos físicos y químicos que resultaron en la
formación de capas de suelo y sedimentos. Los suelos y sedimentos son el sustrato
terrestre y acuático para plantas, las cuales absorben y, en algunos casos, bioacumulan
elementos requeridos para su alimentación. Como parte importante de la cadena
alimentaria, las plantas son la ruta por la cual los animales y humanos incorporan estos
elementos. El agua también es otra fuente significativa de metales; mediante los procesos
de erosión, lixiviación, disolución, hidratación y carbonatación de ciertos materiales, el agua
moviliza y distribuye los metales pesados. Con respecto a las fuentes atmosféricas, la
actividad volcánica, los incendios forestales, el polvo atmosférico y la niebla salina
contribuyen a la formación de aerosoles, los cuales son la principal fuente del ciclo global
de estos elementos traza [Fifield y Haines, 2000].

La actividad humana ha contribuido notablemente al aumento de los niveles naturales

de metales en las aguas, sedimentos, flora y fauna, tanto marinas como epicontinentales.
Aunque la concentración de metales pesados procedentes de fuentes naturales, como la
meteorización química de las rocas, se encuentre en estado estacionario a escalas cortas
de tiempo, no ocurre lo mismo con la emisión antropogénica, la cual es causante del
aumento continuo de la concentración ambiental de algunos de estos metales pesados.
Existe una gran variedad de fuentes antropogénicas emisoras de metales pesados. A
continuación se detallan algunas de las más revelantes [Domènech y Peral, 2006]:

 Extracción de minerales: constituye una fuente importante de emisión de muchos

metales, en especial de As, Cd, Cu, Ni, Pb y Zn, tanto por su presencia en las menas
como en los subproductos de la explotación minera.

 Fundición: el proceso del mineral para obtener el metal correspondiente es una fuente
de emisión de metales, principalmente a la atmósfera en forma de partículas sólidas.
Esta fuente es relevante para los metales más volátiles, como As, Cd, Pb y Tl.

 Industria metalúrgica: este tipo de industria emite metales en forma de partículas de

aerosol a causa del procesado térmico de metales. Además, se genera gran cantidad
de residuos sólidos con un alto contenido en diversos metales, como Cr, Cu, Mn, Pb,
Sn y Zn.

 Otras industrias relevantes, como la electrónica (uso de metales en semiconductores,

contactos, circuitos eléctricos y baterías), industrias de recubrimientos metálicos, y la
industria química de pinturas, pigmentos, materiales plásticos, catalizadores y
23
Capítulo 1

electrodos: estas industrias contribuyen sustancialmente a la emisión de metales como

Cu, Sn, Cr, Cd, Ni, Hg, Pt, Ru, Pd, As, Sb, Se, Mo y Zn.

 Gestión de residuos: la incineración de residuos urbanos, los lixiviados de los

vertederos, así como la eliminación de lodos procedentes de plantas de tratamiento de
aguas residuales, producen emisiones significativas de Cr, Cu, Mn, Ni, Pb y Zn.

 Corrosión metálica: en el proceso de oxidación/corrosión metálica se liberan al medio

ambiente elementos metálicos, tales como Fe de materiales de construcción, Cu y Pb
de cañerías, Cr, Ni y Co de aceros, Cd y Zn de los recubrimientos protectores del acero
y Cr y Pb de la degradación de pinturas.

 Agricultura y ganadería: estas actividades son responsables de emisiones de metales

como Cu y Zn, que se añaden al alimento de diferentes animales de granja y emergen
en los residuos generados por la explotación animal. Además, el uso de pesticidas y
fertilizantes es también una fuente de metales pesados puesto que contienen
elementos metálicos en su composición.

 Industria forestal y maderera: para la preservación de diversos materiales en este tipo

de industria, se suelen utilizar As, Cr y Cu que posteriormente pueden ser liberados al
medio ambiente.

 Quema de combustibles fósiles: metales como Cd, Zn, As, Sb, Se, Cu, Mn y V están
presentes en estos combustibles en pequeñas cantidades y con la quema se emiten
incorporados en las cenizas de combustión.

En la Tabla 1.6 se muestran distintos procesos industriales que producen efluentes

ricos en metales pesados.

El total de emisiones de metales traza a la hidrosfera suma un valor de 109 kg al año,

siendo las principales fuentes de emisión el vertido de aguas residuales urbanas, las
plantas térmicas, las fundiciones y las plantas de producción de acero. Los metales que se
emiten en mayor cantidad son Mn y Zn, con flujos de emisión de aproximadamente 200-
260·106 kg/año. El orden de flujos de emisión de metales a la hidrosfera es el siguiente
[Domènech y Peral, 2006]:

Mn > Zn > Cr > Pb > Ni ≈ Cu > Se ≈ As > Sb > V ≈ Mo ≈ Cd > Hg

24
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

Tabla 1.6. Metales pesados empleados en diversas industrias [Mohan y Pittman, 2006]

Industrias Al Zn As Sn Sb Cd Cr Cu Fe Hg Mn Pb Ni Bi

Automovilística x x x x x x x
Refinerías de
x x x x x x x
petróleo
Papelera x x x x x x

Textil x

Acero x x x x x x x x
Compuestos
químicos x x x x x x x x x
orgánicos
Compuestos
químicos x x x x x x x x
inorgánicos
Fertilizantes x x x x x x x x x x x
Material
plástico y x
sintético
Curtido y
acabado de x
pieles
Minería x x x x x x

Drenaje ácido x x x x x
Chapados
x x x x
metálicos
Vidrio x
Centrales
x
nucleares
Carbón y
x x x
gasolina

Las emisiones de metales traza al suelo son superiores a las que se desprenden a la
hidrosfera, siendo el total de aproximadamente 6,5·109 kg al año. Las principales fuentes
son la deposición de cenizas procedentes de la combustión de carburantes fósiles, la
liberación de metales debido a la corrosión de materiales y el uso de pesticidas y
fertilizantes. En este caso, también son el Mn y el Zn los metales que más se descargan al
suelo, con flujos de emisión de 1300-1700·106 kg/año.

25
Capítulo 1

El orden de flujos de emisión de metales a los suelos es el siguiente:

Mn > Zn > Cu ≈ Cr > Pb > Ni > V > As ≈ Mo > Se > Cd ≈ Sb > Hg

Las emisiones a la atmósfera de estos metales traza son inferiores a las que se
descargan al agua y al suelo, sumando un total de 7,5·108 kg al año. Los metales que se
emiten en mayor cantidad a la atmósfera son el Pb y el Zn, con tasas de descarga de
332·106 y 132·106 kg/año, respectivamente. El orden de flujos de emisión a la atmósfera es
el siguiente:

Pb > Zn > V > Ni > Mn > Cu > Cr > As > Cd > Se > Hg ≈ Sb > Mo

A pesar de que se han ido aplicando numerosas tecnologías de control de emisiones en

industrias y centros urbanos, la cantidad total de estos elementos liberados al medio
ambiente resulta sorprendente (Tabla 1.7).

Tabla 1.7 Descargas globales de elementos traza a aire, aguas y suelos (en 1000
toneladas por año) [Domènech y Peral, 2006]

Elemento Aire Agua Suelo

As 19 41 82

Cd 7,6 9,4 22

Cr 30 142 896

Cu 35 112 954

Hg 3,6 4,6 8,3

Mn 38 262 1670

Mo 3,3 11 88

Ni 56 113 325

Pb 332 138 796

Sb 3,5 18 26

Se 3,8 41 41

V 86 12 132

Zn 132 226 1372

26
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

1.3. Distribución de metales pesados en ecosistemas acuáticos

La distribución de los metales pesados, así como su concentración y accesibilidad a la

atmósfera, hidrosfera, litosfera y biosfera es muy variable, y depende tanto de factores de
origen natural como antropogénico, incluyendo aportaciones atmosféricas o de los ríos,
erosión de suelos, actividades biológicas, drenaje de aguas y descargas de aguas residuales
urbanas e industriales [Carman y col., 2007].

El movimiento y el destino de los contaminantes ambientales son aspectos claves en la

determinación de sus impactos. La Figura 1.2 ilustra las vías principales involucradas en el
transporte y destino químico de dichos contaminantes. Las sustancias consideradas como
contaminantes casi siempre se originan en la antroposfera, aunque sustancias naturales
como los gases volcánicos que contienen azufre también pueden actuar como
contaminantes. Estas sustancias pueden pasar al aire, la tierra, el agua (ya sea superficial o
subterránea), a los sedimentos y a la biota (tanto a las plantas, como a los animales y los
humanos). El lugar donde van a parar tales sustancias y el efecto que producen, depende
de sus propiedades y de las condiciones del medio ambiente en que son introducidas.
Como regla general, el transporte y destino de los contaminantes está controlado por su
transporte físico y su reactividad, que incluye tanto reacciones químicas como bioquímicas
o interacciones físicas con otras fases [Manahan, 2010].

Los sistemas acuáticos naturales pueden considerarse como un conjunto de

compartimentos interrelacionados entre sí, en el que se desarrollan procesos físicos,
químicos, geológicos y biológicos. El agua líquida es el constituyente más característico del
medio acuático, pero existen otros compartimentos, entre los que se incluyen
fundamentalmente materias sólidas (partículas en suspensión y fondos marinos
sedimentarios y rocosos) y biota, entre los que se establecen interacciones mediante
procesos de transporte de masas y transferencias de energía, lo cual puede conllevar
cambios, ya sea a escala local o global, en la composición química de los mismos. Además,
es de destacar las importantes interacciones que este medio tiene con la atmósfera
(mediante intercambio de gases, deposición de partículas atmosféricas,…), con la litosfera
(aportes por meteorización y lixiviación de rocas,…) y con la hidrosfera (aportes
fluviales,…) (Figura 1.2).

En la Figura 1.3 se muestran las principales vías de transferencia de los metales

pesados entre los principales compartimentos ambientales de un sistema acuático, entre
los que se incluyen el sedimento, la materia en suspensión, la biota y la columna de agua
sobrenadante.

27
Capítulo 1

Atmósfera

Partículas Niebla Aire

sólidas

Terrestre
Agua Suelo (sólido)
Bioacumulación Nutrientes
Lixiviación Plantas Animales Adsorción

Organismos

Adsorción Lixiviación
Sedimento Liberación Microorganismos Residuos Suelo (agua)

Acuático

Erosión y escorrentía

Irrigación

Figura 1.2. Intercambio de contaminantes liberados por la antroposfera entre varios

segmentos de las otras esferas ambientales mostrando las vías involucradas en el
transporte y destino químico [Manahan, 2010]

AGUA

Adsorción
Ingestión
Desorción Intercambio iónico Excreción
Absorción
Complejación

Desorción
Materia suspendida Biota
Ingestión

Precipitación Resuspensión Descomposicón Ingestión

SEDIMENTOS

Figura 1.3. Principales interacciones y flujos de metales pesados entre compartimentos

del medio acuático
28
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

Los metales son bioacumulables y persistentes, es decir, no pueden ser creados o

degradados, ni mediante procesos biológicos ni de forma antropogénica. Una vez que han
entrado en los ecosistemas acuáticos, se transforman a través de procesos biogeoquímicos
y se distribuyen entre varias especies con distintas características físico-químicas, como
puede ser material particulado (>0,45 m), coloidal (0,45 m - 1 nm) y especies disueltas
(≤1 nm). En estas últimas especies se incluyen los iones metálicos hidratados, los cuales
suelen ser considerados como la fracción metálica más biodisponible, así como los
complejos metálicos orgánicos e inorgánicos con ligandos de origen natural o
antropogénico, los cuales son potencialmente biodisponibles, en mayor o menor medida
[Tercier-Waeber y Taillefert, 2008].

La concentración de metales en la columna de agua es, generalmente, pequeña debido

a la baja solubilidad de estos elementos; por el contrario, los metales se acumulan en los
sedimentos y en organismos acuáticos, alcanzándose niveles importantes, con factores de
3 5
concentración de entre 10 y 10 respecto a la fase disuelta. Es por ello que los sedimentos
se consideran sumideros y, por tanto, reservorios de metales pesados en el medio acuático.
La afinidad de los metales por la materia particulada y la deposición de dichas partículas
sobre el fondo contribuyen en gran medida a este fenómeno. No obstante, en los estudios
de distribución de metales pesados en los ecosistemas acuáticos se da especial énfasis a
los metales que se encuentran en fase disuelta en el agua, que se define
convencionalmente por aquella fracción que pasa a través de filtros de 0,45 m de tamaño
de poro.

Aunque, la fracción disuelta suele ser la más importante en cuanto a cantidad en la

columna de agua, existen excepciones como es el caso de algunos ecosistemas en los que
la cantidad de materia particulada puede ser sustancial. Esto ocurre en las aguas de zonas
costeras y de estuarios, de áreas oceánicas profundas con materia particulada
resuspendida y de extensiones influenciadas directamente por aportes hidrotermales. En
general, el contenido total en metales pesados presentes en las aguas suele expresarse
como la contribución de ambos, metal en forma disuelta y asociado a la materia
particulada.

La materia particulada y coloidal, tanto orgánica como inorgánica, desempeña un papel

clave en la coagulación, la sedimentación y en los procesos de adsorción, los cuales
influyen en los tiempos de residencia y transporte de los metales traza desde la columna de
agua a los sedimentos. El destino de los metales traza en los ecosistemas acuáticos
depende en gran medida de las especies, las cuales pueden coexistir y pueden o no estar
en equilibrio termodinámico. Variaciones en la proporción de dichas especies presentes
afecta a la biodisponibilidad de los metales traza, su grado de adsorción en los coloides y
partículas, y en general a la movilidad en la columna de agua y sus tasas de transferencia a
través de la interfase agua-sedimento [Tercier-Waeber y Taillefert, 2008].
29
Capítulo 1

Los procesos biogeoquímicos más importantes que regulan la movilidad de los metales
pesados en los medios acuáticos, incluyen los procesos de adsorción, la reacciones redox,
así como los procesos de meteorización de rocas y minerales. Los procesos biogeoquímicos
anteriormente mencionados, se ven afectados por muchos factores, entre los cuales el pH,
las condiciones redox y la concentración de ligandos orgánicos han sido considerados los
más importantes, junto con la salinidad, que es un factor destacado a tener en cuenta en
los sistemas estuáricos [Bradl y col., 2005; Guevara-Riba y col., 2005; Doong y col., 2008].

El pH y el potencial redox rigen la movilidad de los metales en el medioambiente. En la

Figura 1.4 se muestran las tendencias de solubilidad y movilidad de los metales pesados en
ausencia de interacciones significativas con la materia orgánica. Se puede observar cómo la
solubilidad y, por tanto, la movilidad de los metales, se ven incrementadas a valores bajos
de pH y cuando se modifican las condiciones redox del medioambiente mediante un
moderado aumento de los potenciales de reducción. Bajo condiciones reductoras, los
metales son retirados del compartimento acuático como minerales de sulfuro.

(a) pH constante
Concentración
disuelta

Sulfuros Óxidos E
(b) E constante Hidróxidos
Concentración
disuelta

-
Óxidos M(OH)3 pH
2-
Hidróxidos M(OH)4

Condiciones
más comunes

Figura 1.4. Efecto del potencial y el pH en la solubilidad de los metales pesados [Bradl y
col., 2005]

Por otro lado, los metales pesados habitualmente forman complejos tanto con ligandos
de origen natural (ácidos húmicos o fúlvicos) como con agentes complejantes de origen
30
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

antropogénico tales como el ácido etilendiaminotetraacético (AEDT) o el ácido

nitrilotriacético (NTA). La complejación afecta tanto a las propiedades de los metales como
a su actividad catalítica, su toxicidad y movilidad.

Además de los factores anteriormente mencionados, a la hora de estudiar la

concentración y distribución natural de los metales pesados en el medio acuático deben
considerarse las zonas de interfase líquido-líquido (zonas de estuarios, en las que las aguas
continentales se encuentran con las aguas salinas procedente del mar), sólido-líquido
(cauces, sedimentos y materia suspendida), gas-líquido (atmósfera-agua). Además,
también han de tenerse en cuenta otros factores que pueden modificar su concentración y
distribución, como son los movimientos de las masas de aguas (corriente de descenso del
cauce y flujo de las mareas en las zonas de estuario), así como causas de origen biológico.

Concretamente, en las zonas costeras y de estuarios, las concentraciones de metales

pesados suelen ser apreciablemente superiores a las presentes en el agua de mar
oceánica. Así, los ríos junto con aportes derivados de actividades antropogénicas y otros
aportes naturales en las áreas costeras, determinan un gradiente de concentración de
metales que disminuye a medida que aumenta la distancia respecto a la costa.

En la Tabla 1.8 se comparan intervalos típicos mínimos y máximos de concentraciones

de metales en distintas muestras de interés medioambiental. Estos datos deben ser
considerados únicamente como orientativos, aunque pueden ofrecer una visión general
para situar los ecosistemas acuáticos que se estudian dentro de los patrones habituales con
que estos metales suelen presentarse en sistemas semejantes.

En general, las concentraciones de metales dependen tanto de su naturaleza como del

medio en el que se encuentre; en este sentido, en agua de mar oceánica suelen ser
menores que en aguas continentales (ríos, lagos, etc). Esto se debe a la dilución que éstos
sufren cuando llegan al océano desde los ríos y a la intervención de agentes moduladores,
bien sea actuando como fuentes o como sumideros, sobre la distribución de los metales
pesados en los sistemas ambientales costeros. Este efecto se puede apreciar con mayor
claridad si se comparan las concentraciones de estos metales en aguas costeras, bahías y
estuarios con los valores encontrados en aguas oceánicas, donde la influencia de estos
agentes es notablemente inferior. También puede observarse que, en general, la
concentración en sedimentos es superior a la concentración en agua y en la biomasa.

1.3.1. Sumideros de metales en ecosistemas acuáticos

De igual manera que se producen en el medio acuático aportes de metales pesados
por fuentes naturales y antropogénicas, existen además una serie de procesos físico-
químicos que contribuyen a disminuir la concentración de los mismos en el medio acuático,
31
Capítulo 1

destacando: la adsorción sobre la superficie de partículas, la precipitación, coprecipitación y

la incorporación a la biota. No obstante, algunos de estos fenómenos pueden tener
carácter reversible, produciendo una redisolución de los metales asociados a esas especies
mediante desorción, disolución y/o procesos biológicos [Greenaway y Rankine Jones,
1992].

Tabla 1.8 Intervalos de concentración característicos de metales en diversos

compartimentos medioambientales [Alagarsamy, 2006; Crompton, 2007; Alomary y
Belhadj, 2007; Raj y Jayaprakash, 2008; Pozebon y col., 2009; Ianni y col., 2010; Nobi y
col., 2010; Chand y col., 2011; Uluturhan y col., 2011; Heimbürger y col., 2012; Leleyter y
col., 2012]

Agua de mar
Agua de Agua costera, Sedimentos Peces
oceánica
Elemento río bahía y marinos (mg/kg,
superficial
(µg/L) estuario (µg/L) (mg/kg) peso seco)
(µg/L)

Al 73,0-6300 6,40-63,0 0,10-0,60 257,3-86000 -

As 0,4-490,0 1,0-1,04 - 1,0-334,0 1,1-2,9

Cd 0,03-5,0 0,015-5,0 0,01-0,13 0,01-7,5 0,02-0,17

Co 0,20-10,0 0,01-0,25 0,003-0,16 0,44-45,3 0,07-0,38

Cr 0,05-23,0 0,095-3,30 0,005-1,26 2,6-243,2 0,1-2,2

Cu 0,11-200 0,069-20,0 0,006-2,80 1,1-657,0 0,39-3,46

Fe 1,0-3925 1,0-250,0 0,20-320 500-59300 -

Hg 0,01-1,30 0,00002-15,1 0,002-0,08 0,02-0,42 0,09-2,4

Mn 0,97-1835 0,35-250,0 0,018 23,2-16000 0,22-1,63

Mo 0,74-4,10 2,10-200,0 3,20-12,0 - <3,6

Ni 1,5-4,4 0,20-5,33 0,15-0,93 0,8-103 0,15-0,2

Pb 0,13-60,0 0,038-7,44 0,00004-9,00 1,3-70 0,12-1,36

V 0,1-24 0,01-5,1 0,45-2,00 52,6-110 -

Zn 0,86-630 0,007-200,0 0,05-10,9 5,3-309 6,3-39

32
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

A continuación se detallan los procesos que producen una disminución de la

concentración de metales en la columna de agua:

 Procesos de sorción de metales pesados. La mayor parte de la materia particulada en

los medios acuáticos (arcillas, óxidos hidratados metálicos y materia orgánica
particulada) tiene carácter coloidal, con una carga negativa neta. Por tanto, los
cationes metálicos son electrostáticamente atraídos hacia su superficie. Algunas de
estas partículas, enriquecidas de metales pesados, se hunden hasta depositarse en el
fondo. El grado en el que tiene lugar este fenómeno depende, entre otros factores, de
la naturaleza del metal, la abundancia de materia particulada, la concentración de
otros solutos y la profundidad de la columna de agua [Förstner y Witmann, 1983;
Kabata-Pendias, 2000].

 Precipitación. En las aguas naturales están presentes en altas concentraciones cloruros,

sulfatos y bicarbonatos. Aunque, en general, las formas químicas de los metales
pesados asociados a estas especies son bastante solubles, las características del agua
natural pueden producir la precipitación de éstas bajo determinadas condiciones. En el
caso de los hidróxidos, esta solubilidad disminuye con el aumento del pH, lo que puede
producir la precipitación de estos compuestos en condiciones básicas. Por otro lado, los
sulfuros de los metales pesados son prácticamente insolubles al pH de las aguas
naturales, mientras que la solubilidad de los carbonatos es altamente dependiente de
la presión parcial de CO2, aumentando en su presencia [Förstner y Witmann, 1983]. En
el caso particular de las zonas de estuario se ha detectado la disminución de la
concentración de metales procedentes del aporte fluvial que se origina, entre otras
razones, por la aparición de fenómenos de precipitación fundamentalmente debidos a
los cambios de pH y fuerza iónica que tienen lugar en las zonas de mezcla de aguas
dulces y marinas. Igualmente, en las aguas porosas e intersticiales de los sedimentos,
bajo condiciones anóxicas generadas por la oxidación de la materia orgánica
particulada, ciertas bacterias reducen el sulfato a sulfuro, el cual puede formar con los
metales pesados sulfuros metálicos, que presentan muy baja solubilidad, favoreciendo
la precipitación y coprecipitación [Greenaway y Rankine Jones, 1992].

 Incorporación a la biota. Los organismos vivos también influyen en el contenido y

distribución de los metales pesados [Vasconcelos y col., 2002; Oztürk y col., 2003]. Los
organismos tienen mecanismos bien desarrollados para absorber, metabolizar y
excretar diferentes elementos, incluso metales en concentraciones que se encuentran
de forma natural. En este sentido, por ejemplo, el fitoplancton incorpora metales
pesados para emplearlos en determinados sistemas enzimáticos que catalizan procesos
como la glicólisis, el ciclo del ácido tricarboxílico, la fotosíntesis y el metabolismo de las
proteínas; y el zooplancton y la fauna bentónica, que se alimentan por filtración,
acumulan metales pesados presentes en los sedimentos [Bruland, 1983]. Se considera
33
Capítulo 1

que la actividad biológica es responsable de más del 90% del transporte vertical de
metales pesados en la columna de agua [Bryan, 1976].

1.4. Especiación de metales en ecosistemas acuáticos

Tal como se ha indicado anteriormente, la toxicidad de los metales pesados depende

de la concentración en que se encuentren en el medio. No obstante, en relación con la
toxicidad, aún es más importante la forma química en que se encuentra el elemento
metálico (especiación química), y ello depende de las propiedades del elemento en cuestión
y de las condiciones físico-químicas del medio en que se encuentre la especie.

La distribución, movilidad, biodisponibilidad, toxicidad, bioacumulación y

biodegradabilidad de los metales pesados depende no sólo de sus concentraciones sino
también de sus asociaciones físico-químicas con el sistema natural. Cambios en las
condiciones medioambientales, ya sean naturales o antropogénicas, pueden influir
fuertemente en el comportamiento de los elementos tóxicos e incluso los esenciales,
alterando las formas en las que se presentan en la naturaleza. Algunos de los factores más
controlantes son el pH, el potencial redox, la capacidad de las especies reactivas del medio
para interaccionar como ligandos complejantes (tanto orgánicos como inorgánicos) y la
materia coloidal y particulada que pueden producir adsorción de elementos. Así, por
ejemplo, una disminución del pH del agua de lluvia como resultado de la quema de
combustibles fósiles ricos en azufre, puede producir un aumento de la lixiviación de
aluminio de minerales aluminosilicatos en suelos, resultando en efectos perjudiciales e,
incluso en casos extremos, muerte de peces en las aguas. Otro ejemplo es el arsénico, el
cual es extremadamente tóxico en su forma inorgánica, pero relativamente inocuo como
arsenobetaína (comúnmente presente en peces y crustáceos). Los compuestos
organoestánnicos, de los cuales el más conocido es el agente antiincrustante tributilestaño,
son generalmente más tóxicos que las especies inorgánicas [Ure y Davidson, 2002].

Es por ello que el propósito de las investigaciones actuales sobre contaminación del
medio ambiente se centra en desarrollar nuevos métodos analíticos, no solo con la finalidad
de determinar únicamente el contenido total de los elementos sino con el objetivo de
responder estas dos preguntas [Pérez-Bendito y Rubio, 1999]:

(a) ¿En qué formas se encuentran presentes dichos elementos en la muestra?

(b) ¿Cuál es el contenido de cada forma en la muestra?

Es necesario conocer las especies químicas de los elementos para comprender las
reacciones químicas y bioquímicas en las que intervienen, y por tanto, obtener información

34
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

relativa al carácter esencial y tóxico de los elementos químicos. Por ello, la determinación
de la concentración total de un determinado metal sólo proporciona una explicación
incompleta del posible impacto ambiental que puede producir en el medio en el que se
encuentra. Se puede afirmar que el uso de métodos de especiación, con el fin de
determinar las formas químicas o de obtener diferentes fases o fracciones diferenciadas, es
una de las claves que puede ayudar a entender la biogeoquímica de un ecosistema
[Manahan, 2010].

Parece difícil adoptar una definición única y de forma unánime para el concepto de
especiación. Ure y Davidson en 2002 la definieron como el proceso de identificación y
cuantificación de diferentes formas o fases definidas presentes en un material, o bien como
la descripción de las cantidades y los tipos de esas especies, formas o fases presentes [Ure
y Davidson, 2002]. La IUPAC publicó en el año 2000 un documento sobre especiación
química, Guidelines for terms related to chemical speciation and fractionation of trace
elements. Definitions, structural aspects and methodological approaches, donde define el
término especie química como la forma específica de un elemento definida como su
composición isotópica, su estado electrónico o de oxidación y/o su estructura compleja o
molecular [Templeton y col., 2000].

En consecuencia, la especiación de un elemento se define como la distribución de

dicho elemento entre especies químicas definidas en un sistema. Para determinar la
especiación, se define el análisis de especiación como la actividad analítica de identificación
y/o medida de las cantidades de una o más especies químicas individuales en una muestra
[Caruso y col., 2003; Hirose, 2006].

Ure y Davidson consideran que la definición de especie química recomendada por la

IUPAC es limitada, puesto que es únicamente apropiada para la especiación en muestras
líquidas y excluye los estudios realizados sobre materiales sólidos como suelos, sedimentos
y materiales geoquímicos y biológicos del campo de la especiación, puesto que los relega a
la categoría de fraccionamiento.

Frecuentemente, se ha empleado en la bibliografía la definición de especie referida a

formas químicas diferentes para un elemento en particular, como por ejemplo, los iones de
Cr(VI) y Cr(III). Existe un amplio debate sobre si el término especiación también debería
utilizarse para definir aquellos procesos que determinan varias fracciones de un elemento
obtenidas mediante extracciones múltiples. Este hecho ha provocado una incertidumbre
sobre el uso correcto de los términos fraccionamiento y análisis de especiación. Los
procedimientos analíticos que no conducen a la identificación de especies químicas pero
permiten caracterizaciones de grupos de especies no se consideran que sean propiamente
dicho análisis de especiación. Así pues, la IUPAC con el fin de aclarar la diferencia entre
estos dos términos, definió el fraccionamiento como el proceso de clasificación de un
analito o un grupo de analitos de una cierta muestra de acuerdo a sus propiedades físicas
35
Capítulo 1

(por ejemplo: tamaño o solubilidad) o químicas (por ejemplo, reactividad, capacidad de

enlace). Este concepto de fraccionamiento coincide con dos de los tipos de especiación
que se conocen en la bibliografía y que se denominan especiación funcional y operacional.
La primera de ellas hace referencia a la caracterización de las especies en función de su
papel en las rutas bioquímicas, mientras que en la segunda se diferencian las especies en
función de la operación analítica realizada [Caruso y col., 2003]. En este sentido, los
procedimientos de extracción secuencial selectiva se utilizan para aislar metales que se
encuentran asociados a las fracciones intercambiable, reducible, oxidable y residual en los
sedimentos. Las fases reducible, oxidable y residual se corresponden con los metales
asociados, enlazados o adsorbidos en oxihidróxidos de hierro y/o manganeso, en la materia
orgánica y/o sulfhídrica y en silicatos, respectivamente. Aunque éste sea un apropiado
concepto de especiación, debe enfatizarse que estas asociaciones son simbólicas y pueden
malinterpretarse. Por lo tanto, es preferible considerar las fracciones aisladas como
aquéllas definidas por el procedimiento operacional. Procedimientos físicos como la división
de una muestra sólida en partículas de menor tamaño, o el aislamiento de una muestra
disuelta de sedimento por filtración, centrifugación o diálisis son también ejemplos de
especiación operacional. De hecho, incluso la distinción entre especies solubles e insolubles
en sistemas acuáticos puede ser considerada como especiación operacional puesto que
está basada en la definición arbitraria de solubilidad, según la cual una sustancia es soluble
si es capaz de atravesar un filtro de 0,45 m [Ure y Davidson, 2002; vanLoon y Duffy,
2011].

El tercer tipo de especiación, en la cual se mide o se define la forma química precisa de

un elemento o su estado de oxidación, es la más difícil de conseguir puesto que se
requieren métodos analíticos de gran selectividad y sensibilidad. Algunos de los primeros
estudios relacionados con esta forma específica de especiación en agua lograron con éxito
separar los estados de oxidación del Cr [Isshiki y col., 1989] o del Sb [Mohammad y col.,
1990] utilizando métodos cromatográficos y electroquímicos, mediante el empleo de
absorbentes o reactivos específicos. Para muestras sólidas, que incluyen sedimentos y
materiales biológicos, este tipo de especiación rara vez es posible y se debería recurrir a la
especiación funcional u operacional.

El interés en estos procedimientos de especiación química se está expandiendo

rápidamente dado que existen estudios que reconocen que la evaluación de los riesgos
para la salud, la toxicidad y la biodisponibilidad debe basarse en los niveles de las
diferentes formas químicas de los elementos estudiados, en lugar de sus concentraciones
totales [Gonzalvez y col., 2009]. La literatura relacionada con este tema de interés es
relativamente reciente, dado que no se conocen estudios sobre especiación antes de 1980,
y está creciendo de forma muy significativa en los últimos años.

36
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

La determinación de las especies químicas de un elemento constituye un reto mayor

que la determinación del contenido total por las siguientes razones (Figura 1.5):

Concentraciones Distribución de
bajas de analitos las especies

Diversidad de Inestabilidad
analitos y muestras de las especies

Sistema medioambiental

Problemas más relevantes

en el análisis de la especiación
medioambiental según su origen

Proceso analítico

Toma, conservación y Validación

preparación de muestras Separación y detección de datos
de especies

Figura 1.5. Dificultades que se presentan en el análisis de especiación medioambiental

[Rodríguez Baena, 2001]

 Existen dificultades asociadas al aislamiento y separación de los compuestos de interés

de matrices naturales que presentan alta complejidad.

 La mayoría de las técnicas disponibles de especiación provocan cambios en los

equilibrios existentes entre varias especies químicas presentes en el sistema bajo
estudio.

37
Capítulo 1

 Existen pocos procedimientos analíticos que tengan la suficiente sensibilidad y

selectividad para el estudio de especiación de elementos que están presentes a muy
bajas concentraciones (niveles ultra-traza) en los ecosistemas acuáticos.

 Normalmente no se disponen de materiales de referencia para la validación de las

técnicas de especiación.

Aún así, se han realizado importantes avances en el campo de los análisis de

especiación durante los últimos 20 años, de modo que actualmente es posible realizar
análisis de especiación para casi cualquier elemento, aunque no para todas las especies de
cada elemento [Apostoli y col., 2006].

1.4.1. Especiación de metales en aguas

Los metales en las aguas se encuentran repartidos entre las fases disuelta y la
particulada (adsorbidos a partículas). Las concentraciones tan bajas que presentan se
deben normalmente a la poca solubilidad de estos elementos, independientemente del
metal de que se trate y de la especie química en la que se encuentren. Además, en los
sedimentos se suelen acumular los metales, por lo que dada la relación existente entre la
columna de agua y los sedimentos, en algunos casos puede ser muy importante realizar el
estudio de éstos últimos como posibles sumideros de metales.

La gran complejidad que muestran los sistemas acuáticos hace que los estudios de
especiación presenten una elevada dificultad. Esta complejidad se debe a las bajas
concentraciones que presentan los metales en aguas naturales, y a que este tipo de
muestras contienen un gran número de elementos de la tabla periódica (a menudo
presentes en una gran variedad de formas químicas), así como una variedad infinita de
compuestos orgánicos. Además los compuestos presentes en las aguas naturales cubren un
amplio rango de tamaños, desde unos pocos Å (iones inorgánicos hidratados) hasta la
escala macroscópica de 1 mm o mayores (desechos de los organismos). Los compuestos
de un tamaño intermedio, como son los coloides inorgánicos y las macromoléculas
orgánicas, juegan un papel importante en la regulación química del agua.

Las especies metálicas presentes en la fase soluble se encuentran mayoritariamente en

forma de iones o complejos orgánicos e inorgánicos. La naturaleza y concentración de los
ligandos orgánicos e inorgánicos en las aguas dulces y aguas de lluvia varían ampliamente,
mientras que en el agua de mar, sobre todo las aguas oceánicas, presentan una
composición que puede asumirse como virtualmente semejante en toda la tierra [Pérez-
Bendito y Rubio, 1999].
- = =
Los ligandos inorgánicos que se presentan en mayor concentración son Cl , CO3 , SO4 ,
- - -3 -5
OH y F (10 -10 mol/L). Los complejos formados entre ellos y los metales son casi
38
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

siempre muy lábiles. Dentro de los ligandos orgánicos se incluyen tanto especies
3
bioquímicas de baja masa molecular (<10 ), como son los ácidos carboxílicos, aminoácidos,
azúcares, pequeños hidroxiácidos, etc, como otros compuestos de estructura desconocida
3 7
que abarcan un amplio margen de masas moleculares (10 -10 ) [Nowack, 2005]. Las
moléculas orgánicas pequeñas no juegan un papel especial en el control de las
concentraciones de los elementos traza debido a que sus complejos metálicos tienen
constantes de complejación bajas y existen a bajas concentraciones.

La materia orgánica en los ecosistemas acuáticos proviene en gran medida de los

organismos vivos y de las fuentes de contaminación. En el agua dulce, la materia orgánica
existe normalmente a concentraciones más altas que en el agua de mar. Por otro lado, en
las aguas intersticiales de los sedimentos, en algunas aguas costeras con exceso de
fitoplancton y en aguas altamente contaminadas pueden medirse cantidades de materia
orgánica hasta diez veces superiores que en agua dulce; y en consecuencia, la formación
de complejos orgánicos en estos medios es probablemente muy importante [Pérez-Bendito
y Rubio, 1999].

Dentro de los componentes de la materia orgánica en ecosistemas acuosos, son

especialmente importantes las sustancias húmicas. Este tipo de sustancias son resistentes a
la degradación y se forman durante la descomposición de la vegetación depositada en los
suelos o en sedimentos. La materia húmica está formada por macromoléculas
polielectrolíticas, con grupos hidrofóbicos e hidrofílicos, de elevado peso molecular
[Manahan, 2010]. No está formada por moléculas discretas y bien definidas, sino por un
tipo de sustancias que se producen y residen en suelos y agua, considerándose
componente mayoritario de las reservas de carbono tanto terrestres como acuáticas. En la
hidrosfera, la materia húmica constituye el 50% de la materia orgánica disuelta presente
en aguas superficiales y en sedimentos orgánicos. Puede dividirse en diversas fracciones,
que se definen operacionalmente de acuerdo con el método de fraccionamiento empleado.
Según su solubilidad, se clasifican en humina (insoluble en álcali o ácido), ácidos húmicos
(solubles en álcali, pero precipita en medio ácido) y ácidos fúlvicos (solubles en álcali y
ácido). Las masas moleculares varían desde unos pocos cientos para los ácidos fúlvicos a
decenas de miles para las fracciones de ácido húmico y de humina. La fracción de ácido
fúlvico, por tanto, es la de menor masa molecular y complejidad. Estas sustancias
contienen un esqueleto de carbono con un elevado grado de aromaticidad y con un alto
porcentaje de peso molecular incorporado en grupos funcionales, la mayoría de los cuales
contienen oxígeno. La composición elemental de la mayoría de las sustancias húmicas está
dentro de los siguientes intervalos: C, 45-60%; O, 25-45%; H, 4-7%; N, 2-5%; y
elementos inorgánicos, 0,5-5%. Los principales grupos hidrofílicos en los ácidos fúlvicos y
húmicos son carboxilos, alcoholes, cetonas, quinonas y metoxilos. Debido a sus
propiedades ácido-base, de sorción y de formación de complejos, las sustancias húmicas,

39
Capítulo 1

tanto solubles como insolubles, tienen un fuerte efecto en las propiedades del agua. En
general, los ácidos fúlvicos se disuelven en agua y ejercen sus efectos en disolución. Por su
parte, la humina y los ácidos húmicos permanecen insolubles y afectan la calidad de agua a
través del intercambio de especies, como cationes o materiales orgánicos, con el agua
[vanLoon y Duffy, 2011].

Otra fracción considerable de metales pesados en las aguas se encuentra adsorbida

sobre coloides y materia particulada, tales como silicatos no arcillosos (cuarzo, sílice,
opalina), arcillas (montmorillonita, caolinita, illita), carbonatos (calcita, dolomita), óxidos de
Fe-Mn (goetita, magnetita), fosfatos (apatito) y sulfuros (mackinawita). La superficie de las
arcillas está predominantemente cargada negativamente, por lo que pueden adsorber iones
metálicos a los valores de pH que prevalecen en la mayoría de los ecosistemas naturales.
De forma parecida, los óxidos hidratados metálicos, pueden intercambiar protones e iones
-
OH por cationes y aniones, respectivamente, con lo que disminuye su biodisponibilidad. La
materia particulada representa una pequeña fracción de los ecosistemas acuáticos; sin
embargo, su gran número y superficie total facilita la adsorción de especies. Los tamaños
varían incluso desde unos pocos nanómetros a varias decenas de micra. La distribución
usual entre las partículas inorgánicas y orgánicas es de poca significación ambiental ya que
las partículas inorgánicas se sabe que están rodeadas por materia orgánica adsorbida
[Pérez-Bendito y Rubio, 1999].

Así pues, los metales pesados disueltos en agua pueden encontrarse tanto en forma
inorgánica, bajo distintos estados de oxidación y formas químicas, incluyendo iones
solvatados libres y complejos inorgánicos, como asociados a sustancias orgánicas en forma
de compuestos organometálicos (por ejemplo, formas metiladas de As, Ge, Hg, Sb, Sn y
Te, formas de etil-Pb y formas de butil-Sn) o complejos orgánicos (por ejemplo con
metabolitos de fitoplancton, proteínas, sustancias húmicas, etc) y por último asociados a
coloides.

1.4.2. Especiación de metales en sedimentos

Los sedimentos son las capas de materia orgánica y mineral finamente dividida que
cubren los fondos de los cuerpos de agua, como ríos, arroyos, lagos, embalses, bahías,
estuarios y océanos [Baird y Cann, 2005]. Típicamente consisten en mezclas de minerales
granulados de tamaño fino, medio y grueso, incluyendo arcilla, limo y arena, mezclados con
materia orgánica. Su composición puede variar de materia mineral pura a materia
predominantemente orgánica. Los sedimentos son depósitos de una variedad de desechos
biológicos y químicos en los cuerpos o reservorios de agua, siendo sumideros de
contaminantes tales como metales pesados y compuestos orgánicos tóxicos. Es de especial
importancia la transferencia de especies químicas de los sedimentos a las cadenas
40
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

alimenticias acuáticas vía organismos como gusanos y moluscos, que pasan una parte
importante de sus ciclos de vida en contacto con o viviendo en los sedimentos [Manahan,
2010].

Es incorrecto considerar a los sedimentos como simplemente suelos húmedos. Los

suelos normales se encuentran en contacto con el oxígeno de la atmósfera por lo que están
en un ambiente óxico; en cambio, los sedimentos dulceacuícolas o marinos están rodeados
de grandes cantidades de agua con niveles de oxígeno muy inferiores a los presentes en la
atmósfera. Es por ello que los sedimentos suelen estar sometidos a condiciones reductoras.
Por otro lado, los sedimentos sufren continuas lixiviaciones, mientras que los suelos no.

Una de las características más importantes de los sedimentos es su capacidad de

intercambiar cationes con el medio acuático circundante. La capacidad de intercambio
catiónico (CIC) se define como la capacidad de un sólido para adsorber e intercambiar
cationes. El CIC varía con el pH y la concentración de sales [Suresh y col., 2012].

Debido a la naturaleza generalmente anóxica de los sedimentos, su recolección y

tratamiento para el estudio de la especiación metálica debe realizarse con cuidados
especiales. Particularmente, el contacto con el oxígeno atmosférico oxida rápidamente el
2+ 2+
Fe y el Mn intercambiables a óxidos no intercambiables que contienen los metales en
estados de oxidación más altos, como el Fe2O3 y MnO2. Por lo tanto, las muestras de
sedimentos deben sellarse y refrigerarse lo más pronto posible después de ser recolectadas
[Manahan, 2010].

Como se ha indicado anteriormente, tanto los sedimentos como las partículas en

suspensión son sumideros de metales, como cromo, cadmio, cobre, cobalto, molibdeno,
níquel y manganeso, y otros muchos. Estos metales pueden estar presentes como iones
retenidos por intercambio catiónico con las arcillas, pueden estar enlazados a óxidos
hidratados de hierro o manganeso, o bien formando quelatos con las sustancias húmicas
insolubles. La forma química de los metales depende del pE. En la Tabla 1.9 se dan
ejemplos de compuestos específicos de elementos traza que pueden ser estables en
sistemas acuáticos bajo condiciones oxidantes y reductoras. La solubilización de metales
presentes en el material sedimentario o suspendido depende, entre otras causas, de los
ligandos que forman complejo. Estos compuestos pueden ser aminoácidos, citratos o el ión
cloruro, en el caso de agua de mar.

Puesto que los sedimentos están compuestos por mezclas heterogéneas de diferentes
sustancias orgánicas y organominerales, arcillas, óxidos de hierro, aluminio y manganeso,
así como una gran variedad de sustancias solubles, los mecanismos de enlace de los
metales traza en sedimentos son diversos y varían según la composición de los mismos y
sus propiedades físicas.

41
Capítulo 1

Tabla 1.9. Compuestos inorgánicos de metales traza que pueden ser estables bajo
condiciones oxidantes o reductoras [Manahan, 2010]
Metal Condiciones oxidantes Condiciones reductoras

Cd CdCO3 CdS

Cu Cu2(OH)2CO3 CuS

Fe Fe2O3·x(H2O) FeS, FeS2

Mn MnO2·x(H2O) MnS, MnCO3

Hg HgO HgS

Ni Ni(OH)2, NiCO3 NiS

Pb PbCO3, Pb(OH)2, PbCO3 PbS

Zn ZnCO3, ZnSiO3 ZnS

Para estudiar la especiación de metales en sedimentos, se han desarrollado diferentes

procedimientos analíticos que implican sucesivas extracciones. La especificidad del proceso
de extracción puede mejorarse mediante la combinación de varios extractantes en un
esquema de extracción secuencial, en el que el residuo de una extracción se extrae en la
siguiente secuencia de extracción del esquema. El objetivo de este método de extracción
secuencial es que el empleo de sucesivos reactivos (simples o mezcla) puede liberar paso a
paso el metal asociado a las fracciones o fases específicas del sedimentos, de modo que se
delimita más el acceso de cada reactivo a una fase en concreto y aumenta de este modo la
especificidad del método [Baeyens y col., 2003].

Desde finales de la década de los 70 y principios de los 80 se han desarrollado una

gran variedad de esquemas secuenciales de extracción. Tessier y colaboradores se
encuentran entre los primeros autores que desarrollaron un procedimiento secuencial de
extracción para el estudio de la especiación metálica en suelos [Tessier y col., 1979].

Todos los procedimientos de extracción secuencial están basados en la posible

presencia en los sedimentos de las siguientes especies metálicas:

 Solubles en agua

 Intercambiables

 Enlazadas a materia orgánica

 Asociadas a óxidos de hierro y manganeso

42
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

 Formando parte de carbonatos, fosfatos o sulfuros

 Enlazadas a los silicatos que forman el suelo (presentes en lo que se denominaría la

fracción residual)

La gran diversidad y la falta de uniformidad tanto de los métodos de extracción simple,

así como de los esquemas de especiación secuencial no permitía la comparación de los
resultados [Jouanneau y col., 1983; Nirel y Morel, 1990; Hlavay y col., 2004]. A esto, se
sumaba la ausencia de materiales de referencia adecuados para la validación de la
metodología. Estos problemas unidos a las muchas fuentes de errores aleatorios que
presentaban estos métodos, hacía pensar que el uso de los esquemas de extracción sería
abandonado de manera progresiva. Sin embargo, dada la valiosa información que
proporcionaban estos métodos, el Community Bureau of Reference (BCR), actualmente
Mesaurements and Testing Programme, inició un programa de trabajo para estandarizar
esquemas de extracción simple y secuencial para la determinación de metales trazas
extraíbles en suelo y sedimento.

Este programa empezó en 1987 con la comparación de los procedimientos existentes

probados en dos ejercicios interlaboratorios [Ure y col, 1993a, Ure y col., 1993b]. Se
discutió el desarrollo de este programa extensivamente en un taller organizado por el BCR
en 1992 [Quevauviller y col., 1993) que fue reconocido por ser un punto de inflexión en el
uso de estos esquemas en Europa [Salomons, 1993]. La estrategia de trabajo desarrollada
por el BCR en este programa se ha descrito en detalle por Quevauviller [Quevauviller y col.,
1993; Quevauviller y col., 1994]. En esta estrategia se incluía en primer lugar el diseño de
los procedimientos estándar de extracción simple y secuencial para el análisis de suelos y
sedimentos, la realización de ensayos interlaboratorios de estos procedimientos de
extracción y, por último, la preparación de muestras de referencias certificadas para los
metales extraíbles. Estos trabajos culminaron con la propuesta de un procedimiento de
extracción secuencial, el denominado método BCR, que consiste en emplear 3 extracciones
sucesivas empleando ácido acético, cloruro de hidroxilamonio y peróxido de hidrógeno
combinado con acetato amónico, obteniendo la fracción intercambiable, la reducible y la
oxidable, respectivamente. Este procedimiento se explicará con detalle en el capítulo 4 de
esta Tesis Doctoral.

En un trabajo posterior, Quevauviller realizó una serie de recomendaciones

importantes a tener en cuenta en el empleo del método BCR [Quevauviller y col., 1997;
Quevauviller, 1998]:

 Las disoluciones de calibración deben hacerse con las disoluciones extractantes

empleadas en cada paso de extracción.

 Con cada lote de extractos, una muestra blanco (es decir un recipiente sin sedimento)
será tratada con el procedimiento completo.
43
Capítulo 1

 El sedimento debe estar continuamente en suspensión durante la extracción. Si esto no

ocurre, la velocidad de agitación debe adaptarse para asegurar una suspensión
continua de la mezcla.

Más tarde, se propusieron algunas mejoras a este método de extracción secuencial y

se hicieron una serie de recomendaciones acerca de las distintas variables identificadas
como fuentes potenciales de incertidumbre [Rauret y col., 1999; Sahuquillo y col., 1999].
Una de las recomendaciones que se presentó fue la siguiente: como control interno del
procedimiento, se recomienda que el residuo del paso 3º se digiera en agua regia y la
cantidad total de metal extraída (suma de la fase 1 + fase 2 + fase 3 + residuo) se
compare con el resultado de la digestión con agua regia de una muestra separada de 1 g
del sedimento original. El residuo del paso 3º debe transferirse a un recipiente de digestión
adecuado con aproximadamente 3 mL de agua y debe digerirse siguiendo el protocolo ISO-
11466 [ISO, 1994]. El mismo procedimiento debe usarse para la digestión con agua regia
del sedimento original.

A tenor de estos resultados Pueyo describe la preparación del material de referencia de

sedimento BCR-701, preparada a partir de muestras de sedimento recogidas en el lago
Orta en Italia [Pueyo y col., 2001]. En este trabajo se recogen todas las recomendaciones
elaboradas en los trabajos precedentes, tanto para la aplicación del protocolo de extracción
secuencial BCR como para la norma ISO-11466, presentándose los respectivos
procedimientos.

Esta muestra de referencia ha sido extensamente utilizada en estudios de especiación

metálica en sedimentos [The Coung y Obbard, 2006; Pueyo y col., 2008; Díaz-de Alba y
col., 2011], pero un estudio reciente ha puntualizado que deberían existir adicionales
materiales de referencia, con un rango más amplio de metales certificados, con el objetivo
de abarcar una mayor variedad de suelos y sedimentos comúnmente analizados
[Sutherland, 2010].

Como resultado del trabajo sistemático llevado a cabo por los integrantes del
Measurements and Testing Programme el método de extracción secuencial en tres etapas,
conocido como BCR, se ha ido estableciendo como método de referencia internacional, y
será el que se aplique en esta tesis.

1.5. Legislación ambiental

La legislación ambiental o derecho ambiental es un complejo conjunto de tratados,

convenios, estatutos, reglamentos y el derecho común que, de manera muy amplia,
funciona para regular la interacción de la humanidad y el resto de los componentes
44
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

biofísicos o el medio ambiente natural, con la finalidad de reducir los impactos de la

actividad humana, tanto en el medio natural como en la humanidad misma.

Existe un marco legislativo que viene dado desde la Unión Europea al que se deben
adaptar todos los países miembros de la misma y que hace referencia a la calidad de las
aguas y al uso que de ellas se hace.

La Directiva 2000/60/CE, de 23 de octubre de 2000, (DOCE núm. L327/1, de 22 de

diciembre de 2000), también conocida como la Directiva marco del agua o DMA, es una
norma del Parlamento Europeo y del Consejo de la Unión Europea por la que se establece
un marco de actuación comunitario en el ámbito de la política de aguas. En España fue
transpuesta al marco legislativo estatal a través del artículo 129 de la Ley 62/2003, de 30
de diciembre de 2000, de Medidas Fiscales, Administrativas y del Orden Social, que
modificó el Texto Refundido de la Ley de Aguas (Real Decreto Legislativo 1/2001, de 20 de
Julio, BOE núm. 176, de 24 de julio de 2001).
Esta Directiva considera en primer lugar que el agua no es un bien comercial, sino un
patrimonio que hay que proteger, defender y tratar como tal y tiene como principal
objetivo establecer un marco para la protección de las aguas continentales, las aguas de
transición, las aguas costeras y las aguas subterráneas con los fines siguientes:

 La prevención del deterioro adicional y la protección y mejora del estado de los

ecosistemas acuáticos, así como de los ecosistemas terrestres y humedales
directamente dependientes de los ecosistemas acuáticos.

 La promoción de un uso sostenible del agua, basado en la protección a largo plazo de

los recursos hídricos disponibles.

 La protección y mejora del medio acuático, mediante medidas específicas de reducción

de vertidos y emisiones.

 La reducción de la contaminación de las aguas subterráneas.

 La paliación de los efectos de inundaciones y sequías.

Además, la DMA establece, como objetivo para el año 2015, conseguir un “buen
estado” de las aguas europeas y que el “uso sostenible del agua” esté asegurado en toda
Europa. Para alcanzar estas metas, la norma requiere la cooperación entre los distintos
estados miembros, así como la participación de las entidades locales y ONGs en las
actividades de gestión del agua. Además, reafirma el principio según el cual “el que
contamina, paga”. Asimismo, se contempla que las aguas de la Unión Europea están
sometidas, desde hace años, a la creciente presión que supone el continuo crecimiento de
la demanda de agua de buena calidad en cantidades suficientes para todos los usos,

45
Capítulo 1

definiéndose una serie de términos relacionados con las aguas y la contaminación acuática,
de la siguiente forma:

 Aguas superficiales: se entiende como tal a las “aguas continentales (excepto las aguas
subterráneas), las aguas de transición y las aguas costeras, y, en lo que se refiere al
estado químico, también las aguas territoriales”.

 Aguas continentales: son “todas las aguas quietas o corrientes en la superficie del
suelo y todas las aguas subterráneas situadas hacia tierra desde la línea que sirve de
base para medir la anchura de las aguas territoriales”.

 Aguas de transición: son aquellas “masas de agua superficial próximas a la

desembocadura de los ríos que son parcialmente salinas como consecuencia de su
proximidad a las aguas costeras, pero que reciben una notable influencia de flujos de
agua dulce”.

 Aguas costeras: son “las aguas superficiales situadas hacia tierra desde una línea cuya
totalidad de puntos se encuentra a una distancia de una milla náutica mar adentro
desde el punto más próximo de la línea de base que sirve para medir la anchura de las
aguas territoriales y que se extienden, en su caso, hasta el límite exterior de las aguas
de transición”.

 Cuenca hidrográfica: corresponde a la “superficie de terreno cuya escorrentía

superficial fluye en su totalidad a través de una serie de corrientes, ríos y,
eventualmente, lagos hacia el mar por una única desembocadura, estuario o delta”.

 Demarcación hidrográfica: “la zona marina y terrestre compuesta por una o varias
cuencas hidrográficas vecinas y las aguas subterráneas y costeras asociadas”.

 Sustancias peligrosas: incluye a “las sustancias o grupos de sustancias que son tóxicas,
persistentes y pueden causar bioacumulación, así como otras sustancias o grupos de
sustancias que entrañan un nivel de riesgo análogo”.

 Contaminación: se define como “la introducción directa o indirecta, como consecuencia

de la actividad humana, de sustancias o calor en la atmósfera, el agua o el suelo, que
puedan ser perjudiciales para la salud humana o para la calidad de los ecosistemas
acuáticos, o de los ecosistemas terrestres que dependen directamente de ecosistemas
acuáticos, y que causen daños a los bienes materiales o deterioren o dificulten el
disfrute y otros usos legítimos del medioambiente”.

 Contaminante: “cualquier sustancia que pueda causar contaminación, en particular las

sustancias enumeradas en el anexo VIII de la Directiva Marco”.

 Sustancias prioritarias: son aquellas “sustancias que presentan un riesgo significativo

para el medio acuático o a través de él”. Entre estas sustancias se encuentran las
46
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

sustancias peligrosas prioritarias que se establecen de acuerdo a la selección de

sustancias de riesgo realizada en la legislación comunitaria pertinente relativa a
sustancias peligrosas o en los acuerdos internacionales pertinentes.

En el anexo VIII de la Directiva se recoge el listado de los principales contaminantes,

entre los que se encuentran los metales:

ANEXO VIII

LISTA INDICATIVA DE LOS PRINCIPALES CONTAMINANTES

1. Compuestos organohalogenados y sustancias que puedan dar origen a compuestos

de esta clase en el medio acuático.
2. Compuestos organofosforados.
3. Compuestos organoestánnicos.
4. Sustancias y preparados, o productos derivados de ellos, cuyas propiedades
cancerígenas, mutágenas o que puedan afectar a la tiroides, esteroidogénica, a la
reproducción o a otras funciones endocrinas en el medio acuático o a través del
medio acuático, estén demostradas.
5. Hidrocarburos persistentes y sustancias orgánicas tóxicas persistentes y
bioacumulables.
6. Cianuros.
7. Metales y sus compuestos.
8. Arsénico y sus compuestos.
9. Biocidas y productos fitosanitarios.
10. Materias en suspensión.
11. Sustancias que contribuyen a la eutrofización (en particular nitratos y fosfatos).
12. Sustancias que ejercen una influencia desfavorable sobre el balance de oxígeno (y
computables mediante parámetros tales como DBO o DQO).
En la Decisión 2445/2001 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 20 de noviembre
de 2000 (DOCE núm. L331/1, de 15 de diciembre de 2001) se aprobó la lista de sustancias
prioritarias en el ámbito de la Política de Aguas, que posteriormente fue modificada por la
Directiva 2008/105/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008
(DOUE núm. L348/84, de 24 de diciembre de 2008), según la cual varios metales y sus
compuestos (Cd, Pb, Hg y Ni y los derivados organometálicos del estaño) están incluidos
dentro de las sustancias prioritarias, siendo Cd, Hg y los compuestos de tributilestaño
considerados como sustancias prioritarias peligrosas. Además, en la Comunicación de la
Comisión sobre los resultados de la evaluación del riesgo y la estrategia de limitación de
éste en relación con las sustancias siguientes: trióxido de cromo, dicromato de amonio y
dicromato de potasio (DOUE núm. C152/01, de 18 de junio de 2008), así como en la
47
Capítulo 1

Comunicación de la Comisión sobre los resultados de la evaluación del riesgo y la estrategia

de limitación de éste en relación con las sustancias siguientes: cromato de sodio, dicromato
de sodio y 2,2',6,6'-tetrabromo-4,4'-isopropilidendifenol (tetrabromobisfenol A) (DOUE
núm. C152/11, de 18 de junio de 2008), se recomendó la inclusión de compuestos de
Cr(VI) en la revisión de la lista de sustancias prioritarias con arreglo a la Directiva marco de
aguas. Por el momento no se han tomado ningún tipo de decisiones al respecto.

En la Decisión 2445/2001 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 20 de noviembre

de 2000 también se recogen las estrategias para combatir la contaminación de las aguas.
Por otro lado, se proponen guías para la evaluación del estado de las aguas superficiales
por medio del empleo de indicadores de calidad biológicos (fitoplancton, macroalgas,
angiospermas, fauna bentónica de invertebrados y fauna ictiológica), indicadores de calidad
hidromorfológicos (mareas y condiciones morfológicas) e indicadores de calidad
fisicoquímicos (condiciones generales, contaminantes sintéticos específicos y contaminantes
no sintéticos específicos). Asimismo, también se especifican los procedimientos que
deberán seguir los estados miembros para el establecimiento de las normas de calidad
química, en las que se recoge la necesidad de desarrollar programas de monitorización
periódica, tanto sobre las aguas y sedimentos como sobre la biota, entre la que se incluyen
los peces. En este sentido, la Directiva 2008/105/CE establece las normas de calidad
ambiental para las sustancias prioritarias y para otros contaminantes, con el objetivo de
conseguir un buen estado químico de las aguas superficiales.

Como un paso más de la estrategia de protección de las aguas, se aprobó el Real

Decreto 60/2011, de 21 de enero, sobre las normas de calidad ambiental en el ámbito de la
política de aguas (BOE núm. 19, de 22 de enero de 2011). Tal real decreto tiene como
finalidad trasponer todos los aspectos contenidos en la Directiva 2008/105/CE, e incorpora
al derecho español el apartado 1.2.6 del anexo V de la Directiva 2000/60/CE, en el cual se
define el procedimiento para el establecimiento de normas de calidad ambiental (NCA) de
contaminantes en aguas, sedimento o biota. En el citado real decreto se propone como
objetivo

“establecer NCA para las sustancias prioritarias y para otros contaminantes de

riesgo en el ámbito europeo; y para las sustancias preferentes de riesgo en el
ámbito estatal. Asimismo, incorpora las especificaciones técnicas del análisis
químico y del seguimiento del estado de las aguas, y fija el procedimiento para
calcular las NCA de los contaminantes con objeto de conseguir un buen estado de
las aguas”.

Con este nuevo real decreto, se actualiza la legislación española que recoge las normas
de calidad ambiental de las sustancias preferentes, seleccionadas por presentar un riesgo
significativo para las aguas superficiales españolas debido a su especial toxicidad,

48
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

persistencia y bioacumulación o por la importancia de su presencia en el medio acuático, y

entre las que se encuentran el arsénico, el cobre, el cromo, el selenio y el cinc.

En conclusión, la aplicación práctica de la DMA supone un complejo reto para los

estados miembros de la Unión Europea, siendo necesaria una aplicación coordinada y
homogénea, de manera que los estados miembros y la Comisión Europea interpreten de la
misma forma sus pautas y criterios. El mecanismo por el cual se intenta dar respuesta a
estas necesidades mediante un procedimiento no vinculante es la Estrategia Común de
Implantación, que se centra en cuatro actividades: intercambio de información, desarrollo
de guías técnicas, información y gestión de datos, y aplicación, ensayo y validación.

Para garantizar el cumplimiento de la normativa a nivel de Andalucía, en enero de 2005

se constituyó la Agencia Andaluza del Agua, organismo autónomo de carácter
administrativo de la Junta de Andalucía, adscrito a la Consejería de Medio Ambiente,
competente en materia de aguas. Años más tarde, en enero de 2009, se aprobaron los
estatutos de la Agencia Andaluza del Agua, en el Decreto 2/2009, de 7 de enero (BOJA
núm. 6, de 12 de enero de 2009), comenzando a abordar en ese momento sus
competencias. Según dicho Decreto, le corresponde a la Agencia el ejercicio de las
competencias de la Comunidad Autónoma de Andalucía en materia de aguas y obras
hidráulicas, y en particular:

a) La elaboración, seguimiento y revisión de la planificación hidrológica, así como de los

proyectos derivados de la misma.

b) La administración, protección y control de los aprovechamientos hidráulicos y del

dominio público hidráulico en general, incluyendo el otorgamiento de autorizaciones y
concesiones.

c) La planificación, programación, construcción, y en su caso, la explotación y

mantenimiento de las obras hidráulicas de competencia de la Comunidad Autónoma de
Andalucía.

d) La planificación, ordenación y regulación de los servicios de abastecimiento de agua en

alta y de saneamiento de las aguas residuales urbanas.

e) La acción concertada y, si procede, la coordinación de las actuaciones de las

Administraciones y entidades públicas competentes para mejora de la gestión de los
servicios de abastecimiento de agua en alta y distribución de agua potable, y prevención de
avenidas e inundaciones.

f) El otorgamiento de concesiones y autorizaciones relativas al dominio público hidráulico,

así como el censo de las mismas.

49
Capítulo 1

g) La realización de trabajos de información y análisis como apoyo técnico a la formulación

de la política de aguas de la Administración de la Junta de Andalucía y posterior evaluación
de su aplicación.

h) Los trabajos de elaboración y desarrollo de la información sobre la materia hidráulica, así

como la difusión y divulgación de la misma.

i) La colaboración en la investigación, desarrollo tecnológico e innovación en materia de

aguas, con las administraciones y entidades públicas y privadas.

j) La participación en las organizaciones nacionales e internacionales especializadas en

gestión del agua, conservación de los recursos hídricos y tecnología hidráulica de
conformidad con la normativa de aplicación.

k) La gestión, recaudación y administración de los recursos económicos que correspondan

a la Agencia.

l) En general todas las funciones relativas a administración y gestión de las aguas de

competencia de la Comunidad Autónoma, sin perjuicio de las atribuidas a otros órganos o
entidades dependientes de la Administración de la Junta de Andalucía.

m) Aquellas otras que le sean atribuidas legal o reglamentariamente y las que deriven de
convenios que se suscriban con personas físicas o jurídicas, públicas o privadas.

La Agencia Andaluza del Agua desapareció en 2011, tras la reorganización del sector
público realizada por la Junta de Andalucía, quedando integrada sus competencias en la
Secretaría General de Medio Ambiente y Agua de la Consejería de Agricultura, Pesca y
Medio Ambiente de la Junta de Andalucía.

A las disposiciones legales anteriormente mencionadas, vigentes en la Comunidad

Autónoma de Andalucía, hay que sumar otras correspondientes al Estado Español, como la
convención de Barcelona que protege el mar Mediterráneo, así como otras leyes de la
Unión Europea, tales como el convenio OSPAR, para la protección de las aguas del
nordeste Atlántico, el convenio de Londres para la prevención de la contaminación marina
por vertidos de residuos y otras materias, la convención sobre protección del río Danubio o
la Comisión Internacional para la protección del Rin, demostrando así la enorme
preocupación actual que existe por la fragilidad de este recurso, así como el interés por
controlar y evitar su posible contaminación.

En 2010 entró en vigor la nueva Ley 41/2010, de 29 de diciembre, de protección del

medio marino (BOE núm 317, de 30 de diciembre de 2010), que incorpora al derecho
español la Directiva marco sobre Estrategia Marina (Directiva 2008/56/CE), suponiendo la
mayor ampliación territorial del Derecho ambiental comunitario. Esta nueva Directiva, por la
que se establece un marco de acción comunitario para la política del medio marino:

50
 Introducción: Metales pesados en el medio ambiente

“introduce la obligación de lograr un buen estado ambiental de las aguas marinas

europeas mediante la elaboración de estrategias marinas con el objetivo final de
mantener la biodiversidad y preservar la diversidad y el dinamismo de unos
océanos y mares que sean limpios, sanos y productivos, y cuyo aprovechamiento
sea sostenible”.

“Hasta el momento se carecía de un marco normativo completo, que pudiera

garantizar la articulación de las actividades humanas en el mar de manera que no
se comprometiera la conservación de las características naturales de los
ecosistemas marinos, de acuerdo con el enfoque ecosistémico”.

“La presente ley engloba la regulación de otros aspectos de la protección del medio
marino que hasta ahora no se habían abordado en la legislación estatal. De esta
manera, la Ley de Protección del Medio Marino se constituye como el marco
general para la planificación del medio marino, con el objetivo de lograr su buen
estado ambiental”.

“La Directiva marco sobre la estrategia marina establece que sus regulaciones se
aplicarán a las aguas costeras con arreglo a la definición de la Directiva marco del
agua, el lecho marino y el subsuelo situados más allá de la línea de base que sirve
para medir la anchura de las aguas territoriales y que se extienden hasta el límite
exterior de la zona en que un Estado miembro de la Unión Europea ejerce
soberanía o jurisdicción de conformidad con la Convención de las Naciones Unidas
sobre Derecho del Mar”.

El principal objetivo de la Directiva sobre Estrategia Marina es conseguir unas aguas

marinas en un buen estado ecológico para 2020, lo que se logrará mediante el
establecimiento de regiones y subregiones marinas, que gestionarán los Estados miembros
de forma integrada basándose en criterios ecológicos.

Al elaborar las estrategias sobre las aguas de cada región marina, los Estados
miembros deberán cooperar estrechamente. Cada estrategia consiste en un plan de acción
que se aplicará en varias fases. Los Estados miembros deberán evaluar primero el estado
ecológico de sus regiones marinas respectivas y las principales presiones que sufren las
mismas, determinar después lo que se puede considerar un buen estado ecológico y
establecer a continuación objetivos, indicadores y programas de seguimiento. Los
programas de medidas deben elaborarse antes de 2015 para conseguir un buen estado
ecológico para 2020.

Una contribución importante del Parlamento Europeo a la Directiva incluye la obligación

de los Estados miembros de establecer zonas marinas protegidas. Los Estados miembros
que compartan una región marina deberán cooperar para velar porque sus estrategias
marinas sean coherentes y estén coordinadas. Deben también hacer todo lo posible para
51
Capítulo 1

coordinar sus actividades con países no pertenecientes a la UE en la misma región marina,

incluso mediante convenios marinos regionales.

52
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 2
Análisis por Extracción en Fase Sólida del
contenido de cobre en aguas naturales
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Análisis por Extracción en Fase Sólida del

contenido de cobre en aguas naturales

Este capítulo se dedica a exponer una nueva metodología de preconcentración y

análisis de Cu(II) en aguas naturales mediante extracción en fase sólida, utilizando discos
de membrana previamente modificados con un ligando orgánico quelatante. Tomando
como base la experiencia previa del Grupo de Investigación Geoquímica Marina en las
propiedades analíticas de los ligandos de la familia de las aroilhidrazonas, se ha abordado
el estudio de la aplicabilidad de la saliciloilhidrazona del piridoxal (PSH) en esta técnica de
separación y preconcentración, con objeto de desarrollar un nuevo método de análisis de
metales en aguas naturales, principalmente en agua de mar.

La saliciloilhidrazona del piridoxal es un reactivo orgánico que ha demostrado tener

gran interés analítico. Se ha utilizado en la determinación espectrofotométrica y
espectrofluorimétrica de varios metales tales como circonio, aluminio, titanio o cobre
[Gallego y col., 1982b, 1983a y 1983b; Mohan y col., 1992]. También ha sido aplicado en
voltamperometría de redisolución catódica adsortiva (AdCSV) para el análisis de níquel en
agua de mar [Aouarram y col., 2010]. Sin embargo, y hasta el momento, no se ha
estudiado su capacidad de complejación como reactivo en extracción en fase sólida. Esta
técnica cuenta con la ventaja de que aísla el analito y elimina las posibles interferencias de
matriz en muestras con propiedades desfavorables para el análisis directo, y su uso es
novedoso en la preconcentración de trazas metálicas en muestras de aguas naturales.

55
Capítulo 2

Dado que la extracción en fase sólida presenta un gran número de variables químicas,
físicas e instrumentales, parece muy adecuada la aplicación de métodos quimiométricos
para el proceso de optimización.

2.1. El cobre en la naturaleza

Entre los metales más abundantes, de amplia distribución y que presentan toxicidad a
ciertos niveles para los organismos acuáticos, se encuentra el cobre.

Este metal es un elemento que se encuentra a nivel de trazas en aguas naturales. La

concentración de cobre en mar abierto se encuentra en el rango 0,0063 – 2,8 g/L, con un
valor medio de 0,05 g/L; mientras que en aguas costeras, bahías y estuarios puede oscilar
entre 0,069 – 20,0 g/L. En sistemas fluviales estos niveles son algo superiores con valores
entre 0,11 – 200 g/L [Crompton, 2007]. Como es lógico, la cantidad de metal que puede
ser medida en distintas zonas marinas, variará enormemente en función de la localización y
el tipo de fuentes originarias. Así pues, se conocen por ejemplo las vías de ingreso y las
cantidades globales para este metal, expresadas en toneladas/año que acceden al Mar del
Norte, considerado como uno de los mares que sufren más directamente la contaminación
de origen antropogénico [Crompton, 2007]:

- Ríos: 2600 toneladas al año.

- Atmósfera: 3942 toneladas al año.

- Vertidos directos: 276 toneladas al año.

- Dragados: 1469 toneladas al año.

Las precipitaciones atmosféricas contribuyen a la presencia de metales en mayor

medida de la que se suponía, lo que hace que hoy se considere a la atmósfera como una
importante vía de ingreso de metales, sobre todo en el mar. Los valores de transferencia
de cobre desde la atmósfera a la superficie de agua marina (en ng/cm2/año)
correspondientes al Mar del Norte, Mar Mediterráneo, Atlántico Sur y Pacífico Norte son
respectivamente: 1300, 96, 220 y 9 [Díaz Mayans y col., 1993]. Existen grandes diferencias
entre las distintas zonas marítimas y, a pesar de que no se conocen suficientemente las
tasas de lluvia que condicionan estrechamente la deposición húmeda, tales diferencias se
pueden imputar a la actividad industrial y urbana de distintas zonas.

El cobre es importante en el tratamiento de aguas, siendo eficaz en la lucha contra

algas en depósitos de almacenamiento de aguas, lagos, embalses y piscinas. En
distribución de aguas potables, debe tenerse en cuenta que las tuberías de este metal

56
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

pueden corroerse por el oxígeno del agua, la acidez de ésta, temperatura, procesos
electroquímicos, etc. Finalmente, en concentraciones del orden de 3-5 mg/L puede aportar
sabor amargo, coloración y turbidez al agua de consumo, así como provocar manchas en
los sanitarios domésticos para niveles superiores a 1 mg/L. Industrialmente se emplea en la
industria eléctrica y automovilística, construcción, fontanería, latón, y para la conservación
de madera. Además, es un ingrediente esencial en algicidas y herbicidas [Jančula y
Maršálek, 2011]. Las descargas más importantes al medio ambiente se producen por
procesos de minería, fundición y recubrimiento de metales.

La utilización del cobre como elemento con propiedades terapéuticas se ha dado desde
los primeros tiempos de la medicina. Debido a sus propiedades bioquímicas, fue utilizado
por alquimistas hindúes, egipcios y sirios como terapia. En la actualidad, se sigue utilizando
el cobre y sus complejos para sintetizar compuestos que actúen como agentes
antiinflamatorios [Agotegaray y col., 2012], anticancerígenos [Vyas y col., 2012] y
antituberculosos [Joseph y col., 2012]. Se ha demostrado que los complejos de cobre son
efectivos en el tratamiento de cánceres dada su acción citotóxica sobre células tumorales.
Alternativamente, estos complejos intervienen en la homeostasis de los niveles de cobre en
el tejido cerebral, protegiendo al organismo de la neurodegeneración [Duncan y White,
2012].

El cobre es un elemento que se encuentra en todos los organismos como

microcomponente. Es necesario para el metabolismo normal de muchos organismos vivos.
Su presencia en animales y plantas se detectó hace 150 años. Además, es un
micronutriente esencial, necesario para las plantas a niveles muy bajos. Asimismo, es un
oligoelemento esencial para el hombre, estando involucrado en la formación de
hemoglobina, junto al Co, y en la de los eritrocitos, que a su vez intervienen en el
desarrollo de los sistemas óseos y nervioso central. También, se encuentra combinado con
algunas proteínas del plasma sanguíneo y dentro de ciertas enzimas. La esencialidad del Cu
se manifiesta en que actúa como un grupo prostético de numerosas enzimas y puede servir
como cofactor para la activación enzimática, sobre todo de las enzimas asociadas con el
metabolismo oxidativo, como la citocromo c oxidasa [Kim y col., 2012]. Puesto que el cobre
es un metal que puede existir tanto en su forma oxidada como en la reducida, se ha
demostrado que participa en reacciones redox y catalíticas, actuando como cofactor de una
gran variedad de enzimas y moléculas [Duncan y White, 2012].

La mayoría de los datos demuestran que su deficiencia es mucho más crucial para los
animales que las situaciones tóxicas. Sin embargo, hay suficiente evidencia para soportar la
hipótesis de que la sobreexposición puede dar lugar a efectos negativos para la salud
humana. A valores altos resulta tóxico debido a su unión con la membrana celular, que
impide el transporte a través de la pared de la célula [Safavi y col., 2001]. Se ha detectado
que la exposición a este metal afecta negativamente a la glucólisis [Carvalho y Fernandes,
57
Capítulo 2

2008], el ciclo de Krebs [Couture y Kumar, 2003], la regulación osmótica e iónica [Pinho y
col., 2007], el consumo de oxígeno y al crecimiento [Manyin y Rowe, 2009], entre otros. La
mayoría de estos efectos pueden estar asociados directa o indirectamente con una
producción de energía insuficiente para mantener el metabolismo celular y la homeostasis.
En condiciones extremas, puede acabar en muerte del organismo [Lauer y col., 2012].

En los sistemas acuáticos se ha observado que la toxicidad del Cu aumenta cuando

disminuye la dureza del agua y el oxígeno disuelto, decrece en presencia de agentes
quelatantes, ácidos húmicos, aminoácidos y sólidos en suspensión esenciales para atrapar
metales [Armendáriz Sáenz y col., 2008]. En peces se han descrito lesiones morfológicas en
los órganos sensoriales inducidas por Cu, como por ejemplo desintegración celular en las
papilas gustativas de peces de colores, así como lesiones en los órganos olfativos. También
se observan cambios en las córneas lo que sugiere un trastorno del sistema visual.
Además, este metal afecta a la actividad colinesterasa de los peces en el cerebro y
músculo, disminuyendo su actividad y provocando un aumento en el contenido de
acetilcolina en las terminaciones nerviosas interrumpiendo la transmisión del impulso
nervioso. Otros efectos negativos debido a un exceso de cobre son el estrés oxidativo y
efectos nocivos sobre los orgános osmoregulatorios, branquias, como por ejemplo la
inhibición del transporte de iones sodio debido a la inhibición de la enzima Na+/K+-ATPasa
en peces y la inhibición de la anhidrasa carbónica en los crustáceos [Grosell y col., 2004].

Dada la importancia del cobre en el medio ambiente y en los organismos, este capítulo
se centra en la preconcentración y determinación de este metal en aguas naturales para su
aplicación en el control de la contaminación.

2.2. Extracción en fase sólida aplicada al análisis de metales pesados en

aguas

El análisis de trazas de metales en muestras de aguas naturales presenta importantes

exigencias durante los procedimientos de muestreo, conservación, pretratamiento y
metodología, puesto que la mayoría de estas especies se encuentran a niveles muy bajos
en este tipo de muestras (g/L o ng/L). Por lo tanto, se requieren métodos analíticos de
elevada sensibilidad y selectividad, así como procedimientos de manipulación “limpios” de
las muestras, que son muy fáciles de contaminar. La espectroscopía de absorción atómica
con llama (FAAS) o con horno de grafito (GFAAS) se utiliza con frecuencia en la
determinación de metales pesados. Sin embargo, su sensibilidad puede ser insuficiente
cuando se trata de subtrazas metálicas en algunas muestras ambientales [Yaman, 2005;
Mirzaei y col., 2011; Tobiasz y col., 2012]. Por su parte, la técnica de espectrometría de

58
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) también proporciona una mayor
sensibilidad en el análisis de metales pesados. Sin embargo el alto coste del equipo así
como los gastos de funcionamiento son una carga económica bastante grande para un
laboratorio corriente [Peng y col., 2007].

La aplicabilidad de este tipo de técnicas, sobre todo FAAS o GFAAS, se ve reducida

cuando la matriz es muy compleja. Como consecuencia, se suele utilizar como paso previo
al análisis la preconcentración del analito y la eliminación de la matriz. Por ello, las técnicas
de separación y preconcentración se convierten en piezas claves en este tipo de
metodologías.

Las técnicas de separación abarcan un amplio espectro que se extiende desde los
simples procesos de precipitación, destilación, extracción,... hasta las más avanzadas
técnicas cromatográficas. Todas ellas se basan en diferentes fundamentos físico-químicos,
pero tienen en común la transferencia de masa que se realiza entre, al menos, dos fases
distintas. De esta manera, se consigue alcanzar una mayor selectividad en la separación y
sensibilidad en la determinación.

La extracción en fase sólida (Solid-Phase Extraction: SPE) constituye una técnica de

preconcentración ampliamente utilizada para el aislamiento de determinados analitos y la
simplificación de la matriz en muestras con propiedades desfavorables para el análisis
directo. La extracción suele llevarse a cabo utilizando un lecho adsorbente particulado
situado dentro de columnas de pequeña longitud (usualmente llamados “cartuchos”) o bien
inmovilizado en forma de disco. En ambas configuraciones, el analito se transfiere desde
una fase móvil (gas o líquido) a una fase sólida, donde quedará retenido. Posteriormente el
analito se recupera mediante elución de un líquido o mediante desorción térmica en el caso
de que la fase móvil sea un gas [Poole, 2003].

Recientemente, la extracción en fase sólida ha sido muy utilizada como técnica en el

pretratamiento de muestras para análisis de trazas metálicas. En este caso, los principales
objetivos de la SPE suelen ser la preconcentración de metales, la simplificación de la matriz
de la muestra y el intercambio de medio o transferencia del analito desde la matriz de la
muestra a un disolvente diferente o a una fase gaseosa.

Esta técnica de preconcentración se desarrolló inicialmente como complemento a la

extracción líquido-líquido. Hoy en día es la técnica más comunmente utilizada en diversas
áreas de la Química, como pueden ser la ambiental, farmaceútica, clínica, alimentación e
industria [Poole, 2003]. La extracción líquido-líquido convencional es muy laboriosa, difícil
de automatizar y presenta serios problemas, como la formación de emulsiones. Además,
consume grandes volúmenes de disolventes de alta pureza y, por tanto, requiere una
disposición económica bastante alta. En contraposición a esta técnica, la extracción en fase
sólida requiere unos costes menores, tiempos de análisis más cortos, evita la formación de
59
Capítulo 2

emulsiones y no requiere de instrumentación costosa [Armenta, 2008; Das y col., 2012].

Además, se considera una técnica amistosa con el medio ambiente y se engloba dentro de
la Química Analítica Verde, puesto que evita el empleo de grandes volúmenes de
disolventes orgánicos que producen un gran impacto medioambiental [de la Guardia y
Armenta, 2011].

2.2.1. Fundamento de la SPE

El principio en el que está basado la SPE es similar al de la extracción líquido-líquido
(LLE). Ambos procedimientos incluyen una transferencia de solutos entre dos fases. La
diferencia radica en que en LLE la distribución selectiva del analito se produce entre dos
fases líquidas inmiscibles, mientras que en SPE, se produce entre una fase líquida (donde
está contenido el analito de interés) y una fase sólida (que será el adsorbente). Este
tratamiento de la muestra proporciona una preconcentración y una purificación del analito
contenido en la muestra, mediante su adsorción en un material sólido [Camel, 2003].

Generalmente, la SPE consta de 3 etapas fundamentales. La primera de ellas consiste

en la preparación y acondicionamiento del material adsorbente, haciendo uso de
disolventes orgánicos y ácidos con el fin de eliminar posibles impurezas contenidas
inicialmente en el soporte sólido. La segunda etapa consiste en hacer pasar la muestra a
través de dicho soporte, con la subsiguiente preconcentración del analito. Así, es
fundamental que el analito que se va a extraer tenga una mayor afinidad por la fase sólida
que por la matriz de la muestra. Tras esta etapa de extracción, es recomendable realizar
una etapa de secado, especialmente cuando se desea la eliminación de la matriz acuosa,
eliminando los restos de agua del adsorbente sólido. La última etapa sería la desorción del
analito y su elución mediante el uso de un disolvente apropiado. Una vez que el analito se
haya eluído, su concentración será determinada con alguna técnica analítica de medida
[Camel, 2003; Buszewski, 2012].

Como conclusión, se puede definir la SPE como una técnica de preconcentración de

analitos, mediante la retención en una fase sólida y su posterior elución con un disolvente
apropiado.

2.2.2. Tipos de formato

La preconcentración de muestras líquidas mediante SPE comenzó a desarrollarse
ampliamente en los laboratorios a partir de 1980, con la introducción de columnas de sílice.
Posteriormente, en 1989, se introdujo la tecnología de discos, que actualmente compite
con la anterior [Poole, 2000]. Las columnas con diámetros internos reducidos limitan la
velocidad de flujo a 1-10 mL/min, con lo cual se requieren tiempos bastante amplios para
60
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

la preconcentración de muestras de grandes volúmenes. Además, las muestras con materia

particulada pueden obstruir el cartucho y producir canalizaciones preferentes por las que
eluya el analito [Yamini y Tamaddon, 1999]. Los discos fueron desarrollados en un principio
para prevenir estos problemas y proporcionar mayores velocidades de proceso cuando se
utilizaban volúmenes grandes de muestra. Además minimizaban la existencia e
interferencias de partículas suspendidas y otros componentes de la matriz [Lingeman y
Hoekstra-Oussoren, 1997; Thurman y Snavely, 2001; Fritz y Masso, 2001].

En general, los discos para la extracción en fase sólida pueden utilizarse como tales en
aparatos de filtración para volúmenes grandes de muestras o bien formando parte de
jeringuillas y columnas para la extracción de muestras de medio y pequeño volumen
[General Guidelines for Empore Extractions Disks and Cartridges]. Los tipos de formatos
que existen se detallan en la Figura 2.1.

Columnas SPE Cartuchos SPE Discos SPE

1-60 mL 100 mg-1g 47-90 mm
50 mg-10 g

Figura 2.1. Diferentes formatos utilizados en extracción en fase sólida

A pesar de que cuentan con una tecnología similar, existen varias diferencias entre las
columnas y los discos que se pueden resumir de la siguiente manera [Poole, 2003]:

 Las columnas pueden prepararse fácilmente en el laboratorio, mientras que los discos
únicamente se fabrican de forma industrial. Por lo tanto, los discos solo están
disponibles en un limitado número de adsorbentes y son menos económicos que las
columnas.
61
Capítulo 2

 Por el contrario, los discos ofrecen ciertas ventajas que favorecen su uso, tales como
su aplicación en muestras de gran volumen que contengan material particulado en
suspensión, donde los discos funcionan mejor que las columnas ya que evitan que se
produzcan obstrucciones y canalizaciones preferentes. Además, proporcionan tiempos
de proceso más cortos debido al mayor entrecruzamiento entre sus fibras. Esto es
importante en programas de monitorización medioambiental, como por ejemplo, en el
análisis de sustancias tóxicas o persistentes en aguas naturales que contienen
frecuentemente una gran cantidad de materia particulada.

 Los discos proporcionan una gran superficie de retención, lo que facilita su uso en los
muestreos pasivos, en los que se sumerge el disco en la muestra, en lugar de pasar
ésta a través del disco. Esta técnica puede utilizarse tanto en aplicaciones de campo
como en el laboratorio, aunque a veces puede ser difícil su aplicación debido a los
problemas que pueden producirse si el equilibrio de partición no se alcanza
adecuadamente, incluso en muestras con agitación.

 En la configuración de columna, debido al bajo empaquetamiento que existe, se debe

utilizar más cantidad de adsorbente para evitar la retención del analito por obstrucción
o por producción de canalizaciones. El incremento en la masa de adsorbente produce
una disminución en la especificidad de absorción y genera extractos más sucios.

 Los discos contienen más partículas y caminos más tortuosos, lo que implica que exista
una mayor superficie disponible y la cinética de adsorción es mucho más rápida que en
los cartuchos. Esta diferencia de tamaño de partícula en los discos y en columnas se
muestra en la Figura 2.2.

40-80 m

10 m

Partículas en discos

Partículas en columnas y cartuchos

Figura 2.2. Diferencia en el tamaño de las partículas de discos y columnas utilizados en

SPE [Thurman, 2000]

62
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Además, en la bibliografía se detallan diversas investigaciones sobre extracción en fase

sólida en las que se comparan los resultados obtenidos en análisis con discos y columnas
para muestras de aguas naturales [Björklund y Morrison, 1997]. En estos estudios, se llega
a la conclusión de que se obtienen peores blancos utilizando columnas en lugar de discos,
puesto que la materia orgánica de la muestra es capaz de adsorberse en las paredes y
eluirse posteriormente, pudiendo ser un interferente durante el análisis.

Hoy en día los discos para SPE están disponibles en diferentes tamaños y composición.
Existen membranas formadas por partículas de 8 a 12 m de diámetro, que actúan como
adsorbentes y que se encuentran inmovilizadas en una malla de fibras constituidas por
poli(tetrafluoroetileno) (PTFE). Estas fibras se preparan en discos de 0,5 mm de espesor y
con diámetros de 4 a 96 mm. El 90% del peso de estos discos es el adsorbente. Estas
membranas también están disponibles en cartuchos, en cuyo caso el lecho de material
adsorbente está constituido por partículas de un tamaño aproximado de 50 m colocadas
en un disco de 1 mm de grosor, que se encuentra en la base de una jeringuilla. La
superficie superior de estos discos está formada por polipropileno, que produce una
prefiltración de la muestra antes de que ésta llegue al interior del disco [Poole, 2003].

2.2.3 Tipos de adsorbentes y selección adecuada de discos

A la hora de seleccionar un tipo de adsorbente para una determinada aplicación, los
parámetros de interés, además de su naturaleza, son el tamaño del disco, la capacidad de
adsorción y la cantidad de muestra que es capaz de soportar antes de que se sature. Los
discos de gran diámetro son utilizados para volúmenes de muestras grandes con el fin de
mejorar el paso de la muestra a través del disco. Aquéllos que tienen un diámetro menor
se utilizan para muestras de pequeños volúmenes y para recuperar analitos que se
encuentran disueltos en pequeñas cantidades de disolventes. En general, los diámetros
pequeños se usan frecuentemente en análisis clínicos, forenses y farmacéuticos, mientras
que los diámetros mayores se utilizan en análisis medioambientales. Además, los discos
pequeños se han utilizado recientemente en análisis de metales pesados por extracción en
fase sólida colorimétrica, en los que la última etapa de elución no se lleva a cabo, sino que
el procedimiento de medida se realiza determinando la cantidad de analito directamente
sobre la superficie del sólido empleando algún tipo de sensor óptico de colorimetría,
fluorescencia o reflectancia difusa [Espada Bellido, 2010].

Los mismos adsorbentes que se manejan convencionalmente en la extracción en fase

sólida en columna son los que se usan para extracción con discos. Los adsorbentes más
comunes en SPE incluyen los de sílice (C2, C8, C18), los de carbono y los poliméricos
(principalmente los de poliestireno divinilbenceno) [Fontanals y col., 2007].

63
Capítulo 2

Los adsorbentes sólidos para SPE pueden ser hidrofóbicos (no polares) o hidrofílicos
(polares). Debe prestarse atención a la naturaleza y las propiedades de un adsorbente, ya
que de ello va a depender el porcentaje o efectividad en la retención del analito. Los
requisitos principales que se buscan a la hora de seleccionar el adsorbente son [Camel,
2003]:

- La posibilidad de extraer gran número de elementos traza en un amplio rango de pH.

- Una adsorción y elución rápidas y cuantitativas.

- Alta capacidad de retención.

- Regenerabilidad.

- Accesibilidad.

La gran variedad de adsorbentes disponibles explica uno de los aspectos más

importantes de la SPE: su selectividad. Los adsorbentes pueden clasificarse, según su
naturaleza, como inorgánicos (sílice SiO2, alúmina Al2O3, magnesia MgO y otros óxidos) y
como orgánicos (polímeros tanto naturales como sintéticos) [Camel, 2003]:

(a) Adsorbentes de naturaleza inorgánica

El principal adsorbente dentro de este grupo está basado en el empleo de gel de sílice SiO2,
presentando estabilidad mecánica, térmica y química bajo determinadas condiciones.

- Gel de sílice: Los agentes quelatantes pueden ser fácilmente inmovilizados sobre
este tipo de material caracterizado por una elevada estabilidad y por la presencia de
grupos silanol. Sin embargo, este adsorbente posee una baja selectividad además de
sufrir hidrólisis a pH básicos. La presencia de grupos silanol residuales puede tener
una influencia negativa en la separación de analitos polares [Buszewski y Szultka,
2012]. Por ello, normalmente se modifica la superficie del gel de sílice con el fin de
conseguir adsorbentes sólidos más selectivos. En tal caso, por un lado se puede
realizar una inmovilización química, donde se forma un enlace entre los grupos de la
superficie del gel de sílice y los de un compuesto orgánico (adsorbentes
funcionalizados), y por otro lado una inmovilización física donde el compuesto
orgánico es directamente adsorbido sobre los grupos silanol de la superficie del gel
de sílice (adsorbente impregnado) [Camel, 2003].

- Octadecil-sílica (SiO2-C18): Octadecil-sílica se ha convertido en el adsorbente de sílice

más popular. Los grupos alquilo están enlazados covalentemente a los grupos silanol
de la superficie de la sílice [Cámara, 2002]. Este tipo de adsorbente modificado por
los adecuados ligandos, ha sido empleado de manera satisfactoria en la
determinación de iones metálicos. A pesar de su amplio abanico de aplicaciones en la
preconcentración de trazas metálicas, los adsorbentes basados en sílice presentan
64
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

carácter hidrofóbico, por lo que, en la práctica, no funcionan muy bien en la

retención de especies de elementos traza puesto que la mayoría son polares o
iónicos.

- Otros óxidos inorgánicos: TiO2 (titania), Al2O3 (alúmina), ZrO2 (zirconia) y MgO
(magnesia).

(b) Adsorbentes de naturaleza orgánica

Este grupo puede ser dividido en adsorbentes de tipo polimérico y no polimérico. El

material polimérico tiene la ventaja frente a los soportes de tipo sílice, antes comentados,
de que puede trabajar a lo largo de toda la escala de pH. Es de destacar también la
creación de nuevos materiales mediante la formación de enlaces químicos entre grupos
adicionales y las cadenas de polímero.

- Adsorbentes basados en poliestireno-divinilbenceno: Amberlita XAD-1, XAD-2, XAD-4

y XAD-16 son resinas de poliestireno-divinilbenceno (SDB) con cierto carácter
hidrofóbico y sin capacidad de intercambio iónico. Este tipo de material permite las
interacciones de tipo – con anillos aromáticos. Debido al carácter hidrofóbico de
estos materiales de SDB, la retención de elementos traza requiere de la adición de
ligandos a la muestra. Aunque se pueden emplear ligandos de tipo inorgánico, se
prefiere el empleo de ligandos orgánicos [Camel, 2003; Fontanals y col., 2007]. La
ausencia de grupos silanol produce menores interacciones secundarias durante el
proceso de extracción, y su amplio margen de estabilidad a todos los pH incrementa
la flexibilidad del método y su aplicación [Buszewski y Szultka, 2012].

Aunque los adsorbentes basados en poliestireno divinilbenceno son probablemente los

más empleados, también han sido usados otros materiales de manera satisfactoria, entre
los que se encuentran:

- Copolímeros de divinilbenceno-vinilpirrolidina.

- Polímeros de poliacrilato: Amberlita XAD-7 y XAD-8.

- Polímeros de poliuretano.

- Polímeros de polietileno.

- Polímeros de politetrafluoroetileno.

- Polímeros de poliestireno.

- Polímeros de poliamida.

- Resinas quelatantes de tipo iminodiacetato.

- Resinas quelatantes de tipo propilenodiaminotetraacetato.

65
Capítulo 2

- Resinas basadas en poliacrilonitrilo.

- Polímeros basados en la polimerización metatésica por apertura de anillos.

- Adsorbentes de carbono.

- Celulosa.

- Adsorbentes basados en naftaleno.

Existe una metodología algo más compleja que se basa en apilar discos que contengan
distintos adsorbentes con el objetivo de recuperar, en una única elución, varios analitos. De
este modo, se pueden extraer muestras complejas que contengan compuestos de diferente
polaridad o capacidad de ionización, a la vez que se reducen las interferencias debido a que
en uno de los discos se producirá la adsorción selectiva de la matriz y en otro, la adsorción
del analito.

En la Tabla 2.1 se recogen los adsorbentes más utilizados y las aplicaciones descritas
en la bibliografía.

Tabla 2.1. Tipos de adsorbentes y aplicaciones [Poole, 2000]

Adsorbente Aplicaciones generales

Octadecil sílice (C18) y C18 es un adsorbente no específico (y por tanto, su uso

octil sílice (C8) es más amplio que el de C8). Se utiliza en la extracción
de pesticidas, herbicidas, aditivos, compuestos
farmacéuticos, hidrocarburos, etc., todos ellos no
polares.
Poliestireno divinilbenceno (SDB) Se utiliza para compuestos que no pueden extraerse en
C18 por su alta solubilidad en agua: pesticidas y
herbicidas polares, fenoles y compuestos farmacéuticos
polares. Si los polímeros se encuentran sulfonados,
acetilados o hidroximetilados, proporciona una alta
recuperación de compuestos polares neutros.
Carbón activo Sus aplicaciones son similares a las de poli-estireno
divinilbenceno pero su uso es menos frecuente. Puede
extraer herbicidas triazinas, algunos pesticidas polares y
N-nitroso-dialquilaminas.
Adsorbentes mixtos El adsorbente octadecil sílice enlazado a grupos de ácido
bencenosulfónico se utiliza en toxicología para el
aislamiento de drogas y sus metabolitos, como por
ejemplo los derivados de marihuana y cocaína,
anfetaminas y opiáceos en fluidos biológicos.
66
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Tabla 2.1 (cont.). Tipos de adsorbentes y aplicaciones [Poole, 2000]

Adsorbente Aplicaciones generales

Iones intercambiadores Extraen herbicidas ácidos y pesticidas en agua, así como

(ácido sulfónico y aminas drogas básicas en fluidos biológicos.
cuaternarias)
Éteres corona Aíslan metales preciosos (Pd, Pt, Rh) y radionúcleos (Cs,
Sr, Pb). También recuperan impurezas metálicas (Bi, Sb,
Fe, Pb, Bi, Cu, Hg) de vertidos de refinerías.

Para la extracción de metales pesados en aguas naturales se suelen utilizar los discos
de C18 y de poliestireno divinilbenceno (Figura 2.3). Actualmente, algunos de estos discos,
especialmente los de C18, se están comenzando a utilizar con éxito para la separación y
determinación de iones metálicos tanto en suelos como en aguas naturales y potables.

Algunos metales, como hierro, níquel y cobre han sido analizados mediante SPE y
determinación por espectroscopía de absorción atómica con llama [Mashhadizadeh y col.,
2008a y 2008b; Karve y Rajgor, 2009; Fathi y Yaftian, 2009]. Níquel y plata también han
sido determinados en aguas naturales mediante SPE y espectroscopía de reflectancia difusa
[Gazda y col., 2004; Hill y col., 2010].

Figura 2.3. Estructura a nivel microscópico del poliestireno-divinilbenceno (izquierda) y

octadecil sílice (derecha) [http://solutions.3m.com/wps/portal/3M/en_US/Empore/
extraction /center/technology/]

A pesar, de su amplio abanico de aplicaciones en la preconcentración de trazas

metálicas, los adsorbentes basados en sílice (octadecil-sílica o gel de sílice funcionalizada)
presentan un rango de pH limitado, ya que a valores de pH muy ácidos (por debajo de pH
67
Capítulo 2

2) y a pH muy básicos (por encima de pH 10) se produce la hidrólisis del material. Además,
presentan una baja capacidad de carga [Pyrzynska, 2012].

En resumen, con los discos C18 pueden realizarse principalmente extracciones no

polares, mientras que con los discos de SDB se pueden llevar a cabo extracciones de
polaridad moderada. Los materiales de sílice se caracterizan por un mayor consumo de
disolventes y de tiempo, así como por una baja capacidad de carga y un rango de pH
limitado. Además, en algunos casos, los procesos pueden ser irreversibles y pueden
provocar la degradación de ciertos analitos [Culleré y col., 2003]. En contraposición, los
polímeros de SDB presentan una capacidad de carga mucho mayor, son más estables
frente a pH extremos y no presentan interacciones catiónicas secundarias debidas a los
grupos silanol [Buszewski y Szultka, 2012]. Como consecuencia, se prefieren los
adsorbentes poliméricos, como el poliestireno divinilbenceno.

En la Tabla 2.2 se muestran las principales características para las fases sólidas más
utilizadas.

Tabla 2.2. Comparación de características de las fases sólidas típicas de sílice y

copolímeros (http://solutions.3m.com)

Sílice Copolímero
Rango de pH 2 a 12 1 a 14
% Materia orgánica < 22%* 100%
Interacciones
Sí No
secundarias
Funcionalidad Alifática Aromática y alifática
Tamaño de partícula Irregular Esférica
Tamaño de poro 60 Å 80 Å

* varía desde 6% a 22% de carbono, dependiendo del grupo funcional

Por todo lo anteriormente comentado, la metodología por la que se ha optado para la

preconcentración de Cu(II) en aguas naturales y su posterior determinación es, por tanto,
la Extracción en Fase Sólida (SPE), utilizando discos de membrana SDB, y la Espectroscopía
de Absorción Atómica con llama como sistema de detección.

68
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

2.3. Determinación de metales pesados en aguas naturales por extracción

en fase solida SPE

El uso de discos de membrana para la extracción en fase sólida constituye una

alternativa eficaz para la separación y concentración de iones metálicos en muestras
acuosas medioambientales. En concreto, resulta especialmente válida para su aplicación en
aguas naturales de naturaleza salina, ya que por su diseño permiten eliminar el efecto de
matriz que suele interferir en el análisis de metales. Las aguas con un alto contenido en
sales disueltas son muestras en las que los métodos clásicos de análisis pueden ofrecer
ciertas dificultades. Las altas concentraciones de metales alcalinos (Na+, K+),
alcalinotérreos (Mg2+, Ca2+) y halogenuros (Cl-) pueden ser fuentes de interferencias físicas
y químicas que afectan a la precisión de las medidas, así como al funcionamiento de los
instrumentos analíticos empleados para realizar las mediciones [Crompton, 2007]. Además,
los niveles extremadamente bajos de los metales traza que presenta el agua de mar, hace
difícil o imposible la determinación directa de estos metales por la mayoría de los
instrumentos analíticos convencionales [Strickland y Parsons, 1977]. Por este motivo, se
han desarrollado una gran variedad de métodos de preconcentración y separación con el
fin de aumentar la concentración de los metales traza y separarlos de la matriz salina en la
que se encuentran presentes. En la Tabla 2.3, se recogen las aplicaciones analíticas de la
extracción en fase sólida para la determinación de metales en muestras reales de agua de
mar desarrolladas durante los años 2005-2012.

Tabla 2.3. Resumen de los métodos de preconcentración de metales traza en agua de mar
mediante extracción en fase sólida desarrollados durante los años 2005-2012

Metal Procedimiento Deteccióna Referencia

SPE en microcolumna empaquetada con 6-
Cd, Co, Cu, Mannivanan y
[(4-hidroxifenil)diazenil]naftalen-2,3-diol- FAAS
Mn, Pb, Zn Biju, 2012
formaldehído
SPE en minicolumna de sílice coloidal Bagheri y col.,
Cd, Cu FAAS
modificada con difenilcarbacida 2012
SPE en columna de gel de sílice modificada GFAAS o Mladenova y
Au, Pd, Pt
con cisteína ICP-AES col., 2012
Shakerian y col.,
Zn SPE con polímeros de impresión iónica FAAS
2012

69
Capítulo 2

Tabla 2.3 (cont.). Resumen de los métodos de preconcentración de metales traza en

agua de mar mediante extracción en fase sólida desarrollados durante los años 2005-2012

Metal Procedimiento Deteccióna Referencia

Cd, Co, Cr, SPE en minicolumna empaquetada con 1,5-

Sánchez-Trujillo
Cu, Mn, Ni, bis(2-piridil)-3-sulfofenil-metilen-tiocarbono- FI-ICP-MS
y col., 2012
Pb, Zn hidracida
Al, Cu, Fe,
Otero-Romaní y
Mn, Ni, Pb, SPE en cartuchos de C18 ICP-AES
col., 2011
Sn, Zn
SPE en cartucho relleno con Amberlita XAD-
Panahi y col.,
Pb 2 modificada con ácido salicílico e FAAS
2011
iminodiacético
SPE en minicolumna rellena con resina Sahan y Sahin,
Pb FI-GFAAS
Lewatit Monoplus TP207 2011
SPE en minicolumna empaquetada con
Ghanemi y col.,
Cd, Cu, Pb, Zn alúmina modificada con nanopartículas de FAAS
2011
sulfuro
SPE con microcolumna empaquetada con
Ezoddin y col.,
Cd, Pb alúmina modificada con sodio dodecilsulfato FAAS
2010
1-(2-piridilazo)-2-naftol (SDS-PAN)
SPE en minicolumna rellena de Escudero y col.,
Zn ICP-AES
etilvinilacetato (EVA) 2010
SPE con carbón activado modificado con Zhang y col.,
Cr(III), Fe, Pb ICP-AES
trietilenotetramina (ACTETA) 2010
Preconcentración en columna de Diaion SP-
850 modificada con bis(2- Shokrolahi y
Cr(III), Cu, Ni FAAS
hidroxiacetofenona)-1,2-propanodiimina col., 2010
(BHAPPDI)
Preconcentracion en alúmina modificada con Mahmoud y col.,
Pb AAS
ditizona 2010
Preconcentración en gel de sílice modificado Pereira y col.,
Cu FAAS
con 4-amino-2-mercaptopirimidina (AMP) 2010
Complejación con 1-2-piridoxal-2-naftol
Soylak y col.,
Cu, Pb (PAN) y preconcentración en membranas de FAAS
2010
acetato
Co, Cu, Fe, Moreton y col.,
SPE con resina quelatate iminodiacética ICP-AES
Mn, Ni 2009

70
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Tabla 2.3 (cont.). Resumen de los métodos de preconcentración de metales traza en

agua de mar mediante extracción en fase sólida desarrollados durante los años 2005-2012

Metal Procedimiento Deteccióna Referencia

Complejación de Cu(II) con cromazurol S
(CAS) y bromuro de cetiltrimetilamonio Faraji y col.,
Cu ICP-AES
(CTAB), y posterior adsorción en una 2009
minicolumna empaquetada de algodón
Cd, Co, Cu,
Mn, Mo, Ni, SPE empleando disco quelatante ICP-MS Itoh y col., 2009
Pb, U, V, Zn
Adsorción en una columna de clinoptilolita
Faghihian y col.,
Cd, Cu, Pb, Ni impregnada con 1-(2-piridilazo)-2-naftol FAAS
2009
(PAN)
Preconcentración en baño empleando un Dakova y col.,
Hg CV-AAS
polímero de impronta iónico 2009
Preconcentración en una resina quelatante MC-ICP- Nakagawa y
Mo
de TSK-8HQ MS col., 2008
SPE de quelatos metálicos formados con
Cu, Cd, Co, Tuzen y col.,
pirrolidín ditiocarbamato amónico (APDC) FAAS
Ni, Pb, Zn 2008
sobre nanotubos de carbono
Cr(III) Preconcentración mediante alúmina Mahmoud y col.,
UV-VIS
Cr(VI) modificada con isatin-tiosemicarbazona 2008a
SPE sobre sílice cubierta con nanopartículas
Cd, Cu, Hg, Huang y Hu,
magnéticas modificadas con ICP-MS
Pb 2008
-mercaptopropil trimetoxisilano
SPE con gel de sílice modificado con Imamoglu y
Cu y Ni FAAS
tetraamina de trietileno Gunes, 2008
Cr(III) SPE con alúmina modificada con Mahmoud y col.,
UV-VIS
Cr(VI) tiosemicarbazida 2008b
Al, Cd, Co,
Preconcentración empleando una resina Sohrin y col.,
Cu, Fe, Mn, ICP-MS
quelatante de ácido etilendiaminotriacético 2008
Ni, Pb, Zn
Preconcentración sobre Chromosorb 101
Cd, Co, Cr, Mendil y col.,
modificado con bacillus thuringiensis FAAS
Mn, Ni, Pb 2008
israelensis.
Preconcentración sobre microesferas de
Askun y col.,
Cd, Co, Ni, Pb poliestireno-divinilbenceno modificadas con TXRF
2008
8-hidroxiquinolina

71
Capítulo 2

Tabla 2.3 (cont.). Resumen de los métodos de preconcentración de metales traza en

agua de mar mediante extracción en fase sólida desarrollados durante los años 2005-2012

Metal Procedimiento Deteccióna Referencia

Preconcentración con quitosano etilen Katarina y col.,
Metales traza ICP-MS
diamino-N,N,N’-triacético 2008
SPE empleando una resina quelatante
Cr, Cu, Pb fluorada de estireno-divinilbenceno ICP-AES Jan y col., 2007
modificada con -dicetona
SPE empleando una minicolumna
Metales traza ICP-MS Zhu, 2007
empaquetada con resina quelatante
SPE empleando resina quelatante de
Cd, Cu, Fe, ICP-AES / Yamamoto y
poliamino-ácido policarboxílico (NOBIAS
Ni, Pb, Zn MIP-MS col., 2007
chelate-PA1)
SPE empleando C activado modificado con Ghaedi y col.
Co, Cu, Ni FAAS
ditioxamida (ácido rubeánico) 2007
SPE empleando poli(b-esteril)-(1,2-
Ce, Gd, La,
metanofullereno-C60)-61-ácido ICP-MS Agrawal, 2007
Nd, Pr, Sm
formohidroxámico
SPE empleando silica gel modificada con
Hg UV-VIS Fan y col., 2007
naranja de xilenol
Cd, Co, Cu,
Preconcentración con minicolumna Rahmi y col.,
Mn, Mo, Ni, ICP-MS
quelatante 2007
Pb, U, V, Zn
ICP-AES/ Büyüektiryaki y
Metil-Mercurio SPE empleando polímero de impronta iónico
HPLC-DAD col., 2007
Hf, Nb, Ta, W, SPE empleando una resina de TSK-8- Firdaus y col.,
ICP-MS
Zr hidroxiquinolina 2007
Prenconcentración empleando una resina de Li y Meizhou,
Co, Cu, Ni FAAS
polivinil cloruro-polietileno poliamina 2006
Preconcentración empleando naftaleno
Dadfarnia y col.,
Pb microcristalino modificado con ácido FI-FAAS
2006
esteárico
Adsorción y separación empleando gel de Dias Filho y col.,
Hg DPASV
sílice modificado con 2-aminotiazol 2006
Complejación con oxina alfabenzoina
Cd, Co, Cu, Soylak y Tuzen,
seguido de la adsorción en una resina Diaion FAAS
Cr, Fe, Mn, Pb 2006
SP-850

72
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Tabla 2.3 (cont.). Resumen de los métodos de preconcentración de metales traza en

agua de mar mediante extracción en fase sólida desarrollados durante los años 2005-2012

Metal Procedimiento Deteccióna Referencia

Cd, Cu, Ni, SPE con Amberlita XAD-4 y Dowex Komjarova y Blust,
GFAAS
Pb, Zn Optipore V-493 2006
Cd, Co, Cr,
Preconcentración con arcilla Celtek FAAS Tuzen y col., 2006
Cu, Ni, Pb
Preconcentración empleando una
Tierras Raras minicolumna empaquetadada con resina ICP-MS Zhu y col., 2006
quelatante
Preconcentración con adsorbente
quelatante (esferas de agarosa activadas Hashemi y col.,
Cu FAAS
con bis(2-aminopiridil)dioxima (APD) 2005
enlazado químicamente)
SPE con naftaleno modificado con 5,7-
Eu, Lu, Nd FAAS Biju y Rao, 2005
dicloro-8-hidroxiquinolina
Preconcentración en resina de intercambio
Co, Cu, Zn aniónico DOWEX modificada con 4-(2- EDXRF Jiang y col., 2005
piridilazo)-resorcinol
Preconcentración en tándem con Chelex-
Metales traza ICP-MS Zhu y col., 2005a
100
Complejación con N,N´-bis(2-
Hg mercaptofenil)etanodiamida y SPE en UV-VIS Kara y Tekin, 2005
columna de gel de sílice
Cd, Co, Cu,
Mn, Ni, Pb, U, Preconcentración en minicolumna
ICP-MS Zhu y col., 2005b
Y, Zn y empaquetada con resina quelatante
Tierras Raras
Preconcentración en minicolumna
Tierras Raras ICP-AES Liang y col., 2005
empaquetada con nanotubos de carbono
a
CV-AAS: Espectroscopía de Absorción Atómica con vapor frío; DPASV: Voltametría de Redisolución Anódica
Diferencial de Impulso; EDXRF: Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X por Energía Dispersiva; FAAS:
Espectroscopía de Absorción Atómica con llama; FI-GFAAS: Espectroscopía de Absorción Atómica con horno
de grafito con inyección en flujo; FI-FAAS: Espectroscopía de Absorción Atómica con llama con inyección en
flujo; FI-ICP-MS: Espectroscopía de Masas con fuente de Plasma Acoplado Inductivamente con inyección en
flujo; GFAAS: Espectroscopía de Absorción Atómica con horno de grafito; HPLC-DAD: Cromatografía Líquida
de Alta Resolución con diodo array; ICP-AES: Espectroscopía de Emisión Atómica con fuente de Plasma
Acoplado Inductivamente; ICP-MS: Espectroscopía de Masas con fuente de Plasma Acoplado
Inductivamente; MC-ICP-MS: Espectroscopía de Masas Multicolector con fuente de Plasma Acoplado
Inductivamente; MIP-MS: Espectrometría de Masas con Plasma Inducido por Microondas; TXRF:
Fluorescencia de Rayos X con Reflexión Total; UV-VIS: Espectrofotometría Ultravioleta-Visible.

73
Capítulo 2

2.4. Aplicabilidad de las hidrazonas en extracción en fase sólida con discos

de membrana

Dado que los metales, por lo general, no interaccionan directamente con los
adsorbentes comúnmente empleados en SPE, es necesario recurrir a su modificación
mediante el empleo de reactivos orgánicos que complejen el metal de interés.

En la sección 2.2.3 se describieron las ventajas del empleo de discos de membrana de

SDB por lo que se proponen en esta tesis para el desarrollo de un método para
preconcentrar y separar iones Cu(II). Para ello se estudió la posibilidad de aplicar algún
compuesto de la familia de las hidrazonas en la modificación del disco y así favorecer la
retención metálica. Estos reactivos son ligandos con propiedades quelatantes muy
interesantes y potencialmente muy útiles en este tipo de metodologías.

Las hidrazonas son un grupo importante de ligandos tipo imino, los cuales se
caracterizan por la presencia de un doble enlace C=N, y se sintetizan de manera simple
mediante una reacción de condensación entre un compuesto carbonílico y aminas
primarias:

O R1
+ H 2N R N R + H 2O
R1 R2
R2

Según la naturaleza del grupo R, se obtienen distintos grupos de compuestos

orgánicos: oximas, acinas, semicarbazonas, tiosemicarbazonas e hidrazonas (Tabla 2.4).

Tabla 2.4. Grupo imino y sustituciones más características

Grupo R Grupo de compuestos

-OH Oximas
1
-N=CR1R2 Acinas

-NH-CO-NH2 Semicarbazonas
2
-NH-CS-NH2 Tiosemicarbazonas

-N-R3R4 Hidrazonas

74
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Las hidrazonas son azometinos caracterizados por la presencia de una agrupación

triatómica C=N-N y se representan de la siguiente forma:

R1 R4
N N
R2 R3

donde R1, R2, R3 y R4 representan la existencia de cuatro radicales. El átomo de nitrógeno

del grupo azometino (C=N) recibe el nombre de nitrógeno imínico y el inmediatamente
posterior se denomina nitrógeno amínico, el cual a su vez puede presentar sustituciones de
diversa naturaleza.

La facilidad de síntesis y la elevada reactividad que presentan las hidrazonas ha hecho

posible su aplicación en numerosos campos.

En el campo de la medicina, puede señalarse su utilización como agentes

antiinflamatorios [Moldovan y col., 2011], antimalárico [Fattorusso y col., 2008]
antitumorales y anti-VIH [Savini y col., 2004], antibacterianos [Sharma y col., 2011] y
antimicrobianos [Metwally y col., 2006; Sankar y Pandiarajan, 2010]. Además se han
aplicado para el tratamiento de la tuberculosis [Kaymakçıoğlu y col., 2006; Sankar y
Pandiarajan, 2010], leucemia y enfermedades mentales. Asimismo, las hidrazonas son
empleadas para la determinación de diversos compuestos que forman parte de ciertos
fármacos [de la Peña y col., 1993; Sreedhar y col., 1996; Sastry y col., 1997; Sastry y col.,
1998], así como de productos cosméticos [Karlberg y col., 1998]. Del mismo modo, las
hidrazonas son aplicadas habitualmente en agricultura, utilizándose como componentes de
diversos plaguicidas o como agentes reguladores del crecimiento de algunas plantas
[Suvarapu y col., 2012]. Las hidrazonas han sido utilizadas igualmente en estudios
medioambientales, concretamente para la determinación y control en el aire de compuestos
orgánicos que pueden llegar a ser importantes contaminantes atmosféricos, tales como
aldehídos y cetonas [Zurek y Karst, 2000], acetaldehído [Lindahl y col., 1996; Possanzini y
Dipalo, 1997], formaldehído [Chan y Xie, 1997; Kleindienst y col., 1998], o para la
determinación de compuestos fenólicos [Fiehn y Jekel, 1997; Russell y Burton, 1999] y
aminocetonas [Fiehn y Jekel, 1997] que pueden estar presentes en aguas residuales.

Entre otras aplicaciones, y concretamente dentro del campo de la Química Analítica,

han sido empleadas para la detección y determinación de iones metálicos en muestras de
agua, obteniendo importantes resultados [Granado-Castro, 2004a; Granado-Castro, 2004b;
Irigoyen, 2006; Aouarram y col., 2010]. En este último aspecto, se aprovecha la tendencia
de las hidrazonas para formar quelatos coloreados con iones metálicos, generalmente con
los metales de transición. Estos quelatos presentan una alta absortividad molar y son
fácilmente extraíbles en disolventes orgánicos inmiscibles en agua. La hidrazona, que actúa
75
Capítulo 2

como ligando multidentado, puede coordinarse a los metales a través de uno de los átomos
de nitrógeno o en combinación de uno de éstos y algún átomo electronegativo tal como el
azufre o el oxígeno. Los quelatos metálicos originados, en general, son determinados
posteriormente por técnicas espectroscópicas de absorción o fluorescencia molecular,
según las características del complejo metálico.

Dependiendo de la naturaleza de sus sustituyentes, pueden distinguirse varios tipos de

hidrazonas. Estos sustituyentes pueden ser: protones, radicales alquilo, radicales arilo,
radicales acilo, radicales O-alquilo, radicales O-arilo, así como dióxido de nitrógeno o
halógenos.

Las aroilhidrazonas son un subgrupo de hidrazonas que se caracterizan por tener un

radical aroilo unido al nitrógeno amínico (>C=N-NH-CO-Ar). La presencia de un grupo
carbonilo, en posición contigua a la agrupación triatómica fundamental de toda hidrazona
(>C=N-N<), confiere a estas moléculas unas características especiales y gran capacidad
para formar quelatos metálicos. De esta forma, las aroilhidrazonas muestran un variado
comportamiento como ligando, que depende de las posiciones de coordinación que
presenten, pudiendo actuar como ligandos bidentados, tridentados, tetradentados o
pentadentados formando complejos coloreados, principalmente con los metales de
transición.

Entre las aroilhidrazonas, especial atención merecen las saliciloilhidrazonas, en las que
el radical arilo de la aroilhidrazona es un grupo fenólico en posición orto que puede
participar también en la coordinación. Debido a que forman complejos con numerosos
iones metálicos, las saliciloilhidrazonas se han empleado extensamente en métodos de
determinación espectrofotométricos y espectrofluorimétricos [Gallego y col., 1978; Gallego
y col., 1979; García-Vargas y col., 1980; García-Vargas y col., 1982; Gallego y col., 1982a],
habiéndose estudiado además la potencialidad de estos compuestos como agentes de
preconcentración de trazas metálicas por extracción líquido-líquido.

2.5. Un nuevo método de análisis de Cu(II) por Extracción en Fase Sólida

El objetivo central de este trabajo consiste en el desarrollo de un método de

preconcentración y posterior determinación por Espectroscopía de Absorción Atómica de
trazas de cobre en muestras acuosas para su aplicación en la detección de la
contaminación por este metal en aguas naturales.

Para llevar a cabo el proceso de preconcentración se ha elegido un sistema de

extracción en fase sólida por las características y ventajas que presenta frente a otros

76
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

sistemas empleados con la misma finalidad y que se han descrito en la sección 2.2. de este
capítulo.

Como se ha mencionado, la extracción en fase sólida con disco constituye una técnica
de preconcentración ampliamente utilizada para el aislamiento de determinados analitos y
la simplificación de la matriz en muestras con propiedades desfavorables para el análisis
directo. Esta técnica precisa de una membrana, en forma de disco, con partículas
adsorbentes que retengan el analito. La propuesta que se realiza es modificar físicamente
el disco con un ligando quelatante del metal a determinar. Cuando se produce el paso de la
muestra con el analito, éste es complejado por el reactivo orgánico, reteniéndose en la
membrana y produciendo su preconcentración. Posteriormente, se utilizará un eluyente
adecuado que sea capaz de romper el complejo reactivo-metal que se forma en la
superficie del disco, permitiendo la determinación del metal preconcentrado en el eluato.
Por tanto, es de gran interés la búsqueda de reactivos selectivos y sensibles que sean
aplicables a la preconcentración de metales traza de interés medioambiental.

2.5.1. Estudios previos para la elección del reactivo orgánico para SPE
Las características que debe cumplir un reactivo orgánico para que sea aplicable en la
técnica de extracción en fase sólida con inmovilización física, para la preconcentración de
metales trazas, son las siguientes:

 Debe quedar retenido en el adsorbente que forme el disco. Por ello, se han
seleccionado para este estudio discos “EmporeTM” de octadecil sílice (C18) y de
poliestireno divinilbenceno (SDB), ambos con diferente polaridad, para poder estudiar
la aplicabilidad de diversos reactivos orgánicos.

 Debe ser capaz de formar un complejo con el metal, que por sus características quede
retenido en el disco.

 La constante termodinámica de formación del complejo debe ser suficientemente alta

para que se puedan obtener rendimientos adecuados en el proceso de
preconcentración.

 La cinética de formación del complejo metálico debe ser relativamente alta para que
mientras se pase la muestra a través del disco, el complejo se vaya formando a una
velocidad tal que haga el método viable.

Así pues, se han realizado una serie de experiencias en las que se han utilizado 3
reactivos orgánicos diferentes del grupo de las aroilhidrazonas, estudiándose su capacidad
de retención en el disco y su reactividad con varios metales, con la finalidad de encontrar

77
Capítulo 2

aquél que cumpla las condiciones adecuadas para poder desarrollar la técnica de
preconcentración seleccionada.

Estos 3 reactivos fueron los siguientes:

a) 2 HBBH: 2-hidroxibenzaldehído benzoilhidrazona

OH
O

N
N

Esta benzoilhidrazona tiene un pK1 de 6,77 y un pK2 de 9,11. En medio neutro o

ligeramente ácido es un ligando bidentado no cargado. El grupo hidroxilo de la molécula
hace posible que la 2HBBH forme puentes de hidrógeno en disolución. En medio básico,
este reactivo actúa como ligando tridentado cargado negativamente (con carga -1). Se ha
estudiado su reactividad con Ni(II), Cu(II), Mn(II), Zn(II), Co(II), Pb(II), Cd(II) y Bi(III) y
se ha demostrado que es capaz de formar complejos con ellos [Katyal y Dutt, 1975; Cordier
y col., 2004; Lu y col., 2006; Espada-Bellido y col., 2009].

b) 2 APBH: 2-acetilpiridina benzoilhidrazona

N O
N
N
H
CH3

Este reactivo tiene un pK1 de 3,6 y un pK2 de 11,1. La primera constante de ionización
puede atribuirse a la protonación del nitrógeno piridínico y la segunda constante es debida
a la desprotonación del hidrógeno en el grupo -CONH-, cuando éste se tautomeriza según
la siguiente reacción:

O OH

Ph C N N C Ph C N N C
H
78
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Se ha demostrado que este reactivo forma complejo con Pb(II), Mn(II), Ga(III), Zn(II),
Ti(IV), Hg(II), Ni(II), Bi(III), V(V), Fe(II), Pd(II), Cu(II), Co(II), Cd(II), y Fe(III) [García-
Vargas y col., 1981; García-Vargas y col., 1984; Granado-Castro y col., 2004a; Granado-
Castro y col., 2004b; Domínguez-LLedó y col., 2007].

c) PSH: piridoxal saliciloilhidrazona o saliciloilhidrazona del piridoxal

N OH O OH

N
H3C N
H
OH

Esta saliciloilhidrazona tiene un valor de pK1 de 4,0 y un pK2 de 7,9. La primera

constante de ionización puede atribuirse a la protonación del nitrógeno piridínico, el
segundo pK corresponde a la desprotonación del radical –CH2OH que posee el reactivo.

Se ha demostrado que este reactivo forma complejo con Al(III), Cu(II), Ni(II), Ti(IV),
Ga(III), Co(II), Zn(II) y Zr(IV), entre otros [Gallego y col., 1982b; Gallego y col., 1983a;
Gallego y col., 1983b; Aouarram y col., 2010].

Las pruebas previas de aplicabilidad que se realizaron con estos tres reactivos se
llevaron a cabo con discos de C18. Para ello se comenzó el estudio evaluando la retención
de las trazas metálicas a diferentes pH sin empleo de reactivo. Estos valores se consideran
como los “blancos” de la retención del metal para ser comparados con la retención
mediante el empleo del reactivo orgánico que se utilice.

En la Tabla 2.5, se pueden observar los valores de recuperación obtenidos para cada
metal, tras el proceso de extracción sin reactivo. Los porcentajes de recuperación se
calcularon a partir de la concentración teórica obtenida tras la preconcentración y elución
de una muestra de 500 mL que contenía 40 g/L de metal, de manera que obtener un
100% de recuperación, significaba que el eluato (de volumen 10 mL) presentaba una
concentración final de 2 mg/L de metal. El pH de la muestra fue ajustado con NaOH 0,1
mol/L y/o HNO3 0,1 mol/L. No se realizaron pruebas a elevados valores de pH porque a
partir de pH 8 los discos de C18 pueden sufrir hidrólisis. El eluyente utilizado fue una
disolución de HNO3 0,5 mol/L.

De los valores obtenidos en este estudio se puede deducir que un aumento en el pH, y
por tanto, en la concentración de NaOH adicionada a la muestra, incrementa la
recuperación del metal tras eluir con HNO3 0,5 mol/L. Este hecho puede estar relacionado
79
Capítulo 2

con el aumento de la hidrólisis de los cationes metálicos al subir el pH, llegando a precipitar
como hidróxidos de tipo M(OH)x. Estos hidróxidos pueden quedar retenidos en el disco y
ser eluidos finalmente por el ácido, proporcionando cierta retención del metal sin empleo
de ningún reactivo que favorezca este proceso.

Tabla 2.5. Estudio de la retención metálica en discos C18 para Cd(II), Cu(II), Pb(II), Ni(II),
Ag(I) y Co(II) sin empleo de reactivo orgánico (concentración de metal en la muestra: 40
g/L; factor de preconcentración: 50)

Concentración del
Metal pH de la muestra % Recuperación
extracto (mg/L)
Cd(II) 2,06 < Límite de Detección -
4,01 0,028 1,4
6,03 0,019 0,9
7,64 0,243 12,1
Cu(II) 2,10 < Límite de Detección -
4,08 0,015 0,8
6,19 0,173 8,7
7,51 0,300 14,5
Pb(II) 2,10 0,033 1,7
4,08 0,085 4,3
6,19 0,533 26,6
7,51 0,644 32,2
Ni(II) 2,08 0,013 0,7
4,09 0,044 2,2
6,11 0,075 3,8
7,23 0,148 7,4
Ag(I) 2,08 < Límite de Detección -
4,09 0,007 0,3
6,11 0,057 2,9
7,23 0,117 5,9
Co(II) 5,97 0,098 4,9

Después de este estudio, se realizaron diferentes pruebas de preconcentración de

metal pero utilizando los reactivos orgánicos anteriormente mencionados para incrementar
el porcentaje de retención. Para ello, se inmovilizaron 5 mg de reactivo en los discos de
membrana antes de la preconcentración de metal. La inmovilización se realizó pasando
libre y lentamente por el disco una disolución orgánica del reactivo. En el caso de la 2HBBH
y la 2APBH, se utilizó como disolvente 2 mL de cloroformo; en el caso de la PSH, dada su
baja solubilidad en cloroformo, se utilizaron 2,5 mL de metanol. En todos los casos, se
utilizó como eluyente una disolución de HNO3 0,5 mol/L. De todos los metales estudiados,
se recogen en la Tabla 2.6 los resultados más significativos obtenidos utilizando discos de
membrana C18.
80
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Tabla 2.6. Estudio de la retención metálica en discos C18 con 2HBBH, 2APBH y PSH
inmovilizados a diferentes valores de pH de la muestra (concentración de metal en la
muestra: 40 g/L; factor de preconcentración: 50)

pH de la muestra
Reactivo Metal % Recuperación
pH inicial pH final
2HBBH Cu(II) 4,1 4,1 1,5
Co(II) 6,0 5,4 6,5
Ni(II) 6,2 6,0 12,2
2APBH Cu(II) 6,0 6,0 6,2
Co(II) 6,1 5,8 3,2
Ni(II) 6,2 6,2 6,5
PSH Cd(II) 4,1 4,2 -
Cu(II) 4,6 4,5 13,0

A la vista de los resultados obtenidos, se puede concluir que los discos C18 no
proporcionaron recuperaciones muy elevadas, bien porque el reactivo no tuviera las
propiedades adecuadas para que se retuviera en el disco, o bien porque el complejo que se
pudiera formar, no fuera lo suficientemente apolar como para que se inmovilizara en el
disco, ya que el adsorbente octadecil sílice preferentemente retiene compuestos apolares.

Por ello, se realizaron experiencias similares con los discos de membrana SDB. En este
caso el reactivo más adecuado para su inmovilización fue la PSH a valores de pH
ligeramente ácidos, los cuales presentaban valores de retención de metal muy pequeños en
ausencia de reactivo. Los estudios realizados sobre retención metálica se recogen en la
Tabla 2.7. De los resultados obtenidos se pudo comprobar que utilizando discos de
membrana SDB se conseguía una gran recuperación de cobre de una muestra a pH 4,5
después de la inmovilización del reactivo PSH en el disco. Además, de los estudios
realizados para la retención de este metal sin reactivo a diferentes valores de pH se había
obtenido previamente una recuperación pequeña del 0,8%.

Tabla 2.7. Estudio de la retención metálica en discos SDB con PSH inmovilizada a valores
de pH de la muestra moderadamente ácidos (concentración de metal en la muestra: 40
g/L; factor de preconcentración: 50)

pH de la muestra
Reactivo Metal % Recuperación
pH inicial pH final
PSH Cd(II) 3,0 3,0 0
4,2 4,5 9,3
6,3 6,3 5,3
Cu(II) 4,5 4,6 93,5

81
Capítulo 2

Por ello, de todos los estudios preliminares, se seleccionó la piridoxal

saliciloilhidrazona (PSH) para ser inmovilizada en los discos de membrana SDB y
estudiar su aplicabilidad en la preconcentración de trazas de Cu(II) en aguas naturales.

2.5.2. Piridoxal Saliciloilhidrazona

Los primeros estudios realizados sobre la saliciloilhidrazona del piridoxal datan de
principios de los años ochenta y fueron llevados a cabo por Gallego y colaboradores, que
realizaron por primera vez su síntesis y describieron sus propiedades analíticas [Gallego y
col., 1982b].

La síntesis de la saliciloilhidrazona del piridoxal se realiza mediante calentamiento a

reflujo de una mezcla equimolecular de saliciloilhidracida (1 g en 20 mL de etanol) y
piridoxal (1,1 g en 20 mL de agua destilada), durante 10 minutos (Figura 2.4.). La mezcla
se deja a temperatura ambiente. El precipitado filtrado de color amarillo, se recristaliza dos
veces en etanol. El producto obtenido tiene un punto de fusión de 247 ºC y el rendimiento
de esta síntesis es del 80%.

O OH
N OH N OH O OH
H
+ H 2N
N
N H 3C
H3C H N
OH H
OH O
Piridoxal (P) Saliciloilhidracida (SH) Saliciloilhidrazona del Piridoxal

Figura 2.4. Síntesis de la PSH

El análisis elemental del compuesto sintetizado por estos autores fue: C 55,3%, H
5,0%, N 13,4%, O 26,3%, siendo los valores calculados a partir de la fórmula molecular
C15H15N3O4·H2O los siguientes: C 56,4%, H 5,3%, N 13,2%, O 25,1% [Gallego y col.,
1982b].

Los datos obtenidos para el análisis elemental de la PSH en estado sólido hacía
suponer que el reactivo en estado sólido posee una molécula de agua asociada al grupo
>C=O, circunstancia que se confirmaría posteriormente con el estudio del espectro de IR, y
que era eliminada tras el secado del sólido obtenido durante 1 hora a 110ºC.

Los espectros IR de PSH sólido exhiben las bandas de absorción (NH) y (N-H+) del
anillo de la piridina en 3350, 3130, y 2800 cm-1, respectivamente, cuya protonación se

82
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

debe a la migración desde el grupo fenólico al nitrógeno de la piridina, indicando que el

ligando existe en forma ceto en estado sólido. Sin embargo, en disolución y en presencia
de algunos iones metálicos los ligandos pueden existir en equilibrio con la forma
tautomérica del enol. El tautómero, debido a la pérdida del protón enólico, puede actuar
como ligando tridentado cargado que coordina a través del oxígeno del grupo fenólico, del
nitrógeno del grupo azometino y de los átomos de oxígeno del carbonilo. Otras bandas
importantes del IR corresponden a las vibraciones de tensión y flexión fenólicas de (C=O)
en 1520 y 1280 cm-1, y la banda en 1630 cm-1 asignada a las vibraciones de tensión de
(C=N) [Mohan, 1992]. Como consecuencia de su estructura molecular, el ligando puede
funcionar como un ligando bidentado o tridentado en la complejación de metales. El
espectro de absorción molecular UV de la PSH muestra dos máximos de absorción en 230 y
300 nm cuando se disuelve en etanol; estos picos se detectan a 300 y 350 nm en
disolución acuosa ácida, presentando un desplazamiento batocrómico en medios alcalinos
[Gallego y col., 1982b]. Este ligando también presenta propiedades fluorescentes debido
probablemente a la presencia de dos grupos hidroxilo en posición orto [Gallego y col.,
1983a].

La saliciloilhidrazona del piridoxal es poco soluble en los disolventes orgánicos más

comúnmente usados en las determinaciones fotométricas, tales como metanol, etanol,
tetracloruro de carbono, cloroformo, alcohol amílico, nitrobenceno y benceno (con
solubilidades menores a 1,2 g/L). Sin embargo, en dimetilformamida presenta una
solubilidad de 10 g/L [Gallego y col., 1982b].

Las constantes de ionización en medio acuoso a una fuerza iónica de 0,05 mol/L están
descritas en la bibliografía, y fueron determinadas por un método simultáneo
potenciométrico-fotométrico, encontrándose unos valores medios de las constantes de
ionización de 4,0  0,1 para pK1 y de 7,9  0,1 para pK2 [Gallego y col., 1982b].

De igual forma se encuentra descrita la estabilidad de la saliciloilhidrazona del

piridoxal, frente a los principales oxidantes y reductores a diferentes valores de pH,
destacando que los agentes oxidantes como el peróxido de hidrógeno o el peroxidisulfato
de potasio en concentraciones moderadas no afectan de manera apreciable al espectro de
absorción de la PSH en disolución acuo-orgánica durante varias horas. Sin embargo los
agentes reductores, como la hidracina o la hidroxilamina, afectan fuertemente al reactivo
en medio alcalino, pero no en medio ácido [Gallego y col., 1982b].

El estudio de reaccionabilidad de la PSH con los iones metálicos es de gran

importancia, de tal forma que está descrita la reacción de la PSH con 40 iones metálicos, a
una concentración de 1 mg/mL, para valores de pH de 1,5-2 (HCl), 4,7 (tampón acetato) y
10,2 (tampón amonio). Las características espectrales de los principales complejos solubles
(todos ellos de color amarillo o naranja) a pH ácido se muestran en la Tabla 2.8. Todos los

83
Capítulo 2

máximos de absorción aparecen en el intervalo de longitudes de onda de 390 a 490 nm

[Gallego y col., 1982b]. Puede concluirse que este reactivo presenta una reaccionabilidad
muy amplia. Con los cationes Cu(II), Ni(II), Co(II) y Fe(II) presenta una sensibilidad
apreciable en tampón acético-acetato, mientras que con Al(III), Zr(IV) y Ti(IV) presenta
mayor sensibilidad a pH ácido [Gallego y col., 1982b].

Tabla 2.8. Complejos metálicos con PSH y características espectrales de sus disoluciones
acuosas
pH=1,5-2,0 (HCl) pH=4,7 (Tampón acetato)
3
máx (x10 máx (x103
Metal máx (nm) Metal máx (nm)
L·mol-1·cm-1) L·mol-1·cm-1)

Cu(II) 420 15,8 Cu(II) 390 17,4

Mo(VI) 420 2,4 Fe(II) 420, 490 12,6; 7,0

V(V) 410 4,6 U(VI) 425 6,0

Zr(IV) 405 27,4 Ti(IV) 450 1,8

U(VI) 390 3,0 Al(III) 425 29,7

Ti(IV) 390; 440 5,9; 3,6 Ga(III) 425 10,4

Al(III) 420 20,3 Ni(II) 425 22,0

Ga(III) 420 2,8 Co(II) 420 13,3

La saliciloilhidrazona del piridoxal ha sido aplicada en Química Analítica como reactivo

espectrofluorimétrico y espectrofotométrico. De este modo se ha empleado en la
determinación espectrofotométrica de Zr(IV) [Gallego y col., 1982b] y Ti(IV) [Gallego y
col., 1983a] en la determinación espectrofotométrica y espectrofluorimétrica de Al(III)
[Gallego y col., 1983b]. También ha sido aplicado en voltamperometría de redisolución
catódica adsortiva (AdCSV) en el análisis de níquel en agua de mar [Aouarram y col.,
2010].

En el campo de la medicina la saliciloilhidrazona del piridoxal se ha estudiado por su

capacidad quelatante como agente para la terapia oral de las enfermedades debidas a una
sobrecarga de hierro [Williams y col., 1982]. Asimismo la PSH ha sido considerada como un
análogo de la piridoxal isonicotinoil hidrazona, por ser un efectivo quelatante del Fe(III), y
por tanto por su potencial para tratar las enfermedades debidas a una sobrecarga de

84
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

hierro. La actividad biológica de estos compuestos se relacionó con sus liposolubilidades,

medidas por sus coeficentes de partición o reparto entre n-octanol y agua [Edward y col.,
1995; Edward y col., 1997; Edward, 1998].

Por todo ello, se puede concluir que la PSH presenta características complejantes muy
adecuadas para estudiar su potencial uso como reactivo inmovilizado en discos de
membrana para la preconcentración por extracción en fase sólida de diversos metales de
interés medioambiental.

2.5.2.1 Estabilidad de la disolución metanólica de PSH

Con el fin de aplicar la PSH en extracción en fase sólida, se estudió previamente la
estabilidad de una disolución de este reactivo en metanol, considerado un disolvente muy
adecuado para SPE. Para ello, se preparó una disolución de concentración 6,64·10-4 mol/L.

La estabilidad de la disolución se evaluó espectrofotométricamente, midiendo la

absorbancia a 390 nm, haciendo uso de un espectrofotómetro UV-Vis, modelo Helios 
074515, Unicam (Reino Unido). En la Figura 2.5 se encuentran representados los valores
de absorbancia frente al tiempo estudiado. Se puede observar que el reactivo fue estable
en metanol durante al menos 6 semanas.

0,4
Absorbancia (390 nm)

0,3

0,2

0,1

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Día
Figura 2.5. Estabilidad de la absorbancia del ligando PSH en disolución metanólica
(6,64·10 -4 mol/L) con el tiempo

2.5.3. Estequiometría del complejo Cu-PSH

Con objeto de conocer la composición del complejo formado por Cu y PSH, se realizó el
estudio de su estequiometría mediante dos métodos diferentes: método de las variaciones
85
Capítulo 2

continuas [Kirkbright y col., 1965; Job, 1928] y método de la razón molar [Skoog y col.,
2005; Yoe y Jones, 1944]. Este último método puede llevarse a cabo bien manteniendo la
concentración de metal constante, o manteniendo la concentración de ligando constante.

Dado que estos métodos están basados en medidas espectrofotométricas en UV-Vis, se

procedió a determinar previamente la longitud de onda de máxima absorción para el
complejo en disolución acuometanólica. Para ello, se preparó una disolución de 10 mL que
contenía 2 mL de tampón acético/acetato 4 mol/L a pH 4,5; 0,5 mL de disolución
metanólica de PSH 6,64·10-4 mol/L; 0,5 mL de Cu(II) 6,64·10-4 mol/L, y se midió el
espectro de absorción (Figura 2.6). A partir de los resultados obtenidos, se seleccionó como
longitud de onda de máxima absorción del complejo el valor de =420 nm.

3
PSH
2,5
Absorbancia

2
PSH-Cu(II)
1,5

0,5

0
0 100 200 300 400 500 600
nm

Figura 2.6. Espectro de absorción UV-Vis de la disolución de Cu(II)-PSH a pH 4,5

(Cu(II)]=3,32·10 -5 mol/L; [PSH]= 3,32·10 -5 mol/L)

Estos métodos tienen la particularidad de que proporcionan resultados más fácilmente

cuando el reactivo no absorbe a la longitud de onda máxima del complejo. En este caso,
dado que el reactivo presenta cierta absorbancia a 420 nm, los métodos mencionados
pueden llevarse a cabo aplicando una ligera modificación en los blancos preparados, que se
detallará a continuación en cada una de las secciones.

En estos métodos se van a obtener siempre dos rectas con pendientes distintas. En la
primera recta, los valores de absorbancia son bajos y cualquier error puede generar
resultados inexactos. Por ello, es importante centrarse en evitar los errores en la primera
recta, mediante la utilización de los blancos adecuados.

86
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

2.5.3.1. Método de la razón molar

Una vez establecida la longitud de onda de máxima absorción (420 nm), se procedió a
estudiar la estequiometría utilizando el método de la razón molar. Este método consiste en
la medición de la señal espectrofotométrica del complejo metal-ligando en una serie de
disoluciones en las que se mantiene constante la concentración de uno de los reactivos,
mientras que se varía la del otro [Skoog y col., 2005]. En este estudio se llevaron a cabo
los dos procedimientos: método de la razón molar con metal constante y método de la
razón molar con ligando constante.

 Método de la razón molar con la concentración de metal constante

En este caso se mantuvo constante la concentración de Cu(II) mientras se fue
incrementando la concentración de ligando PSH.

En la Tabla 2.9 se indica la composición de las diferentes disoluciones que se

prepararon para el estudio de la estequiometría. Todas las disoluciones se enrasaron con
agua desionizada hasta 10 mL, conteniendo la misma relación de volumen metanol/agua
para evitar diferencias de matriz. Se utilizó una disolución tampón acético/acetato 4 mol/L
a pH 4,5, dos disoluciones de Cu(II) de 3,32·10-4 y 6,64·10-4 mol/L y dos disoluciones
metanólicas de PSH de 3,32·10-4 y 6,64·10-4 mol/L, para evitar tomar volúmenes
demasiado pequeños. El blanco fue preparado con 1 mL de tampón, 1,5 mL de metanol y
fue enrasado con agua hasta 10 mL.

En este método, antes de llegar a la relación óptima metal-ligando, el metal queda en

exceso, por lo que las absorbancias se deberían corregir con un blanco que contuviera la
cantidad de metal que queda en exceso en cada disolución. Sin embargo, previamente al
estudio de la estequiometría, se demostró que el Cu(II) en disolución no absorbe a 420
nm, por lo que no influye en la medida de la absorbancia. Es por ello, que las absorbancias
se midieron frente a un blanco preparado de la misma manera que las disoluciones de
estudio, pero sin contener metal ni reactivo.

El resultado del método de la razón molar manteniendo constante la concentración de

metal se muestra en la Figura 2.7. Se obtienen dos rectas por regresión lineal, y el punto
de cruce entre ellas indica que la relación molar entre PSH:Cu es de aproximadamente 1,5,
lo que implica que la estequiometría del complejo es 3 PSH:2 Cu.

87
Capítulo 2

Tabla 2.9. Composición de las disoluciones para la determinación de la estequiometría del

complejo PSH-Cu(II) por el método de la razón molar con metal constante
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

VT (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

VCu (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

VPSH,1 (mL) 0 0,2 0,4 0,6 1 - - - - -

VPSH,2 (mL) - - - - - 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5

VMet (mL) 1,5 1,3 1,1 0,9 0,5 0,8 0,6 0,4 0,2 0

RPSH/Cu 0 0,2 0,4 0,6 1 1,4 1,8 2,2 2,6 3

Abs
0 0,096 0,227 0,340 0,597 0,694 0,887 0,917 0,932 0,956
(420 nm)

VT: volumen de tampón acético/acetato 4 mol/L de pH 4,5; VCu: volumen de Cu(II) 6,64·10 -4 mol/L; VPSH,1:
volumen de PSH 3,32·10 -4 mol/L; VPSH,2: volumen de PSH 6,64·10 -4 mol/L; VMet: volumen de metanol;
RPSH/Cu: relación molar PSH/Cu(II)

1,2

1
Absorbancia (420nm)

0,8 y = 0,6024x - 0,013 y = 0,0555x + 0,7898

R2 = 0,998 R2 = 0,9849
0,6

0,4

0,2

0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Moles PSH/mol Cu

Figura 2.7. Aplicación del método de la razón molar con metal constante en el cálculo de
la estequiometría del complejo PSH-Cu(II) ([Cu(II)]= 3,32·10 -5 mol/L)

88
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

 Método de la razón molar con la concentración de ligando constante

En este método se mantuvo constante la concentración de PSH mientras que se fue
incrementando la concentración de Cu(II).

En las Tablas 2.10 y 2.11 se indica la composición de las diferentes disoluciones y

blancos que se prepararon para el estudio de la estequiometría. Las disoluciones se
prepararon de manera análoga a las anteriores y utilizando las mismas disoluciones de
partida.

En este método, antes de llegar a la relación óptima metal-ligando, el reactivo que

queda en exceso es el ligando, que sí absorbe a 420 nm. Por lo tanto y teniendo en cuenta
la estequiometría que ha resultado en el método anterior, se debe preparar un blanco para
cada muestra, que deberá contener la diferencia estequiométrica de ligando en exceso. A
partir de la relación óptima metal-ligando, el blanco no contendrá ligando puesto que todo
se ha consumido, y se utilizaría un mismo blanco para todas las muestras siguientes.

El resultado del método de la razón molar manteniendo constante la concentración de

ligando se muestra en la Figura 2.8. El punto de cruce entre las rectas indica que la
relación molar entre Cu:PSH es de aproximadamente 0,65, lo que confirma la
estequiometría del complejo de 3 PSH:2 Cu.

Tabla 2.10. Composición de las disoluciones para la determinación de la estequiometría

del complejo PSH-Cu(II) por el método de la razón molar con ligando constante

Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

VT (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

VCu,1 (mL) 0 0,2 0,4 0,6 1 - - - - -

VCu,2 (mL) - - - - - 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5

VPSH (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

RCu/PSH 0 0,1 0,2 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5

Abs
0 0,196 0,393 0,555 0,934 1,137 1,172 1,170 1,141 1,141
(420 nm)

89
Capítulo 2

Tabla 2.11. Composición de los blancos para la determinación de la estequiometría del

complejo PSH-Cu(II) por el método de la razón molar con ligando constante

Blancos 1 2 3 4 5 6-10

VT (mL) 1 1 1 1 1 1

VCu (mL) 0 0 0 0 0 0

VPSH (mL) 1 0,85 0,7 0,55 0,25 0

VMet (mL) 0 0,15 0,3 0,45 0,75 1

VT: volumen de tampón acético/acetato 4 mol/L de pH 4,5; VCu,1:
volumen de Cu(II) 3,32·10 -4 mol/L; VCu,2: volumen de Cu(II) 6,64·10 -4
mol/L; VPSH: volumen de PSH 6,64·10 -4 mol/L; VMet: volumen de
metanol; RCu/PSH: relación molar Cu(II)/PSH

1,4

1,2
Absorbancia (420nm)

1 y = 1,855x + 0,0075
y = -0,061x + 1,2292
R2 = 0,9993
0,8 R2 = 0,8251

0,6

0,4
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
Moles Cu/mol PSH

Figura 2.8. Aplicación del método de la razón molar con ligando constante en el cálculo de
la estequiometría del complejo PSH-Cu(II) ([PSH]= 6,64·10 -5 mol/L)

2.5.3.2. Método de las variaciones continuas

Tras realizar el estudio de la estequiometría con el método de la razón molar, se
procedió a confirmar el resultado aplicando el método de las variaciones continuas. Este
método consiste en medir la señal espectrofotométrica del complejo metal-ligando en una
serie de disoluciones en las que se varía progresivamente las cantidades de los reactivos,
pero se conserva su suma constante. Las proporciones de sus concentraciones respectivas
se ajustan gradualmente desde una disolución que contenga únicamente ligando hasta una

90
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

disolución que sólo contenga metal. Así se variará también la extensión de la reacción, la
cual pasará por un máximo, correspondiente al punto estequiométrico [Kirkbright y col.,
1965].

En las Tablas 2.12 y 2.13 se recoge la composición de las disoluciones y los blancos
preparados para la determinación de la estequiometría. Las concentraciones de las
disoluciones de partida de disolución reguladora, metal y ligando fueron las mismas a las
utilizadas en el método anterior. Los blancos para la primera recta se prepararon sin metal
y con la diferencia estequiométrica de ligando; mientras que para la segunda serie de
disoluciones se preparó un único blanco sin metal ni ligando.

En la Figura 2.9 se han representado los resultados obtenidos. La intersección de las

dos líneas mostró la fracción molar XCu característica del complejo de 0,4 como la indicativa
de la estequiometría del complejo, correspondiendo a una relación 3:2 (PSH:Cu).

Tabla 2.12. Composición de las disoluciones para la determinación de la estequiometría

del complejo PSH-Cu(II) por el método de las variaciones continuas

Muestra 1 2 3 4 5 6 7

VT (mL) 1 1 1 1 1 1 1

VCu (mL) 0 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400

VPSH (mL) 1 0,850 0,800 0,750 0,700 0,650 0,600

VMet (mL) 0 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400

XCu 0 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400

Abs (420 nm) 0 0,311 0,396 0,499 0,605 0,684 0,717

Muestra 8 9 10 11 12 13

VT (mL) 1 1 1 1 1 1

VCu (mL) 0,500 0,650 0,750 0,800 0,875 1

VPSH (mL) 0,500 0,350 0,250 0,200 0,125 0

VMet (mL) 0,500 0,650 0,750 0,800 0,875 1

XCu 0,500 0,650 0,750 0,800 0,875 1

Abs (420 nm) 0,585 0,403 0,293 0,217 0,128 0

91
Capítulo 2

Tabla 2.13. Composición de los blancos para la determinación de la estequiometría del

complejo PSH-Cu(II) por el método de las variaciones continuas

Blancos 1 2 3 4 5 6 7-13

VT (mL) 1 1 1 1 1 1 1

VCu (mL) 0 0 0 0 0 0 0

VPSH (mL) 1 0,625 0,500 0,375 0,250 0,125 0

VMet (mL) 0 0,375 0,500 0,625 0,750 0,875 1

VT: volumen de tampón acético/acetato 4 mol/L de pH 4,5; VCu: volumen de
Cu(II) 6,64·10 -4 mol/L; VPSH: volumen de PSH 6,64·10 -4 mol/L; VMet: volumen
de metanol; XCu: fracción molar Cu(II)

0,8
Absorbancia (420nm)

y = 1,9681x + 0,0058
0,6 R2 = 0,9989 y = -1,2031x + 1,1898
R2 = 0,9987
0,4

0,2

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
XC u

Figura 2.9. Aplicación del método de las variaciones continuas en el cálculo de la

estequiometría del complejo PSH-Cu(II) ([PSH] + [Cu(II)]= 6,64·10 -5 mol/L)
Por tanto, por ambos métodos se obtuvieron idénticos resultados, demostrando que la
estequiometría del complejo es 3 PSH:2 Cu.

2.5.4. Constante de formación del complejo Cu(II)-PSH

La formación de un complejo ML, a partir de un ligando L y un ion central M, es una
reacción reversible, definida como:

nM  mL  MnL m (2.1)

92
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

cuya constante de equilibrio:

[ML] eq
K  (2.2)
[M]neq [L]m
eq

se denomina constante de formación o constante de estabilidad del complejo. Es decir,

cuanto mayor es el valor de la constante de formación de un complejo, más favorecida está
su formación a partir de sus componentes (metal y ligando), y por tanto el complejo es
más estable.

La constante de formación del complejo estudiado se calculó utilizando los métodos de

la razón molar y el método de las variaciones continuas.

En el método de la razón molar con ligando constante, como ha sido indicado

anteriormente, se preparan disoluciones conteniendo todas la misma concentración del
ligando pero diferentes concentraciones del ion metálico central. Se obtienen diferentes
relaciones o razones de concentración de metal respecto del ligando (R). A bajos valores de
R, cuando el ligando está en exceso, el metal se encuentra en defecto y el incremento en la
absorbancia del complejo será proporcional a los moles de metal agregados. Si el complejo
es infinitamente estable se obtendría una recta creciente hasta el punto en que R alcanza
un valor igual al cociente estequiométrico del complejo. A partir de ese punto para mayores
valores de R se obtendría un valor constante de absorbancia. Para complejos reales, cuya
constante sea elevada pero no infinita, se obtendrá una curva a la que se le puede trazar
las rectas tangentes para bajos y altos valores de R. Las rectas se cruzarían en el valor de
R correspondiente a la estequiometría del complejo y a un valor de Absorbancia (Amax)
equivalente a que todo el metal y todo el ligando se encuentre formando complejo. La
Figura 2.10 muestra el comportamiento descrito.

Para la determinación de la constante de formación del complejo se ha hecho uso de la

curva de absorbancia frente a la razón molar (tanto RCu/PSH como RPSH/Cu). Asimismo, se ha
realizado el mismo cálculo mediante el método de las variaciones continuas, utilizando la
curva de absorbancia frente a la fracción molar de cobre (XCu), Por tanto, se han obtenido 3
valores diferentes de K, que han sido posteriormente comparados. El procedimiento del
cálculo se basa en la diferencia o GAP de absorbancia que existe entre el valor
correspondiente a la completa formación del complejo (Amax), punto en el que se cortan las
rectas, y el valor experimental (Aeq) en dicho punto cuando la reacción de formación se
encuentra en equilibrio.

93
Capítulo 2

1,4
Amax
1,2
1
Absorbancia

Aeq
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
Moles Cu/mol PSH

Figura 2.10. Aplicación del método de la razón molar para el cálculo de la constante de
formación del complejo Cu(II)-PSH

En cada punto de la curva se conoce la concentración inicial de cobre y de ligando que

se ha adicionado, las cuales se relacionan con el valor correspondiente de razón o fracción
molar, por medio de la abscisa. Así, en el punto en que las rectas se cruzan, tendremos un
valor de razón (RCu/PSH, RPSH/Cu) o fracción molar (XCu) en el eje x, un valor de absorbancia
Amax y Aeq en el eje y, y las concentraciones iniciales de metal [Cu]i, ligando [PSH]i añadido,
así como la concentración de complejo [Cu2PSH3]max, calculada a partir de la estequiometría
resultante.

Según la Ley de Beer,

A = ·b·c (2.3)

siendo  el coeficiente de absortividad molar ((mol/L)-1·cm-1), b la longitud del paso óptico

de la muestra, en este estudio 1 cm, y c, la concentración del complejo (mol/L).

Se puede calcular utilizando el valor de AMax y la concentración máxima que podría

obtenerse del complejo si la constante fuera infinita:

A max
 (2.4)
b·Cu 2 PSH 3 max

Una vez obtenido el valor de , se podrán calcular las concentraciones en equilibrio del
metal [Cu]eq, del ligando [PSH]eq y del complejo [Cu2PSH3]eq, cuyos valores determinarán la
constante de formación, K.

94
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

A eq
[Cu 2 PSH 3 ] eq  (2.5)
b·

[Cu] eq  [Cu]i  2 [Cu 2 PSH 3 ] eq (2.6)

[PSH] eq  [PSH]i  3 [Cu 2 PSH 3 ] eq (2.7)

Sustituyendo estos valores en la ecuación de la constante,

[Cu 2 PSH 3 ] eq
K  (2.8)
Cu2eq [PSH] 3eq
se obtendría el valor de ésta para cada uno de los tres métodos (Tabla 2.14).

Tabla 2.14. Valores de la constante de formación del complejo Cu2PSH3 calculada

mediante el método de la razón molar y de las variaciones continuas

Método K ((mol/L)-4)

Razón molar - Cu constante 5,53·1021

Razón molar - PSH constante 4,14·1021

Variaciones continuas 5,66·1021

El valor medio de la constante de formación del complejo y su desviación estándar es

de:

K = (5,11 ± 0,8)·1021 (mol/L)-4

2.5.5. Equipos y metodología de análisis de Cu(II) utilizando extracción en

fase sólida

2.5.5.1. Equipos utilizados

A continuación se detalla el material utilizado para llevar a cabo el análisis de

Cu(II) mediante extracción en fase sólida:

- El pH de todas las disoluciones fue medido con un pH-metro modelo 2001 (Crison,
España) equipado con un electrodo combinado de vidrio-Ag/AgCl 52-02, calibrado
mediante patrones de pH 4 y 7.
95
Capítulo 2

- Las extracciones se llevaron a cabo en un aparato estándar de filtración Millipore, de

47 mm de diámetro, conectado a una bomba de vacío modelo D95 (Dinko, España).

- Para la determinación de cobre tras la elución después de la extracción en fase sólida

se empleó un espectrómetro de absorción atómica, Solaar M-Series Thermo Elemental,
Unicam (Reino Unido), con lámpara de cátodo hueco a una longitud de onda de 324,8
nm, utilizando llama de aire-acetileno.
La preparación de las disoluciones utilizadas en este capítulo se encuentra detallada en
el Anexo 1.

2.5.5.2. Metodología de análisis de Cu(II) utilizando extracción en fase

sólida
El objetivo de este capítulo es desarrollar y optimizar un método adecuado de
preconcentración y determinación de trazas metálicas de Cu(II) en aguas naturales. Para
ello, se utiliza la extracción en fase sólida con discos de poliestireno divinilbenceno (SDB)
que contienen un 10% de PTFE, de 47 mm de diámetro y 0,5 mm de espesor, con un
tamaño de poro de 80 Å, un tamaño de partículas de 16 m y un área superficial de 450
m2/g. Estos discos son estables en el rango de pH 2-12 y son resistentes a la mayoría de
disolventes orgánicos.

La extracción en fase sólida consta de 6 etapas esenciales: descontaminación,

acondicionamiento, extracción de la muestra, secado, recuperación y lavado del disco.

Descontaminación
Después de colocar el disco en el aparato de filtración (Millipore), se hacen pasar con
ayuda de la bomba de vacío 5 mL de metanol para humedecerlo, 10 mL de HNO3 1 mol/L,
10 mL de metanol y 10 mL de acetonitrilo. Todos estos disolventes o disoluciones eliminan
los contaminantes procedentes del proceso de fabricación y del ambiente, que pueda
contener el disco.

Acondicionamiento
Tras secar el disco dejando pasar aire durante varios minutos, se pasa a través del
mismo una disolución del reactivo a inmovilizar disuelto en un volumen adecuado de
disolvente. En el caso de la PSH se utilizó metanol para disolverla. En el caso de los otros
dos reactivos que se han estudiado durante los análisis previos, la 2HBBH (2-
hidroxibenzaldehído benzoilhidrazona) y la 2APBH (2-acetilpiridina benzoilhidrazona) se
utiliza cloroformo, puesto que son más solubles en dicho disolvente.

96
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

La disolución de reactivo se deja pasar libremente, sin el uso de la bomba de vacío

para que todo el contenido de reactivo quede retenido lentamente en el disco. Una vez que
el disolvente ha pasado a través del disco, éste se deja secar a temperatura ambiente el
tiempo necesario para que se evapore el resto de disolvente (aproximadamente entre 5 y
10 minutos).

Finalmente, el disco se lava con 25 mL de agua Milli-Q y se deja secar pasando aire.

De esta manera, el polímero SDB se encuentra modificado con el reactivo y

acondicionado para el siguiente proceso, que será el de extracción del metal de la muestra.

Extracción y preconcentración de la muestra

Se humedece el disco con 25 mL de agua Milli-Q y posteriormente, se hace pasar la
muestra que contiene el metal a preconcentrar a una velocidad determinada. De esta
manera, se forma el complejo entre el metal y el reactivo que quedó retenido en el disco
en la etapa anterior.

Secado
Una vez que haya pasado toda la muestra a través del disco, se aplica un alto vacío
durante 1 minuto para eliminar los restos de disolución. Este paso es importante, porque el
agua que quede retenida en el disco puede producir una dilución del eluyente posterior y
reducir la eficiencia de la etapa de elución.

Recuperación o elución
El metal es recuperado pasando un volumen adecuado de disolución de ácido que
destruyen el complejo formado y permiten la elución del metal en un pequeño volumen.
Este volumen de eluato es recogido en un tubo colector para su posterior análisis por
Espectroscopía de Absorción Atómica. Finalmente, se deja que el disco se seque totalmente
haciendo pasar aire a vacío.

Lavado del disco

Esta última etapa es esencial para poder seguir utilizando el disco en otros análisis.
Consta de 3 pasos: pasar 10 mL de HNO3 1 mol/L, 10 mL de metanol y 10 mL de H2O para
eliminar los restos de ácido nítrico y metanol.

Finalmente, se deja secar completamente el disco dejando pasar aire a alto vacío. Este
paso es muy importante ya que uno de los principales mecanismos de degradación de los
discos es la hidrólisis que se podría producir por el contacto de éstos con el agua durante
un largo periodo de tiempo. Si en algún caso se llegara a producir degradación, la hidrólisis
se puede invertir calentando los discos en una estufa calefactora hasta que el agua que
contienen se evapore.

97
Capítulo 2

En la Figura 2.11 se ilustran las etapas normalmente empleadas en las técnicas de

extracción en fase sólida empleando reactivos orgánicos inmovilizados en el soporte sólido.

1) Descontaminación 2) Inmovilización del 3) Paso de la muestra 4) Elución

reactivo

Figura 2.11. Etapas del proceso de extracción en fase sólida

Asimismo, en las Figuras 2.12 y 2.13 se muestra el equipo de filtración de 47 mm de

diámetro de Millipore empleado en la técnica de extracción en fase sólida.

Figura 2.12. Imagen del sistema de extracción en fase sólida con discos

98
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Recipiente para la
muestra y
disolventes

Pinza

Disco
Base

Vacío

Colector del
extracto

Figura 2.13. Esquema del equipo de filtración empleado en la técnica de extracción en

fase sólida con discos

El sistema consta de un recipiente de vidrio, en el cual se vierten con cuidado las

distintas disoluciones y la muestra; un soporte donde se coloca el disco de membrana; una
pinza que sujeta el recipiente de vidrio y el soporte; y un matraz kitasato que se acopla a la
bomba de vacío a través de un tubo de C-Flex. Dentro del matraz se introduce un tubo
colector de las disoluciones o extractos obtenidos después de que pasen a través del filtro.

2.5.6. Optimización de la metodología de análisis de Cu(II) por SPE

mediante el empleo de PSH
Una vez elegido el reactivo adecuado para desarrollar el método de preconcentración y
análisis de trazas de cobre y conocido el complejo metálico que se forma entre el reactivo y

99
Capítulo 2

el metal, se pasa a la optimización de los parámetros que influyen en la técnica de

preconcentración.

Los parámetros que influyen en el método de extracción en fase sólida son los
siguientes:

 Tipo de eluyente: existen varios tipos de ácidos que se pueden utilizar como eluyentes
de iones metálicos retenidos como complejos orgánicos, a distintas concentraciones. El
más adecuado será aquél que consiga destruir de manera efectiva el complejo PSH-Cu
para la elución del metal.

 Volumen de eluyente: con objeto de obtener altos factores de preconcentración, es

necesario encontrar volúmenes pequeños que sean suficientes para destruir el
complejo y que eluyan el metal con una elevada recuperación.

 Valor de pH de las disoluciones acuosas empleadas: los ligandos orgánicos con carácter
ácido/básico pueden estar en su forma neutra o cargada dependiendo del valor del pH
del medio. Esta carga puede influir en su capacidad de retención en el disco. Asimismo,
el pH también influye en la formación del complejo, por lo que habrá que trabajar con
valores de pH apropiados para que el reactivo quede adsorbido sobre el disco de
membrana y compleje de forma eficaz al cobre o lo eluya, según la etapa del proceso.

 Cantidad de reactivo inmovilizado en el disco: este factor es muy importante en el

proceso de extracción en fase sólida. Dado que el equilibrio de formación de complejo
depende de la cantidad de reactivo inmovilizado, se debe encontrar un valor que sea
adecuado para que todo el metal presente en la muestra quede complejado con el
reactivo. Por ello, se iniciarán los estudios con suficiente cantidad de reactivo,
inmovilizando una cantidad inicial de 5 mg de PSH (Peso molecular = 319 g/mol) y
preconcentrando una muestra que contiene 20 g de Cu(II). Estas condiciones
corresponden a una relación molar catión:ligando de 1:50.

 Velocidad de flujo de la muestra y del eluyente: estos factores son muy importantes
desde el punto de vista cinético de la extracción. Será necesario elegir una velocidad
de paso de la muestra suficiente para que todos los iones Cu(II) tengan opción de
reaccionar con el ligando y formar complejo, quedando retenidos en el disco.
Posteriormente, se seleccionará una velocidad de paso del eluyente tal que éste sea
capaz de destruir el complejo formado en el disco de manera eficaz.

El estudio previo del comportamiento de estos parámetros químicos fue realizado

mediante el método univariante, es decir, estudiando las mejores condiciones para cada
una de las variables de forma individual, con el objetivo de conocer el sistema. Este estudio
supuso un paso previo a la optimización del método mediante el empleo de un diseño de
100
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

experimento, en el que la adecuada elección de las variables (variables de diseño), así

como de sus intervalos permitió el diseño final de la metodología. Hay que recordar que el
estudio univariante de los parámetros proporciona una fuente muy útil de información
inicial del comportamiento de las variables en el proceso. Además sirve para establecer los
rangos iniciales en los que serán estudiadas con el diseño, sobre todo para aquellos valores
que no vienen determinados por limitaciones propias del sistema.

2.5.6.1. Estudio de la influencia de la naturaleza del eluyente

Se seleccionaron tres ácidos distintos, de los cuales uno es débil (CH3COOH) y dos son
fuertes (HCl y HNO3) y se aplicaron como eluyentes en la SPE a tres concentraciones
diferentes: 0,5, 1 y 2 mol/L.

Las pruebas se realizaron en la siguientes condiciones: se inmovilizaron 5 mg de

saliciloilhidrazona del piridoxal disueltos en 2,5 mL de metanol; el valor de pH de la
muestra (controlado con NaOH 0,1 mol/L y/o HNO3 0,1 mol/L.) fue aproximadamente de
4,5 conteniendo una concentración de Cu(II) de 40 g/L (20 g). El volumen de muestra a
preconcentrar fue de 500 mL y el volumen de eluyente utilizado fue de 10 mL, con lo que
se obtenían factores de preconcentración de 50 unidades.

a) Estudio del ácido acético como eluyente

El porcentaje de recuperación de Cu(II) obtenido para cada una de las eluciones
realizadas con diferentes disoluciones de ácido acético se han detallado en la Tabla 2.15 y
se han representado en la Figura 2.14. Al utilizar una concentración baja de ácido acético,
se obtuvo una recuperación muy pequeña. Al ir aumentando la molaridad del ácido,
aumentó el metal extraído, pero no se llegó a obtener una recuperación cuantitativa. Esto
se debe probablemente a que el ácido acético no es un ácido suficientemente fuerte como
para favorecer la destrucción del complejo estable Cu-PSH retenido en el disco de
membrana.

b) Estudio del ácido nítrico como eluyente

Los valores de porcentaje de recuperación de Cu(II) obtenido para cada una de las
eluciones realizadas con ácido nítrico se detallan en la Tabla 2.16 y en la Figura 2.15. En
este caso, se puede observar que este eluyente proporcionó resultados más adecuados que
el anterior, puesto que se obtuvieron recuperaciones completas del metal, debido
probablemente a su naturaleza de ácido fuerte. Así, a partir de una concentración de 1
mol/L ya se obtuvo una extracción cuantitativa.

101
Capítulo 2

c) Estudio del ácido clorhídrico como eluyente

Los resultados obtenidos para la elución con ácido clorhídrico se resumen en la Tabla
2.17 y se han representado gráficamente en la Figura 2.16. Este ácido proporcionó valores
de recuperación más adecuados para valores de concentración bajo o intermedio dentro
del intervalo estudiado. Por lo que su utilización disminuye el coste del proceso de
extracción al utilizar menos cantidad de ácido.

Como conclusión, tanto el ácido nítrico (1-2 mol/L) como el ácido clorhídrico (0,5-1
mol/L) fueron capaces de eluir de forma eficaz el metal por destrucción del complejo que
se formó entre la saliciloilhidrazona del piridoxal y el cobre, y, por tanto, proporcionaron
una recuperación cercana al 100%.

Tabla 2.15. Estudio del porcentaje de recuperación de Cu(II) (20 g) retenido en discos
de SDB modificado con PSH (5 mg) para diferentes concentraciones de ácido acético (n=3;
Veluyente= 10 mL)
Concentración pH de la muestra
% Recuperación
Ácido Acético (mol/L) pH inicial pH final
0,5 4,6 4,4 7,1
1 4,5 4,4 28,0
2 4,6 4,4 83,4

100%
S.D. 0,62
80%
Recuperación de Cu(II)

60%

40% S.D. 0,18

20% S.D. 0,21

0%
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración de CH3COOH (mol/L)

Figura 2.14. Porcentaje de recuperación de Cu(II) (20 g) con ácido acético

102
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Tabla 2.16. Estudio del porcentaje de recuperación de Cu(II) (20 g) retenido en discos
de SDB modificado con PSH (5 mg) para diferentes concentraciones de ácido nítrico (n=3;
Veluyente=10 mL)
Concentración pH de la muestra
% Recuperación
Ácido Nítrico (mol/L) pH inicial pH final
0,5 4,6 4,7 93,2
1 4,6 4,6 101,0
2 4,6 4,4 102,1

104%

102%
Recuperación de Cu(II)

100%

98%

96%

94%

92%
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración de HNO3 (mol/L)

Figura 2.15. Porcentaje de recuperación de Cu(II) (20 g) con ácido nítrico

Tabla 2.17. Estudio del porcentaje de recuperación de Cu(II) (20 g) retenido en discos
de SDB modificado con PSH (5 mg) para diferentes concentraciones de ácido clorhídrico
(n=3; Veluyente=10 mL)
Concentración pH de la muestra
% Recuperación
Ácido Clorhídrico (mol/L) pH inicial pH final
0,5 4,7 4,3 100,7
1 4,5 4,3 101,4
2 4,6 4,4 96,4

103
Capítulo 2

104%

102%
Recuperación de Cu(II)

100%

98%

96%

94%
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración de HCl (mol/L)

Figura 2.16. Porcentaje de recuperación de Cu(II) (20 g) con ácido clorhídrico

2.5.6.2. Estudio del volumen de eluyente en la recuperación del metal

Las pruebas presentadas hasta el momento para el estudio del eluyente se llevaron a
cabo con un volumen de 10 mL de cada ácido. En estas condiciones, el proceso de
extracción en fase sólida proporciona un factor de preconcentración de 50 unidades. No
obstante, por modificación de este volumen se podría incrementar ese factor. Por ello, se
pasó a estudiar la influencia del volumen de ácido empleado en la eficacia de la elución.

El procedimiento seguido para este estudio consistió en inmovilizar 5 mg de PSH

disueltos en 2,5 mL de metanol y preconcentrar 500 mL de una muestra conteniendo 40
g/L de Cu(II) (20 g) a pH cercano a 4,5 (controlado con NaOH 0,1 mol/L y/o HNO3 0,1
mol/L). El volumen de eluyente se disminuyó a 5 mL, por lo que se podrían obtener
factores de preconcentración de 100.

En la Tabla 2.18 se recogen los resultados obtenidos con los dos mejores eluyentes
estudiados, utilizando 5 mL de disolución de ácido nítrico o ácido clorhídrico (para
concentraciones 0,5, 1 y 2 mol/L). Así, puede observarse cómo eluyendo con 5 mL de
HNO3 0,5 o 1 mol/L no se llegó a recuperar todo el cobre contenido en la muestra. Sin
embargo, si la elución era realizada con ácido clorhídrico 0,5 mol/L, pudo disminuirse el
volumen del eluyente a 5 mL y aumentar el factor de preconcentración, pues se obtuvo un
valor de recuperación aproximado de 100%.

Como conclusión, se puede decir que 5 mL de HCl 0,5 mol/L fueron suficientes para
obtener un factor de preconcentración de 100 unidades, con una recuperación
prácticamente del 100%, siendo necesarios, sin embargo, 10 mL de HNO3 1-2 mol/L. Dado
que el HCl puede, en ciertos casos, presentar interferencias moleculares en la
104
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

determinación metálica mediante Espectroscopía de Absorción Atómica [Welz, 1985], que a

su vez es una de las técnicas de determinación metálica más usual después de la
preconcentración de trazas de metales en una fase ácida, en este trabajo se consideró más
interesante utilizar 10 mL de HNO3 1 mol/L como eluyente para los experimentos
posteriores de preconcentración.

Tabla 2.18. Estudio de la eficacia del eluyente utilizado en el porcentaje de recuperación

de Cu(II) (20 g) retenido en discos de SDB modificado con PSH (5 mg) (n=3; Veluyente=5
mL)
Concentración pH de la muestra
Ácido % Recuperación
(mol/L) pH inicial pH final

5 mL 0,5 4,6 4,5 91,7

HNO3 1 4,5 4,5 95,7
2 4,5 4,5 93,7
5 mL 0,5 4,6 4,5 100,3
HCl
1 4,6 4,5 96,8

2 4,6 4,5 95,7

2.5.6.3. Estudio de la influencia del pH de la muestra sobre la eficacia de la

SPE
El pH de la muestra que se desea preconcentrar es un parámetro fundamental en el
proceso de extracción en fase sólida y debe de ser optimizado. Por ello se prepararon
diferentes disoluciones reguladoras de ácido acético/acetato 4 mol/L de pH 3,5; 4; 4,5; 5 y
5,5; respectivamente para ser utilizadas en la regulación del pH de la muestra. Estas
disoluciones tienen la ventaja frente al empleo de NaOH y/o HNO3, de controlar mejor el
pH para valores moderadamente ácidos, obteniéndose mejor reproducibilidad durante el
ajuste del pH de la muestra. Las restantes condiciones del proceso de extracción fueron
similares a las ya descritas, utilizando 5 mg de PSH disueltos en 2,5 mL de metanol, un
volumen de muestra de 500 mL con 40 g/L de Cu(II) (20 g) acondicionada con 50 mL de
disolución reguladora 4 mol/L y eluyendo con 10 mL de HNO3, 1 mol/L, ya que la detección
se realizó mediante Espectroscopía de Absorción Atómica con llama. Los resultados
obtenidos se recogen en la Figura 2.17, donde se ha representado el porcentaje de
recuperación obtenido para cada valor de pH estudiado.

105
Capítulo 2

102%

98%
Recuperación de Cu(II)

94%

90%

86%

82%
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6
pH

Figura 2.17. Influencia del pH de la muestra en el porcentaje de recuperación de Cu(II)

(20 g) retenido en discos SDB modificado con PSH (5 mg) empleando disolución
reguladora de ácido acético/acetato sódico 0,4 mol/L (n=3)

Se puede observar que el máximo de recuperación se encontró para valores de pH

próximos a 4,5, por lo que en siguientes experimentos se adicionó disolución reguladora de
ácido acético/acetato sódico de pH 4,5 a las muestras de agua que se desearon
preconcentrar, con una concentración final en la muestra de 0,4 mol/L.

2.5.6.4. Estudio de la influencia de la cantidad de reactivo inmovilizado en el

disco de membrana SDB
En todas las experiencias realizadas y descritas hasta el momento, se emplearon 5 mg
de saliciloilhidrazona del piridoxal en 2,5 mL de metanol, los cuales eran inmovilizados en el
disco de poliestireno divinilbenceno, favoreciendo la retención del metal de la muestra para
su preconcentración.

No obstante, se decidió estudiar si la cantidad de reactivo influía de forma significativa

en el sistema de preconcentración. Por ello, se realizaron experiencias por duplicado, de tal
forma que se hicieron pasar por el disco diversas cantidades de PSH: 0; 1; 2,5; 5 y 7,5 mg,
utilizando volúmenes diferentes de una disolución del reactivo en metanol de 1 mg/mL.
Con el primer experimento se evaluó la retención metálica en el disco en ausencia de
reactivo y se observó que la recuperación media, para 5 réplicas, se encontraba por debajo
del 0,8%. Los resultados se detallan en la Figura 2.18. De este estudio se pudo comprobar
que 2,5 mg de reactivo eran suficientes para una recuperación cuantitativa. Por ello, y a

106
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

partir de este estudio se decidió utilizar para los siguientes experimentos 2,5 mg de
saliciloilhidrazona del piridoxal.

100%
Recuperación de Cu(II)

75%

50%

25%

0%
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Cantidad de PSH (mg)

Figura 2.18. Estudio de la influencia de la cantidad de reactivo inmovilizado en el disco

SDB sobre el porcentaje de recuperación de Cu(II) (20g) tras la SPE

2.5.6.5. Estudio de la influencia de la velocidad de flujo de la muestra y del

eluyente durante el proceso de preconcentración de metal
La velocidad de flujo que se aplica para hacer pasar la muestra a través del disco, así
como la velocidad con la que se hace pasar el eluyente son dos parámetros importantes en
este método, puesto que influyen en la capacidad de retención de los iones Cu(II) en los
discos y en su posterior recuperación.

Por este motivo, se estudió la influencia de la velocidad de flujo de la muestra y se

encontró que la retención de Cu(II) era cuantitativa y reproducible en un rango de 10-20
mL/min. De esta manera, se seleccionó una velocidad de 10 mL de muestra/min para
posteriores experiencias. De igual manera se investigó la velocidad de flujo del eluyente, y
se consiguió una extracción cuantitativa en el rango de velocidades de 1-10 mL/min,
utilizando 10 mL de ácido nítrico 1 mol/L. Para valores de velocidad superiores, se
necesitaron mayores volúmenes de eluyente para alcanzar una recuperación cuantitativa.
Por ello, se seleccionó una velocidad de paso de eluyente de 5 mL/min para los siguientes
estudios.

107
Capítulo 2

2.5.6.6. Optimización de las variables más significativas: Diseño de

experimento factorial fraccionario 33-1
Después del conocimiento previo del sistema mediante su estudio univariante, se
realizó una optimización simultánea de las variables más importantes y significativas del
sistema. Para seleccionar los valores más adecuados de estas variables se realizó un diseño
factorial fraccionario 33-1 incluyendo tres réplicas del experimento del punto central, con lo
que se tenían que realizar un total de 11 experimentos. La codificación empleada fue (-1, 0
y +1) para el nivel inferior, intermedio y superior, respectivamente (Tabla 2.19). Los
factores fueron el volumen de eluyente, el pH de la muestra y la concentración de
eluyente. Los demás parámetros se mantuvieron constantes en los valores que a
continuación se detallan:

- Eluyente: HNO3

- Cantidad de reactivo: 2,5 mg de PSH disueltos en 2,5 mL de metanol

- Velocidad de flujo en la etapa de preconcentración de la muestra: 10 mL/min

- Velocidad de flujo en la etapa de recuperación: 5 mL/min

- Volumen de muestra: 500 mL

- Concentración de Cu en la muestra: 40 g/L

Tabla 2.19. Matriz de las variables del diseño de experimentos 33-1 con los valores
codificados
Volumen Concentración HNO3
Experimento pH
HNO3 (mL) (mol/L)
2 -1 0 +1
5 0 0 0
3 -1 +1 0
8 +1 0 -1
4 0 -1 +1
7 +1 -1 0
6 0 +1 -1
9 +1 +1 +1
1 -1 -1 -1
10 0 0 0
11 0 0 0

108
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Este tipo de diseño factorial permite reducir el número de experiencias a realizar y

evaluar eficazmente los factores usando una pequeña fracción de los experimentos del
diseño factorial completo [Araujo y Brereton, 1996]. Estos diseños reducidos son
adecuados cuando se trabajan con intervalos pequeños para los factores [Figueroa, 2003].
En este tipo de diseños se suelen agregar dos o más observaciones del nivel central de los
factores para estimar el error experimental.

En la Tabla 2.20 se pueden observar los tres niveles utilizados para cada una de las
variables. La elección de estos valores se realizó en función de los resultados
experimentales obtenidos en los estudios univariantes. El tipo de disolución reguladora
empleada para estos estudios fue la disolución de AcH/AcNa, con una concentración final
en la muestra de 0,4 mol/L. En la Tabla 2.21 se muestran los datos de recuperación
obtenidos para cada uno de los experimentos del diseño.

Tabla 2.20. Niveles de las variables del diseño de experimentos 33-1

Nivel inferior Nivel intermedio Nivel superior
Variable
(-1) (0) (+1)
Volumen HNO3 (mL) 5 10 15
pH muestra 3,5 4,5 5,5
Concentración HNO3 (mol/L) 0,5 1 1,5

Tabla 2.21. Eficacia de la extracción en fase sólida para cada experimento del diseño 33-1

Volumen Concentración
Experimento pH % Recuperación
HNO3 (mL) HNO3 (mol/L)
2 5 4,5 1,5 77,6
5 10 4,5 1 99,4
3 5 5,5 1 70,3
8 15 4,5 0,5 86,5
4 10 3,5 1,5 64,2
7 15 3,5 1 72,8
6 10 5,5 0,5 67,6
9 15 5,5 1,5 73,1
1 5 3,5 0,5 76,2
10 10 4,5 1 99,2
11 10 4,5 1 99,5
109
Capítulo 2

Los resultados del diseño de experimento fueron analizados empleando el programa

informático Statistica 7 [Statistica, 2004]. En primer lugar, se representó el correspondiente
diagrama de Pareto de los efectos estandarizados (Figura 2.19) que incluye la posible
dependencia cuadrática o lineal de las variables.

Del diagrama de Pareto se desprende que en el intervalo estudiado para cada una de
las variables, la variable significativa (con un nivel de significación p>0,05) en el proceso
fue el pH de la muestra teniendo una influencia cuadrática positiva. Con estos resultados,
la recuperación de cobre fue máxima en el punto central del intervalo de pH, es decir, para
un valor de pH de 4,5. Con respecto a la concentración y volumen del ácido del eluyente, el
ácido nítrico, el estudio concluyó que eran dos variables no significativas (p<0,05), pero
aún así la dependencia cuadrática de ambas superó, en cuanto al nivel de significación, a la
lineal, por lo que se seleccionaron como datos óptimos los valores intermedios de los
rangos estudiados: 10 mL de HNO3 1 mol/L.

Diagrama de Pareto de Efectos Estandarizados

pH(Q) 3,90

[HNO 3](Q) 1,72

[HNO 3](L) -0,84

V HNO 3(Q) 0,55

V HNO 3(L) 0,45

pH(L) -0,12

p=,05
Efectos Estandar izados estimados ( V alor absoluto)

Figura 2.19. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados para la recuperación de

Cu(%) tras la preconcentración por SPE

110
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

En las Figuras 2.20, 2.21 y 2.22 se representó la superficie de respuesta del modelo
producida por el diseño factorial fraccionario para los factores estudiados, combinados de
dos en dos.

En la Figura 2.20 se representó el efecto del pH frente al volumen de HNO3

manteniendo el factor de la concentración de nítrico fijo en el nivel intermedio 0. En el
gráfico se puede observar que el punto máximo (100% de recuperación de cobre) se
encontró en los valores intermedios de pH y volumen de HNO3, lo que equivaldría a pH 4,5
y 10 mL de HNO3.

Se representó también el efecto del pH frente a la concentración de HNO3,

manteniendo constante al nivel codificado 0 el volumen de HNO3 (Figura 2.21). El punto
máximo se encontró alrededor de los valores intermedios de cada factor representado, es
decir, pH 4,5 y 1 mol/L de HNO3.

Por último, en la Figura 2.22 se pudo observar la respuesta obtenida al variar la

concentración de HNO3 frente a su volumen, manteniendo fijo el pH con el valor intermedio
del intervalo. El 100% se consigue con los valores intermedios de los factores
representados.

A partir de estas figuras puede comprobarse que las condiciones que permitieron
obtener la máxima recuperación de cobre fueron pH 4,5 y 10 mL de HNO3 1 mol/L,
confirmando las condiciones obtenidas en la optimización univariante.
)

100
Recuperación de Cu (%

90
80
70
60
50
40
1
95
1
90
0 85
0
80
pH

NO
3

-1 VH

Figura 2.20. Superficie de respuesta del efecto del pH y volumen de HNO3 sobre la
recuperación de Cu (%) (Nivel del factor [HNO3]= 0)

111
Capítulo 2

)
100

Recuperación de Cu (%
90
80
70
60
50
40
1
1

0 95
0
[H
NO

90
pH
3
]

-1 85
80
Figura 2.21. Superficie de respuesta del efecto de la concentración de HNO3 y el pH sobre
la recuperación de Cu (%) (Nivel del factor V HNO3 = 0)

105
)
Recuperación de Cu (%

100
95
90
85
80
75
70
65
1
1
95
0 90
0
[H

85
NO

NO
3
80
VH
3
]

-1

Figura 2.22. Superficie de respuesta del efecto de la concentración y volumen de HNO3

sobre la recuperación de Cu (%) (Nivel del factor pH =0)

112
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

2.5.7. Características analíticas del método propuesto para la extracción en

fase sólida de iones Cu(II) en aguas naturales
Concluida la optimización, se propuso el método de preconcentración de trazas de
cobre en muestras acuosas mediante extracción en fase sólida con PSH inmovilizada en
discos de membrana de poliestireno divinilbenceno. A continuación, en la Tabla 2.22 se
detallan las condiciones óptimas del método.

Tabla 2.22. Condiciones óptimas del método de SPE con discos modificados con PSH para
la preconcentración y separación de trazas de Cu(II)
Variables Valores
Naturaleza del eluyente HNO3 1 mol/L
Volumen de eluyente 10 mL
pH de la muestra 4,5
Disolución reguladora AcH/AcNa 0,4 mol/L
2,5 mg disueltos en
Cantidad de PSH inmovilizada
2,5 mL de metanol
Velocidad de flujo en la etapa de
10 mL/min
extracción de la muestra
Velocidad de flujo en la etapa de
5 mL/min
recuperación del metal

Posteriormente se estudiaron los parámetros analíticos que lo caracterizan:

reutilización del disco, capacidad máxima, volumen máximo de muestra, rango dinámico de
aplicación (linealidad), límite de detección y cuantificación, y la precisión del método. Para
finalizar se estudiaron las interferencias de iones mayoritarios y minoritarios presentes en
las aguas naturales y de otros iones metálicos traza.

2.5.7.1. Reutilización y capacidad máxima del disco

La reutilización del disco es un parámetro importante en la metodología de extracción
en fase sólida que utiliza esta configuración, puesto que indica cuántas experiencias
pueden realizarse sobre un mismo disco tras ser descontaminado. El estudio de la
reutilización se llevó a cabo mediante la medida de la recuperación de cobre durante varios
ciclos. Se observó que el disco modificado con 2,5 mg de PSH podía ser utilizado al menos
20 veces, sin cambios en el porcentaje de recuperación del metal (99,8 ± 1,2%). Esto

113
Capítulo 2

indica que el disco modificado con PSH presenta una buena reutilización para usos
continuados.

Igualmente, se determinó la capacidad máxima del disco modificado con 2,5 mg de

PSH haciendo pasar a través del disco 500 mL de muestra que contenía 350g de cobre
(cantidad estequiométrica máxima de Cu que puede formar complejo con 2,5 mg de PSH),
a pH 4,5 y midiendo posteriormente por FAAS. La capacidad máxima del disco, para 3
réplicas, fue 65,6 ± 2,1 g de cobre, debido probablemente a la obturación del disco por la
elevada cantidad de complejo retenido.

2.5.7.2. Volumen máximo de muestra

Como se ha explicado anteriormente, la saliciloilhidrazona del piridoxal es un reactivo
orgánico poco soluble en agua. Su límite de solubilidad es de 0,6 g en 1 L. Si se supera
este valor, la PSH no se disuelve. Sin embargo, si se pone en contacto con una cantidad
considerable de agua, es susceptible de sufrir una disolución parcial. En el método que se
ha desarrollado es fundamental que el reactivo se encuentre retenido en el disco durante el
proceso completo de extracción. En el caso de que éste se disuelva al hacer pasar la
muestra acuosa, la recuperación de Cu(II) podría no ser cuantitativa.

Por este motivo, es de vital importancia estudiar el máximo volumen de muestra que
se puede tratar en el proceso de preconcentración por extracción en fase sólida con el
método propuesto, sin que se produzca una pérdida significativa del reactivo inmovilizado y
con ello se reduzca el rendimiento del método.

Así, se realizaron diferentes experiencias variando el volumen de muestra con las

condiciones definidas para el método propuesto. En todos los casos la cantidad de Cu(II)
permaneció constante, con un valor de 5 g, con lo que el factor de preconcentración fue
variando; únicamente se modificó el volumen total de disolución, siendo por tanto las
muestras cada vez más diluidas al incrementarse el volumen de muestra. En la Tabla 2.23
se detallan los resultados obtenidos. Puede observarse que volúmenes de muestra de 2
litros produjeron una disminución en la recuperación del metal, probablemente debido a
una pérdida de retención del reactivo y/o del complejo metálico en el disco de membrana.
Por este motivo, el volumen máximo de muestra recomendado para emplear fue de 1000
mL, dando lugar a un factor de preconcentración de 100 veces.

114
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Tabla 2.23. Influencia del volumen de muestra en la recuperación de Cu(II) (5 g)

aplicando el método de preconcentración por SPE con discos modificados con PSH
Volumen de muestra Concentración de Cu(II)
% Recuperación
(mL) (g/L)

50 100 99,4

100 50 99,8

250 20 99,9

500 10 101,7

1000 5 102,2

2000 2,5 39,5

2.5.7.3. Curva de calibrado

Uno de los parámetros que se precisan definir cuando se desarrolla un nuevo método
analítico es su rango lineal de aplicación. Para establecer el intervalo de linealidad del
método, se prepararon por duplicado diferentes muestras sintéticas a las que se les
adicionó Cu(II) a las concentraciones usuales en las que se suele encontrar este metal en
las aguas naturales: 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 g/L. Los parámetros utilizados
fueron los optimizados y detallados en la Tabla 2.22. El volumen de muestra que se
preconcentró fue en todos los casos de 500 mL.

Los resultados que se obtuvieron fueron prácticamente del 100% de recuperación,

para las muestras estudiadas en el intervalo de 1 a 60 g/L, dando una respuesta lineal
para la determinación de Cu(II). Este intervalo fue considerado muy adecuado para el
análisis de cobre en muestras de aguas naturales. El coeficiente de regresión (para n=10) y
la ecuación de regresión lineal fueron: R2=0,9982 y Absorbancia (=324,8 nm) =
0,0047[Cu(II) (g/L)] + 0,0038 (Figura 2.23).

Para muestras con concentraciones superiores (a partir de 80 g/L) la recuperación

comenzó a disminuir en un 15%, debido probablemente a la saturación del disco de
membrana. No obstante, el método resulta interesante para muestras de baja
concentración, y en caso de aplicarlo con objeto de eliminar la matriz de la muestra se
puede aplicar utilizando menor volumen de muestra, lo que impediría la saturación de la
membrana al disminuir la cantidad de metal a preconcentrar.

115
Capítulo 2

0,35

0,3

0,25
Absorbancia

0,2
y = 0,0047x + 0,0038
0,15
R2 = 0,9982
0,1

0,05

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Cu (g/L)

Figura 2.23. Recta de calibrado para concentraciones de cobre de 1 a 60 g/L aplicando

el método de separación y preconcentración propuesto por SPE con discos modificados con
PSH

2.5.7.4. Límite de detección y cuantificación

El límite de detección se calculó de acuerdo con la definición de la IUPAC [IUPAC,
1997], según la cual

L.D. = 3/m (2.9)

donde es la desviación estándar del blanco y m la pendiente de la recta de regresión

(Figura 2.23). El valor de ese límite se estimó para 5 réplicas del blanco (utilizando agua
desionizada Milli-Q sin metal), tras ser preconcentrado con el método propuesto y analizado
por FAAS. De esta forma, se obtuvo un límite de detección de 4 ng/L de Cu(II).

Igualmente, se evaluó el límite de cuantificación definido como L.C. = 10/m [IUPAC,

1997] y se obtuvo un L.C. de 14 ng/L de Cu(II).

2.5.7.5. Reproducibilidad del método

Para estudiar la reproducibilidad del método de análisis de Cu por el método de SPE
propuesto se realizaron diez análisis diferentes en las condiciones óptimas obtenidas, sobre
una muestra de agua con una concentración de metal de 40 g/L y se calculó la eficacia de
la preconcentración (%).

116
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Para calcular el valor de la distribución t se tuvo en cuenta los grados de libertad del
sistema n-1=9 (siendo n el número de experimentos realizados) y se aceptó un intervalo
de confianza del 95%. Así, para 9 grados de libertad y un intervalo de confianza del 95%,
el valor de t tabulado es 2,262.

Con estos datos se pudo calcular el valor de la precisión del método a partir de la
siguiente ecuación:

st
% error   100 (2.10)
x n

donde s es la desviación estándar de las medidas, t el valor de la distribución t tabulado,

x el valor medio de los resultados obtenidos y n el número de repeticiones.

La desviación estándar se calculó según la expresión:

Σ(x  x )2
s (2.11)
n 1

La desviación estándar relativa (RSD) se calculó de la siguiente manera:

s
RSD   100 (2.12)
x

La media de los diez experimentos fue del 99,0 % con una desviación estándar de 2,1.
A partir de estos valores, se obtuvo la precisión del método que fue del 1,5% (para un
95% de intervalo de confianza). Esta reproducibilidad obtenida en el proceso de transporte
fue muy satisfactoria, confirmando las adecuadas características analíticas del método
propuesto. Como puede comprobarse, el promedio de recuperación en estos 10
experimentos fue ligeramente inferior al obtenido en las 20 experiencias realizadas para
estudiar la reutilización del disco (99,8%). Esto puede deberse a que para el estudio de
reproducibilidad se utilizaron discos diferentes, mientras que para el estudio de
reutilización, se utilizó el mismo disco para todas las experiencias.

En las Tablas 2.24 y 2.25 se muestran los datos obtenidos para la concentración de
Cu(II) y el porcentaje de recuperación encontrado, respectivamente, incluyendo la
desviación estándar (s), desviación estándar relativa (RSD) y la precisión del método. La
concentración promedio encontrada fue de 39,6 g/L, siendo el margen de concentraciones
obtenido durante la determinación de Cu(II) de 38,8 hasta 40,4 g/L.

117
Capítulo 2

Tabla 2.24. Reproducibilidad de la concentración obtenida en el análisis de Cu mediante el

método de separación y preconcentración propuesto por SPE con discos modificados con
PSH
Parámetros Valores
Concentración de Cu(II) 38,5; 39,8; 40,5; 39,7; 38,4;
(g/L) 39,19; 39,4; 40,5; 40,9; 39,4
n 10

Grados de libertad (n-1) 9

Intervalo de confianza 95%

t 2,262

Media 39,6

s 0,8

RSD (%) 2,1

Precisión (%) 1,5

Tabla 2.25. Reproducibilidad de la recuperación obtenida en el análisis de Cu mediante el

método de separación y preconcentración propuesto por SPE con discos modificados con
PSH
Parámetros Valores
97,0; 99,5; 101,2; 99,2; 96,0;
Recuperación (%)
98,0; 98,4; 101,3; 102,2; 98,4
n 10

Grados de libertad (n-1) 9

Intervalo de confianza 95%

t 2,262

Media 99,0

s 2,1

RSD (%) 2,1

Precisión (%) 1,5

118
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

2.5.7.6. Interferencias del método de separación y preconcentración de

Cu(II) por SPE con discos modificados con PSH
Dado que se pretende aplicar el método propuesto a muestras de aguas, como agua
de mar, es importante estudiar el efecto que podrían producir los elementos presentes en
este tipo de muestras. Dichos elementos podrían influir tanto en la retención del ligando en
el disco de membrana, como en la formación y posterior elución del complejo Cu-PSH. En
aguas naturales están presentes diferentes iones mayoritarios en forma de sales, sobre
todo en el caso de muestras de agua de mar, y ciertos metales que podrían tener afinidad
con el ligando orgánico utilizado. Es por ello que se estudiaron las interferencias tanto
salinas como metálicas en la separación y preconcentración de Cu(II) por extracción en
fase sólida.

Se prepararon diferentes disoluciones conteniendo una concentración de Cu(II) de 40

g/L y se procedió a adicionar cada uno de los metales y las sales más frecuentes que
constituyen la matriz del agua de mar, por ser sus concentraciones superiores a la de las
restantes sales presentes en el resto de aguas naturales.

2.5.7.6.1. Efecto de los iones mayoritarios y minoritarios presentes en agua

de mar
Se ha evaluado la influencia de distintas sales inorgánicas en la extracción en fase
sólida de Cu con PSH. La composición cuantitativa de las sales en agua de mar puede verse
alterada en función de la localización y características de la zona; aún así, la composición
cualitativa y las relaciones de concentración pueden considerarse aproximadamente
constante. Por ello, se estudió el efecto que producen estas especies iónicas a los niveles
de concentración que se encuentran en aguas de mar de salinidad 35 g/L. En la Tabla 2.26
se detalla la naturaleza y concentración de cada una de las sales, según las indicaciones de
Grasshoff y colaboradores, en agua de mar [Grasshoff y col., 1983].

Se prepararon distintas muestras sintéticas conteniendo Cu(II) 40 g/L y una sal a la

concentración que se detalla en la Tabla 2.26. Las sales utilizadas fueron de calidad
Suprapur, excepto MgCl2·6H2O y SrCl2·6H2O por no estar comercializadas. Las demás
condiciones experimentales son las recogidas en la Tabla 2.22. El ión cobre preconcentrado
fue analizado después de la aplicación de la extracción en fase sólida por espectroscopía de
absorción atómica con llama.

Los resultados obtenidos para el estudio de estas especies interferentes se resumen en

la Tabla 2.27. Como se indica, los porcentajes de recuperación obtenidos fueron
aproximadamente del 100% y el intervalo de concentración de metal preconcentrado fue

119
Capítulo 2

de 38,7 a 41,1 g/L, quedando dentro del rango ofrecido por la precisión del método y
expuesto en el apartado anterior.

Tabla 2.26. Composición salina de las muestras utilizadas para el estudio de las
interferencias del método de SPE debidas a sales inorgánicas
Especie interferente Concentración en la
Iones en la disolución de ensayo
Sal (g/L)
disolución
Na+, Cl- NaCl 23,939
2+ -
Mg , Cl MgCl2·6H2O 10,825
Na+, SO42- Na2SO4 3,994
2+ -
Ca , Cl CaCl2·H2O 1,704
K+, Cl- KCl 0,677
Na+, HCO3-,
NaHCO3 0,196
CO32-
K+, Br- KBr 0,098
-
H2BO3 ,
H3BO3 0,027
HBO32-, BO33-
Sr2+,Cl- SrCl2·6H2O 0,024
+ -
Na , F NaF 0,003

Tabla 2.27. Eficacia de la separación y preconcentración de Cu(II) (40 g/L) por SPE en
presencia de las sales inorgánicas presentes en el agua de mar
Especie [Cu] (g/L)
% Recuperación
interferente encontrado
NaCl 39,8 99,3
MgCl2·6H2O 38,7 96,7
Na2SO4 39,8 99,6
CaCl2·H2O 40,0 100,1
KCl 39,4 98,5
NaHCO3 39,8 99,4
KBr 40,3 100,8
H3BO3 41,1 102,7
SrCl2·6H2O 39,7 99,3
NaF 40,3 100,8
120
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Por lo tanto, no se ha observado la existencia de interferencias significativas

procedentes de las sales más abundantes en agua de mar, por lo que el método puede ser
aplicado a matrices de este tipo y con concentraciones inferiores, como podrían ser agua
de río, de lago o de lluvia.

2.5.7.6.2. Efecto de la presencia de iones de metales pesados presentes en

agua de mar
Otro grupo principal de interferencias lo constituye la existencia de diversos metales en
disolución que también pueden presentar afinidad por la formación de complejo con la PSH
y que, por tanto, puedan competir con el Cu(II) en el proceso de formación del complejo
Cu(II)-PSH.

Para estudiar la influencia de estas especies interferentes, se prepararon muestras

sintéticas conteniendo 40 g/L de Cu(II) y se adicionaron diversos iones metálicos que
podrían formar complejo con el ligando PSH.

Las concentraciones de estos metales se seleccionaron de acuerdo con los niveles a los
que se encuentran presentes en el agua de mar natural. Estos niveles se recogen en la
Tabla 2.28 [Crompton, 2007].

Tabla 2.28. Concentraciones de metales (nmol/L y g/L) usuales en agua de mar

[Crompton, 2007]
Aguas costeras Aguas oceánicas
Metal
(nmol/L) (g/L) (nmol/L) (g/L)
Al(III) 237,2 - 2335 6,40 - 63,0 3,71 - 22,24 0,10 - 0,60
Fe(III) 17,91 - 4476 1,0 - 250,0 3,58 - 5766 0,20 - 320
Mn(II) 6,37 - 4551 0,35 - 250,0 0,33 0,018
Ni(II) 3,41 - 90,79 0,20 - 5,33 2,55 - 15,84 0,15 - 0,93
V(V) 0,20 - 100 0,01 - 5,1 8,83 - 39,26 0,45 - 2,00
Zn(II) 0,11 - 3059 0,007 - 200,0 0,76 - 167 0,05 - 10,9
Pb(II) 0,18 - 35,91 0,038 - 7,44 0,0002 - 43,43 4·10-5 - 9,00
Bi(III) 0,00024 - 3,25 5·10-5 - 0,68 <1,4·10-5 - 2,4·10-5 <3·10-6 - 5·10-6
Cd(II) 0,13 - 44,48 0,015 - 5,0 0,089 - 1,12 0,01 - 0,13
Co(II) <0,17 - 4,24 <0,01 - 0,25 0,051 - 2,72 0,003 - 0,16

121
Capítulo 2

En primer lugar, se eligieron aquellos metales que suelen aparecer en mayor

concentración en aguas naturales: Al(III), Fe(III), Mn(II), Ni(II), V(V) y Zn(II), que fueron
estudiados para una concentración de 100 nmol/L. Se estudió también el Pb(II) con una
concentración de 30 nmol/L, y por último, se estudiaron las interferencias de Bi(III),
Cd(II), Co(II) y Tl(I) a una concentración de 3 nmol/L, como subtrazas, pues en las aguas
no suelen encontrarse a mayores concentraciones. Las disoluciones de metal de 100, 30 y
3 nmol/L se prepararon por dilución a partir de las correspondientes disoluciones patrones
comerciales de 1000 mg/L (Merck, Alemania).

Los resultados se han detallado en la Tabla 2.29. Como puede observarse, todos los
porcentajes de recuperación se encontraron en torno al 100%, y además los valores de
concentración de Cu(II) recuperado estuvieron dentro de intervalo de precisión del método.

Puede concluirse, por tanto, que no se hallaron efectos interferentes significativos por
causa de los iones metálicos a los niveles característicos presentes en agua de mar.

Tabla 2.29. Efecto de las sustancias interferentes en el análisis de Cu(II) (40 g/L) por
SPE
Especie Concentración de la especie Cu:Metal [Cu] (g/L)
% Recuperación
interferente (nmol/L) (g/L) (g/L:g/L) encontrado

Al(III) 100 2,70 14,8 39,7 99,2

Fe(III) 100 5,58 7,2 40,6 101,1
Mn(II) 100 5,49 7,3 39,9 99,8
Ni(II) 100 5,87 6,8 39,7 99,3
V(V) 100 5,09 7,9 40,2 100,5
Zn(II) 100 6,54 6,1 39,7 99,2
Pb(II) 30 6,22 6,4 39,8 99,6
Bi(III) 3 0,63 63,5 39,7 99,2
Cd(II) 3 0,34 117,6 40,5 101,2
Co(II) 3 0,18 222,2 39,9 99,7
Tl(I) 3 0,61 65,6 39,8 99,4

122
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

2.5.8. Validación del método de Extracción en Fase Sólida

El análisis de muestras medioambientales, como aguas naturales (continentales o
marinas), presenta la dificultad de que su composición puede ser muy compleja debido a
las diversas sustancias que conforman su naturaleza. Esta matriz puede influir en la calidad
de los resultados e influir en la exactitud del método de análisis que se emplee. Para
evaluar este parámetro, se suele realizar la simulación en el laboratorio de la composición
química de los diferentes tipos de muestras acuosas procedentes de ecosistemas naturales,
aunque no resulta una tarea sencilla. Dos métodos que se suelen utilizar con frecuencia
para validar un método, consisten en la elaboración y análisis de muestras sintéticas y en el
análisis de materiales de referencia certificados. No obstante, el grado de adecuación y
similitud de las muestras artificiales con las muestras naturales es, a veces, hasta cierto
punto limitado y la elaboración no siempre es fácil. Resulta más adecuado el empleo de
materiales certificados cuyo contenido ha sido previamente validado.

El método de determinación de Cu(II) por SPE empleando PSH ha sido validado

analizando el contenido de Cu(II) total disuelto en una muestra certificada de agua de
lago: TM-DWS.2, suministrada por LGC Promochem SL (España) y en dos muestras reales
de agua de mar.

La muestra certificada es un agua preparada a partir de dilución y filtración de agua

del Lago Ontario (Canadá), y preservada con 0,2% de ácido nítrico. Presenta valores
certificados para Ag, Al, As, B, Ba, Be, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Li, Mn, Mo, Ni, Pb, Se, Sb, Sn, Sr,
Tl, Ti, U, V y Zn, siendo el valor certificado para Cu(II) de 168 g/L.

Las muestras reales de agua de mar fueron recogidas en la costa de Huelva mediante
un tubo de teflón (tubo 6429-25 de Cole-Parmer Instrument Co. Illinois U.S.A) acoplado a
una bomba peristáltica (Masterflex 7521-00, cabezal 07518-10, Cole-Parmer (EE.UU.))
siguiendo el protocolo manos limpias-manos sucias. Este protocolo requiere la colaboración
de tres personas: una de ellas debe sostener una pértiga telescópica de 4 m a la que se
sujeta el tubo de teflón, y su cometido es el de mantener el extremo de entrada de agua
en las aguas superficiales y lo más lejos posible de la embarcación para que la muestra no
se vea afectada por la contaminación emitida por el motor; las otras dos personas son las
encargadas de realizar la toma de muestra propiamente dicha.

La primera de ellas, manos sucias, debe sostener el extremo de salida del agua y
facilitar el material que va a ser utilizado en cada momento, así como realizar las
operaciones de encendido y apagado de la bomba peristáltica empleada para succionar el
agua. La otra persona, manos limpias, debe mantener el mínimo contacto con todo el
material del barco y sólo toma los recipientes en los que se va a recoger la muestra
utilizando dobles guantes de plástico en todo momento.

123
Capítulo 2

Las muestras de agua se filtraron in situ a través de filtros de membrana de 0,45

micras de tamaño de poro conectados en línea con la bomba y el recipiente recolector. El
agua se depositó en las botellas de toma de muestra, que se cerraron e introdujeron en
dos bolsas de plástico de cierre hermético. Las botellas se conservaron en neveras de
plástico refrigeradas con bloques de hielo hasta su llegada al laboratorio. Una vez allí, se
acidificaron con HNO3 (calidad Suprapur, Merck (Alemania)) hasta una concentración de 2
mL/L. Se dejaron aproximadamente dos semanas a temperatura ambiente para que el
ácido pudiera lixiviar los metales que pudieran haberse adsorbido en las paredes del
recipiente de plástico antes de ser congeladas para su conservación a -20ºC hasta su
análisis.

Previamente a la aplicación del método, las muestras de agua fueron digeridas durante
2 horas en tubos de cuarzo con un digestor de UV (Equipo Metrohm 705 UV Digester) con
la adición de 50 L de H2O2 para eliminar la interferencia de la materia orgánica que
pudiera estar complejando el metal.

En la Tabla 2.30, se recogen los resultados de concentración de Cu(II) obtenidos

mediante el método propuesto, tanto para la muestra de referencia como las de agua de
mar reales. Los resultados se compararon con el valor verdadero de concentración de
Cu(II), que en el caso de la muestra de referencia se corresponde con el valor certificado,
mientras que en las muestras reales se corresponde con el valor calculado mediante un
segundo método considerado de referencia, que fue la Voltamperometría de Redisolución
Anódica (VA Application Bulletin No. 231/2, B12916, Metrohm).

Tabla 2.30. Concentración de Cu encontrado en muestras de agua reales y certificadas

mediante el método propuesto de SPE (n=2) y por ASV (n=4) o su valor certificado
Concentración de Cu(II) encontrado por el Error Relativo
Muestra
Cu(II) (g/L) método propuesto (g/L) (%)
a
TM-DWS.2 168 ± 7,1 172,7 ± 2,3 2,8
b
Agua de mar 1 13,83 ± 0,51 13,97 ± 0,28 1,0
b
Agua de mar 2 26,11 ± 0,63 26,49 ± 0,12 1,5
a b
Valor certificado de la muestra de referencia; Cu medido por ASV

Como se puede comprobar, los errores relativos para cada una de las muestras
(calculados teniendo en cuenta la diferencia entre el valor de la medida y el valor tomado
como exacto dividido entre el valor exacto), son relativamente bajos, todos por debajo del
5%, indicándonos la fiabilidad de los resultados. De esta manera, se ha comprobado la

124
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

exactitud del método propuesto, justificándose su adecuación para su aplicación en

muestras de aguas naturales como agua de mar.

Una de las propiedades más importantes de un método analítico es que debería estar
libre de errores sistemáticos. Es decir, el valor dado para la cantidad de analito debería ser
el valor verdadero. Sin embargo, incluso si no existieran errores sistemáticos, los errores
aleatorios hacen poco probable que la cantidad medida sea exactamente igual que la
cantidad conocida. Por lo que, para decidir si la diferencia entre ambas cantidades se
puede atribuir a errores aleatorios se debe emplear algún contraste de significación.

Para validar el método propuesto mediante muestras de referencia, el contraste de

significación se realiza mediante la comparación de una media experimental con un valor
conocido [Miller, 2002].
En primer lugar se debe establecer la hipótesis nula H0 , en la que se considera que el
método analítico no está sujeto a errores sistemáticos, es decir, que no existe diferencia
significativa entre el valor observado y el conocido.

Para decidir si la diferencia entre la media experimental y el valor verdadero es

significativa, es decir, para contrastar H0 , se calcula el estadístico t:

( x  )  n
t (2.13)
s
donde x es la media muestral,  es la media de la población, s la desviación estándar
muestral y n el número de muestras.

Para la muestra de referencia, se tiene el valor certificado de cobre () y para los
análisis replicados obtenidos por el método propuesto, se tiene la media ( x ) y la
desviación estándar (s). Al sustituir estos valores en la expresión de la t de Student, se
obtiene el valor de t calculada:

(172,68  168)  2
t  2,88
2,30

Si el valor absoluto de la t calculada es mayor que un cierto valor crítico, entonces se

rechaza la hipótesis nula. El valor crítico de la t de Student para el contraste de dos colas
con un 5% de probabilidad y 1 grado de libertad está tabulado y vale t=12,706. En este
caso, se obtuvo una t calculada menor que la tabulada, por lo que se acepta la hipótesis
nula, lo que significa que no hay evidencia de error sistemático, o lo que es lo mismo la
diferencia observada no es estadísticamente significativa.

Para el caso de las muestras reales, el contraste de significación empleado para

evaluar la exactitud del método fue la comparación de dos medias experimentales [Miller,
2002], empleando los resultados obtenidos mediante el método propuesto y aquellos
125
Capítulo 2

obtenidos usando el método de referencia. En este caso, el estadístico t y la s se calculan

utilizando las siguientes expresiones (se ha considerado la condición de que las dos
desviaciones individuales no son significativamente diferentes, por lo que se puede calcular
una estimación conjunta de la desviación estándar):

( x1  x 2 ) (n1  1) s12  (n2  1) s 22

t  s2  (2.14)
1 1 (n1  n 2  2)
s 
n1 n2

En este caso se tienen dos medias muestrales y la hipótesis nula incluye la igualdad
entre las medias. El número de grados de libertad del estadístico t es igual a (n1+n2-2). En
este caso, el número de grados de libertad fue de 4, puesto que se realizaron dos análisis
de Cu(II) por el método propuesto y cuatro por el método de referencia. El valor de t
tabulado para el contraste de dos colas es de 2,776. Los valores absolutos observados para
el estadístico t fueron de 0,378 y 0,804, para cada muestra. Puesto que ambos valores son
inferiores al t tabulado se acepta la hipótesis nula y puede decirse que ambos métodos
proporcionan el mismo resultado y son significativamente iguales.

2.5.9. Comparación del método propuesto con otros descritos en la

bibliografía
El cobre es un metal traza, que se encuentra en la naturaleza ampliamente distribuido,
tanto en el suelo como en el agua, aire y biosfera. Puede presentarse bien como elemento
nativo, o integrando numerosos compuestos como óxidos o hidróxidos, sulfato de hierro y
cobre o carbonato cúprico. El interés por determinar el efecto que el cobre puede producir
sobre los procesos biológicos ha provocado una gran demanda de metodologías analíticas
que puedan proporcionar determinaciones de Cu sensibles, rápidas y precisas.

Por ello, se ha desarrollado un método de extracción en fase sólida y se ha comparado

con otros en la bibliografía que abordan el análisis de Cu en muestras de aguas naturales.
En la Tabla 2.31 se han incluido estos métodos y además se ha descrito el material soporte
seleccionado, el ligando, el límite de detección, el factor de preconcentración, el rango de
aplicación y las muestras a las que se ha aplicado el método. La mayoría de estos métodos
fueron aplicados a muestras no salinas (agua de río, mineral, de manantial, de grifo o
aguas de lluvia).

126
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

Tabla 2.31. Métodos descritos por la bibliografía para la determinación de Cobre mediante
extracción en fase sólida con discos de membrana en muestras de aguas
Factor de
Soporte L.D. Aplicación
Ligando preconcen- Rango
sólido (g/L) [Ref]
tración

5-Ter-butil-2-
hidroxibenzalde- 0,25 400 2,5 -2847,2 g/L
hido oxima Agua de grifo,
agua de
Disco C18 manantial y agua
de mar [Dindar,
3,5- di-ter-butil- 2010]
2-hidroxibenzal- 0,29 400 2,5 – 3825 g/L
dehido oxima

Bis(5-bromo-2- Nieve, agua de

hidroxibenzal- grifo y agua
Disco C18 0,0024 400 0,1 – 80 g/L
dehido)-1,2- mineral
propanodiimina [Fathi, 2009]
Muestras de agua
Aza-tioéter
Disco C18 0,08 200 sintéticas
corona
[Moghimi, 2009]
Agua de río,
bis-(3-metoxi
orina, sangre,
salicilaldehído)-
Disco C18 0,03 100 1- 150 g/L suero y aleaciones
1,6-
[Mashhadizadeh,
diaminohexano
2008b]
Agua de grifo,
N,N'- nieve, agua de
Disco C18 disalicilidenoeti- 0,005 500 lluvia y agua de
lenodiamina mar
[Moguimi, 2007a]
Agua de grifo,
nieve, agua de
1,5-
Disco C18 0,005 400 lluvia y agua de
difenilcarbazida
mar
[Moguimi, 2007b]
4-(4-cloro-
fenilazo)-2- Agua natural
Disco C18 [(4-hidroxi- 0,20 1-80g/L [Mashhadizadeh,
fenilamino) 2006]
metil]fenol
3,6,9,14- Muestras de agua,
tetratiabiciclo minerales y
Disco C18 [9.2.1] 5 productos
tetradeca-11,13- metalúrgicos
dieno [Mollaei, 2005]

127
Capítulo 2

Tabla 2.31 (cont.). Métodos descritos por la bibliografía para la determinación de Cobre
mediante extracción en fase sólida con discos de membrana en muestras de aguas
Factor de
Soporte L.D. Aplicación
Ligando preconcen- Rango
sólido (g/L) [Ref]
tración
1-hidroxi-2-(prop-
2′-enil)-4-(prop-2′ Agua sintética
Disco C18 0,1 400
-enioxil)-9,10- [Shamsipur, 2004]
antraquinona
bis(2- Agua de grifo, aguas
Disco C18 hidroxifenilamino) 0,004 100 de desecho
glioxima [Ghiasvand, 2004]
3-{2-[2-(2-
300 para
hidroxiimino-1-
todas las Agua de grifo, nieve,
metil-
muestras río, manantial,
Disco C18 propilidenamino)- 0,17
excepto mineral y agua de
etilamino]-
200 para mar [Dalman, 2003]
etilimino}-butan-2-
agua de mar
ona oxima
Agua sintética, de río
bis-2-tiofenol
Disco C18 0,02 500 y agua de desecho
propandiamina
[Ganjali, 2003]
1, 8-bis
Aguas de desecho
Disco C18 (salicilaldiminato) - 0,2
[Ganjali, 2002a]
3, 6-dioxaoctano
N,N′-
Disco C18 bis(salicilideno) 0,04 [Ganjali, 2002b]
etilendiamina
Agua sintética, de
11-hidroxinaftace- grifo, manantial y de
Disco C18 0,2 400
no-5,12-quinona río
[Shamsipur, 2001]
(2,2’-[1,2-
etanodiilo Agua de grifo, nieve,
Disco C18 bis(nitriloetilidi- 0,004 500 lluvia y agua de mar
no)] [Shamsipur, 2000]
bis(1-naftaleno)
Agua sintética y agua
Disco Piridoxal
0,004 100 1-60 g/L de mar
SDB saliciloilhidrazona
[Este trabajo]

Como puede verse, el compuesto PSH presenta para la determinación de Cu(II) por
SPE un límite de detección de 0,004 g/L que es inferior a la de los otros métodos
propuestos en la bibliografía cuando se aplican a muestras de agua de mar. Además
presenta muy buena selectividad, exactitud y reproducibilidad. El método está libre de

128
 Análisis por SPE del contenido de Cu en aguas naturales

interferencias de matriz salinas y de otros metales traza a los niveles usuales presentes en
agua de mar, con lo que puede utilizarse para medir trazas de cobre en agua de mar.

2.6. Conclusiones

Se ha desarrollado en este capítulo un método simple y rápido de Extracción en Fase

Sólida para la preconcentración y el análisis de trazas de cobre en muestras de agua de
mar, utilizando para ello discos de SDB de 47 mm y el reactivo piridoxal saliciloilhidrazona
(PSH).

Como perspectiva de futuro, se comenzará a desarrollar un nuevo sensor químico de

fibra óptica basado en la Extracción en Fase Sólida Colorimétrica, para el análisis de Cu(II)
en muestras de agua real, utilizando de nuevo el reactivo orgánico PSH. De esta forma la
detección será más rápida, disminuirá la manipulación de la muestra y se evitará el uso del
eluyente para realizar posteriormente el análisis, por lo que esta modificación ofrecerá
grandes ventajas en la detección, complementando las ventajas de la preconcentración.

129
 
 
 
 
 
 
 
 

Capítulo 3
Estudio de especiación de plomo en agua de mar
mediante AGNES y SSCP
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Estudio de especiación de plomo en agua

de mar mediante AGNES y SSCP

En el presente capítulo se estudia la aplicabilidad de las técnicas de Redisolución en

Ausencia de Gradiente y en Equilibrio Nernstiano (AGNES), así como la
Cronopotenciometría de Redisolución de Barrido (SSCP) para evaluar la especiación de
Pb(II) en muestras de agua de mar, determinando la concentración de metal libre en el
seno de la disolución y su constante de estabilidad en el sistema. La primera técnica servirá
para medir la concentración de metal libre (más disponible) y la segunda servirá para el
estudio de la especiación dinámica, permitiendo además la evaluación del carácter
heterogéneo de los ligandos presentes en las muestras. Las concentraciones libres de metal
en diversas muestras se compararán con los valores teóricos que pueden obtenerse
mediante simulación de especiación química utilizando el software MINTEQ.

3.1. El plomo en la naturaleza

El plomo se encuentra de forma natural en la corteza terrestre a concentraciones

aproximadas de 15-20 mg/kg [Abadin y Pohl, 2010]. Es el metal tóxico más extendido y es
destacable su presencia en casi todos los compartimentos ambientales. Aunque hay más de
200 minerales de plomo, los más importantes son la galena (PbS), la cerusita (PbCO3), la
crocoita (PbCrO4) y la piromorfita (Pb5(PO4)3Cl). Las principales causas naturales de

133
Capítulo 3

movilización de plomo desde la corteza terrestre a los ecosistemas acuáticos la constituyen

las erupciones volcánicas y la meteorización de las rocas. Una vez allí, los compuestos
insolubles de plomo se adsorben en los sedimentos o bien se adhieren en las partículas en
suspensión (especialmente partículas de arcilla), funcionando éstas como secuestrante de
compuestos de plomo.

En las aguas naturales, el plomo suele estar a nivel de trazas. La concentración de

plomo en aguas superficiales de mar abierto se encuentra en el rango 0,000041 – 9 g/L,
mientras que en aguas superficiales costeras, bahías y estuarios puede oscilar entre 0,038
– 7,44 g/L [Crompton, 2007]. Para este metal, por ejemplo, se conocen las vías de
ingreso y las cantidades globales que acceden al Mar del Norte [Crompton, 2007]:

- Ríos: 2554 toneladas al año.

- Atmósfera: 2920 toneladas al año.

- Vertidos directos: 150 toneladas al año.

- Dragados: 3440 toneladas al año.

Asimismo, también se han publicado los valores de transferencia de plomo desde la

atmósfera a las aguas superficiales marinas correspondientes al Mar del Norte, Mar
Mediterráneo, Atlántico Sur y Pacífico Norte, siendo respectivamente: 2650, 1050, 660 y 7
ng/cm2/año [Díaz Mayans y col., 1993]. Las posibles diferencias entre las distintas zonas
pueden deberse a la actividad industrial y urbana.

Por sus propiedades físicas y químicas se aplica en las industrias de la fabricación, de la

construcción y química. Se ha empleado con diferentes fines, entre otros se pueden
destacar: baterias, aditivos de la gasolina, aleaciones, munición, producción de plásticos,
cerámicas, pigmentos y pinturas. La exposición al Pb se suele producir a través del agua
potable, del alimento, del aire, del suelo y del polvo procedente de viejas pinturas que
contienen plomo [Kasuba y col., 2010].

El envenenamiento subletal por Pb en vertebrados se caracteriza por la aparición de

defectos neurológicos, disfunción del riñón y anemia, bloqueando la transmisión del
impulso nervioso y la liberación de la acetilcolina. La anemia se produce como resultado de
dos efectos básicos: la disminución de la longevidad de los glóbulos rojos y la inhibición de
numerosas enzimas que intervienen en la síntesis de hemoglobina. También provoca la
inhibición del metabolismo de los nucleótidos de pirimidina, que causa una acumulación de
Pb en los glóbulos rojos. Además, induce inhibición en la síntesis de proteínas. Se han
descrito efectos sobre diversas enzimas, como la disminución de la actividad de la ATPasa a
nivel de la membrana de los hematíes, riñón e hígado y se ha reseñado un marcado
aumento de enzimas en el suero acompañando a lesiones hepáticas. Cabe destacar la gran
afinidad del plomo por las mitocondrias, donde inhibe la fosforilación oxidativa. Además de
134
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

los efectos que produce en los sistemas cardiovascular, renal y reproductivo, también se ha
descubierto su efecto genotóxico [Ferrer, 2003; García-Lestón, 2012].

Se han señalado distintos efectos del plomo en los organismos de ecosistemas de agua
dulce. Los peces presentan ennegrecimiento de las aletas y curvatura espinal; ambos
procesos normalmente son reversibles, excepto en casos muy agudos. También se ha
podido demostrar que los efectos tóxicos que produce en estos organismos son menos
frecuentes cuando aumenta la dureza del agua. El grupo más sensible de los invertebrados
de agua dulce son los crustáceos, aunque en este tipo de organismos no se ha podido
demostrar la dependencia de su toxicidad con la dureza del agua. En ecosistemas marinos
los datos son confusos debido a la relativa insolubilidad de los compuestos de plomo; esto
ha dado lugar a la descripción de efectos adversos muy variados y en algunos casos
opuestos, pero se conoce que las especies marinas son más resistentes que las que viven
en medios dulceacuícolas [Crompton, 2007].

En humanos, el riesgo principal ante una exposición al Pb se centra en su efecto sobre

el sistema nervioso. El plomo es un potente agente neurotóxico. El feto y el niño, en
comparación con los adultos, son más vulnerables a esta exposición, ya que la barrera
hematoencefálica que protege al cerebro adulto de la exposición a sustancias tóxicas no
está totalmente formada hasta 6 meses después del nacimiento [Llop y col., 2012]. Los
efectos sobre el sistema nervioso central se manifiestan como encefalopatías por
exposición crónica o subcrónica, siendo los síntomas principales torpeza, irritabilidad, dolor
de cabeza, temblor muscular, trastornos del movimiento y pérdida de memoria. Igualmente
pueden darse trastornos sensoriales como el aumento de la sensación de dolor, calor, frío,
etc. En casos extremos puede llegarse al coma y sobrevenir la muerte. Además, se han
asociado diversos trastornos renales con la intoxicación por plomo; las células del túbulo
proximal del riñón son las más afectadas y se produce una alteración de la reabsorción de
glucosa, aminoácidos y fosfato [Ferrer, 2003].

La U.E. estableció en 2001 (Reglamento (CE) Nº 466/2001, sobre el contenido máximo

de determinados contaminantes en los productos alimenticios) que la absorción de plomo
puede constituir un grave riesgo para la salud pública, pudiendo provocar un retraso del
desarrollo mental e intelectual de los niños y causar hipertensión y enfermedades
cardiovasculares en los adultos. El plomo puede incorporarse al organismo por inhalación
de polvos o por consumo de alimentos que contienen plomo o, en el caso de los vegetales,
a través de sales de plomo solubles contenidas en el suelo. Si bien la inhalación es la vía de
entrada más importante para las personas expuestas en razón de su profesión, la mayoría
de la población lo incorpora al organismo a través de la ingesta y absorción en el tracto
gastrointestinal. En la actualidad, la ingestión de plomo con la comida y el agua es la
principal vía de exposición en la población general adulta [World Health Organization,
2007]. Como consecuencia del conocimiento de estos riesgos, los contenidos de Pb de los
135
Capítulo 3

productos alimenticios se han reducido sensiblemente en los últimos años, ya que ha

aumentado la sensibilización ante el problema sanitario que puede representar este
elemento. De hecho, las concentraciones de plomo detectadas en recientes estudios
españoles son bajas en todos los grupos de alimentos analizados, por lo que el contenido
medio de plomo en los productos alimenticios no parece ser causa de alarma [Martorell y
col., 2011].

La ingesta de plomo a través del consumo de agua potable puede llegar a ser
importante [Deshommes y col., 2010]. Este metal ha sido un constituyente muy utilizado
en la soldadura y algunas formulaciones utilizadas para la unión de cañerías, por lo que el
agua doméstica de hecho tiene algún contacto con el plomo (junto con cinc, cadmio y
cobre). Actualmente, el plomo probablemente no sea ya un problema importante en el
suministro de agua potable, puesto que ya se han sustituido la mayoría de las cañerías de
plomo por PVC. Aún así, existe peligro potencial en los casos donde todavía estén en uso
cañerías antiguas de plomo.

Una medida interesante adoptada por el Gobierno Español, en relación con la

contaminación por este metal y consciente de la importancia de preservar el medio
ambiente, fue el adelanto de la fecha de prohibición de comercialización de gasolinas con
plomo en todo el territorio nacional, fijada mediante el Real Decreto 403/2000, de 24 de
marzo, para el día 1 de Enero de 2002, al día 1 de Agosto de 2001, por el Real Decreto
785/2001, de 6 de Julio de 2001. Las gasolinas de sustitución pasaron a estar formadas por
una mezcla de hidrocarburos de origen mineral y de compuestos oxigenados orgánicos, con
las características adecuadas para ser utilizadas en los vehículos que anteriormente venían
necesitando gasolina con plomo. Desde entonces, se ha demostrado que la concentración
de plomo, tanto en el aire como en sangre de la población infantil española, ha ido
disminuyendo notablemente gracias a las medidas legislativas que han regulado la cantidad
máxima de plomo en la gasolina, desde 1987 hasta su prohibición total en agosto de 2001.
Puede decirse, por tanto, que desde el punto de vista de la salud pública, la prohibición del
uso de gasolina con plomo fue una acción que aumentó la protección de la salud de la
población española [Llop y col., 2012].

Otras medidas similares también fueron adoptadas en otras naciones, como en Estados
Unidos, donde la legislación estableció un límite máximo de plomo en gasolinas y se inició
un programa de eliminación de compuestos de este metal en las gasolinas comercializadas.
Como consecuencia, los concentraciones atmosféricas de plomo disminuyeron en un 89%
entre los años 1980 y 2010 [U.S. EPA, 2010; Cho y col., 2011].

136
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

3.2. Técnicas electroanalíticas aplicadas al análisis y especiación de metales

pesados

La especiación de metales determina en gran medida el comportamiento y la toxicidad

de los metales en el medio ambiente. La especiación hace referencia a la presencia de un
metal en varias formas químicas. Estas formas pueden incluir iones metálicos libres,
complejos metálicos disueltos y adsorbidos sobre superficies sólidas, y especies metálicas
coprecipitadas. La especiación de un metal no solo afecta a su toxicidad, sino también a su
volatilización, fotólisis, absorción, deposición atmosférica, equilibrios ácido-base,
polimerización, formación de complejos, reacciones de transferencia de electrones,
solubilidad y equilibrios de precipitación, las transformaciones microbianas, y la difusión
[Fairbrother y col., 2007].

Los parámetros que se utilizan para predecir la reactividad y el comportamiento de los

metales pesados en la naturaleza son: la concentración total, la distribución de sus
especies químicas, las propiedades de dichas especies y las de aquellos componentes
presentes en la naturaleza que son capaces de reaccionar con el metal. La distribución,
movilidad, toxicidad, bioacumulación y biodegradabilidad de los elementos depende no solo
de su concentración, sino también de la forma química en la que éstos se encuentran
[Ferreira Domingos, 2006].

Es por ello que la especiación es un factor importante que debe ser considerado a la
hora de evaluar el comportamiento y la biodisponibilidad de los metales pesados en
sistemas ambientales. Como se ha indicado en el capítulo de Introducción, la especie
química ha sido definida por la IUPAC como la forma específica de un elemento
considerada como su composición isotópica, su estado electrónico o de oxidación y/o su
estructura compleja o molecular [Templeton y col., 2000]. La clave para comprender el
efecto de estos elementos en la biota radica en esta especiación metálica. En este sentido,
desde un punto de vista medioambiental, la investigación en especiación metálica está
actualmente enfocada hacia dos objetivos: por un lado, establecer las especies metálicas
potencialmente peligrosas y por otro, dilucidar los mecanismos de biotransformación de los
metales como función de sus diferentes formas químicas.

La especiación, dentro de un contexto químico, indica la distribución de un elemento

en sus diferentes especies químicas. Esta distinción es muy importante ya que puede
afectar en gran medida a la reactividad química y biológica.

Los sistemas acuáticos naturales están sujetos a condiciones variables, por lo que en la
mayoría de los casos, no se encuentran en equilibrio químico. En estos sistemas, el carácter
tóxico de un metal no sólo depende de su equilibrio de distribución entre los numerosos
complejos metálicos que se pueden formar, sino también de la labilidad de esas especies,
137
Capítulo 3

es decir, de las constantes de velocidad de complejación y los coeficientes de difusión del

metal, del ligando y de los complejos en las diferentes fases de los ecosistemas acuáticos
[Buffle y col., 2007].

El conocimiento de estos factores dinámicos es fundamental para establecer de

manera rigurosa y cuantitativa la relación que existe entre la especiación de un ión
metálico y su biodisponibilidad e ingestión en los organismos acuáticos. Para realizar una
interpretación correcta del impacto medioambiental que pueden producir los complejos
metálicos en los sistemas acuáticos, debe considerarse la importancia de la reactividad y
los flujos de cada una de las especies presentes, así como su intercambio entre los
compartimentos y la biota a través de procesos de interfase, y las escalas temporales de
dichos procesos. Es por ello que el análisis mediante técnicas de especiación dinámica es
necesario para entender las propiedades de no-equilibrio de estos sistemas. Así, el análisis
por especiación dinámica no solo se basa en el estudio de la distribución de las especies en
equilibrio, sino también de las características cinéticas de interconversión entre dichas
especies. De esta forma, tanto las propiedades cinéticas como termodinámicas de cada una
de las especies influyen en la señal analítica de las técnicas dinámicas [van Leeuwen y col.,
2005].

Las técnicas de especiación dinámica intentan reproducir los procesos que ocurren en
un sistema acuático. En el caso de las técnicas electroquímicas, muy utilizadas en este tipo
de análisis, se hace uso de un electrodo de trabajo, el cual presenta una interfase entre su
superficie y la disolución, simulando el comportamiento de la membrana celular de los
organismos, a través de la cual se produce el transporte de metal desde el agua hacia el
interior de los mismos. En la Figura 3.1 se muestra una representación esquemática del
papel que juega la especiación dinámica en un medio con un organismo que ingiere metal.
Pueden observarse claramente las similitudes que presenta con lo que ocurre en la
interfase del electrodo de trabajo.

Dentro del contexto de la especiación dinámica, el flujo total que se crea en la

interfase, puede dividirse en un flujo de difusión (que depende del transporte de masa) y
un flujo cinético (que depende de la velocidad de asociación/disociación de las especies).
Así, se pueden describir dos condiciones extremas [Mota y col., 2012]:

(a) Sistemas estáticos, en los que los complejos no tienen tiempo de disociarse o asociarse
en la capa de difusión que se crea entre el electrodo y el seno de la disolución, debido
a que la cinética de estos sistemas es muy lenta. En este caso, estas especies no
contribuyen a la señal analítica, por lo que se consideran complejos inertes. En
presencia de este tipo de complejos, la señal analítica estará relacionada directamente
con el metal libre de la disolución.

138
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

(b) Sistemas dinámicos, en los que la velocidad de disociación o asociación del complejo es
suficientemente alta como para que el proceso se produzca dentro de la escala de
tiempo de medida de la técnica. En este caso, son posibles dos situaciones:

- Complejos lábiles: el flujo cinético es mucho mayor que el de difusión, por lo que
el metal libre estará en equilibrio con su forma complejada a lo largo de toda la
capa de difusión hasta la superficie del electrodo, y la concentración total de metal
contribuirá a la señal. Este sistema estaría controlado por el flujo de difusión.

- Complejos no lábiles: los flujos cinéticos y de difusión son del mismo orden de
magnitud. La señal medida vendrá influenciada por las características cinéticas
(control cinético).

Organismo

DML
ML ML

kd ka K
DM
M M
+ +

L L

Capa de difusión Medio acuático

Figura 3.1. Representación esquemática de la especiación dinámica en un medio con un

con un organismo que ingiere metal (M: metal libre, ML: complejo metálico, D: coeficiente
de difusión, ka: constante de velocidad de asociación, kd: constante de velocidad de
disociación, K: constante de estabilidad del complejo)

Por todo lo anteriormente mencionado, es necesario realizar un análisis detallado de la

especiación dinámica para un mejor conocimiento de los sistemas naturales estudiados.

139
Capítulo 3

La dificultad de la realización de la especiación sobre muestras acuáticas

medioambientales radica en las laboriosas y complicadas etapas que todo muestreo
necesita: un adecuado sistema de recogida de muestras, estabilización de las diferentes
formas químicas del metal durante el muestreo, traslado al laboratorio, conservación (si es
posible) y protocolo de análisis. A pesar de esto, se han empleado con éxito diversas
técnicas analíticas espectroscópicas para la determinación de la especiación, relacionada
principalmente con distintas formas químicas de Hg, As, Mn y Cr [Jia y col., 2011; Boyaci y
col., 2011; Citak y col., 2010; Duran y col., 2011]. Sin embargo, este tipo de técnicas
espectroscópicas tienen el inconveniente de que solo pueden utilizarse para el análisis de
especiación si están acopladas a técnicas de separación [Pesavento y col., 2009]. Por el
contrario, las técnicas electroquímicas, poco empleadas hasta el momento, tienen un gran
potencial para el estudio directo de la especiación en muestras medioambientales. Estas
técnicas se basan en la medida de señales eléctricas asociadas con las propiedades
moleculares o los procesos en las interfases de las especies químicas. La transformación
directa de la información química deseada (concentración o actividad) en una señal
eléctrica hace que estos métodos sean sencillos y baratos. Dentro de las técnicas
electroquímicas, las de redisolución juegan un papel muy importante en los estudios la
especiación dinámica. Estas últimas consisten en una acumulación del analito sobre la
superficie de un electrodo de trabajo y en una subsiguiente redisolución del mismo
mediante una técnica voltamperométrica, potenciométrica o coulombimétrica [Lovric,
2010].

3.2.1. Voltamperometría de redisolución

Entre las técnicas electroquímicas más empleadas en los análisis de especiación de
metales traza se encuentra la Voltamperometría de redisolución. Las técnicas
voltamperométricas de redisolución están basadas en la preconcentración del analito
presente en una disolución en la superficie de un electrodo y su posterior redisolución. Si
las condiciones experimentales se mantienen constantes durante la etapa de
preconcentración, a partir de los calibrados adecuados, la respuesta voltamperométrica
(por ejemplo, intensidad de corriente (I) que circula entre un electrodo de trabajo y un
electrodo auxiliar, debido a la reducción o la oxidación de una especie en función del
potencial aplicado (E) en el electrodo de trabajo) puede emplearse para determinar la
concentración en disolución de la especie preconcentrada. La mayor ventaja de esta
técnica radica precisamente en dicha preconcentración sobre el electrodo, con factores que
oscilan entre 100 y más de 1000, lo que hace que la voltamperometría de redisolución sea
especialmente adecuada para el análisis de trazas, consiguiéndose límites de detección de
hasta 10-10-10-11 mol/L [Pingarrón Carrazón y Sánchez Batanero, 2003; Lovric, 2010].

140
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

La voltamperometría de redisolución se caracteriza por la combinación de tres etapas

durante el proceso de análisis:

- Etapa de preconcentración o deposición: el analito disuelto en la muestra se acumula

en la superficie o en el interior del electrodo de trabajo mediante un proceso de oxidación,
reducción o adsorción. Durante esta etapa, la disolución se agita para garantizar la difusión
del analito hasta las proximidades del electrodo, y se aplica un determinado potencial
conocido como potencial de preconcentración o deposición, cuyo valor depende del
potencial redox del analito y del procedimiento de deposición del mismo. En este paso de
electrodeposición, la cantidad de metal preconcentrado depende de su concentración en
disolución y de las condiciones electroquímicas e hidrodinámicas del sistema, que han de
mantenerse constantes con el fin de asegurar la reproducibilidad de las medidas. En este
paso, la deposición se ve facilitada por un transporte convectivo de los iones hacia la
superficie del electrodo como resultado de la agitación, un transporte por migración bajo la
influencia de un campo eléctrico y un transporte por difusión, debido a diferencias de
concentración en la interfase entre la superficie del electrodo y el seno de la disolución

- Etapa de reposo: durante la etapa de deposición, la concentración de analito en el

electrodo presenta una distribución parabólica, aumentando en dirección hacia el electrodo.
La etapa de redisolución requiere una distribución inicial uniforme de la concentración en el
electrodo. Por ello, tras la etapa de electrodeposición normalmente se detiene la agitación,
con lo que el transporte solo se ve influenciado por la difusión, permitiendo alcanzar
rápidamente una distribución uniforme. Esta etapa de reposo dura generalmente unos 10 o
15 s.

- Etapa de redisolución: en esta etapa, se aplica un barrido de potencial entre los

electrodos de tal manera que el analito es sometido a un proceso de oxidación o reducción
que le devuelve hasta una forma química que favorezca su redisolución hacia el seno de la
disolución. En ese momento se registra la intensidad de corriente, que será proporcional a
la concentración del analito en la disolución de la muestra, frente al potencial aplicado,
dando lugar a un voltamperograma. Sin embargo, en ciertos casos esta etapa no implica
necesariamente la redisolución del analito hacia el seno de la disolución como consecuencia
del proceso de oxidación/reducción, pudiendo quedar éste retenido en la superficie o bien
incorporado en el interior del electrodo si se trabaja con electrodo de gota colgante de
mercurio (HMDE) mediante la formación de una amalgama, aunque se incluyen dentro de
este grupo de técnicas y se mantiene el nombre de redisolución.

Para la cuantificación de la concentración de analito suele emplearse el método de las

adiciones patrón en lugar de la típica curva de calibración directa, ya que la sensibilidad de
los métodos de redisolución puede variar en función de la composición de la matriz de la
disolución, lo que resulta especialmente importante en matrices de diferente salinidad (ej.

141
Capítulo 3

agua de estuario, agua de río, agua de mar,…). Así, realizando adiciones sobre la muestra,
se garantiza la realización de todas las medidas en similares condiciones.

Las técnicas de voltamperometría más ampliamente utilizadas en el análisis de

especiación dinámica de trazas metálicas son la Voltamperometría de Redisolución Anódica
(ASV) y la Voltamperometría de Redisolución Catódica Adsortiva por Competición de
Ligando (CL-AdCSV) [Mota y col., 2010]. A continuación se detallará cada una de estas dos
técnicas, teniendo en cuenta que para el entendimiento correcto de la CL-AdCSV es
necesario explicar previamente las características básicas de otras dos técnicas, como son
la Voltamperometría de Redisolución Catódica (CSV) y la Voltamperometría de Redisolución
Catódica Adsortiva (AdCSV).
-Voltamperometría de Redisolución Anódica: en esta técnica se determinan iones
metálicos mediante una electrodeposición catódica previa (aplicando un potencial más
negativo que el potencial de reducción de los iones metálicos), de tal forma que se produce
una reducción del analito (Mn+) hacia su forma metálica (M) y su deposición en el
electrodo. Posteriormente, se aplica una redisolución anódica mediante un barrido de
potencial hacia valores más positivos, de manera que se consigue una oxidación del metal
cuando el potencial alcance el valor de potencial del par redox correspondiente. La máxima
sensibilidad de esta técnica se consigue con electrodos de película, aunque suelen ser poco
reproducibles [Vyskocil y Barek, 2009; Mota y col., 2012].

La técnica de ASV se ha utilizado durante más de 30 años en la determinación de

metales traza en aguas. Esta técnica puede medir la concentración de metal total en la
muestra previa acidificación y digestión por UV de la misma [Buffle y Tercier-Waeber,
2005].

En el caso de que no se lleve a cabo un pretratamiento de la muestra, la técnica ASV

mide las concentraciones de equilibrio de los iones metálicos libres, así como aquéllos que
resultan de la disociación de complejos lábiles en la capa de difusión durante el tiempo que
dura el análisis [Pesavento y col., 2009].

Además, esta técnica no perturba la distribución de las especies por lo que puede
identificar y cuantificar cada una de las especies en función de su potencial de reducción.
La alta sensibilidad de esta técnica permite la detección de numerosos elementos traza
frecuentes en la naturaleza y con interés medioambiental, como por ejemplo Cu, Pb, Cd o
Zn (en agua de mar muchas especies de interés aparecen a concentraciones de 10-9 mol/L,
que pueden ser analizadas por ASV).

Sin embargo, ASV presenta ciertos inconvenientes a la hora de estudiar los parámetros
de complejación de ciertos sistemas: las medidas y la interpretación de los datos son
sensibles a la cinética de disociación de los iones metálicos complejados, a las condiciones
hidrodinámicas (que dependen de la velocidad de agitación), a la heterogeneidad de los
142
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

complejos presentes en la muestra, a los coeficientes de difusión de los complejos si

existen macromoléculas (como, por ejemplo, materia orgánica coloidal), a la concentración
de ligando y efectos de superficie (como la ausencia de exceso de ligando en la superficie
del electrodo durante la etapa de redisolución) y a la adsorción de materia orgánica sobre
el electrodo [Mota y col., 2012].

Aún así, la ASV ha sido ampliamente utilizada en el análisis de especiación de metales

traza en muestras medioambientales. En la Tabla 3.1 se recogen algunas aplicaciones
típicas más recientes de la voltamperometría de redisolución anódica utilizando diversos
tipos de electrodos.

Tabla 3.1. Aplicaciones recientes del análisis por voltamperometría de redisolución anódica
a la especiación metálica en aguas
Metales Tipo de muestra Electrodo de trabajo Referencias

Zn(II) Agua de mar Electrodo rotatorio de carbono vitrificado Jakuba y col., 2008

Cu(II) Agua de estuario Electrodo de gota estática de mercurio Louis y col., 2009
Omanovic y col.,
Cu(II) Agua de estuario Electrodo de gota estática de mercurio
2010
Pb(II) Magnier y col.,
Agua de río Electrodo de gota colgante de mercurio
Zn(II) 2011
Cu(II)
Durán y Nieto,
Pb(II) Agua de estuario Electrodo de gota colgante de mercurio
2011
Zn(II)
Cd(II) de Souza y col.,
Agua de estuario Microelectrodo de película de bismuto
Zn(II) 2011
Cd(II)
Electrodo rotatorio de película fina de Annibaldi y col.,
Cu(II) Agua de mar
mercurio 2011
Pb(II)
As(III)
Agua de estuario Electrodo rotatorio de oro Balzer y col., 2012
As(V)
Cu(II) Tonietto y Grassi,
Agua de embalse Electrodo de gota colgante de mercurio
Zn(II) 2012
Cd(II)
Cu(II) Agua de drenaje Electrodo de carbono vitrificado con
Jung y col., 2012
Pb(II) ácido de mina película fina de mercurio
Zn(II)

- Voltamperometría de Redisolución Catódica (CSV): esta modalidad es utilizada para la

determinación de especies inorgánicas y orgánicas susceptibles de formar compuestos poco
solubles con los iones procedentes de la oxidación del electrodo. Así, aplicando un potencial

143
Capítulo 3

ligeramente positivo al electrodo de trabajo (suficiente para que se produzca dicha

oxidación del material electródico) en presencia de una de estas especies, se forma una
fina película de sal poco soluble en la superficie de dicho electrodo. Tras la etapa de
preconcentración, la película depositada es redisuelta mediante un barrido catódico de
potencial, midiendo la señal electroquímica. En este caso, la mayor sensibilidad se alcanza
usando electrodos de gran superficie, como el de gota colgante de mercurio (HMDE),
donde se puede depositar una gran cantidad del compuesto poco soluble. La aplicabilidad
de la CSV es mucho más limitada y se usa para compuestos que formen sales o complejos
de mercurio insolubles [Pingarrón Carrazón y Sánchez Batanero, 2003].

- Voltamperometría de Redisolución Catódica Adsortiva (AdCSV): esta técnica se basa

en una etapa de preconcentración adsortiva no electrolítica. Así, el analito se deposita en el
electrodo de trabajo mediante un mecanismo de adsorción. Posteriormente, el analito
preconcentrado puede cuantificarse empleando un programa de potencial apropiado que
permita la reducción del mismo. En este tipo de técnicas se suele utilizar un ligando
orgánico que forme complejo con el metal que se va a analizar. En la primera etapa, y
mediante agitación, se forma el complejo metálico, el cual se preconcentrará en el
electrodo. En la etapa de redisolución, lo más frecuente es que el complejo se rompa al
reducirse el metal, permitiendo que el ligando pase de nuevo a la disolución. El metal
reducido queda retenido bien en la superficie del electrodo o en sus proximidades, según el
metal en cuestión. En otros casos, puede ocurrir que la especie que se reduce es el
ligando, y el metal quede en su estado oxidado. Este método se considera complementario
a la ASV puesto que es adecuado para analizar metales que no son acumulables en
superficies electródicas por medio de una electrolisis. AdCSV es una técnica muy sensible y
frecuentemente utilizada, sin embargo su uso en análisis medioambiental es un poco
limitado ya que es menos robusta y más propensa a sufrir interferencias producidas por
compuestos presentes en las matrices medioambientales. Por ello, debería ser utilizada
para el análisis de muestras relativamente limpias (como agua potable) o bien, muestras
que previamente hayan sido sometidas a un proceso de limpieza o separación [Vyskocil y
Barek, 2009].

- Voltamperometría de Redisolución Catódica Adsortiva por competición entre ligandos

(CL-AdCSV): los estudios de especiación mediante AdCSV suelen aplicarse de forma más
eficiente si se combinan con el método de competición entre ligandos (CL), en el cual se
añade a la muestra un ligando L, no presente originalmente en la misma, que forme un
complejo muy estable con el metal a estudiar y que sea cuantificable mediante AdCSV, el
cual competirá con los ligandos naturales por la formación de complejos metálicos [Millar y
Bruland, 1997; Monticelli y col., 2010]. La medida se hace cuando se ha establecido el
equilibrio competitivo entre el ligando L adicionado y el complejo orgánico natural ML:

ML orgánico natural  L adicionado  ML adicionado  L orgánico natural

144
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Finalmente, el complejo formado (MLadicionado) se mide por voltamperometría de

redisolución adsortiva.

Las condiciones de competición [Van den Berg y Donat, 1992] deben ser
cuidadosamente controladas mediante la elección de un ligando apropiado (cuya constante
de estabilidad condicional sea conocida para el metal a investigar) y la adición de la
concentración adecuada.

La competición de ligandos no solo sirve para precisar las fracciones lábiles de metales
pesados a nivel de trazas, sino también para establecer la concentración de ligandos
complejantes naturales (L), así como sus constantes de estabilidad condicionales (K’ML).
Todo ello, resuelve el problema de la necesidad de determinar las diferentes especies
químicas en las que se encuentran los metales traza en una muestra real, imprescindible
para conocer su toxicidad, biodisponibilidad, comportamiento biogeoquímico, así como el
riesgo potencial de su presencia en el medio ambiente.

Destacan los estudios por competición de ligandos mediante voltamperometría de

redisolución catódica adsortiva realizados por Nimmo y col., (1997 y 1998). Estos autores
han estudiado las especies más disponibles de Cu, Pb, Cd, Ni y Co en aguas marinas por
CL-AdCSV. También ha sido ampliamente aplicada en los laboratorios oceanográficos [Van
den Berg y Nimmo, 1987] y se ha convertido en un método ampliamente utilizado para
investigar la complejación de varios metales por la materia orgánica natural [Van Leeuwen
y Town, 2005]. También, se han empleado estos métodos para el estudio de la especiación
de Fe en agua de mar [Van Den Berg, 1995; Macrellis y Col., 2001; Rue y Bruland, 2001],
mostrando que el 99% de este metal se encuentra fuertemente complejado con ligandos
naturales.

Una limitación importante a considerar en la determinación de la especiación de

metales pesados es que es realmente necesario que la disolución llegue al equilibrio
durante la primera etapa del método. Normalmente, se considera que se ha alcanzado el
equilibrio cuando, después de la adición del ligando, la medida de la corriente permanece
constante con el tiempo. Sin embargo, durante la aplicación de la técnica puede producirse
una liberación lenta del metal libre por disociación de complejos naturales con altas
constantes de equilibrio y bajas velocidades de disociación, creando una disminución de la
señal con el tiempo y alcanzando un equilibrio aparente que llevará a errores
experimentales [Mota y col., 2012].

Entre los ligandos más utilizados para los estudios de especiación mediante
competición de ligandos se pueden citar los siguientes: tropolona, 8-hidroxiquinoleína,
salicilaldoxima, catecol, benzoilacetona, pirrolidin ditiocarbamato de amonio,
dimetilglioxima, 1-nitroso-2-naftol, etc. En la Tabla 3.2 se incluye una revisión de estos

145
Capítulo 3

ligandos complejantes utilizados en análisis de especiación de metales en muestras de

aguas de diferente naturaleza aplicando el método de competición de ligandos.

3.2.2. Cronopotenciometría de redisolución de barrido (SSCP)

Asimismo, recientemente se ha desarrollado una nueva técnica para el estudio de la
especiación dinámica de metales, denominada Cronopotenciometría de redisolución de
barrido (SSCP) (van Leeuwen y Town, 2003; Town y van Leeuwen, 2004a; Pinheiro y van
Leeuwen, 2004) a partir de la técnica tradicional de cronopotenciometría de redisolución
(SCP). Esta técnica SCP es adecuada para estudios de complejación de metales traza
debido a su sensibilidad y su capacidad para proporcionar información sobre la naturaleza
dinámica de los complejos, aunque solo puede ser aplicada a los metales que forman
amalgama con el electrodo. La SCP consiste en dos etapas: la etapa de deposición, en la
que los iones metálicos se reducen y depositan en el electrodo a potencial constante, de
manera similar a lo que ocurre en la voltamperometría de redisolución anódica; y la etapa
de redisolución, en la que el metal acumulado se reoxida mediante la aplicación de una
corriente oxidante constante. Cuando la corriente de redisolución es suficientemente
pequeña, el metal, que previamente se ha acumulado en la gota, se redisuelve lentamente
produciendo una señal elevada cuando se redisuelve completamente. En estas
circunstancias, puede aplicarse fácilmente la ley de Faraday para obtener una relación
directa cuantitativa entre la señal analítica (tiempo de transición o redisolución ) y la
concentración de las especies en la muestra. Sin embargo, en presencia de ligandos, no
existe una relación directa entre los parámetros que caracterizan el pico (potencial y
anchura media) y la especiación en la muestra. Este inconveniente se resuelve haciendo
uso de la cronopotenciometría de redisolución de barrido (en la que se realizan varias
medidas de SCP a diferentes valores de potencial de deposición) que soluciona cualquier
problema relacionado con la interpretación de los resultados. Los parámetros
característicos de la curva SSCP (la altura máxima de la curva, es decir, el valor límite del
tiempo de transición *,y el potencial de semi-onda E1/2) son sensibles a la pérdida de
labilidad, por lo que proporcionan información relacionada con la especiación [Mota y col.,
2012].

146
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Tabla 3.2. Determinación de la complejación metálica en aguas naturales por el método

de competición de ligandos y voltamperometría de redisolución catódica adsortiva (CL-
AdCSV)
Metales Tipo de muestra Ligando adicionado AdCSVa Referencias
Pirrolidín ditiocarbamato de Van den Berg,
Zn(II) Agua de mar HMDE
amonio 1985
Catecol;
Cu(II) Van den Berg y
Agua de estuario Pirrolidín ditiocarbamato de HMDE
Zn(II) Nimmo, 1987
amonio
Van den Berg y
Cu(II) Agua de mar 8-Hidroxiquinoleína SMDE Donat, 1992
Donat y Van den
Cu(II) Agua de mar Tropolona HMDE Berg, 1992
Cu(II) Agua dulce 1-(2-Tiazolilazo)-2-naftol SMDE Farias y col., 1992
Campos y Van den
Cu(II) Agua de mar Salicilaldoxima HMDE Berg, 1994
Cu(II) Agua dulce 8-Hidroxiquinoleína SMDE Jin y Gogan, 2000
Pirrolidín ditiocarbamato de Ellwood y Van den
Zn(II) Agua oceánica SMDE Berg, 2000
amonio
Ellwood y Van den
Co(II) Agua de mar Nioxima SMDE Berg, 2001
Fischer y Van den
Pb(II) Agua de lago Azul de calceína HMDE Berg, 2001
Guthrie y col.,
Ni(II) Agua dulce Dimetilglioxima HMDE 2003
Witt y Jickells,
Cu(II) Agua de lluvia Tropolona HMDE 2005
Buck y Bruland,
Cu(II) Agua de mar Salicilaldoxima SMDE 2005
1) Co(II), 1) Dimetilglioxima
Ni(II) 2) 8-Hidroxiquinoleína Chakraborty y
Agua dulce HMDE
2) Cu(II) 3) Pirrolidín ditiocarbamato Chakrabarti, 2006
3) Zn(II) de amonio
Laglera y col.,
Fe(III) Agua natural Formaldehído HMDE 2007
Cu(II) Agua de lluvia Salicilaldoxima HMDE Witt y col., 2007
Bennett y col.,
Fe(III) Agua de mar 2-(2-Tiazolilazo)-p-cresol HMDE 2008
Fe(III) Agua de mar 2-(2-Tiazolilazo)-p-cresol HMDE Wu y Jin, 2009

Cu(II) Agua de estuario Salicilaldoxima HMDE Money y col., 2011

Fe(III) Agua de lluvia 1-Nitroso-2-naftol SMDE Cheize y col., 2012

Cu(II) Agua de lluvia Salicilaldoxima HMDE Nason y col., 2012

a
HMDE: electrodo de gota colgante de Hg; SMDE: electrodo de gota estática de Hg

147
Capítulo 3

3.2.3. Redisolución en ausencia de gradiente y en equilibrio Nernstiano

(AGNES)
Por otro lado, la técnica de redisolución en ausencia de gradiente y en equilibrio
Nernstiano, AGNES, ha sido desarrollada y aplicada para la determinación de
concentraciones de metal libre por Galceran y col., 2004, y puede ser una alternativa a
otras técnicas existentes, especialmente para aquellos iones metálicos, tales como Zn, para
los que no hay disponibles electrodos selectivos de iones comerciales [Galceran y col.,
2007]. Durante la etapa de deposición, el metal se amalgama en la gota de mercurio hasta
alcanzar un equilibrio Nernstiano sin gradiente de concentración. Por lo tanto, la
concentración de metal amalgamado y la corriente de redisolución faradaica medida son
proporcionales a la concentración de metal libre en la disolución.

Ambas técnicas (SSCP y AGNES) aplicadas conjuntamente presentan un gran potencial

para el estudio de la especiación de metales traza en muestras de aguas naturales. En la
Tabla 3.3 se muestran las aplicaciones de estas técnicas en estudios de especiación de
metales.

Tabla 3.3. Aplicación de las técnicas AGNES y SSCP al estudio de especiación de metales
en diferentes muestras
Electrodo
Metales Método Muestra Ligando estudiadoa Referencia
de trabajob
Cd(II) AGNES Disolución de metal NTA HMDE Galceran y
col., 2004
Zn(II) AGNES Disolución de metal 1) NTA HMDE Companys y
(pH: 6) 2) AEDT col.,
3) Oxalato 2005
Zn(II) AGNES Agua de mar Sin ligando HMDE Galceran y
costera col., 2007
Pb(II) AGNES Disolución de metal PDCA HMDE y Huidobro y
(pH: 6,1) Hg-Ir col., 2007
Pb(II) AGNES Disolución de metal 1) Nanoesferas TMF-RDE Rocha y col.,
(pH: 4) carboxiladas de 2010
Latex
2) IDA
Zn(II) AGNES Disoluciones de Sin ligando HMDE Galceran y
Cd(II) metal (pH: 3-5) col., 2010
Zn(II) AGNES Disolución de metal PDCA (en disolución HMDE Zavarise y
(pH: 6), agua de de metal) col.,
río, real y sintética 2010
Zn(II) AGNES Disoluciones de Oxalato SPE y Parat y col.,
Cd(II) metal (pH: 2-7) HMDE 2011a
Pb(II)

148
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Tabla 3.3 (cont.). Aplicación de las técnicas AGNES y SSCP al estudio de especiación de
metales en diferentes muestras
Electrodo de
Metales Método Muestra Ligando estudiadoa Referencia
trabajob
Zn(II) AGNES- Disoluciones de 1) Oxalato SPE y HMDE Parat y col.,
Cd(II) SCP metal (pH: 4,8 y 6) 2) NTA 2011b
Pb(II)
Zn(II) AGNES Disolución de metal NTA (en disolución HMDE Chito y col.,
(pH: 5,5 y 6,2), de metal) 2012
agua de río y
muestras de suelo
Cd(II) SSCP Disoluciones de 1) PDCA Hg-Ir Van
Pb(II) metal (pH: 4,8 y 2) Ácido fúlvico Leeuwen y
6,5) Town,
2002a
Cd(II) SSCP Disoluciones de Sin ligando HMDE y Van
Pb(II) metal (pH: 5) Hg-Ir Leeuwen y
Town,
2002b,
2002c
Cd(II) SSCP Disoluciones de 1) Ácido fúlvico HMDE y Van
Cu(II) metal (pH: 5-8) 2) Ácido húmico Hg-Ir Leeuwen y
Pb(II) 3) Materia orgánica Town,
2003a
Zn(II) SSCP Disolución de metal Sin ligando HMDE y Van
(pH: 5) Hg-Ir Leeuwen y
Town,
2003b
Cd(II) SSCP Disoluciones de 1) PDCA HMDE Town y van
Pb(II) metal (pH: 5 y 6) 2) Ácido húmico Leeuwen,
3) Ácido fúlvico 2003
Cd(II) SSCP Disolución de metal NTA HMDE y Van
(pH: 4, 5 y 8) Hg-Ir Leeuwen y
Town, 2004
Cd(II) SSCP Disoluciones de Nanoesferas HMDE Pinheiro y
Pb(II) Cd(II) y Pb(II) (pH: carboxiladas de van
5,15-7,23) Latex Leeuwen,
2004;
Pinheiro y
col., 2005,
2006
Cd(II) SSCP Disoluciones de 1) PDCA HMDE y Town y van
Cu(II) Cd(II) (pH: 6 y 8), 2) Ácido húmico Hg-Ir Leeuwen,
Pb(II) Cu(II) y Pb(II) (pH: 2004a
5)
Cd(II) SSCP Disoluciones de Sistemas HMDE y Town y van
Zn(II) metal (pH: 5) multimetálicos Hg-Ir Leeuwen,
2004b
Ni(II) SSCP Disoluciones de 1) NTA HMDE Town y col.,
Zn(II) metal (pH: 4,7 y 6) 2) Ácido cítrico 2005
3) Ácido tartárico
149
Capítulo 3

Tabla 3.3 (cont.). Aplicación de las técnicas AGNES y SSCP al estudio de especiación de
metales en diferentes muestras
Electrodo de
Metales Método Muestra Ligando estudiadoa Referencia
trabajob
Cd(II) SSCP Disoluciones de 1) PCA Hg-Ir en Town y col.,
Pb(II) Cd(II) (pH: 4,8 y 7) 2) PDCA presencia y 2006
y de Pb(II) 3) Histidina ausencia de
(pH: 4,8 y 8) 4) NTA una capa de
gel de agarosa
Cd(II) SSCP Disoluciones de 1) IDA HMDE y Hg-Ir Van
Zn(II) Cd(II) (pH 6 y 8) y 2) HIMDA Leeuwen y
de Zn(II) (pH: 4,7) 3) PDCA Town, 2006
Pb(II) SSCP Disolución de metal 1) Ácido aspártico Hg-Ir en Noel y col.,
(pH: 6,3) 2) Dextrans I, II, III presencia y 2006
ausencia de
una capa de
gel de agarosa
Cd(II) SSCP Disoluciones de 1) Nanoesferas SMDE Pinheiro y
Pb(II) metal carboxiladas de col., 2007
(pH: 4,5-8) Latex
2) Nanopartículas
de Au y Ag
3) Ácido fúlvico
4) Ácido húmico
Pb(II) SSCP Disolución de metal Nanoesferas TMFE Rocha y
(pH: 5,5) carboxiladas de col.,
Latex 2007
Cd(II) SSCP Disolución de metal 1) Ftalato HMDE Serrano y
(pH: 5,5) 2) Ioduro col., 2007
Cd(II) SSCP Disoluciones de Nanoesferas SMDE Domingos y
Pb(II) metal carboxiladas de col.,
(pH: 5,2-6,4) Latex 2007
Cd(II) SSCP y Disoluciones de 1) PDCA SMDE Domingos y
Pb(II) AGNES Cd(II) (pH: 6-7,6) y 2) Nanoesferas col.,
de Pb(II) (pH: 5- carboxiladas de 2008
6,1) Latex
3) Ácido húmico
Cd(II) SSCP Disolución de metal 1) NTA TMF-SPE Parat y col.,
(pH: 4,3 y 7,15) 2) PDCA 2011c
a
AEDT: Ácido etilendiaminotetraacético; HIMDA: ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético; IDA: Ácido
iminodiacético; NTA: Ácido nitrilotriacético; PCA: Ácido piridina-2-carboxílico; PDCA: Ácido 2,6-
piridindicarboxílico
b
Hg-Ir: Microelectrodo de disco de iridio recubierto de mercurio; HMDE: electrodo de gota colgante de Hg;
MDE: Electrodo de gota de mercurio; TMFE: electrodo de película fina de mercurio; TMF-RDE: electrodo de
disco rotativo de película fina de mercurio; TMF-SPE: electrodo de película fina de mercurio serigrafiado;
SMDE: electrodo de gota estática de Hg; SPE: Electrodo serigrafiado

150
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Como puede concluirse de la tabla, hasta ahora no se han aplicado ambas técnicas en
muestras de agua de mar para el estudio de especiación del Pb.

Se han descrito hasta el momento las técnicas más comúnmente empleadas en el

estudio de especiación de metales traza. Sin embargo, las técnicas voltamperométricas de
redisolución (SV) presentan algunos inconvenientes, a diferencia de las técnicas SCP y
AGNES (tal y como se explicará en la siguiente sección).

Es por ello que uno de los objetivos de esta Tesis Doctoral ha sido la aplicación de
dichas técnicas en el análisis de Pb(II) en muestras reales de agua de mar. Dado que este
capítulo se centra en el estudio de especiación de dicho metal mediante la utilización de
estas dos últimas técnicas, a continuación se detalla ampliamente el fundamento de cada
una de ellas.

3.3. Fundamentos teóricos de las técnicas SCP y SSCP

La cronopotenciometría de redisolución de barrido (SSCP) está englobada dentro de las

técnicas de especiación dinámica de metales que actualmente se aplican en análisis. Puesto
que la SSCP deriva de la técnica de cronopotenciometría de redisolución (SCP), es
necesario conocer primero las características de ésta con la finalidad de conseguir una
mejor comprensión de la SSCP.

3.3.1. Fundamentos de la Cronopotenciometría de Redisolución (SCP)

El uso de las técnicas de redisolución para estudios de especiación ha ido
incrementando desde que se desarrolló la cronopotenciometría de redisolución (SCP). En
esta técnica, la reoxidación del metal acumulado se consigue mediante la aplicación de una
corriente de oxidación constante Is, y la señal analítica es el tiempo necesario para la
reoxidación del metal, es decir, el tiempo de transición o redisolución, conocido como.

Un aspecto importante sobre la técnica SCP es que la interpretación de los datos

requiere un conocimiento del tipo de régimen del tiempo de redisolución con el que se
trabaja. Town y van Leeuwen demostraron en 2001 que cuando se utilizan altas corrientes
de redisolución se observan líneas bases poco apropiadas, como consecuencia de un
proceso faradaico que no permite una reoxidación completa del metal acumulado. En este
caso, el régimen se define como régimen de difusión lineal semi-infinita (en el que Ies
constante y es proporcional al cuadrado de la concentración del metal). De modo inverso,
cuando se aplican corrientes bajas, la reoxidación ocurre lentamente y el metal acumulado
termina por agotarse completamente cuando el proceso de redisolución llega a su final, por
151
Capítulo 3

lo que la señal analítica es relativamente elevada y el régimen de tiempo se define como

régimen de redisolución completa o difusión limitada (I es constante y  es proporcional a
la concentración del metal). La sensibilidad y resolución son mayores bajo condiciones de
redisolución completa, y comparables con las de las técnicas de voltamperometría de
redisolución anódica de pulso diferencial [Town y van Leeuwen, 2001].

La sensibilidad de una técnica viene definida por su capacidad para discriminar la señal
analítica de la señal de fondo. En los métodos electroquímicos, esta sensibilidad depende
de la capacidad de discriminación entre la señal o corriente faradaica (provocada por la
reacción de óxido-reducción que tiene lugar en el electrodo) y la capacitiva (que se debe a
que el electrodo se comporta como un condensador, debido a los cambios de potencial que
se aplican en el sistema). En SCP, la curva original obtenida de los datos de potencial (E)
frente a tiempo (t) tiene una pendiente que, en ausencia de proceso faradaico, viene
determinada por la capacitancia del electrodo; esta pendiente se modificará en presencia
de especies capaces de ser adsorbidas en el electrodo. Trabajos previos sobre esta técnica
destacaron la dificultad de obtener medidas fiables de tiempos de redisolución utilizando
los datos directos de E frente a t, puestos que están influenciados por la corriente
capacitiva [Rodgers y Meites, 1968; de Vries, 1968; Olmstead y Nicholson, 1968]. El primer
intento de transformar estas curvas consistió en medir el tiempo de redisolución como la
distancia entre picos consecutivos en una gráfica de dE/dt frente a t [Jagner y Arén, 1978;
Schulze y Bönigk, 1985; Tutunji, 1996]. Sin embargo, esta opción no presentaba ventaja
alguna puesto que la corriente capacitiva seguía contenida en la señal medida. La
estrategia más adecuada fue determinar los tiempos de redisolución midiendo el área bajo
el pico en las gráficas de dt/dE frente a E. Esto es lo que se utiliza en los trabajos más
recientes. Se usa dt/dE para denotar la inversa de la derivada del potencial respecto al
tiempo, de manera que se elimina la influencia de la corriente capacitiva. En la
representación de dt/dE frente a E, el área bajo el pico corresponde al tiempo necesario
para que se produzca el proceso faradaico de oxidación, mientras que el área bajo la línea
base es el tiempo en el que se carga la doble capa, es decir, corresponde a la corriente
capacitiva [Town y van Leeuwen, 2001; Town y van Leeuwen, 2002]. En la Figura 3.2 se
muestra una representación esquemática de las curvas que se obtienen en SCP, según
estas opciones. Además, en la Figura 3.3 puede distinguirse claramente la contribución de
la señal capacitiva en las curvas obtenidas en SCP, utilizando la última opción.

Por lo tanto, una de las ventajas de la SCP frente a la ASV es la eliminación de la

interferencia de la corriente capacitiva, lo cual evita las dificultades asociadas con la forma
de los picos y las interferencias de fondo, que siguen suponiendo un problema en ASV.

152
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

(a)

E (V)

t (s)

(b)
dE/dt (V/s)

t (s)
(c)
dt/dE (s/V)

E (V)

Figura 3.2. Representación esquemática de la señal registrada para: (a) SCP directa (E vs.
t), (b) su correspondiente derivada (dE/dt vs. t) (distancia entre picos) y (c) su derivada
inversa (dt/dE vs. E) (: área bajo la curva) [Town y Van Leeuwen, 2001]
153
Capítulo 3

()+(a) = ’
dt/dE (s/V)



Línea base
a

E (V)

Figura 3.3. Curva SCP (dt/dE frente a E) (’: área sombreada total (+a);  (área por
encima de la línea base): contribución de la corriente faradaica; a (área bajo la línea base):
contribución de la corriente capacitiva)

Otra ventaja frente a la técnica voltamperométrica de redisolución anódica (ASV) es

que la SCP es menos susceptible a interferencias por adsorción de compuestos orgánicos.
Como se ha comentado previamente, la ASV es una excelente técnica para determinar
concentraciones de metales traza en disolución, pero tiene la desventaja de que presenta
problemas cuando se aplica a matrices medioambientales que contienen altos niveles de
materia orgánica, principalmente debido a la adsorción de diferentes especies sobre la
superficie del electrodo. En ambas técnicas, la etapa de deposición se lleva a cabo
normalmente a valores más bajos que el potencial de carga cero (pzc) del electrodo de
trabajo (que suele ser el electrodo de mercurio). Esto significa que durante la etapa de
deposición, el electrodo está cargado negativamente, por lo que la adsorción de ligandos
(que normalmente presentan una carga negativa) es despreciable. Sin embargo, la
acumulación de exceso de ligando en la superficie del electrodo, y la subsiguiente
adsorción del complejo se considera que comienza al inicio del proceso de redisolución,
cuando los potenciales aplicados son mayores que el pzc y la carga del electrodo es
positiva [Town y van Leeuwen, 2002].

Estos efectos secundarios dificultan la aplicación tanto de la ASV como de la SCP en

régimen de difusión lineal semi-infinita para estudiar la complejación de metales. La posible
saturación del electrodo por la presencia de compuestos orgánicos durante la etapa de

154
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

redisolución resulta en un incremento en la altura de los picos, así como una distorsión de
los mismos [Town y van Leeuwen, 2002; van Leeuwen y Town, 2002a]. Además, si la
materia orgánica presente en la muestra es heterogénea, se producirá un aumento de la
anchura del pico [van Leeuwen y Town, 2003a]. En SCP en régimen de redisolución
completa, los tiempos de transición son generalmente del orden de 102 s, suficientemente
altos como para que la difusión del ligando adsorbido hacia la superficie del electrodo sea
rápida en comparación con la velocidad de reoxidación del metal. Por tanto, en este
régimen, los ligandos no estarán adsorbidos en la gota tanto tiempo y no producirán
efectos negativos en la medida. Por el contrario, en SCP con régimen de difusión lineal
semi-infinita, los tiempos de transición son más cortos, del orden de 1 s y el ligando no
habrá tenido suficiente tiempo para difundir y todavía estará en la gota durante la medida
[Town y van Leeuwen, 2002].

Se han desarrollado numerosas estrategias para solucionar este tipo de interferencias

producidas por la adsorción de materia orgánica. Las más comunes implican una
modificación de la superficie del electrodo, como puede ser el revestimiento con un
polímero (ej. Nafion® [Murimboh y col., 2000; Hurst y Bruland, 2005; Cao y col., 2006] o
acetato de celulosa [Christensen y Hoyer, 2000]). Sin embargo, es especialmente
complicada la modificación del electrodo de manera reproducible y bien caracterizada.
Además, dado que los materiales utilizados están cargados negativamente (ej. Nafion ®),
éstos confieren al electrodo un carácter de intercambiador iónico, que puede perturbar el
equilibrio original y crear problemas en la interpretación de datos.

Existe además una limitación de la técnica SCP relacionada con la presencia de

especies oxidantes en la muestra. Teóricamente, el tiempo de redisolución debería
aumentar continuamente a medida que la corriente de redisolución Is disminuye; sin
embargo, en la práctica existe una limitación para el aumento de  que viene determinada
por la concentración de trazas de oxígeno disuelto (u otros oxidantes). La presencia de este
tipo de compuestos produce un descenso notorio del tiempo que se necesita para oxidar el
analito, especialmente cuando los procesos son demasiado largos. Para valores bajos de Is
se observa una contribución relativamente significativa del oxígeno en el proceso de
oxidación; sin embargo, esta contribución puede considerarse despreciable si se trabaja
con corrientes mayores, aunque se perdería sensibilidad y resolución [Town y van
Leeuwen, 2001].

La técnica SCP se puede realizar con diferentes tipos de electrodos de mercurio. Así,
muchas aplicaciones de SCP han sido llevadas a cabo utilizando un electrodo de película
fina de mercurio (TMFE). Con este electrodo, el rápido transporte de metal a través de la
capa durante la etapa de redisolución implica que las medidas se producen bajo
condiciones de redisolución completa. Sin embargo, las películas finas de mercurio son
mucho menos reproducibles que las gotas.
155
Capítulo 3

La ASV con el electrodo de gota de mercurio (HMDE) opera bajo condiciones de

difusión lineal semi-infinita [Bard y Faulkner, 2001], es decir, la redisolución completa del
metal amalgamado no se alcanza durante la etapa de redisolución. En SCP dependiendo del
valor de la corriente de redisolución aplicada, las condiciones varían entre redisolución
completa y difusión lineal semi-infinita. Así, el uso de gotas de mercurio de radio pequeño
proporciona una difusión lineal semi-infinita para tiempos cortos.

La forma de la curva SCP de E frente a t para el sistema reversible Mn+/M0(Hg) viene

determinada básicamente por la ecuación de Nernst en la superficie del electrodo:

 c0 
RT  
E  E0  Ln M  (3.1)
nF  c 0 0 
 M 

0 0
donde c M y cM 0 son las concentraciones del ion metálico y el metal reducido en la superficie

del electrodo, respectivamente, n es el número de electrones implicados en el proceso

faradaico, R es la constante de los gases, T es la temperatura y F, la constante de Faraday.
Para entender rigurosamente la forma de la curva de redisolución, se debe tener en cuenta
la dependencia del tiempo respecto a las concentraciones de las especies oxidadas y
reducidas en la superficie del electrodo [van Leeuwen y Town, 2002c].

Considerando el caso más simple de una disolución que contenga únicamente iones
metálicos, los flujos que están implicados durante el proceso de redisolución son el
correspondiente a M0 desde el interior del electrodo hasta su superficie, y el de Mn+ desde
la superficie del electrodo hasta el seno de la disolución. Cuando se aplica una corriente de
redisolución pequeña (modo de redisolución completa), la concentración de metal reducido
en la superficie del electrodo c 0 0 se asemeja a la concentración de metal reducido en el
M
*
interior c M0, y esta situación permanecerá así durante todo el periodo de transición, puesto
que ambas concentraciones van a ir disminuyendo de manera casi lineal con el tiempo por
mantener la corriente impuesta. Es importante destacar que para tiempos de transición
* - *
próximos a redisolución completa, la corriente debe ser tan baja que ( c M 0 c 0 0 )/ c M 0 sea
M
mucho menor que la unidad, es decir,
* 0
cM 0 c 0 1 (3.2)
M

*
De esta manera, c M 0 irá disminuyendo continuamente durante el tiempo de transición,

hasta llegar a un valor cercano a cero. Cuando se alcanza el estado estacionario, el valor
0
de c M permanecerá aproximadamente constante en el tiempo debido a que la corriente
aplicada genera un gradiente constante de Mn+ y además, el volumen de la disolución es lo

156
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

* [van
suficientemente grande como para garantizar una concentración constante de c M
Leeuwen y Town, 2002c].

La evolución de las concentraciones durante la etapa de redisolución puede observarse

en la Figura 3.4.

Disolución Superficie del Volumen del

electrodo electrodo

c*M 0 (t=0)

c0M 0 (t=0)

c*M 0 (t1)

c0M 0 (t1)

c*M 0 (t2)
c0M 0 (t2)
c0M (t)

c*M

M M 

Figura 3.4. Representación esquemática de los perfiles de concentración durante la etapa

de redisolución en SCP, aplicable para electrodos de HMDE (M: espesor de la capa de
difusión creada entre la superficie del electrodo y el seno de la disolución; M0: espesor de
la capa de difusión creada entre la superficie del electrodo y el interior del mismo) [Van
Leeuwen y Town, 2002c]

Por lo tanto, para valores bajos de Is, el término logarítmico de la ecuación (3.1)
contiene un valor prácticamente constante en el numerador ( c 0 ) y un término dependiente
M
del tiempo en el denominador ( c 0 0  c M
*
0 , que es proporcional a - t).
M

Durante la etapa de redisolución, la concentración de Mn+ en la superficie c M

0 viene

definida según una corriente de redisolución, que es constante [van Leeuwen y Town,
2002c]:
157
Capítulo 3

0  c*  I s M
cM M (3.3)
nFAD M

donde A es el área de la superficie del electrodo, M es el espesor de la capa de difusión y

DM, el coeficiente de difusión del metal. Esta concentración de ión metálico en la superficie
del electrodo llegará a un valor constante tras alcanzarse el estado estacionario, que para
un electrodo HMDE se corresponde con tiempos cortos de aproximadamente 20 s [Town y
van Leeuwen, 2002] o mucho menos para un microelectrodo [van Leeuwen y Town,
2002a].

El perfil de concentración de M0 dentro del electrodo alcanzará un valor límite

cuando  M0 sea igual al radio de la gota (rgota para HMDE), o al espesor de la película (d) o
al radio de la microgota (ro), dependiendo del tipo de electrodo empleado.
0 *
Si se ignoran las pequeñas diferencias existentes entre c M 0 y c M 0 , se tiene la siguiente
0
ecuación para la disminución de c 0 con el tiempo:
M
Idt d
c0 0  cM
* 
0 (1  t / ) (3.4)
M nFV

ecuación que expresa la eliminación continua de M0 del electrodo, pasando a la disolución.

La redisolución será completa cuando t= (donde Id es la corriente de deposición, td es el
tiempo de deposición y V es el volumen del electrodo).

Así, la redisolución completa implica que el número de moles depositados en la gota es

igual al número de moles que se reoxidarán durante el proceso de redisolución:

Idt d Is 
N depositados  ; N oxidados 
nF nF

Idtd=Is  (3.5)

donde Id es la corriente de deposición, Is es la corriente de redisolución, td es el tiempo de

deposición y  es el tiempo de transición (señal analítica).

Combinando las Ecuaciones (3.3), (3.4) y (3.5) con la ecuación de Nernst (3.1), en la
cual el potencial aplicado E es, en este caso, el potencial de deposición Ed, se obtiene:

 * nFAD M 
nF
E d  E 0   Ln c M  I s  M (3.6)
RT  I s (   t ) nFV 

o bien,

t    g exp( nF(E d  E 0 ) / RT ) (3.7)

158
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

donde el valor de g viene definido como:

*  I  / nFAD )
nFV (c M s M M
g (3.8)
Is

* con el
Esta es la ecuación que relaciona la concentración metálica en la disolución c M
tiempo de transición  que tarda el metal en reoxidarse. Además, se obtiene que la relación
entre t y E es una simple relación exponencial asimétrica [van Leeuwen y Town, 2002c], y
como consecuencia, la curva dt/dE vs. E tiene una subida muy pronunciada seguida de una
caída exponencial (ver Figura 3.2.c).

Posteriormente al desarrollo de la técnica SCP, se avanzó un paso más y se investigó la

posibilidad de aplicar un nuevo método, denominado cronopotenciometría de redisolución
de barrido (SSCP) para estudiar la especiación metálica, con el objetivo de facilitar la
interpretación de los parámetros de complejación.

3.3.2. Fundamentos de la Cronopotenciometría de Redisolución de Barrido

Las curvas SSCP se construyen mediante una serie de medidas de SCP que se realizan
a diferentes valores de potencial de deposición. De esta forma, las curvas SSCP son
representaciones de los valores de tiempo de transición  obtenidos como el área del pico
bajo la curva SCP frente al potencial de deposición Ed. Cada una de esas curvas SCP se
obtiene en dos etapas: en la primera, se fija un potencial de deposición durante un tiempo
de deposición td, para que se reduzca el metal presente en la muestra; y en la segunda
etapa, se aplica una corriente oxidante hasta que se reoxide el metal.

A continuación, se explican los aspectos teóricos más importantes de la técnica SSCP

bajo condiciones de redisolución completa, que es el régimen utilizado en las
investigaciones realizadas en esta tesis. Se comenzará por la deducción de la expresión
más sencilla que se utiliza en SSCP (caso de un sistema que contenga solo metal), y luego
se presentará la expresión para el caso de que exista un ligando en la muestra,
diferenciando entre ligando lábil con tamaño similar al del metal, ligando lábil con tamaño
mayor al del metal, y ligando no lábil. Por último se indicará la respuesta que se obtiene si
los ligandos presentes en la muestra son heterogéneos.

159
Capítulo 3

3.3.2.1. Expresión para la curva SSCP en el caso de una muestra que solo
contenga metal
Van Leeuwen y Town publicaron en 2002 [van Leeuwen y Town, 2002b] la deducción
detallada de la expresión para la curva SSCP de  frente a Ed. En esta sección se
describirán los puntos más importantes de la explicación.

Según una aproximación basada en la teoría de la capa de difusión en estado de

equilibrio, para un potencial dado, la corriente de deposición Id en un electrodo esférico con
radio ro viene definida por [Bard y Faulkner, 2001]:

 
*  c 0 ) 1  1 
I d  nFADM (c M (3.9)
M  
 M ro 

Para una electrodo macroscópico, con ro >>M, el término esférico 1/ro desaparece y el
flujo es controlado por la difusión en la interfase electrodo-disolución. Para un
microelectrodo, con ro << M, el término 1/M desaparece, y es el término de difusión radial
el que controla el flujo.

El parámetro M se puede definir como un parámetro proporcional a una constante 

que depende de las condiciones hidrodinámicas que se tienen durante el proceso de
deposición, como son la agitación y la geometría de la celda, y que se puede expresar
como función del coeficiente de difusión [Rocha y col., 2007]:

 M  D1M/ 3 (3.10)

La corriente límite de deposición I *d se obtiene para potenciales de deposición muy

0 es prácticamente 0 a lo largo de la etapa de deposición:
negativos, en los que c M

 
*  1  1
I *d  nFAD M c M  (3.11)
 
 M ro 

Para una reacción de transferencia de electrones reversible como es la de M ± ne- 

M , existe una relación entre las concentraciones de M y M0 (ecuación (3.1)) que puede
0

expresarse en términos de  (cociente de concentraciones en la superficie):

0
cM

 nF
 exp 
Ed  E0  (3.12)
c00  RT 
M

Durante la etapa de deposición, la concentración de metal reducido en el electrodo va

aumentando desde 0 en t=0 hasta valores muchos más altos que c M * en t=t , debido a la
d

preconcentración que se consigue al pasar el metal del seno de la disolución al interior de

160
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

la gota. Esto tiene como consecuencia que en el régimen de redisolución completa, la

concentración de metal reducido en la superficie del electrodo es prácticamente la misma
que la de metal reducido en el interior del mismo. Esta condición es una característica
bastante atractiva puesto que evita el uso de ecuaciones complejas de flujos o gradientes
de concentración.

La concentración media de metal reducido en el interior del electrodo durante la etapa

de deposición se puede expresar en términos de la integral de la corriente de deposición
respecto al tiempo:

1
* 
cM0
nFV  I dt d (3.13)

Sustituyendo la ecuación (3.13) en la (3.12), junto con la expresión del flujo para M
(ecuación (3.9)), se obtiene:
* m I )
nFV ( c M M d
 (3.14)
 I d dt

siendo mM el coeficiente de transporte de carga para M en disolución, expresado como:

(1 /  M  1 / ro ) 1
mM  (3.15)
nFAD M

La ecuación (3.14) es una integral que se resuelve, dando:

I d ( t )  I *d exp(  t /  d ) (3.16)

donde d es una constante característica del proceso de deposición, que depende de  ,

que a su vez depende del potencial según la ecuación (3.12), y que se expresa mediante la
siguiente ecuación:
1
 1V 1 
d    (3.17)
AD M    M ro 


La carga total Q, transferida durante el proceso de deposición de duración td se calcula

fácilmente por integración de la ecuación (3.16) desde t=0 hasta t=td. En régimen de
redisolución completa, la carga total se relaciona linealmente con el tiempo de transición ,
mediante la corriente de redisolución Is:
td
Q

0
I *d exp(  t /  d )dt  I s  (3.18)

161
Capítulo 3

Esta característica de la SSCP es muy importante dado que en voltamperometría de

redisolución de barrido (SSV) no se obtiene esta relación tan simple entre la carga y la
señal analítica. En régimen de redisolución completa, resolviendo la integral se puede
escribir Q en términos de :

I *d  d
 1  exp(  t d /  d ) (3.19)
Is

que representa la curva completa SSCP de  frente a Ed, puesto que el potencial está
presente en el parámetro d, según la ecuación (3.12) y (3.17). Es importante destacar que
este tipo de aproximación se puede aplicar únicamente a técnicas de redisolución en
régimen de redisolución completa.

Para valores de potencial de deposición más negativos que el potencial estándar de

reducción, el parámetro  tiende a 0, y se alcanza el valor límite del tiempo de transición,
*. Esto se puede entender considerando d mucho mayor que td (td/d << 1), de manera
que el término exponencial de la ecuación (3.19) puede desarrollarse como una serie, en la
que pueden despreciarse el tercer término y los siguientes:

I *d  d  t d  d ( t d  d ) 2  I* t
*  1  (1    ...  d d (3.20)
I s  1! 2!  Is

que es el balance de carga para la redisolución completa [van Leeuwen y Town, 2002b].

En la Figura 3.5 se puede observar la forma de una curva de SSCP típica para la
determinación de Pb. Los parámetros que definen la curva son el tiempo de transición
límite  y el potencial de semi-onda E1/2. El primero proporciona información
dinámica/cinética del sistema y depende de los coeficientes de difusión; mientras que el
segundo está íntimamente relacionado con el potencial necesario para oxidar o reducir el
analito, por lo que aporta datos termodinámicos (constante de formación de los
complejos).

3.3.2.2. Expresión para la curva SSCP en el caso de que existan ligandos en

la muestra
Para aplicar la técnica de SSCP al estudio de la especiación metálica, es necesario
conocer la influencia que tienen los parámetros asociados a la complejación sobre la forma
y la posición de las curvas. En este apartado, se considerará la influencia de la constante
de estabilidad del complejo metálico, así como los valores de coeficiente de difusión del
metal y del ligando.

162
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

40
35 *
30
25
 (s)

20
15
10
5 E1/2
0
-0,59 -0,54 -0,49 -0,44
Ed (V)

-6
Figura 3.5. Curva típica de SSCP para una disolución de Pb(II) (1,4·10 mol/L) ( valores
experimentales; curva teórica)

Consideremos un esquema sencillo de un ion metálico M que, en presencia de ligando,

forma el complejo ML según el siguiente equilibrio:

ka
M+L ML (3.21)
kd

donde las cargas se omiten para mayor claridad.

La constante de velocidad para la reacción de formación de complejo se denota como

ka y la constante de velocidad para la reacción de disociación se denota como kd. La
relación ka/kd se define como la constante termodinámica de estabilidad K de ML [Pinheiro
y van Leeuwen, 2004].
ka c ML
K  (3.22)
kd c Mc L

donde cML, cM y cL son las concentraciones de complejo, metal y ligando en el equilibrio.

Para concentraciones de ligando en exceso sobre la concentración de metal (cL,Total >>

cM,Total; cL,Total  cL) la reacción se vuelve quasi-monomolecular con una constante de
velocidad:

163
Capítulo 3

k 'a  k a c L , T

 k 'a k a c L ,T c (3.23)
K '    Kc L , T  Kc L  ML
 kd kd cM

donde el subíndice T denota la concentración total.

K’, constante de estabilidad condicional, es un parámetro que indica la relación

existente entre la concentración de metal libre y el complejado. Cuanto mayor sea K’,
mayor será la concentración de metal complejado en el medio. En la superficie del
electrodo durante el proceso de preconcentración, la concentración de ion metálico en
* es cero porque a medida que llega a la interfase, se va transformando en M0.
disolución c M
* , dependerá del equilibrio
La concentración de metal complejado en disolución c ML
(3.21) y por tanto de ka y kd.

El concepto de labilidad describe la capacidad del complejo de mantener el equilibrio

durante el proceso de análisis, en el cual el metal M es consumido en el electrodo según las
siguientes reacciones (Figura 3.6):

M+L ML (3.21)

ne-
M0

Difusión
Electrodo
ML

ka kd Disolución
kox
M0 M
kred +
L

Figura 3.6. Equilibrios entre el metal M y el complejo ML en las proximidades de un

electrodo

164
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Por tanto, hay que considerar que la disolución contiene M y ML, y que el proceso de
medida consume metal libre M, que afecta al equilibrio de complejación.

Durante el proceso de análisis, los tiempos de vida característicos de las especies

metálicas se obtienen a partir de sus constantes de velocidad, según la reacción (3.21).
Así, el tiempo de vida del metal es 1 / k 'a , mientras que el del complejo es 1 / k d . Se define
una escala de tiempo t, que corresponde con el tiempo característico que necesita el metal
en recorrer la capa de difusión  [van Leeuwen, 2001].

Tal y como se explicó anteriormente, los sistemas pueden considerarse como estáticos
o dinámicos:

En el caso de que k 'a t y k d t  1 , los tiempos de vida de M y ML serán mayores que el

tiempo que necesitan estas especies para difundir a través de la capa, por lo que el
equilibrio no se restablece mientras el metal se consume en el análisis, el complejo no
puede disociarse a medida que difunde hacia el electrodo, y se define como inerte. En este
caso, el potencial de semi-onda será el mismo que en el caso de metal libre. Lo único que
se puede detectar cuando el complejo es inerte, será la concentración de metal libre
[Pinheiro y col., 2006].

Ahora bien, cuando k 'a t y k d t  1, los tiempos de vida de M y ML son más cortos que
el tiempo en el que recorren la capa de difusión, por tanto, durante el análisis el equilibrio
se restablece y el sistema es dinámico [Pinheiro y col., 2006]. En este caso, pueden
describirse dos condiciones extremas: que el complejo sea lábil o no lábil [Mota y col.,
2012]. Para diferenciar estos dos tipos de complejos, se puede hacer referencia a los flujos
que entran en juego en la capa de difusión: el cinético y el de difusión.

Dc M, T
- El flujo de difusión: J d 


k d c ML
- El flujo cinético: J c 


donde D es el coeficiente de difusión promedio del metal (en presencia de ligando),  es el

espesor promedio de la capa de difusión (en presencia de ligando), cM,T es la concentración
total de metal (tanto libre como complejado), y  se define como el espesor de la capa
cinética de reacción, definida en términos de movilidad (DM) y tiempo de vida del metal
( 1 / k 'a ), siendo igual a [van Leeuwen y col., 2005]:

DM
 (3.24)
k 'a

165
Capítulo 3

El parámetro  puede definirse como el espacio que pueden recorrer las especies
presentes (M y ML) por difusión sin que se produzca interconversión entre ellas debido a su
equilibrio dinámico. Así, si <<< , el espacio que recorren las especies sin sufrir esta
interconversión es pequeño, y durante su acercamiento hacia el electrodo el complejo se
disocia fácilmente, por lo que el sistema es lábil y la relación entre sus concentraciones
siempre vendrá definida por K’. La etapa controlante será el proceso de difusión, por lo que
Jd < Jc.

Por el contrario, si el valor de es próximo al valor de , las especies pueden recorrer
gran parte de la capa de difusión sin llegar a restablecerse el equilibrio, lo que implica que
el sistema es no lábil y Jd ≈ Jc.

Así, y según la aproximación de Koutecký-Koryta [Koutecký y Koryta, 1961], existen

dos regiones espaciales dentro de la capa de difusión, una lábil y otra no lábil (Figura 3.7).

No lábil Lábil

c*ML

ML
cML
ML

M+L M+L c*M

cM
c0M

  x
0
Figura 3.7. Esquema de los perfiles de concentración de M y ML en función de la distancia
0 ) hacia la disolución (: espesor de la capa cinética
x desde la superficie del electrodo ( c M
de reacción) [van Leeuwen y col., 2005]

Estas dos regiones están definidas por el espesor de la capa de reacción . Desde la
superficie del electrodo (x=0) hasta no existe intercambio dinámico alguno entre el metal
libre y el complejado, y la contribución de ML es puramente cinética. Desdehasta  existe

166
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

un equilibrio entre las dos especies y el sistema es lábil [Ferreira Domingos, 2006]. Para
cualquier tamaño de electrodo los flujos vendrán dados por las siguientes ecuaciones [van
Leeuwen y Town, 2004]:

- El flujo de M desde x=0 hasta x= es: J 


DM c M 0
 cM 


- El flujo de M y ML desde x= hasta x= es: J  

*
D cM 
, T  c M, T , siendo
d
1
1 1 
d  
 r 
 o 

El espesor de la capa cinética de reacción solo tiene sentido físico cuando es menor
que la capa de difusión. Si = , significaría que no existe disociación en toda la capa de
difusión y por lo tanto el sistema sería inerte.

Una vez definidos los sistemas que se pueden encontrar en una muestra
medioambiental, se expondrán las ecuaciones que rigen la técnica SSCP para cada uno de
los casos siguientes: (a) sistema lábil con ligando pequeño, (b) sistema lábil con ligando
grande, (c) sistema no lábil y (d) sistema con ligandos heterogéneos.

(a) Sistema lábil con ligando de pequeño tamaño (DML = DM)

En el caso de que el ligando que compleje al metal sea pequeño, entonces los
coeficientes de difusión del metal y del complejo serán similares y por ello, el tiempo de
transición límite del metal será igual al tiempo de transición límite del metal en presencia
de ligando; sin embargo el parámetro E1/2 se verá modificado puesto que existirá un
equilibrio entre el metal y el complejo y será necesario aplicar más energía para
desplazarlo. Por ello, cuando el sistema es lábil, la altura de la curva SSCP no variará con
respecto a la del metal en ausencia de ligando, pero estará desplazada hacia valores de
potencial más negativos [van Leeuwen y Town, 2002b].

La influencia de este desplazamiento puede explicarse con la siguiente deducción para

casos de complejos lábiles:

c 0  c 0  c 0
 M, T M ML

 0
c ML (3.25)
K '  0
 cM

0 , se tiene que
Si se divide la expresión anterior de la concentración entre c M
167
Capítulo 3

0
cM 0 0
,T cM c ML
   1  K' (3.26)
0
cM 0
cM 0
cM

0
cM
0  ,T
cM (3.27)
1  K'

Con lo cual,

0 0
cM
cM ,T
  (3.28)
c00 (1  K ' )c 0 0
M M

con la correspondiente modificación de la ecuación (3.1):

 c0   c0 
RT RT  M, T  0 '  RT Ln M, T 
Ed  E0  Ln(1  K ' )  Ln   E   (3.29)
nF nF  c 0 0  nF  c 0 0 
 M   M 

En presencia de ligando, se introduce un factor nuevo K’ que afectará a  y por tanto,

a la curva SSCP [van Leeuwen y Town, 2002b]. Combinando la ecuación (3.28) con la
(3.29) se obtiene una expresión para  en función del potencial, que es la que se cumple
también para el caso de metal sin ligando:

 nF
  exp 
Ed  E0  (3.12)
 RT 

siendo

 c0   0
cM 
RT RT  M, T  RT  ,T 
Ed  E0   Ln(1  K ' )  Ln   Ln   (3.29)
nF nF  c 0 0  nF  (1  K ' ) c 0 0 
 M   M 

Atendiendo a estas expresiones y de forma similar a lo explicado para la ecuación

(3.19), la ecuación para la curva SSCP en el caso de complejos lábiles con ligando
pequeño, viene dada por la ecuación:

I *d,ML  d
 M L  1  exp( t d /  d ) (3.30)
Is

donde el subíndice M+L denotará que en el sistema hay ligando.

En este caso, I*d,ML viene definida como

168
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

 
*  1  1
I *d,ML  nFAD M c M  (3.31)
,T
 
 M ro 

y d se expresa de la misma manera que en el caso de sistemas que solo contengan metal
(ecuación (3.17)):
1
V  1 1 
d     (3.17)

AD M    M ro 


con la diferencia de que en sistemas lábiles el parámetro  viene definido por la ecuación
(3.28).

I *d,ML  d
El factor en la ecuación (3.30) no afecta la posición de la curva en el eje x
Is
(correspondiente al parámetro Ed) [van Leeuwen y Town, 2002b]. Por lo que, considerando
solamente el término exponencial se puede obtener una expresión para el desplazamiento
del potencial de semi-onda debido a la formación de complejos (Ed,1/2), que es equivalente
a la expresión de DeFord-Hume [DeFord y Hume, 1951], y que no depende del tamaño del
ligando:

E d,1 / 2  
RT
Ln1  K '  LnM*  L / M*  (3.32)
nF

La mayor ventaja de la técnica SSCP es la posibilidad de calcular las constantes de

estabilidad del sistema de estudio. La constante de estabilidad condicional K’ puede
calcularse mediante la ecuación (3.32) en todas las situaciones dinámicas posibles
(complejos lábiles, semi-lábiles o no lábiles).

(b) Sistema lábil con ligando de mayor tamaño (DML < DM)

Cuando el metal está complejado con un ligando grande, difunde más lentamente que
si está como metal libre. Entonces se define un coeficiente de difusión promedio, que
estará comprendido entre DM y DML [van Leeuwen y Town, 2002b]:

c *M D M  c *ML D ML
D (3.33)
*
cM ,T

Del sistema de ecuaciones siguiente, se puede obtener la relación entre D y DM:

169
Capítulo 3

 c * D M  c *ML D ML
D  M
 *
cM ,T

 *
c ML
K '  (3.34)
 cM *


c *  c *  c *
 M, T M ML

1  (D ML / D M )K ' 1  K '
D DM  DM (3.35)
1  K' 1  K'

donde se define ( D ML / D M ) = .

Dado que el espesor de la interfase depende del coeficiente de difusión, se define de

igual manera un espesor promedio, tal que

 Dt (3.36)

que a su vez es proporcional a una constante  que depende de la agitación y la geometría

de la celda [Rocha y col., 2007]:
1/3
  D (3.37)

De esta forma, se tiene que en presencia de ligando:

 
* 1  1 
I *d,ML  nFADc M (3.38)
,T
 r 
 o 

1
V  1 1 
 d,ML   (3.39)

AD   ro 

donde  viene definida por la ecuación (3.12) y (3.28).

Teniendo en cuenta que en ausencia de ligando (ver apartado 3.3.2.1.), la corriente

límite de deposición se expresaba como:

 
*  1  1 
I *d  nFAD M c M (3.11)
 
 M ro 

*
y dado que en estas circunstancias se cumplía que c M *
, T = c M , se puede indicar que:

 
*  1  1 
I *d,M  nFAD M c M (3.40)
,T
 
 M ro 
170
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Dividiendo la ecuación (3.38) entre la (3.40), se obtiene:

1 
 
 1
  1 
1 
 r  1 / 3  
I *d,ML D D  D ro 
 o  
  (3.41)
I *d,M DM  1 1  DM  1 1 
    
   1 / 3
ro 
 M ro   D M

Igualmente, y dado que:

I *d t d
*  (3.20)
Is

y que td e Is son las mismas en ausencia y presencia de ligando, se tiene que

*
M L I *d,ML t d / I s I *d,ML
  (3.42)
*
M I *d,M t d / I s I *d,M

por lo que, teniendo en cuenta la ecuación (3.35), se obtiene:

1     
  1   1 1   1 1 
 1 / 3    1 / 3  
*  r  ro  ro 
M L D  o D  D
  1  K '  D 
   (3.43)
* DM  1
M
 1  D M  1 1  1  K' 
 1 1 
  
   1 / 3   1/3
ro 
 M ro   D M ro   D M

Para un macroelectrodo, donde 1/r0 << 1/, la ecuación se reduce a:

2/3 2/3
*
M  D   1  K ' 
L
     (3.44)
*
M D   1  K' 
 M 

Ésta sería la máxima diferencia de altura * que existiría entre las curvas SSCP en
presencia y ausencia de ligando, siempre que el sistema sea lábil. Para sistemas no lábiles,
la diferencia de altura será mucho más acusada.

Si se aplicara esta expresión al caso de ligandos pequeños, para cualquier tipo de

electrodo, se cumpliría que D = DM y por tanto, las alturas de ambas curvas serán iguales
(  M
*
L =  M ), que fue lo que se indicó en el apartado anterior.
*

La expresión para la curva SSCP en este caso viene dada por la ecuación:

I *d,ML  d
 M L  1  exp(  t d /  d ) (3.30)
Is

171
Capítulo 3

donde I*d,ML y d han quedado definidos en las ecuaciones (3.38) y (3.39), respectivamente.

Así, se proponen dos maneras de calcular la K’ cuando el sistema es lábil, bien a partir
del desplazamiento del potencial de deposición de semi-onda E d,1 / 2 (ecuación (3.32), que
no dependía del tamaño del ligando) o bien a partir del tiempo de transición límite *
(ecuación (3.43) o (3.44)).

Si el sistema no es completamente lábil, la concentración de metal reducido en el

*
interior del electrodo c M es menor que en sistemas totalmente lábiles, y por tanto, también
será menor M * . En este caso de no labilidad, no es posible calcular la constante utilizando
L
la variación del tiempo de transición límite (ecuación (3.43)), puesto que su aplicación
proporcionará una sobreestimación de K o incluso valores negativos de la constante.

(c) Sistemas no lábiles

En este caso, entra en juego el parámetro , y la corriente límite de deposición vendrá

dada por [Ferreira Domingos, 2006]:
1
 d  
I *d,ML  * 
nFAc M  (3.45)
 
 D(1  K ' ) D M 

* es la concentración de metal sin complejar en el seno de la disolución.

donde c M

Igualmente, d también se ve modificada:

V  d    

d   (3.46)

A  D(1  K ' ) D M 


donde  viene definida por la ecuación (3.12) y (3.28).

Estas dos últimas expresiones se pueden usar de manera general, tanto si el sistema
es lábil como si no lo es, de manera que si es lábil, << d , por lo que puede
despreciarse y el segundo término dentro del paréntesis en (3.45) y (3.46) desaparece. En
1
1 
* (1  K ' )  c *
este caso, dado que c M   1 
M , T y que d  , se tiene la siguiente ecuación:
 ro 


1 * D
 d  * D(1  K ' )
nFAc M nFAc M  
* 
I *d,ML  nFAc M   
,T * 1  1
 nFADc M  (3.47)
 D(1  K ' )  ,T
d d  r 
   o 

que es la que se obtuvo anteriormente para el caso de complejos lábiles (3.38).

172
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

De esta forma, se obtendría una ecuación teórica para la curva SSCP que sería
aplicable tanto para sistemas lábiles como no lábiles:

I *d  d
 1  exp(  t d /  d ) (3.19)
Is

donde I *d y d han sido definidas en las ecuaciones (3.45) y (3.46).

La labilidad del sistema podrá ser estudiada mediante el cálculo y la comparación del
valor de K’ obtenido a partir de E d,1 / 2 (ecuación (3.32)) y el valor de K’ obtenido a partir
de * (ecuación (3.43) o (3.44)); o bien mediante el cálculo del parámetro  y su
comparación frente al valor de d [Ferreira Domingos, 2006].

(d) Sistemas en presencia de ligandos heterogéneos

Es frecuente encontrar en la naturaleza ligandos complejantes que muestran efectos

polifuncionales, polielectrostáticos y conformacionales, debido a su variedad de grupos
funcionales, a su alta densidad de carga y a su estereoquímica, respectivamente. Este tipo
de ligandos presentan heterogeneidades puesto que contienen una gran variedad de
grupos funcionales complejantes, los cuales actúan de diferente manera en la complejación
del metal. Por ello, en los sistemas de complejos metálicos con ligandos heterogéneos,
existirán varios coeficientes de difusión del complejo [Town y van Leeuwen, 2002].

SSCP es una técnica que permite también identificar la presencia de ligandos

heterogéneos [Buffle, y col., 1987; Town, 2008]. De hecho, la presencia de sustancias
como ácidos fúlvicos o húmicos causa una disminución de la altura de la curva SSCP y un
ensanchamiento de la misma a lo largo del eje x (Ed) en comparación con la obtenida con
un sistema homogéneo [Van Leeuwen y Town, 2003a]. En muestras donde existen
complejos con ligandos heterogéneos, la ecuación (3.32) no puede aplicarse debido a que
no se conoce con exactitud el coeficiente de difusión medio D , pero su variación permite
identificar la presencia de este tipo de ligandos. Los ligandos heterogéneos tienen tamaños
muy diversos y desconocidos, por lo que una sola constante de estabilidad condicional no
puede describir la fuerza de los diferentes enlaces que pueden producirse entre el metal y
el ligando.

173
Capítulo 3

3.4. Fundamentos teóricos de la técnica AGNES

Galceran y col. han propuesto recientemente una nueva técnica de redisolución para la
determinación de la concentración de metal libre: AGNES (Absence of gradients and
Nernstian equilibrium stripping o Redisolución en ausencia de gradiente y en equilibrio
Nernstiano) [Galceran y col., 2004]. Esta técnica consiste en la aplicación de dos etapas
fundamentales:

- Una etapa de deposición del metal presente en la disolución hacia un electrodo de

mercurio en la que se alcanza una situación de equilibrio con ausencia de gradientes
en los perfiles de concentración de todas las especies, y un equilibrio Nernstiano del
par redox en la superficie del electrodo.

- Una etapa de redisolución y cuantificación del metal reducido y acumulado en la

amalgama de mercurio.

La etapa de deposición consta de un período con agitación y otro sin agitación, y la

etapa de redisolución, en la que se lleva a cabo la medida, se realiza en ausencia de
agitación.

La respuesta analítica que proporciona esta técnica después de aplicar un programa de

potencial en la etapa de deposición es la intensidad de corriente. La concentración del
metal amalgamado y la corriente de redisolución faradaica son proporcionales a la
concentración de metal libre en la disolución.

AGNES puede aplicarse mediante dos metodologías para la primera etapa,

denominadas AGNES de un pulso (AGNES 1P) y AGNES de dos pulsos (AGNES 2P). Sus
principales diferencias radican en el número de subetapas de deposición y en los tiempos
necesarios [Chito Trujillo, 2012]. En la Figura 3.8 se representan de forma general los
programas de potencial que tienen lugar en AGNES 1P y AGNES 2P.

A continuación se explicará con más detalle cómo transcurren las etapas en las que se
basa la técnica AGNES.

174
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

(a)
E
Medida
+

E2

Con agitación Sin agitación

E1
tw
-
t
t1 t2

(b)

E
Medida
+

E2

Con agitación Sin agitación

E1,b

E1,a

-
t1,a t1,b tw t

t1 t2

Figura 3.8. Esquema del programa de potencial y agitación en AGNES: (a) AGNES 1P, (b):
AGNES 2P [Companys y col., 2005; Galceran y col., 2007]

175
Capítulo 3

1. Primera etapa: preconcentración hasta alcanzar ausencia de gradiente de concentración

manteniendo el equilibrio Nernstiano en la superficie del electrodo.
Consiste en una deposición o preconcentración del metal hasta que se alcanza la
ausencia de gradiente de concentración a ambos lados de la superficie del electrodo,
mientras se mantiene constante la relación del par electroactivo según el equilibrio de
Nernst. En este paso se asume que el electrodo de mercurio tiene un volumen mucho más
pequeño que el de la disolución con la que está en contacto. Esta disolución contiene un
ion metálico M, cuya forma reducida M0 se disolverá en el mercurio formando una
amalgama. Durante la etapa de deposición se produce la siguiente reacción en el sistema:

M  ne   M0 (Hg) (3.48)

En esta etapa, se aplica un potencial constante de reducción (que se denota por E1 y

es unos milivoltios más negativo que el potencial estándar del par redox) durante un
tiempo suficientemente largo t1, agitando durante un tiempo t1-tw, y sin agitación durante
el tiempo de reposo tw. Al final de esta etapa, el flujo de metal que atraviesa la superficie
del electrodo se hará cero y las concentraciones de metal a cada lado de la superficie
estarán en equilibrio Nernstiano.

En esta técnica se define un nuevo parámetro Y, como la relación que existe entre las
concentraciones de metal a ambos lados de la superficie del electrodo en cualquier
momento del proceso:

c00
M
Y  (3.49)
0
cM

Cuando los perfiles de concentración consiguen una forma plana (Figura 3.9.a), se
alcanza el equilibrio Nernstiano, siendo las concentraciones c 0 0 y c 0 iguales a la
M M
*
concentración final de metal reducido dentro de la gota de mercurio c M 0 , y a la
* , respectivamente.
concentración de metal presente en la disolución c M

Aplicando la ecuación de Nernst, se tiene:

*
cM
Y 
*
0  nF
 exp    
E1  E 0'  (3.50)
cM  RT 

donde E 0 ' es el potencial formal estándar del par redox. El término Y es, por tanto, el
aumento en concentración del metal a través de la superficie, debido a su preconcentración
en la amalgama, y está relacionado con el factor (E1 - E 0 ' ). Este término no depende de las
características del medio (adsorción o complejación) y puede controlarse
experimentalmente a través de E1. A menos que la transferencia electrónica entre M y M0

176
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

sea extremadamente lenta, por lo general el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio es
mucho menor que el que se necesita para llegar a la condición de ausencia de gradiente.

Estrictamente hablando, AGNES mide actividades (puesto que su fundamento está

basado en la ecuación de Nernst), sin embargo, esas actividades pueden referirse a
concentraciones puesto que la fuerza iónica de las disoluciones estudiadas se fija en un
valor constante.

a)
t=t1
Amalgama Disolución
c*M 0

c*M 0
=Y
c*M

c*M

b)
Amalgama Disolución t=t1+t2

c*M 0

cM 0 cM

c*M

r=0 r=r0
Centro Superficie
de la gota del electrodo

Figura 3.9. Perfil de concentraciones dentro (región gris a la izquierda) y fuera del
electrodo de mercurio durante la técnica AGNES: (a) Perfiles al final de la etapa de
deposición (t=t1) exhibiendo la ausencia de gradiente y una relación fija (Y) entre las
concentraciones de las especies en la interfase; (b) Perfiles durante t2 en la etapa de
redisolución con detección de la I [Galceran y col., 2004]

177
Capítulo 3

La duración de esta primera etapa, t1, puede verse reducida si se divide en dos sub-
etapas, que es lo que ocurre en AGNES 2P [Companys y col., 2005]:

(a) Aplicación de un potencial E1,a tal que Y sea suficientemente grande, denominado
Y1,a (bajo condiciones de difusión limitada) durante un tiempo t1,a de forma que, al
menos, la mayoría de los moles requeridos dentro del electrodo sean
proporcionados por el medio.

(b) Aplicación de un potencial E1,b correspondiente al factor de preconcentración

deseado Y (que también puede ser denotado como Y1,b) de manera que los perfiles
lleguen a ser suficientemente homogéneos después de t1,b. Después de aplicar E1,b
durante un tiempo t1,b con agitación, existe un periodo sin agitación tw, para
asegurar que se han alcanzado las condiciones requeridas y evitar los posibles
efectos de la agitación durante la medida de la corriente en el siguiente paso.

Si se aplica el potencial E1,a durante un tiempo muy largo, entrará en la gota gran
cantidad de metal, lo que dará lugar a un exceso de metal dentro del electrodo. En esta
situación, para alcanzar las condiciones de ausencia de gradiente y equilibrio Nernstiano se
necesitaría aplicar tiempos muy largos durante la segunda sub-etapa (t1,b). Se ha
demostrado [Companys y col., 2005] que cuando se trabaja con una concentración de
ligando libre constante, si t1,b=3t1,a es suficiente para evitar cualquier exceso de metal y
poder llegar a las condiciones de AGNES.

2. Segunda etapa: determinación de la concentración de metal reducido en la gota.

Esta etapa se basa en la detección de la concentración de metal c M * que se ha

o

preconcentrado en la gota durante la etapa previa. Para ello, se aplica un potencial E2 de

reoxidación, relacionado con un factor de preconcentración Y2, durante un tiempo t2, de tal
forma que se revierta el proceso (3.48) para obtener:

M 0 (Hg)  M  ne  (3.51)

El potencial que se aplica debe ser suficientemente positivo para garantizar condiciones
de difusión limitada, de tal forma que la respuesta analítica (corriente faradaica, Ifaradaica)
sea proporcional a la concentración de ión libre e independiente de cualquier fenómeno
que puede producirse en la disolución (como complejación, convección o adsorción).

La cuantificación del metal reducido se calcula a partir de la diferencia entre la

corriente medida a un tiempo t2 y la corriente de un blanco medida a este mismo tiempo.
Por lo tanto, la función respuesta de AGNES será [Chito Trujillo, 2012]:

I faradaica  I t 2  I blanco (3.52)

178
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

La corriente medida está formada por:

(a) La corriente capacitiva Ic, debida principalmente a la diferencia entre el potencial

de deposición y el de reoxidación.

(b) La corriente debida a la reducción del oxígeno I O 2. El oxígeno estará presente en la

muestra a nivel de trazas, a pesar de haber pasado flujo de N2 por la celda.

(c) La corriente faradaica debida al analito If.

(d) La corriente faradaica debido a otras especies distintas del analito Ifna.

Así, la corriente total medida con AGNES a t2 se puede expresar como:

I t 2  I c  I O2  I f  I fna (3.53)

Por ello, la medida del blanco permite eliminar todos los componentes que no sean
faradaicos de la corriente, así como los faradaicos debidos a las especies que no son el
analito.

Para la medida de este blanco se puede utilizar el propuesto por Galceran y

colaboradores, que se denomina shifted blank o blanco realizado a un potencial desplazado
[Galceran y col., 2007]. Estudios anteriores utilizaban como blanco una disolución sintética
preparada con la misma composición que la muestra, pero sin metal añadido. Este blanco
presenta una serie de limitaciones: (a) la presencia de trazas de metal por contaminación
no se evita fácilmente, y si la concentración de metal en el blanco no se determina
correctamente, habrá una pérdida de exactitud en el método cuando se analicen muestras
de bajas concentraciones de metal; (b) resulta muy difícil preparar muestras sintéticas
cuyas matrices sean similares a las de las muestras naturales. Por ello, Galceran y col.,
propusieron un nuevo sistema para evaluar el blanco, que consiste en analizar la propia
muestra utilizando el mismo programa de potencial que para las medidas reales, pero
solamente con un pulso (AGNES 1P) y desplazando el potencial de deposición E1 una
cantidad Eshift hacia valores menos negativos, en los que no se deposita el metal de
interés, de forma que el valor de Y, y por tanto, de la corriente faradaica sea despreciable.
En términos de ganancia, el valor del blanco shifted es insignificante al de la medida.
Usualmente, el potencial de deposición para el shifted blank E1,sb corresponde con un factor
de preconcentración (Y1,sb=0,01) y el potencial de redisolución E2,sb se aplica de forma que
se produzca el mismo salto de potencial que en la medida del metal en la muestra, que se
realiza aplicando AGNES 2P [Rocha y col., 2010]. Así, la preconcentración Y2,sb se puede
calcular como el producto del factor de preconcentración de deposición del blanco Y1,sb por
el de stripping Y2 entre el de deposición Y1,b de la medida principal, es decir: Y2,sb = Y1,sb ·
Y2 / Y1,b [Chito Trujillo, 2012].
179
Capítulo 3

En la Figura 3.10 se observa una gráfica de intensidad frente al tiempo, obtenida

mediante la aplicación de AGNES para una muestra y su blanco.

-7
0.900x10
0,9·10-7

0,8·10-7-7
0.800x10

0,7·10-7-7
0.700x10 E1,a = -0,6813 V
E1,b = -0,4962 V
0,6·10-7-7
0.600x10
I (A)

0,5·10-7-7
0.500x10

0,4·10-7-7
0.400x10

0,3·10-7-7
0.300x10

0,2·10-7-7
0.200x10

0,1·10-7-7
0.100x10 E1 = -0,3875 V

00
00 25.0
25 50.0
50 100
75.0
75
t (s) t (s)
Figura 3.10. Valores de intensidad (señal analítica) frente al tiempo mediante la técnica
AGNES 2P para una muestra de agua de mar sintética (línea roja) con una concentración
de Pb(II) de 6·10 -7 mol/L y su correspondiente shifted blank (línea azul) realizado con
AGNES 1P

El perfil de concentración que se alcanza en esta etapa de redisolución se muestra en

la Figura 3.9.b.

En AGNES, puesto que la corriente faradaica no depende de las características de la

disolución, no es necesario conocer los parámetros relacionados con la muestra, como
concentración de ligando, constantes cinéticas o coeficientes de difusión del metal y del
complejo.

Debido a la naturaleza lineal de la ecuación de continuidad del metal reducido dentro

de la gota de mercurio y teniendo en cuenta la condición inicial de perfil plano y la
condición de contorno, según la cual c M0  0 en la interfase electrodo-disolución [Galceran
y col., 2004], la intensidad medida es proporcional a la concentración de metal reducido al
final de la primera etapa. Se establece entonces una relación, cuyo factor se denota por ,
entre la intensidad faradaica y la concentración de metal reducido en la gota:
*
I faradaica  c M (3.54)
0

180
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

donde  solo depende del tiempo transcurrido en la etapa de redisolución y de las

características del proceso de difusión de M0 hacia el interior de la gota (tamaño y forma
del electrodo y coeficiente de difusión) [Galceran y col., 2010].

Por otro lado, de la ecuación (3.50) se obtiene que la concentración de metal reducido
es:
*  Yc *
cM (3.55)
0 M

Sustituyendo esta ecuación en la ecuación (3.54), se encuentra que la intensidad

medida en la etapa de redisolución y la concentración de metal libre quedan relacionadas a
través de un factor de proporcionalidad h :
*  hc *
I faradaica  Yc M (3.56)
M

donde h es un factor que depende de la geometría y tamaño del electrodo de mercurio, el

tiempo de medida y la ganancia.

El factor h puede determinarse experimentalmente realizando una calibración por

adición estándar, en la que se mide la corriente de una muestra con diferentes
concentraciones de metal libre conocidas. De esta forma, si la calibración y la medida de la
muestra problema se realizan con el mismo electrodo, mismo potencial aplicado y mismos
tiempos característicos, bastará con conocer el valor de h para determinar la concentración
libre de metal en cualquier muestra problema.

Alternativamente al uso estándar de la intensidad de corriente como función respuesta

de AGNES, recientes trabajos [Galceran y col., 2010; Parat y col., 2011a] han propuesto
utilizar la carga Q. Esta carga, que corresponde con la reoxidación total de M0, se obtiene
integrando la ecuación (3.54) para el tiempo de la etapa de redisolución t2:

     *
Q

0
Idt 2 

0
* dt  
c M0 2 

 dt
0
2 c 0   c * 0
 M

Q M
(3.57)

donde se utiliza el subíndice Q para indicar que la proporcionalidad se refiere a la carga, y

no a la corriente. Q se relaciona con el volumen del electrodo. Si se asume un electrodo
esférico de radio ro, se tiene que:

4
 Q  2F ro3 (3.58)
3

Combinando las ecuaciones (3.55) y (3.57), se puede escribir:

*   Yc *  h c *
Q   Q cM (3.59)
0 Q M Q M

181
Capítulo 3

Si se ha determinado previamente hQ en una calibración, las medidas de la carga Q en

una muestra problema proporcionarán la concentración libre de metal:

*  Q
cM (3.60)
hQ

También se ha estudiado otra variante de la técnica, que se denomina AGNES-SCP en

la que se aplica una corriente de redisolución Is y se mide el tiempo necesario para la
reoxidación (). El producto Is se corrige teniendo en cuenta la contribución de otros
oxidantes presentes en la disolución, obteniendo la expresión Q=(Is-Iox), que corresponde
al valor de la carga faradaica [Parat, 2011b].

3.5. Material y metodología de análisis de Pb en agua de mar utilizando

AGNES y SSCP

3.5.1. Disoluciones y equipos utilizados

El material utilizado para este capítulo fue el siguiente:

- El pH de todas las disoluciones fue medido con un pH-metro modelo Microprocessor

(Hanna Instruments) equipado con un electrodo combinado de vidrio-Ag/AgCl XC 250,
calibrado mediante patrones de pH 4 y 7.

- Las medidas de SSCP y AGNES se llevaron a cabo utilizando un potenciostato Eco Chemie
Autolab PGSTAT12 conectado a un equipo de Metrohm 663 VA Stand y a un ordenador con
el software GPES 4.9 (Eco Chemie) (Figura 3.11). Tanto en SSCP como en AGNES, se
utilizó un electrodo de gota colgante de mercurio (HMDE) como electrodo de trabajo, un
electrodo de referencia Ag/AgCl saturado con NaNO3 0,55 mol/L y un electrodo auxiliar de
carbono vitrificado.

Figura 3.11. Equipo Metrohm 663 VA Stand con potenciostato Eco Chemie Autolab
PGSTAT12
182
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

- El carbono orgánico de la muestra de agua de mar real se evaluó con el equipo analizador
de carbono modelo 3100 (Analytik Jena, Alemania).

La preparación de las disoluciones utilizadas en este capítulo se encuentra detallada en

el Anexo 1. Todas las disoluciones se prepararon en agua desionizada Milli Q. Las
disoluciones de plomo se prepararon por dilución de una disolución estándar de 1000 mg/L
de Pb (Merck, Alemania). Las disoluciones de NaNO3 se prepararon a partir del sólido de
calidad para análisis (Merck, Alemania). Las disoluciones reguladoras ácido 2-morfolino
etano sulfónico (MES) 0,2 mol/L a pH 6 y ácido 3-morfolino propano sulfónico (MOPS) 0,2
ml/L a pH 7 fueron preparadas a partir del sólido (Fluka, Microselect, >99.5%). El ácido
fúlvico fue cedido por Dr. Cooper Langford, de la Universidad de Calgary (Canadá). Las
muestras de agua de mar sintéticas se prepararon disolviendo en agua Milli Q la sales
presentes en agua de mar, en las concentraciones indicadas por Grasshoff y colaboradores
[Grasshoff y col., 1982] (ver Tabla 2.26 en el Capítulo 2). Todas las sales utilizadas fueron
de calidad para análisis (Merck, Alemania). Todo el material de laboratorio se limpió con
HNO3 (20% v/v) y enjuagado con agua Milli Q.

Previo al uso de las disoluciones de NaNO3 y de agua de mar sintética, se evaluó

sistemáticamente el nivel de contaminación que pudieran presentar estas disoluciones
debido a la presencia de trazas de Pb(II) en el nitrato sódico y en las sales inorgánicas
utilizadas para preparar las disoluciones. Esta determinación se realizó mediante
voltamperometría de redisolución anódica de onda cuadrada (SW-ASV), ya que ofrece
límites de detección muy bajos para metales pesados (del orden de 10-10 mol/L) [Chito
Trujillo, 2012]. Se aplicó el método de calibración por adición estándar, utilizando un
tamaño de gota de 2,5·10-7 m2. Los parámetros físicos, químicos y electroquímicos
utilizados para llevar a cabo la técnica SW-ASV se detallan en la Tabla 3.4.

Se comprobó que los niveles totales de Pb(II) en las disoluciones preparadas de NaNO3
(0,55 mol/L) y agua de mar sintética eran inferiores a 5,04·10-9 y 6,70·10-9 mol/L,
respectivamente.

La temperatura del laboratorio se midió diariamente para todos los experimentos y fue
de 23±0,8ºC. Las variaciones en la temperatura fueron insignificantes, no influyendo así en
los resultados.

183
Capítulo 3

Tabla 3.4. Parámetros físicos, químicos y electroquímicos utilizados en la determinación de

Pb(II) por SW-ASV
Parámetro Valor

Potencial de deposición -1,3 V

Tiempo de deposición 30 s

Tiempo de equilibración 15 s

Potencial inicial de barrido -1,3 V

Potencial final de barrido -0,05 V

Salto de potencial 0,00495 V

Amplitud de pulso 0,01995 V

Velocidad de agitación 2500 min-1

Volumen de muestra 25 mL

Concentración de la disolución estándar de Pb(II) 10-4 mol/L

Rango de la calibración Blanco-1,4·10-6 mol/L

Volúmen de la primera adición estándar 150 L

Volúmen de la segunda y tercera adición estándar 100 L

3.5.2. Metodología de análisis de Pb en agua de mar utilizando AGNES y

SSCP
El objetivo de este trabajo es estudiar la aplicabilidad de las técnicas AGNES y SSCP al
análisis de la especiación dinámica de Pb(II) en agua de mar. Al aplicar estas dos técnicas
a una misma muestra, se obtendrá por un lado el valor de concentración de Pb(II) libre y,
por el otro, las constantes de estabilidad de los posibles complejos formados. Además, se
podrá estimar el carácter lábil de los complejos de plomo presentes en el sistema.

Para ello, se verificará la adecuación de ambas técnicas al estudio de este metal en

aguas de mar sintética y real a diferentes valores de pH, abordando las dificultades que
existen en estas matrices. Las muestras de agua de mar real se tomaron en la costa de
Faro (Portugal), durante la estancia realizada en la Universidade do Algarve, y se
almacenaron en botellas de PVC previamente lavadas con HNO3 2 mol/L (de calidad

184
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Suprapur, Merck, Alemania) y agua Milli Q. Puesto que no presentaban gran cantidad de
materia particulada, se analizaron sin filtrar con el objeto de no alterar los posibles
equilibrios presentes en las mismas.

En la zona de Faro no se habían detectado en estudios previos concentraciones de

plomo suficientemente altas para realizar un estudio de especiación (Pb(II) ≈ 10-9 mol/L)
[Santos-Echeandía y col., 2012], por lo que en los estudios realizados en este capítulo se
adicionó una alícuota de una disolución de plomo a las muestras de agua de mar real, de
forma que la concentración de plomo total resultara del orden de 6·10-7 mol/L. La misma
cantidad de plomo también fue adicionada a las muestras de agua de mar sintéticas.

Por ello, y dado que los niveles de Pb(II) presentes en dichas muestras, así como en
las disoluciones de NaNO3 y agua de mar sintética fueron previamente evaluadas,
obteniéndose valores del orden de 10-9 mol/L, y puesto que las adiciones sucesivas de este
metal para aplicar ambos métodos fueron de entre 100 y 1000 veces mayores, el contenido
metálico total que se utilizó en los cálculos de especiación en la disolución fue igual a la
concentración de Pb(II) añadido en cada una de las adiciones.

3.5.2.1. Metodología para el análisis del carbono orgánico

Debido a que la presencia de materia orgánica en las muestras de agua reales influye
notablemente en el grado de complejación de los metales, antes de proceder a la
aplicación de AGNES y SSCP a las muestras de agua de mar real, se evaluó el carbono
orgánico total utilizando el equipo analizador de carbono Analytic Jena 3100. Este
analizador utiliza el método diferencial, en el que el contenido de COT es obtenido por
diferencia del contenido de carbono total y el contenido de carbono inorgánico en la
muestra. El procedimiento seguido para analizar ambas concentraciones de carbono en las
muestras fue el siguiente:

Análisis del contenido de carbono total

1. Se colocó la muestra en el automuestreador y de forma automática se inyectaron
500 L en el horno vertical de cuarzo.

2. Al encontrarse el horno a una temperatura de 800 °C el carbono procedente de la

muestra, tanto orgánico como inorgánico, fue transformado en CO2 y vapor de agua,
catalizado por la presencia de platino.

3. El CO2 producido fue transportado a través de un flujo continuo de gas O2 a un

detector de infrarrojo donde se determinó la concentración de carbono total a partir de
un calibrado realizado con una mezcla de carbonato/bicarbonato.
185
Capítulo 3

Análisis del contenido de carbono inorgánico

1. Otra porción de 500L de muestra fue inyectada en una cámara de acidificación
que contenía ácido ortofosfórico (H3PO4) al 10%, con control de temperatura a 10ºC,
en la que burbujeaba continuamente gas O2.

2. Al llegar a la cámara, el carbono inorgánico presente en la muestra sufrió la reacción

siguiente:

H3PO4
Cinorg + O2 CO2 + H2O

3. El CO2 producido en el paso anterior se determinó a través del mismo detector que
el carbono total.

3.5.2.2. Experimentos de AGNES-SSCP

Cada experimento de AGNES y SSCP se llevó a cabo en la misma celda electroquímica
(una técnica se aplicó seguida de la otra) durante el mismo día. Las experiencias de SSCP
se realizaron en régimen de redisolución completa (I constante).

A continuación se detalla la metodología seguida para el análisis de plomo en las

muestras de agua de mar:

3.5.2.2.1. Metodología para AGNES

La técnica que se utilizó en esta tesis para determinar el metal libre fue AGNES 2P. La
aplicación experimental de dicha técnica implica la siguiente secuencia de etapas:

1. Determinación del potencial de óxido-reducción del metal (Epeak) en las condiciones

de trabajo mediante la técnica de polarografía de impulso diferencial (DPP). Con este
parámetro se determinó el potencial de deposición E1 que se aplicó posteriormente en
AGNES.

2. Evaluación del parámetro h mediante calibración de una disolución de metal sin

ligando.

3. Aplicación de AGNES a la muestra de estudio.

A continuación, se detallará cada una de las etapas:

186
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

(1) Determinación de Epeak a partir de una medida de DPP para obtener el potencial de
deposición E1
El potencial de deposición que se debe aplicar a la muestra viene definido por la
ecuación (3.61), que resulta de la combinación de la ecuación (3.50) con la expresión para
DPP en el caso de electrodo plano [Bard y Faulkner, 2001]. Así, se tiene que

DM  nF  E DPP 
Y  exp    E 1  E peak    (3.61)
D M0  RT  2  

donde D M y D M0 son los coeficientes de difusión del ión metálico libre y del metal reducido
en la amalgama, y E DPP es la amplitud de pulso, parámetro característico de la técnica
DPP.

Conociendo Epeak y la ganancia Y que se quiere alcanzar durante la etapa de

preconcentración, se obtiene el valor de E1 de deposición que se debe aplicar, teniendo en
cuenta que para el plomo, los coeficientes de difusión son: DPb = 9,85·10-10 m2/s y DPb0 =
1,25·10-9 m2/s; y que el valor de n es igual a 2.

Así, previamente al procedimiento de AGNES, se debe llevar a cabo un experimento de

polarografía de impulso diferencial (DPP) con el fin de determinar el potencial de óxido-
reducción del metal Epeak de forma precisa para cada experimento, evitando así las posibles
desviaciones en el electrodo de referencia.

Para ello, se colocaron en la celda del polarógrafo 25 mL de una disolución acuosa de

NaNO3, con una fuerza iónica similar a la de agua de mar (0,55 mol/L). El pH de esta
disolución fue próximo a 4 o ligeramente inferior, siendo adecuado para evitar la adsorción
de metal sobre las paredes de la celda. La muestra fue purgada con N2 para eliminar las
posibles trazas de oxígeno que pudieran influir en la medida.

La DPP se realizó aplicando un barrido de potencial hacia valores más negativos,

mediante pulsos. En cada pulso se aplicó un potencial más reductor y una amplitud de
pulso E constante. Se realizaron dos medidas de intensidad de corriente: la primera se
efectuó 16,7 ms antes de aplicar el pulso, y la segunda 16,7 ms antes de acabar el pulso.
La diferencia de intensidad por pulso se registró en función del potencial, el cual aumentó
linealmente [Skoog y col., 2001].

Tras una primera adición de plomo a la disolución de NaNO3, se realizó un experimento

DPP con el máximo tamaño de gota (área: 5,2·10-7 m2), que por extrapolación permitió
utilizar la expresión para el caso de electrodo plano (ecuación (3.61)). Los parámetros
utilizados para llevar a cabo la DPP se describen en la Tabla 3.5.

187
Capítulo 3

Tabla 3.5. Parámetros electroquímicos utilizados en las medidas de disoluciones de Pb(II)

por DPP
Parámetro Valor
Tiempo de purga 1h
Intervalo de tiempo para
1s
el salto de potencial
Tiempo de pulso 0,05 s
Potencial inicial de barrido -0,25 V
Potencial final de barrido -0,55 V
Salto de potencial 0,45 mV
Amplitud de pulso (E) 49,95 mV
Velocidad de agitación 2500 min-1

En la Figura 3.12 se observa el polarograma obtenido cuando se aplicó DPP a una

disolución acuosa de NaNO3 con una primera adición de plomo de 6·10-7 mol/L.

-0,15·10-8

-0,25·10-8
I (A)

-0,35·10-8

-0,45·10-8
-0,2 -0,25 -0,3 -0,35 -0,4 Epeak -0,45 -0,5 -0,55
E (V)

Figura 3.12. Polarograma obtenido mediante la técnica DPP aplicada a una disolución
acuosa de NaNO3 0,55 mol/L con una concentración de Pb(II) 6·10 -7 mol/L (parámetros
electroquímicos: ver Tabla 3.5)

188
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

(2) Evaluación del parámetro h mediante calibración de una disolución de metal sin ligando
de fuerza iónica 0,55 mol/L
Después de la determinación del valor de Epeak de la disolución de Pb(II) se evaluó el
parámetro h, a través del cual la intensidad de corriente se relacionaba directamente con la
concentración de metal libre (ecuación (3.56)). Para ello se realizó una calibración a partir
de una disolución de metal que no contenía ligando (NaNO3 0,55 mol/L) y se fueron
adicionando sucesivas concentraciones conocidas de Pb(II).

Así, una vez establecido el potencial del pico de plomo y conocida la concentración de
dicho metal en la disolución, se aplicó la técnica AGNES en las sucesivas adiciones,
obteniéndose los valores de intensidad (señal analítica) correspondientes.

El tamaño de gota en todos los experimentos de AGNES fue 2,5·10-7 m2 y la velocidad

de agitación, 2500 min-1. Los parámetros electroquímicos utilizados en la aplicación de
AGNES en la disolución de Pb(II) en NaNO3 0,55 mol/L fueron establecidos a partir de
estudios previos, y se detallan a continuación:

1. Primera etapa:

(a) Se aplicó un potencial E1,a bajo condiciones de difusión limitada,

correspondiente a Y1,a = 108 durante un tiempo t1,a = 35 s. Estos valores de
ganancia Y y de tiempo fueron elegidos de manera que proporcionaran una señal
de corriente en la muestra al menos 3 veces mayor que la corriente obtenida para
el shifted blank.

(b) Se aplicó un potencial E1,b correspondiente al factor de preconcentración

deseado, que se estableció en Y1,b = 50 durante t1,b = 105 s (t1,b=3t1,a). El tiempo
de espera sin agitación tw fue de 50 s.

2. Segunda etapa:

El potencial aplicado E2 correspondió con Y2 = 1·10-8 bajo condiciones de

reoxidación, durante 50 s. La corriente se midió para t2 = 0,16 s.

El blanco (shifted blank) se realizó con Y1,sb = 0,01, que es despreciable comparado
con la Y1,b que se utiliza en las medidas principales, de manera que el potencial de
deposición calculado utilizando la ecuación (3.61) fue más positivo que en las medidas
principales, y de esta forma, no se depositó nada de metal en la gota. La Y2 para la etapa
de reoxidación fue de 2·10-12 (calculada como Y2=Y1,sb·Y2/Y1,b). Así, la intensidad obtenida

189
Capítulo 3

para el blanco (Iblanco) se le restó a la corriente total medida a t2 (It2) con el fin de obtener
la corriente faradaica (Ifaradaica).

Puesto que la ecuación (3.56) relaciona la intensidad con la concentración de metal

libre, se utilizó el programa de especiación en equilibrio Visual MINTEQ [Herndon y Flowery
Branch, 1999; Gustafsson, 2010] para obtener dicha concentración a partir de la
concentración total presente en cada punto de la calibración y de esta manera, calcular el
valor de h. El programa MINTEQ (Figuras 3.13 y 3.14) es un programa de modelización
científico capaz de simular la especiación de diferentes especies inorgánicas en equilibrio
presentes en una muestra de agua, ya sea sintética o real. Así, mediante la introducción en
el programa de las condiciones experimentales, como son el pH, temperatura, fuerza
iónica, cantidad de carbono orgánico, componentes en la muestra y concentración total del
analito, proporciona información de gran importancia, como son las diferentes especies
químicas en las que el analito puede estar presente en la muestra, así como sus
concentraciones.

Figura 3.13. Ventana principal del programa Visual MINTEQ

190
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Figura 3.14. Datos proporcionados por MINTEQ para las diferentes especies químicas de
plomo y sus concentraciones en una disolución de Pb total 1,4·10 -6 mol/L de fuerza iónica
0,55 mol/L en NaNO3 y pH 4, en ausencia de materia orgánica

(3) Aplicación de AGNES a muestras de agua de mar sintética y real

Después de la evaluación del parámetro h se limpió la celda adecuadamente con una
disolución 2 mol/L de HNO3 (calidad Suprapur) y posteriormente con agua Milli Q, y se
procedió al estudio de la aplicabilidad de la técnica AGNES con muestras de agua de mar
sintética y real.

El pH de las muestras se ajustó con ácido nítrico HNO3 de calidad Suprapur, con la
disolución reguladora de ácido 2-morfolino etano sulfónico (MES) 0,2 mol/L a pH 6 o con la
de ácido 3-morfolino propano sulfónico (MOPS) 0,2 mol/L a pH 7. Se ha demostrado que
ambas reguladoras tienen baja afinidad por el Pb(II) [Soares y col., 1999].
191
Capítulo 3

Una vez que la celda se limpió adecuadamente se comenzó el estudio colocando 25 mL

de muestra de agua de mar en la celda (tanto en el caso de los estudios con agua sintética
como en los de agua real). Se purgó la muestra con N2 para eliminar las posibles
interferencias del O2. Posteriormente, se ajustó la muestra a pH 2,7 haciendo uso de HNO3
y se comenzó el análisis por AGNES, utilizando una gota de área 2,5·10-7 m2. El programa
de potencial aplicado fue el mismo que se utilizó para el análisis de la disolución de metal
sin ligando, de fuerza iónica 0,55 mol/L.

Tras finalizar el programa, se registró la intensidad y se calculó la concentración de

metal libre presente en la muestra mediante la aplicación de la ecuación (3.56), haciendo
uso del valor de h previamente evaluado. Posteriormente, se fue modificando el pH a la
misma muestra contenida en la celda, aplicando sucesivamente la técnica AGNES para
diferentes valores de pH: 5; 6; 7 y 8,6 (en todos los casos se realizaron correcciones de
concentración debido al volumen adicionado para ajustar el pH de las muestras). El
programa de potencial aplicado para el caso de las muestras a pH 5 y 6 fue el mismo que
se aplicó para el caso de la muestra a pH 2,7. Sin embargo, en el caso de las muestras a
pH 7 y 8,6 fue necesario incrementar la sensibilidad del método aumentando el tiempo de
aplicación del potencial de deposición, puesto que a valores básicos de pH la concentración
de metal libre en la muestra es más baja.

Así, para estas últimas muestras, se eligió un valor de ganancia de Y=100, y se aplicó
E1,a durante un tiempo t1,a = 70 s, y E1,b durante t1,b = 210 s. De esta forma, para calcular la
concentración de metal libre que contenía la muestra, se tuvo que duplicar el valor de h
evaluado anteriormente, de forma que la concentración de Pb(II) libre se calculó a partir de
esta expresión:

*  I faradaica
cM (3.62)
2h

Con el fin de validar las medidas de AGNES, las concentraciones de metal libre
obtenidas en las muestras de agua de mar sintética y real se compararon con los valores
teóricos predichos por el programa de especiación en equilibrio MINTEQ.

3.5.2.2.2. Metodología para SSCP

Las etapas en las que consiste la técnica SSCP se detallan a continuación:

(1) Calibración con SSCP de una disolución de metal sin ligando de fuerza iónica conocida
Para aplicar la técnica SSCP a las muestras de agua de mar reales, se requiere primero
realizar una calibración en una disolución de NaNO3 de fuerza iónica similar, mediante la

192
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

cual se obtienen los valores de  y del potencial de semi-onda del metal en una disolución
en ausencia de ligando E1 / 2 ,M.

Previamente se estudió la influencia de la fuerza iónica de la disolución metálica en las

curvas SSCP y, por tanto, en los parámetros  y E1 / 2 ,M . Para ello, se aplicó SSCP a 3
disoluciones de Pb(II) 1,4·10-6 mol/L en NaNO3 de concentraciones 0,01, 0,1 y 0,55 mol/L,
todas ellas a un pH menor que 4 para evitar que el metal se complejara y obtener los
parámetros característicos para una disolución de metal sin ligando.

Así pues, se aplicó la técnica SCP con los parámetros electroquímicos siguientes: el
tiempo de purga inicial fue de 1 hora, la velocidad de agitación fue 2500 min-1, el potencial
de deposición se mantuvo constante durante 45 s (tiempo suficiente para que se
depositara el metal) en un valor Ed tras el cual se aplicó una corriente oxidante de
redisolución Is = 2,5·10-9 A, que proporcionaba, según estudios previos, condiciones de
redisolución completa, dado que se conseguía que el producto Is se mantuviese constante.
Las curvas SSCP se construyeron a partir de las medidas individuales de SCP,
representando los datos de  (área bajo el pico) obtenidos para cada potencial de
deposición Ed, que se varió desde -0,4 V hasta -0,57 V.

En la Figura 3.15 se ha representado un ejemplo de las curvas SCP superpuestas

correspondientes a cada uno de los potenciales de deposición aplicados. Las curvas más
altas corresponden a valores de potencial más negativos. Se puede observar claramente
que para potenciales de deposición suficientemente negativos, el área bajo la curva, es
decir ,fue llegando a su valor límite , a partir del cual se mantuvo constante

Ed=-0,57 V

(s)
Ed=-0,4 V

()

Figura 3.15. Ejemplo de curvas SCP para una disolución de Pb(II) 1,4·10-6 mol/L en
NaNO3 0,55 mol/L a pH 3,76 para diferentes potenciales de deposición (desde -0,4 V hasta
-0,57 V)
193
Capítulo 3

Los valores de  obtenidos de las curvas SCP fueron representados frente al valor de
potencial de deposición Ed aplicado en cada caso. Así, se obtuvieron las curvas SSCP para
cada disolución acuosa de Pb(II) 1,4·10-6 mol/L de diferente fuerza iónica y pH<4 (Figura
3.16).

El valor * (Figura 3.16) o tiempo de transición límite se obtuvo calculando la media de

los valores más altos y constantes de 

40
35 *
30
25
 (s)

20
15
10
5
0
-0,59 -0,54 -0,49 -0,44
Ed (V)
Figura 3.16. Ejemplo de curva SSCP para la disolución de Pb(II) 1,4·10 -6 mol/L en NaNO3
0,55 mol/L construida a partir de los valores de  (s) de las curvas SCP de la Figura 3.15

Una vez obtenidos los puntos experimentales, se pasó a construir la curva teórica
SSCP. Para ello, se diseñó una hoja Excel con los siguientes parámetros: Ed (eje x de la
curva SSCP),  , d, (eje y de la curva SSCP), valor promedio del potencial de deposición
Ed entre un punto y el siguiente, y el incremento del eje y con respecto al incremento del
eje x (y/x). Cada uno de estos parámetros se calculó haciendo uso de las ecuaciones
(3.11), (3.12), (3.17), (3.19) y (3.20). Así, el orden a seguir en los cálculos fue el siguiente:

1. Con los datos obtenidos experimentalmente de *, y con la corriente de

redisolución aplicada Is y el tiempo de deposición td establecido, se calculó la
corriente límite de deposición con la siguiente ecuación:

I *d t d *I s
*  I *d  (3.20)
Is td

2. Conociendo la corriente límite de deposición, el coeficiente de difusión del ión

Pb(II) (9,85·10-10 m2/s), el radio (1,4·10-4 m) y el área de la gota (2,5·10-7 m2), la
194
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

concentración total y las constantes n (2) y F (96485 C/mol), se calculó M a partir

de la ecuación (3.11). Con la ecuación (3.10) se puede calcular el factor  para
futuros análisis si las condiciones hidrodinámicas se mantienen invariables.

 
*  1  1
I *d  nFAD M c M  (3.11)
 
 M ro 

 M  D1M/ 3 (3.10)

3. Se fue dando valores al parámetro Ed, en incrementos de 0,5 mV (para obtener

una curva teórica muy bien definida), y para cada uno de ellos se calculó  con la
siguiente ecuación:
0
cM

 nF
 exp 
Ed  E0  (3.12)
c00  RT 
M

donde R era 8,31 J/mol K y T era 296,15 K. Como primera aproximación, se eligió
un valor inicial de E0 que correspondió con el Epeak de la DPP que se había realizado
anteriormente como paso previo a la aplicación de AGNES.

4. Conocido el valor de  y el volumen de la gota (1,18·10-11 m3), se halló el valor de

d:
1
V 1 1 
d     (3.17)

AD M    M ro 


5. Y con el valor de d se obtuvo el valor de , según la siguiente expresión:

I *d  d
 1  exp(  t d /  d ) (3.19)
Is

De esta manera, a cada valor de Ed le correspondió un valor de . Representando estos

valores (Ed en el eje x y  en el eje y) se construyó la curva teórica SSCP para un valor
inicial aproximado de E0. La curva teórica SSCP así construida no coincidía perfectamente
con los puntos experimentales, por lo que se fue modificando el valor de E0 hasta que
visualmente las curvas teórica y experimental estuvieran ajustadas. La representación
gráfica de la curva teórica de  frente a Ed permitió observar la bondad del ajuste por
comparación de la curva con la posición de los puntos experimentales (ver Figura 3.5).

Una vez ajustada la curva teórica SSCP, se procedió a calcular el valor del potencial de
semi-onda del metal en disolución en ausencia de ligando. Para ello, se fue calculando el

195
Capítulo 3

promedio de dos valores sucesivos de Ed, así como el incremento de  con respecto al
incremento de Ed de la siguiente manera:

E d,1  E d,2 y  2  1
Ed  ; 
2 x E d,2  E d,1

Para cada valor de  y Ed, se obtuvo un valor de E d y de y/x. Se halló entonces, el valor
máximo de y/x, al cual le correspondió un valor de E d (que fue el valor de x en el cual
aparece el punto de inflexión de la curva SSCP) y que equivalía al valor de potencial de
semi-onda.

En la Tabla 3.6 puede observarse parte de la hoja Excel diseñada para la construcción
de la curva teórica SSCP en el caso de la disolución de plomo en NaNO3 0,55 mol/L.

Tabla 3.6. Hoja Excel diseñada para obtener la curva teórica SSCP para una disolución de
plomo (1,4·10 -6M) en NaNO3 0,55 mol/L
Eje x: Ed (V)  d (s) Eje y: (s) E d (V) y/x (s/V)
-0,57 0,00051 3315,59 33,94
-0,5695 0,00053 3189,01 33,93 -0,56975 -18,24
-0,569 0,00055 3067,27 33,92 -0,56925 -18,96
-0,5685 0,00057 2950,17 33,91 -0,56875 -19,70
…

…
-0,5075 0,06557 25,56 16,07 -0,50775 -793,34
-0,507 0,06817 24,58 15,67 -0,50725 -793,79
-0,5065 0,07088 23,64 15,28 -0,50675 -793,28
…

-0,4015 251,43292 6,66·10-3 5,06·10-3 -0,40175 -0,402

-3 -3
-0,401 261,41260 6,41·10 4,87·10 -0,40125 -0,386
-3 -3
-0,4005 271,78839 6,17·10 4,68·10 -0,40075 -0,372
-0,4 282,57600 5,93·10-3 4,50·10-3 -0,40025 -0,357

En este ejemplo, el valor máximo absoluto de y/x fue 793,79 s/V, al cual le
correspondió un valor de potencial de semi-onda del metal en disolución sin ligandos de
E1/2,M = -0,507 V.

196
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

De esta manera se construyeron las curvas SSCP para cada una de las disoluciones de
plomo en NaNO3 con diferentes valores de fuerza iónica, que están representadas en la
Figura 3.17.

40
35
30 I=0,01 mol/L
25 I=0,1 mol/L
 (s)

20 I=0,55 mol/L
15
10
5
0
-0,59 -0,54 -0,49 -0,44
Ed (V)

Figura 3.17. Efecto de la fuerza iónica en la curva SSCP de una disolución de Pb(II)
(1,4·10 -6 mol/L) con una matriz de NaNO3 de diferentes concentraciones

En la mayoría de los estudios realizados hasta el momento (ver Tabla 3.3) se había
trabajado con una fuerza iónica de 0,01 o 0,1 mol/L (bien utilizando NaNO3 o KNO3), ya
que la técnica SSCP no había sido aplicada a agua de mar. En este trabajo, puesto que se
trabajó con muestras cuya fuerza iónica era aproximadamente 0,55 mol/L, debió tenerse
en cuenta el efecto de la presencia de esta elevada salinidad durante el calibrado inicial. En
disoluciones de NaNO3 con fuerza iónica baja, casi todo el metal se encuentra en su forma
libre. Sin embargo, si aumenta esa fuerza iónica, el plomo comenzará a formar diversos
compuestos y/o complejos inorgánicos, por lo que la curva SSCP se verá desplazada hacia
la izquierda. Esto fue comprobado en esta Tesis cuando se analizaron por SSCP tres
disoluciones de NaNO3 con concentraciones diferentes (0,01, 0,1 y 0,55 mol/L). Así, en la
Figura 3.17 puede observarse que cuando la fuerza iónica es de 0,55 mol/L, la curva se
desplaza a la izquierda, indicando la disminución del metal libre por formación de
compuestos de diversa naturaleza. Esto se tuvo en cuenta para calcular la constante de
estabilidad condicional K’ a partir de la diferencia de potencial de semi-onda del metal sin
ligandos y del metal complejado E d,1 / 2 utilizando la ecuación (3.32)). Además, se añadió
otra corrección al potencial de semi-onda del metal en NaNO3 0,55 mol/L; esta corrección
se basa en que el SSCP trabaja sobre actividades, en lugar de concentraciones. Con la
ayuda de MINTEQ, que utiliza actividades, se calculó la concentración de metal libre en el
caso de la muestra de plomo de concentración total 1,4·10-6 mol/L en NaNO3 0,55 mol/L, a
197
Capítulo 3

un pH de 3,44. Con esa concentración libre, se calculó la constante de formación del

complejo K’, haciendo uso de la siguiente expresión:

c M, T  c M
K'  f (3.63)
cM

donde f es el coeficiente de actividad, que se calcula como

I
 0 ,512
f  10 1 I (3.64)

siendo I la fuerza iónica.

Este valor de K’, calculado a partir de datos proporcionados por MINTEQ, tiene en
cuenta tanto la influencia de la fuerza iónica como la del coeficiente de actividad. Así, a
partir de esta K’ se puede calcular un factor de corrección haciendo uso de la ecuación
(3.32), donde el segundo logaritmo es cero puesto que no se comparan dos disoluciones
diferentes, sino la misma pero realizando la corrección al aplicar el coeficiente de actividad:

RT
E   Ln1  K ' (3.65)
nF

Así, se calculó el coeficiente de actividad f, para una I de 0,55 mol/L, dando un

resultado de 0,605. A partir de f y de los datos de cM,T (1,4·10-6 mol/L) y cM proporcionado
por MINTEQ (3,4·10-7 M), se calculó el valor de K’, que resultó ser 1,89. De esta manera,
se halló el valor de E, que fue -1,36·10-2 V. Este valor fue el factor de corrección debido a
la elevada salinidad, utilizado en todas las muestras de estudio para calcular la diferencia
de potenciales de semi-onda E d,1 / 2 (y así obtener el valor de K’ del sistema estudiado a
partir de la ecuación (3.32)), con la siguiente expresión:

E d,1 / 2  E 1 / 2 ,ML  (E 1 / 2 ,M  E) (3.66)

Una vez estudiada la influencia de la fuerza iónica en las curvas SSCP, se pasó a aplicar
esta técnica a la misma disolución de NaNO3 0,55 mol/L a pH<4 empleada en la
determinación del parámetro h en la calibración con AGNES. Antes de aplicar SSCP a esta
muestra, se purgó durante un periodo corto de tiempo, de alrededor de 5 minutos, puesto
que ya había sido previamente purgada antes de la aplicación de AGNES. Esta disolución de
25 mL contenía del orden de 1,4·10-6 mol/L de Pb(II) después de las 3 adiciones estándar
que se realizaron. El volumen final de la disolución era de 25,35 mL. Así se obtuvo el valor
*
de  
M y E1/2,M para el sistema de metal sin ligando. Puesto que las muestras de estudio de
agua de mar sintética y agua de mar real no contenían la misma cantidad de metal, los
* *
valores que se obtendrían de  M y M  L no serían comparables. Por ello, una vez obtenido
*
el valor de  M se dividió entre la concentración de plomo en la disolución de NaNO3, de

198
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

*
manera que se obtuvo el valor de por unidad de concentración total de plomo sin
M
complejar. De esta forma, este nuevo factor se multiplicó por la concentración de la
muestra de estudio que se analizaría posteriormente, de manera que se obtuvo un
*
M corregido
*
M
*
M (3.68)
, corregido  c M, T ( en la muestra de estudio) 
c M, T (en la disolución de calibración)

que fue el que se utilizó en la ecuación (3.32) en el cálculo del valor de la constante K’ para
evitar el efecto producido por la diferencia de concentraciones entre la disolución con la
que se realizó la calibración inicial y la concentración de la muestra de estudio.

(2) Aplicación de SSCP a muestras de agua de mar

* , se limpió la celda y se colocaron 25 mL de la muestra de agua
Conocido el valor de M
de mar, que era la misma a la cual se le había aplicado anteriormente la técnica AGNES,
con una concentración total de plomo de 6·10-7 mol/L. Se ajustó el pH bien con HNO3, o
con las disoluciones reguladoras MES y MOPS. Así, tras aplicar la técnica AGNES, se
procedió a la aplicación de la SSCP para cada valor de pH. Para ello, se aplicó la técnica
SCP con los mismos parámetros electroquímicos que se utilizaron en el caso de la
calibración de la disolución acuosa de plomo en NaNO3 0,55 mol/L. Las curvas SSCP se
construyeron a partir de las medidas individuales de SCP, representando los datos de 
(área bajo el pico) obtenidos para cada potencial de deposición Ed, que se varió desde -0,4
V hasta -0,57 V o incluso valores más negativos en el caso de las muestras a pH 7 y 8, por
el posible desplazamiento hacia la izquierda que pudiera presentar la curva a estos valores
de pH.
*
Una vez obtenidos los puntos experimentales y calculado el valor de  M  L , se procedió
a construir la curva teórica de la siguiente manera:

Al igual que en el caso de la disolución de plomo en NaNO3, se diseñó una hoja Excel
con los siguientes parámetros: Ed (eje x de la curva SSCP),  , d, (eje y de la curva
SSCP), valor promedio del potencial de deposición Ed entre un punto y el siguiente, y el
incremento del eje y con respecto al incremento del eje x (y/x). Cada uno de estos
parámetros se calculó haciendo uso de las ecuaciones (3.12), (3.19), (3.37), (3.45) y
(3.46), como se verá a continuación. Así, el orden a seguir en los cálculos fue el siguiente:

1. Se fue dando valores al parámetro Ed, en incrementos de 0,5 mV (para obtener

una curva teórica muy bien definida), y para cada uno de ellos se calculó  con la
siguiente ecuación:

199
Capítulo 3

 nF
  exp Ed  E0  (3.12)
 RT 

Como primera aproximación, se eligió un valor inicial de E0 que correspondió con el

E0 obtenido en la calibración de la disolución de plomo en NaNO3 0,55 mol/L, tras
ajustar la curva teórica a los puntos experimentales.

2. Con el parámetro  calculado a partir de la calibración de la disolución de plomo en

NaNO3 0,55 mol/L, se halló el valor de  a partir de la siguiente ecuación:
1/3
  D (3.37)

Puesto que en agua de mar existen una gran variedad de ligandos, el coeficiente
de difusión de los complejos no se conoce. Por ello, se realizó una primera
aproximación que consistió en suponer que DM ≈ DML ≈ D , es decir, que los
ligandos presentes en la muestra son pequeños.

3. Con el valor de  y conociendo el radio de la gota (1,41·10-4 m) se calculó el valor

de d, como d = (1/  + 1/ro)-1

4. Conocido  , d , D , el área de la gota (2,5·10-7 m2) y el volumen de la gota

(1,18·10-11 m3), se halló el valor de d:

V  d    
d   (3.46)
A  D(1  K ' ) D M 

Para este cálculo se realizó una segunda aproximación, que fue suponer que el
sistema era lábil, por lo que se eligió un valor de  muy pequeño (10-9 m), de
forma que fuera despreciable y no influyera en el cálculo. Además, se eligió un
valor aleatorio inicial de K’ de 1.

5. * que ofrece
Utilizando el valor de concentración de plomo libre en la disolución c M
*
MINTEQ, se calculó el valor de I d,ML:
1
 
*  d
I *d,ML  nFAc M 
  (3.45)
 D(1  K ' ) D 
 M 

6. Y con el valor de I*d,ML , d , Is y td se obtuvo el valor de , según

I *d  d
 1  exp(  t d /  d ) (3.19)
Is

De esta manera, a cada valor de Ed le correspondió un valor de . Representando estos

valores (Ed en el eje x y  en el eje y) se construyó la curva teórica SSCP para el valor
200
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

inicial aproximado de E0 elegido. La curva teórica SSCP asi construida no coincidía

perfectamente con los puntos experimentales, por lo que se fue modificando el valor de E0
hasta que visualmente las curvas teórica y experimental se ajustaran. El parámetro E0 se
usó para modificar la curva a lo largo del eje x. Además, en este caso también hubo que
modificar la curva a lo largo del eje y para que quedara a la misma altura que la
experimental. Para ello se fue variando el valor de K’ de las ecuaciones (3.45) y (3.46)
hasta que se igualaran los valores de  M *
 L experimental y el teórico, calculado como
* *
 ML ,teórico  I d ,ML t d / I s .

De este modo, se obtuvieron los valores de E0 y de K’.

Una vez que la curva teórica coincidía perfectamente con los datos experimentales, se
procedió al cálculo de E1/2,M+L como punto de inflexión de la curva. Para ello, se siguió el
mismo procedimiento que el utilizado en el caso de la disolución de plomo en NaNO3. Así,
con este valor de E1/2,M+L y con el valor de E1/2,M obtenido en la calibración de la disolución
de plomo en NaNO3 0,55 mol/L, se calculó el valor de E d,1 / 2 , según la ecuación:

E d,1 / 2  E 1 / 2 ,ML  (E 1 / 2 ,M  E) (3.66)

Haciendo uso de la ecuación:

E d,1 / 2  
RT
Ln1  K '  LnM*  L / M*  (3.32)
nF
* *
y teniendo en cuenta que  M se debe sustituir por  M corregido , según la ecuación (3.68),
se halló el valor de K’ a partir de E d,1 / 2 . Este valor de K’ se comparó con el obtenido
durante el ajuste de la curva teórica. Si entre las dos constantes no hubiera diferencia
alguna, el sistema se consideraría lábil. Si existiera diferencia, significaría que las
condiciones que se asumieron al principio no se cumplieron; es decir, que el sistema podría
ser no lábil, o lábil con complejos cuyos coeficientes de difusión fueran mucho menores
que el del metal en ausencia de ligando. Estos dos casos se podrían diferenciar fijándose
en la forma de las curvas. Si las curvas del sistema de metal con ligando tienen la misma o
similar altura a la del sistema sin ligando, significará que el sistema es lábil y entonces, los
complejos tendrían un menor coeficiente de difusión que el del metal solo. En caso
contrario, si existe una gran diferencia entre las curvas, significará que el sistema es no
lábil. En estos casos, el cálculo de K’ a partir de las ecuaciones (3.45) y (3.46)) no sería
fiable para caracterizar el sistema.

201
Capítulo 3

3.6. Resultados del análisis de especiación de Pb en agua de mar sintética y

real

3.6.1. AGNES

3.6.1.1. Determinación de Epeak a partir de medidas de DPP para obtener el

potencial de deposición E1 que se aplicará en AGNES
El valor de Epeak fue evaluado previamente a la aplicación de AGNES cada día. Para ello
se realizaron medidas de DPP en una disolución de NaNO3 de fuerza iónica 0,55 mol/L, de
pH 3,44 y con una concentración de Pb(II) adicionado de 6·10-7 mol/L. Cada vez que se
estudió una muestra de agua de mar, tanto sintética como real, se evaluó este parámetro
en una disolución de NaNO3. Así, como las muestras de agua de mar sintética y real fueron
analizadas por triplicado, se obtuvieron diversos valores de Epeak de los análisis diarios, el
cual varió entre -0,4161 y -0,4390 V. Puesto que el valor de Epeak fue evaluado en una
matriz salina de fuerza iónica similar a la de las muestras de estudio (0,55 mol/L), fue
posible utilizarlo en el análisis dichas muestras.

En la Figura 3.18 se observa el registro de DPP en el cual se muestra un ejemplo

de la variabilidad en el parámetro Epeak.

Figura 3.18. Registro DPP de las disoluciones de Pb(II) 6·10-7 mol/L en NaNO3 0,55 mol/L

202
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

3.6.1.2. Evaluación del parámetro h mediante calibración de una disolución

de metal sin ligando
Para evaluar el parámetro h se realizó la calibración de una disolución de metal de
fuerza iónica 0,55 mol/L de NaNO3 a pH 3,44. Para ello, se fue añadiendo volúmenes
conocidos de una disolución patrón de Pb(II), de manera que el rango de calibración fue
3·10-9-1,4·10-6 mol/L. Para cada una de las adiciones, se realizó por duplicado una medida
de AGNES, con la que se obtuvieron valores de intensidad de corriente. De esta manera, se
representó la corriente obtenida para cada una de las disoluciones frente a la concentración
libre de metal teórico que proporciona el programa MINTEQ a partir de las concentraciones
totales de metal, y se obtuvo la pendiente de la recta h. Este parámetro fue evaluado cada
día que se analizó una muestra de estudio, por lo que se obtuvieron valores de h
comprendidos entre 0,340 y 0,389 A·(mol/L)-1. En la Tabla 3.7 se pueden observar los
compuestos mayoritarios de Pb(II) predichos por MINTEQ que pueden formarse en la
disolución de NaNO3 0,55 mol/L a pH 3,44 y 23 ºC de temperatura, para cada una de las
adiciones.

Tabla 3.7. Compuestos mayoritarios de Pb(II) predichos por MINTEQ presentes en una
disolución de NaNO3 0,55 mol/L (pH 3,44) a 23 ºC
[Pb(II)]total Compuestos principales de Pb(II) (mol/L (% sobre el total))
+
(mol/L) Pb2+ Pb(NO3)2 (aq) PbNO3
3,05·10-9 7,70·10-10 (25,2%) 6,72·10-10 (22,0%) 1,61·10-9 (52,8%)

6,22·10-7 1,50·10-7 (24,1%) 1,40·10-7 (22,5%) 3,32·10-7 (53,4%)

1,02·10-6 2,47·10-7 (24,2%) 2,29·10-7 (22,4%) 5,44·10-7 (53,4%)

1,41·10-6 3,43·10-7 (24,3%) 3,15·10-7 (22,3%) 7,52·10-7 (53,3%)

Así, se puede observar que los compuestos mayoritarios en la disolución de NaNO3 son
+ 2+
PbNO3 (en un 53% de la concentración total de Pb(II)), seguido de Pb libre (en un 24-
25%) y finalmente Pb(NO3)2 (en un 22-22,5%).

En la Tabla 3.8 se observan los valores de concentración total y de concentración de

Pb(II) libre predicho por MINTEQ para la disolución de NaNO3 0,55 mol/L en cada una de
las adiciones, así como los valores de intensidad obtenidos al aplicar AGNES. Además, en la
Figura 3.19 se muestra una curva típica de calibrado en AGNES donde se observa la
relación lineal existente entre la corriente faradaica y la concentración de metal libre en la
disolución.

203
Capítulo 3

Tabla 3.8. Variables del análisis por AGNES de una disolución de NaNO3 0,55 mol/L (pH
3,44) tras sucesivas adiciones de Pb(II)
[Pb(II)]total [Pb(II)]libre (MINTEQ) ITotal (AGNES) Ishifted blank If (AGNES)
(mol/L) (mol/L) (nA) (AGNES) (nA) (nA)
3,05·10-9 7,70·10-10 4,7 4,4 0,3

6,22·10-7 1,50·10-7 64,4 4,5 59,9

1,02·10-6 2,47·10-7 102,0 4,3 97,7

1,41·10-6 3,43·10-7 138,0 4,3 133,7

160
S.D. 0,04

120 h=0,388 A·(mol/L)-1 S.D. 0,28

If (nA)

80
S.D. 0,17 y = 388,39x + 0,957
R2 = 0,9998
40
S.D. 0,04

0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
2+
[Pb ] (mol/L)

Figura 3.19. Curva de calibración para Pb(II) en NaNO3 0,55 mol/L a pH 3,44.
Parámetros: t1,a = 35 s, t1,b = 105 s, Y1,a = 10 8, Y1,b = 50, Y2 = 10 -8 (n=2)

3.6.1.3. Aplicación de AGNES a las muestras de estudio

Antes de la aplicación de AGNES a agua de mar, se procedió a evaluar el límite de
detección de la técnica. Para ello, se prepararon 7 muestras de agua de mar sintética, sin
ninguna concentración añadida de plomo, conteniendo las sales inorgánicas que están
presentes en agua de mar [Grasshoff y col., 1983]. Las muestras así preparadas fueron
colocadas en la celda de medida, se aplicó el programa de potencial de AGNES 2P
anteriormente mencionado y se cuantificaron los niveles de intensidad de cada una. Se
realizaron por cada muestra (blanco) dos análisis de AGNES, uno para Y=50 y otro para
Y=100, para determinar el límite de detección correspondiente en ambas condiciones.

204
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Los valores de intensidad obtenidos para cada una de las muestras blanco y para cada
valor del factor de preconcentración se detallan en la Tabla 3.9. Como puede observarse,
en general se consiguen valores más altos de intensidad cuando la Y es mayor.

Tabla 3.9. Intensidad (señal analítica) obtenida tras la aplicación de la técnica AGNES en
muestras de agua de mar sintética sin adición de metal
Intensidad (A)
Blanco
Y=50 Y=100
1 3,3·10-10 2,7·10-9

2 2,9·10-10 6,8·10-10

3 3,7·10-10 1,3·10-9

4 4,0·10-9 2,9·10-9

5 9,3·10-10 2,8·10-9

6 1,1·10-9 1,3·10-9

7 1,1·10-9 1,4·10-9

El límite de detección del método AGNES propuesto para la determinación de plomo

libre se calculó como 3 veces la desviación estándar de las concentraciones halladas en los
blancos. Cada una de estas concentraciones fue calculada a partir de la intensidad obtenida
y el parámetro h correspondiente. El valor de ese límite se estimó para 7 réplicas de agua
de mar sintética sin metal adicionado. De esta forma, se obtuvo un límite de detección
6,34·10-9 mol/L de plomo para un factor de preconcentración Y = 50 y de 3,06·10-9 mol/L
para Y = 100 (teniendo en cuenta que la concentración de plomo en los blancos para
Y = 100 fue calculada como cM = If/2h).

Igualmente, se evaluó el límite de cuantificación como 10 veces la desviación estándar

de las concentraciones halladas en los blancos y se obtuvo un L.C. de 2,11·10-8 mol/L para
Y = 50 y 1,02·10-8 mol/L para Y = 100.

Se puede observar que tanto el límite de detección como el de cuantificación son

menores cuanto mayor sea Y, siendo la técnica más sensible para Y=100 que para Y=50.

205
Capítulo 3

(a) Aplicabilidad de AGNES en muestras de agua de mar sintética para la

determinación de plomo libre
Se realizó un estudio de la aplicabilidad de la técnica AGNES a la evaluación de la
concentración de plomo libre en muestras de agua de mar sintética. Para ello se llevó a
cabo un procedimiento de validación en aguas de mar sintéticas a varios valores de pH. Los
resultados obtenidos fueron validados por comparación con aquellos predichos por el
programa MINTEQ.

Una vez obtenido el valor de h mediante calibración con NaNO3, dicho valor fue
aplicado al análisis por AGNES de la muestra de agua de mar sintética. Así, y después de la
calibración, la celda fue limpiada con HNO3 2 mol/L y agua Milli Q para eliminar cualquier
posible contaminación. Posteriormente, se procedió al estudio de la muestra de agua de
mar sintética (preparada con las sales inorgánicas que están presentes en agua de mar
[Grasshoff y col., 1983]). Se colocaron 25 mL de muestra en la celda y se realizó una
adición de una disolución estándar de Pb(II) de forma que la concentración total de la
muestra fuera del orden de 6·10-7 mol/L de Pb(II), y su pH fue modificado en el rango de
2,7-8,6. Las diferencias de pH entre la muestra de NaNO3 en la calibración (pH=3,44) y la
muestra sintética (pH=2,7-8,6) se consideran irrelevante puesto que se ha encontrado que
h permanece invariable en un gran intervalo de pH [Galceran y col., 2007]. Conociendo h y
la corriente obtenida en la muestra tras la aplicación de AGNES, se aplicó la ecuación del
ecuación (3.56) y se obtuvo la concentración de metal libre presente en la muestra para
cada pH. Esta concentración de metal libre fue comparada con la teórica propuesta por
MINTEQ.

En la Tabla 3.10 pueden observarse los compuestos mayoritarios de Pb(II) predichos

por MINTEQ que pueden encontrarse en el agua de mar sintética (con una concentración
de Pb(II) total 6·10-7 mol/L) para cada pH estudiado. Los compuestos mayoritarios en el
+
agua de mar sintética son los clorocomplejos PbCl y PbCl2 (aq) en los pH 2,7; 5; 6 y 7. A
pH 8,6 el compuesto mayoritario es el PbCO3 (aq), alcanzando un 48,9% del total.

En general, al aumentar el pH se observa un incremento en la concentración de los

2- +
compuestos PbCO3 (aq), Pb(CO3)2 , Pb(OH) y Pb(OH)2 (aq). El resto de los compuestos
+
disminuyen al aumentar el valor de pH, a excepción del PbHCO3 , cuyo porcentaje es
mayor cuando el pH es 7. La concentración de plomo libre disminuye al ir aumentando el
pH.

206
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Tabla 3.10. Compuestos mayoritarios de Pb(II) predichos por MINTEQ presentes en una
muestra de agua de mar sintética para cinco valores de pH a 23 ºC (en negrita: porcentaje
más alto para cada pH) (Pb total 6·10-7 mol/L)
Compuestos Concentración del compuesto (mol/L (% sobre el total))
de Pb(II)a pH 2,7 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8,6
+ 2,9·10-7 2,9·10-7 2,8·10-7 2,7·10-7 8,8·10-8
PbCl
(48,6%) (48,3%) (47,3%) (43,9%) (14,2%)
PbCl2 (aq) 1,4·10-7 1,4·10-7 1,4·10-7 1,3·10-7 4,3·10-8
(23,3%) (23,2%) (22,8%) (21,1%) (6,9%)
- 5,7·10-8 5,7·10-8 5,7·10-8 5,3·10-8 1,8·10-8
PbCl3
(9,7%) (9,7%) (9,6%) (8,8%) (2,9%)
2- 1,9·10-8 1,9·10-8 1,8·10-8 1,7·10-8 5,9·10-8
PbCl4
(3,1%) (3,1%) (3,1%) (2,8%) (1,0%)
PbSO4 (aq) 2,6·10-8 2,7·10-8 2,7·10-8 2,5·10-9 8,4·10-9
(4,5%) (4,6%) (4,5%) (4,2%) (1,4%)
2- 2,2·10-9 2,3·10-9 2,3·10-9 2,1·10-9 7,1·10-10
Pb(SO4)2
(0,4%) (0,4%) (0,4%) (0,4%) (0,1%)
+ 9,8·10-12 2,1·10-9 1,2·10-8 2,1·10-8 6,2·10-9
PbHCO3
(<0,01%) (0,4%) (2,0%) (3,4%) (1,0%)
PbCO3 (aq) 6,2·10-16 3,1·10-11 1,8·10-9 3,1·10-8 3,0·10-7
(<0,01%) (<0,01%) (0,3%) (5,0%) (48,9%)
2- 7,3·10-26 1,9·10-16 6,2·10-13 1,9·10-10 5,8·10-8
Pb(CO3)2
(<0,01%) (<0,01%) (<0,01%) (0,03%) (9,3%)
+ 2,7·10-13 6,4·10-11 6,4·10-10 6,0·10-9 6,5·10-8
Pb(OH)
(<0,01%) (0,01%) (0,1%) (1,0%) (10,4%)
Pb(OH)2 (aq) 3,0·10-20 1,6·10-15 1,7·10-13 1,5·10-11 5,4·10-9
(<0,01%) (<0,01%) (<0,01%) (<0,01%) (0,9%)
Pb2+ (libre) 6,0·10-8 5,9·10-8 5,8·10-8 5,5·10-8 1,8·10-8
(10,0%) (10,0%) (9,7%) (9,1%) (2,9%)
a
El resto de los compuestos de Pb(II) representan < 0,1%

La Tabla 3.11 muestra los valores de metal libre y de la constante de estabilidad

condicional K’ de la muestra sintética a pH 2,7; 5; 6; 7 y 8,6 obtenidos por AGNES y
MINTEQ. La constante se calculó a partir de los valores de concentración de metal libre y
metal total en la superficie del electrodo, según la ecuación (3.27) para cada valor de pH:
0
cM 0
cM
0  ,T ,T
cM K'  1 (3.27)
1  K' 0
cM

207
Capítulo 3

Tabla 3.11. Valores medios de concentración de plomo libre y constante de estabilidad

condicional obtenidos en agua de mar sintética utilizando AGNES. Comparación con los
valores predichos por MINTEQ (Pb total en las muestras: 6·10-7 mol/L (n=3 para cada pH))
Muestra AGNES (agua de mar sintética) MINTEQ
pH CPb(II) libre (mol/L) K´ experimental CPb(II) libre (mol/L) K´calculada

2,7 5,6·10-8 ± 9,4·10-10 9,66 ± 0,12 6,0·10-8 9,00

5 5,5·10-8 ± 8,0·10-10 9,68 ± 0,16 5,9 ·10-8 9,17

6 5,5·10-8 ± 9,7·10-10 9,90 ± 0,39 5,8 ·10-8 9,34

7 4,4·10-8 ± 1,4·10-9 12,90 ± 0,18 5,5·10-8 9,91

8,6 1,6·10-8 ± 1,5·10-9 37,80 ± 0,23 1,8·10-8 32,33

Se puede observar cómo a mayor pH, menor es la concentración de plomo libre que
existe en la muestra. Por ello, la constante de estabilidad condicional K’ se ve incrementada
claramente en medios más básicos. Los datos de metal libre y K’ obtenidos por AGNES y
MINTEQ son similares, aunque siempre se consiguen valores de metal libre ligeramente
menores para AGNES. Estas diferencias pueden deberse a las constantes utilizadas por
MINTEQ (las constantes en las base de datos normalmente son obtenidas para valores de
concentración de metal y ligando más altos). Considerando las dificultades presentes en la
determinación teórica de concentraciones de metal libre, los resultados experimentales han
resultado ser muy satisfactorios. Así, se ha puesto de manifiesto la utilidad de AGNES como
técnica válida para conseguir la concentración de metal libre en disolución.

(b) Aplicabilidad de AGNES en muestras de agua de mar real para la determinación de

plomo libre
AGNES también se aplicó a muestras reales de agua de mar recogidas en la playa de
Faro (Portugal). El pH de la muestra fue 8,52 y el carbono orgánico total (TOC) fue 2,01
mg/L. La metodología seguida fue la misma que para agua de mar sintética, en la que,
previo al análisis de la muestra, se realizó un calibrado con NaNO3 0,55 mol/L para conocer
el parámetro h. Tras este calibrado, se pasó a analizar la muestra de agua de mar real, a la
que se añadió un volumen conocido de una disolución patrón de Pb(II), de manera que la
concentración total resultara de 6·10-7 mol/L, y realizando el estudio a diferentes valores de
pH (2,7; 5; 6; 7; 8,6).

208
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Se realizó un análisis previo con MINTEQ de los posibles compuestos que pudieran
estar presentes en el agua de mar real, teniendo en cuenta el dato de carbono orgánico
total. Los resultados se muestran en la Tabla 3.12.

Tabla 3.12. Compuestos mayoritarios de Pb(II) predichos por MINTEQ presentes en una
muestra de agua de mar real para cinco valores de pH a 23 ºC (en negrita: porcentaje más
alto para cada pH) (Pb total 6·10-7 mol/L)
Compuestos Concentración del compuesto (mol/L (% sobre el total))
de Pb(II)a pH 2,7 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8,6
+ 2,9·10-7 2,5·10-7 2,3·10-7 1,8·10-7 5,5·10-8
PbCl
(47,7%) (41,4%) (37,8%) (30,0%) (9,3%)
PbCl2 (aq) 1,4·10-7 1,2·10-7 1,1·10-7 8,7·10-8 2,7·10-8
(23,0%) (20,0%) (18,3%) (14,6%) (4,5%)
- 5,9·10-8 5,1·10-8 4,7·10-8 3,7·10-8 1,1·10-8
PbCl3
(9,6%) (8,4%) (7,7%) (6,2%) (1,9%)
2- 1,9·10-8 1,7·10-8 1,5·10-8 1,2·10-8 3,7·10-9
PbCl4
(3,1%) (2,7%) (2,5%) (2,0%) (0,6%)
PbSO4 (aq) 2,7·10-8 2,4·10-8 2,2·10-8 1,7·10-8 5,3·10-9
(4,4%) (3,9%) (3,6%) (2,8%) (0,9%)
2- 2,2·10-9 2,0·10-9 1,9·10-9 1,4·10-9 4,5·10-10
Pb(SO4)2
(0,4%) (0,3%) (0,3%) (0,2%) (0,1%)
+ 1,1·10-11 1,6·10-9 8,8·10-9 1,4·10-8 3,8·10-9
PbHCO3
(<0,01%) (0,3%) (1,4%) (2,4%) (0,6%)
PbCO3 (aq) 7,6·10-16 2,0·10-11 1,1·10-9 4,7·10-8 2,1·10-7
(<0,01%) (<0,01%) (0,2%) (7,9%) (34,7%)
2- 1,1·10-25 8,9·10-17 3,0·10-13 6,8·10-10 4,2·10-8
Pb(CO3)2
(<0,01%) (<0,01%) (<0,01%) (0,1%) (7,1%)
+ 3,06·10-13 4,8·10-11 4,4·10-10 8,6·10-9 4,5·10-8
Pb(OH)
(<0,01%) (0,01%) (0,1%) (1,5%) (7,5%)
Pb(OH)2 (aq) 3,6·10-20 1,0·10-15 9,5·10-14 4,8·10-11 4,1·10-9
(<0,01%) (<0,01%) (<0,01%) (<0,01%) (0,7%)
Pb-Mat Org 1,0·10-8 8,8·10-8 1,2·10-7 1,6·10-7 1,8·10-7
(1,7%) (14,3%) (20,1%) (26,0%) (30,0%)
Pb2+ (libre) 6,0·10-8 5,2·10-8 4,8·10-8 3,6·10-8 1,1·10-8
(9,8%) (8,5%) (7,8%) (6,1%) (1,9%)
a
El resto de los compuestos de Pb(II) representan < 0,1%

Los compuestos mayoritarios en el agua de mar real a pH 2,7 y 5 son los

+
clorocomplejos PbCl y PbCl2 (aq). A partir de pH 6 el complejo formado entre Pb y la
materia orgánica va siendo mayoritario, hasta llegar a un porcentaje del 30% sobre el total
a pH 8,6. Además, a este pH también es importante la presencia de PbCO3 (aq), con un
34%, algo menos que en agua de mar sintética.

209
Capítulo 3

En general, al aumentar el pH se observa un incremento en la concentración de los

2- +
compuestos PbCO3 (aq), Pb(CO3)2 , Pb(OH) y Pb(OH)2 (aq), al igual que ocurría en el
agua de mar sintética. Sin embargo, en este caso hay que añadir la presencia del complejo
formado entre Pb(II) y la materia orgánica, cuya concentración se va incrementando al
aumentar el pH. El resto de los compuestos disminuyen al aumentar el valor de pH, a
+
excepción del PbHCO3 , cuyo porcentaje es mayor cuando el pH es 7. La concentración de
plomo libre disminuye al ir aumentando el pH.

Los resultados de la aplicación de AGNES a la muestra de agua de mar real y su

comparación con los obtenidos por MINTEQ están detallados en la Tabla 3.13. Como se
esperaba, los valores de K’ presentaron el mismo patrón de comportamiento con respecto
al pH que en la muestra de agua de mar sintética, pero esta vez los valores son
ligeramente mayores debido a la presencia de materia orgánica en la muestra de agua de
mar real. Además, se puede observar cómo los valores de metal libre proporcionados por
AGNES y MINTEQ para el agua de mar real a todos los valores de pH son muy similares. En
estas condiciones, los valores de K’ son del mismo orden que los encontrados en agua de
mar sintética para los pH 2,7; 5; 6 y 7. Sin embargo, para valores ligeramente básicos
(valor típico de pH en agua de mar: 8,6), el plomo se encuentra mucho más complejado y
por tanto el valor de K’ es mayor que en agua de mar sintética.

Tabla 3.13. Valores medios de concentración de plomo libre y constante de estabilidad

condicional obtenidos en agua de mar real utilizando AGNES. Comparación con los valores
predichos por MINTEQ (Pb total en las muestras: 6·10-7 mol/L; n=3 para cada pH)
Muestra AGNES (agua de mar real) MINTEQ
pH CPb(II) libre (mol/L) K´experimental CPb(II) libre (mol/L) K´calculada

2,7 5,5·10-8 ± 3,5·10-9 9,97 ± 0,40 6,0·10-8 9,00

5 5,4·10-8 ± 1,2·10-9 10,06 ± 0,23 5,2 ·10-8 10,54

6 4,7·10-8 ± 1,4·10-9 11,66 ± 0,27 4,8 ·10-8 11,50

7 3,1·10-8 ± 1,6·10-9 18,29 ± 0,96 3,6·10-8 15,67

8,6 1,06·10-8 ± 9,2·10-10 55,01 ± 4,7 1,1·10-8 53,55

210
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

3.6.2. SSCP

3.6.2.1. Repetibilidad de la señal analítica  en SCP

Para estudiar la repetibilidad de la técnica de análisis de Pb(II) en SCP se realizaron 6

análisis diferentes en las condiciones detalladas en la sección 3.5.2.2.2.(1), sobre muestras
de plomo en NaNO3 0,55 mol/L con una concentración de metal de 1,4·10-6 mol/L. El
potencial de deposición que se utilizó fue -0,5 V, por ser un valor intermedio en el rango de
potenciales de deposición utilizado para realizar las curvas SSCP.

La precisión se calculó de la misma manera que en el capítulo 2. Para ello, el cálculo

del valor de la distribución t se realizó teniendo en cuenta los grados de libertad del
sistema n-1=5 (siendo n el número de experimentos realizados) y se aceptó un intervalo
de confianza del 95%. Así, para 5 grados de libertad y un intervalo de confianza del 95%,
el valor de t tabulado de dos colas es 2,571.

La media de los 6 experimentos fue de 10,8 s con una desviación estándar de 1,0 s. A
partir de estos valores, se obtuvo la precisión de la medida que fue del 9,5%. Esta
reproducibilidad obtenida fue muy satisfactoria, confirmando las adecuadas características
analíticas de la técnica SCP. En la Tabla 3.14 se muestran los datos obtenidos, incluyendo
la desviación estándar (s), desviación estándar relativa (RSD) y la precisión de la medida de
.

Tabla 3.14. Reproducibilidad de la medida de  para Pb(II) en disolución de NaNO3

mediante la técnica SCP aplicada para un potencial de deposición intermedio ([Pb(II)]=
1,4·10-6 mol/L; [NaNO3]= 0,55 mol/L; n=6)
Parámetros Valores
9,93; 9,47; 10,55;
 (s)
10,95; 11,94; 11,71
Grados de libertad (n-1) 5

Intervalo de confianza 95%

t 2,571

Media 10,8

s 1,0

RSD (%) 9,0

Precisión (%) 9,5

211
Capítulo 3

3.6.2.2. Reproducibilidad de las curvas SSCP

Asimismo, también se estudió la reproducibilidad de las curvas SSCP en 4 muestras de
plomo en NaNO3 0,55 mol/L con una concentración de metal de 1,4·10-6 mol/L (Figura
3.20). Los parámetros característicos de dichas curvas, E0, E1/2 y *, se muestran en la
Tabla 3.15. Como se puede observar, la técnica SSCP es muy reproducible y presenta poca
variabilidad en los resultados.

40
35
30
25
 (s)

20
15
10
5
0
-0,57 -0,55 -0,53 -0,51 -0,49 -0,47 -0,45 -0,43 -0,41
Ed (V)

Figura 3.20. Reproducibilidad de las curvas SSCP (tiempo de transición frente a potencial
de deposición) para una disolución de Pb(II) en NaNO3 ([Pb(II)]= 1,4·10-6 mol/L; [NaNO3]=
0,55 mol/L) ( , , , : valores experimentales; curvas teóricas ajustadas)

Tabla 3.15. Reproducibilidad de los parámetros significativos de las curvas SSCP de una
disolución de Pb(II) en NaNO3: valores de tiempo de transición límite *, potencial de
deposición de semi-onda E1/2 y potencial redox estándar E0 (curvas SSCP de la Fig. 3.20)

Réplica  (s) E1/2 (V) E0 (V)

1 33,3 -0,50275 -0,468

2 36,3 -0,50475 -0,469

3 34,3 -0,50025 -0,466

4 34,2 -0,50075 -0,466

212
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

3.6.2.3. Aplicación de SSCP a muestras sintéticas de agua de mar

Previamente a la aplicación de la técnica SSCP a muestras sintéticas, se debe realizar
una curva SSCP con una disolución de NaNO3 en ausencia de ligando, cuya concentración
debe ser similar a la fuerza iónica de la muestra a estudiar (en este caso 0,55 mol/L) y con
una concentración conocida de Pb(II). Esta curva se denomina curva de calibración de
SSCP, y será aquélla con respecto a la cual se compararán los parámetros importantes de
la curva correspondiente de la muestra que se quiere analizar, es decir, * y E1/2. Una vez
obtenidos los datos experimentales para la disolución de metal en NaNO3 0,55 mol/L, y
ajustada la curva teórica (según el procedimiento explicado en 3.5.2.2.2.(1)), se calcularon
*
los valores de  M , corregido y E1/2,M para 3 réplicas y resultaron ser 16,48 ± 0,33 s y -0,48305 ±
0,00246 V, respectivamente.

Después de realizar dicha calibración, se pasó a estudiar la muestra de agua de mar

sintética, a la cual se le añadió una cantidad específica de Pb(II) para que su concentración
total fuera de 6·10-7 mol/L (previo al análisis con SSCP, se estudió su concentración de
metal libre con AGNES). Se comenzó por estudiar la muestra ajustada a un pH de 2,7. Se
aplicó SSCP y se obtuvieron los valores experimentales de para cada potencial de
deposición aplicado (Tabla 3.16). A partir de estos valores, se calculó el valor de  M *
L ,
como promedio de los 3 valores más altos, resultando en un valor de 16,23 s.

Tabla 3.16. Valores de  (s) para cada valor de potencial de deposición aplicado en SCP,
en una muestra de agua de mar sintética a pH 2,7 ([Pb(II)]=6·10 -7mol/L)

Ed (V) -0,57 -0,56 -0,55 -0,54 -0,53 -0,52 -0,51 -0,5 -0,49

 (s) 16,65 16,10 15,94 15,87 15,31 13,99 12,08 8,86 5,19

Ed (V) -0,48 -0,475 -0,47 -0,465 -0,46 -0,45 -0,44 -0,43 -0,42

 (s) 2,51 1,27 1,17 0,89 0,87 0,15 0,20 0 0

Estos datos se representaron en una gráfica de  frente a Ed, obteniéndose la curva

SSCP experimental. Posteriormente, se procedió al ajuste de la curva teórica, tal y como se
indicó en la sección 3.5.2.2.2.(2). Una vez que la curva teórica fue similar a la de los datos
experimentales, se procedió al cálculo del valor de E1/2,M+L. En la Tabla 3.17 se muestra la
hoja Excel para la muestra de agua de mar sintética a pH 2,7.

213
Capítulo 3

Tabla 3.17. Hoja Excel diseñada para obtener la curva teórica SSCP para una muestra de
agua de mar sintética a pH 2,7 ([Pb(II)]=6·10 -7mol/L)
Eje x: Ed (V)  d (s) Eje y: (s) E d (V) y/x (s/V)
-0,57 0,00017 8540,14 16,191
-0,5695 0,00018 8211,96 16,189 -0,56975 -3,41
-0,569 0,00019 7896,38 16,187 -0,56925 -3,54
-0,5685 0,00019 7592,93 16,186 -0,56875 -3,68
…

…
-0,496 0,05723 25,87 7,693 -0,49625 -379,29
-0,4955 0,05952 24,87 7,503 -0,49575 -379,64
-0,495 0,06190 23,92 7,313 -0,49525 -379,54
…

…
-0,4015 94,22169 1,57·10-2 5,67·10-3 -0,40175 -0,45
-0,401 97,98722 1,51·10-2 5,45·10-3 -0,40125 -0,44
-2 -3
-0,4005 101,90324 1,45·10 5,24·10 -0,40075 -0,42
-2 -3
-0,4 105,97575 1,40·10 5,04·10 -0,40025 -0,40

A partir de esta hoja Excel, se obtuvo que el valor de E1/2,M+L para esta réplica de la
muestra sintética a pH 2,7 fue de -0,49575 V. Teniendo en cuenta que E1/2,M calculado
anteriormente durante la calibración de la disolución de plomo en ausencia de ligando fue
de -0,48125 V y utilizando el factor de corrección E descrito en la sección 3.5.2.2.2.(1), se
llegó a un valor de Ed,1/2 igual a:

Ed,1/2 = E1/2,M+L – (E1/2,M – E) = -0,49575 – (-0,48125 – (-1,36·10-2)) = -2,81·10-2 V

* *
Se calculó también el valor de  M ,corregido a partir del  M de la calibración, según la
ecuación (3.68):
*
M
*
M , corregido  c M, T ( en la muestra de estudio)  
c M, T (en la disolución de calibración)
39,19
 6  10 7   16 ,8 s
1,4  10 6

*
Con el valor deEd,1/2 (-2,81·10-2 V), el valor calculado de  M  L (16,23 s), y el
*
valor de  M ,corregido (16,8 s), se calculó el valor de K’ utilizando la ecuación:

214
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

E d,1 / 2  
RT
Ln1  K '  LnM*  L / M*  (3.32)
nF

Así, el valor de K’ obtenido para la muestra sintética de agua de mar a pH 2,7 fue de
8,36.

De esta misma manera se calculó *, E1/2 y K’ para todas las muestras de agua de mar
sintética y real estudiadas a los valores de pH seleccionados.

En la Figura 3.21, se muestran los datos de SSCP experimentales para la muestra

sintética ajustada a cinco valores de pH, junto con las curvas teóricas ajustadas utilizando
el procedimiento descrito en 3.5.2.2.2.(2). La comparación de las curvas SSCP de las
muestras de estudio con respecto a la curva SSCP de la calibración (metal en NaNO3 0,55
mol/L) se realizó normalizando las curvas de las muestras de estudio con respecto a la de
calibración, de forma que los valores de tiempo de transición de la muestra fueron divididos
*
por el tiempo de transición límite corregido obtenido en la SSCP de calibración  M ,corregido y
0
a los valores de potencial estándar se les sustrajo el valor de E de la curva de calibración
EM0
.

Se encontró que los datos experimentales están en perfecta consonancia con aquellos
predichos teóricamente, por lo que la expresión utilizada se ajusta muy bien para muestras
de este tipo, en las que no están presentes ligandos heterogéneos, al ser una muestra de
agua de mar sintética preparada sin ligandos orgánicos.

A valores bajos de pH (2,7; 5; 6 y 7), el tiempo de transición límite de la muestra es

prácticamente el mismo que en la curva de calibrado, por lo que no existe pérdida de
labilidad alguna. Sin embargo, la curva se ve desplazada hacia la izquierda a lo largo del
eje x, indicando que hay presencia de ligandos que complejan al metal (en este caso de
muestra sintética, los ligandos presentes son iones inorgánicos). A pH 8,6 (pH natural del
agua de mar) se observa una disminución apreciable en * con respecto a la muestra de
Pb(II) en NaNO3, y un desplazamiento de la curva hacia la izquierda muy acusado,
indicando que hay presencia de ligandos que complejan el metal y que los complejos
formados no son lábiles.

Los valores de K’ fueron calculados a partir de la expresión (3.32) para el

desplazamiento del potencial de semionda Ed,1/2, y se pueden observar en la Tabla 3.18.

215
 Capítulo 3

1,0

0,8
3, corregido

0,6
/*M en NaNO

0,4

0,2

0,0
-0,15 -0,13 -0,11 -0,09 -0,07 -0,05 -0,03 -0,01 0,01 0,03
0
Ed - E M (V)

Figura 3.21. Datos experimentales de SSCP medidos para una muestra sintética de agua
de mar a diferentes valores de pH ([Pb(II)]=6·10 -7mol/L): 2,7 ( ), 5 ( ), 6 ( ), 7 ( )
y 8,6 ( ). ( , , , , : curvas teóricas ajustadas)

Tabla 3.18. Valores medios del tiempo de transición límite *, potencial de deposición de
semi-onda E1/2 y constante de estabilidad condicional K’ obtenidos en agua de mar sintética
a diferentes valores de pH utilizando SSCP ([Pb(II)]=6·10 -7mol/L; n=3)
SSCP en agua de mar sintética
pH
* (s) E1/2 (V) K’ a

Calibrado 16,48 ± 0,33b -0,48305 ± 0,00246d -

(3,44)
2,7 16,23 ± 1,34c -0,49575 ± 0,00318e 8,14 ± 0,71

5 16,09 ± 0,14c -0,49525 ± 0,00141e 7,88 ± 0,04

6 15,99 ± 0,29c -0,49525 ± 0,00212e 7,96 ± 0,23

7 13,46 ± 1,56c -0,50225 ± 0,00318e 12,66 ± 1,71

8,6 9,14 ± 1,08c -0,51125 ± 0,00141e 38,57 ± 1,66

a
Valores de K’ obtenido de la ecuación para el desplazamiento del potencial de
semionda Ed,1/2 (ecuación (3.32))
*
b
Valor de  M ,corregido
d
Valor de E1/2,M
c
Valores de  M* e
Valores de E1/2,M+L
L

216
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Para valores de pH 2,7; 5 y 6, el tiempo de transición límite se mantiene constante y

con él, la constante de estabilidad condicional. Sin embargo, cuando el pH aumenta hacia
valores más básicos, * decrece debido a que existe una mayor proporción de metal
complejado que libre, y por tanto, la constante de estabilidad condicional aumenta.

3.6.2.4. Aplicación de SSCP a muestras reales de agua de mar

SSCP se aplicó a la muestra real de agua de mar recogida en la playa de Faro
(Portugal), después de haber sido estudiada su concentración de metal libre mediante
AGNES. La concentración total en la muestra fue 6,0·10-7 mol/L y el contenido de carbono
orgánico, evaluado mediante el parámetro TOC, fue de 2,01 mg/L.

En la Figura 3.22 se muestran los datos experimentales y las curvas ajustadas teóricas.
Los datos fueron normalizados con respecto al tiempo de transición límite y el potencial
estándar para Pb(II) en NaNO3 en ausencia de ligando.

1,0

0,8
/*M en NaNO , corregido
M en NaNO33, corregido

0,6

0,4
/

0,2

0,0
-0,2 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,1 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0 0,02

Ed - E0M (V)

Figura 3.22. Datos experimentales de SSCP medidos para una muestra real de agua de
mar a diferentes valores de pH ([Pb(II)]=6·10 -7mol/L): 2,7 ( ), 5 ( ), 6 ( ), 7 ( ) y
8,6 ( ). ( , , , , : curvas teóricas ajustadas)

Se puede observar que para pH 2,7; 5 y 6 los datos experimentales concuerdan

perfectamente con la curva teórica, por lo que la expresión utilizada se ajusta muy bien
para muestra real a pH ácidos, en los que los posibles ligandos heterogéneos presentes en
217
Capítulo 3

la muestra (que forman parte de la materia orgánica presente en agua de mar) no forman
complejos estables con el metal o, si lo forman, resultan ser lábiles.

Sin embargo, a partir de valores más altos de pH (7 y 8,6) los datos discrepan de los
téoricos puesto que la curva formada por los puntos experimentales se hace más plana,
con una pendiente muchos menos acusada con respecto a la predicha teóricamente. Esto
puede ser debido a la presencia de ligandos heterogéneos, como por ejemplo materia
orgánica natural en disolución [van Leeuwen y Town, 2003; Town, 2008].

A valores bajos de pH (2,7; 5; 6 y 7), no existe pérdida de labilidad, puesto que el

tiempo de transición límite de la muestra es similar al obtenido en la curva de calibrado. Tal
y como ocurre en la muestra sintética, las curvas se ven desplazadas hacia la izquierda,
indicando que hay presencia de ligandos que complejan al metal (en este caso, los ligandos
presentes son sales inorgánicas y materia orgánica, probablemente ácidos húmicos y/o
fúlvicos).

A pH 8,6 (pH natural del agua de mar) se observa una disminución apreciable en *
con respecto a la del caso de metal sin ligandos, y un desplazamiento de la curva hacia la
izquierda muy acusado. A pH 8,6 existe una pérdida de labilidad bastante acentuada. En
este caso, puesto que los datos experimentales no se ajustan adecuadamente a la curva
teórica, los valores calculados de K’ no serán fiables.

Aún así, K’ fue calculada para todos los valores de pH, utilizando la expresión (3.32) y
sus valores pueden observarse en la Tabla 3.19.

Igual que ocurría en el caso de agua de mar sintética, la constante de estabilidad

condicional para plomo permanece aproximadamente constante para valores bajos de pH,
mientras que aumenta cuando el pH es 7 y 8,6.

Para entender el comportamiento del agua de mar real a valores altos de pH, se
estudió una muestra de agua de mar sintética, a pH 8,6 con 6·10-7 mol/L de Pb(II), a la
que se le añadió tres cantidades diferentes de materia orgánica (ácidos fúlvicos). En la
Figura 3.23, se muestran los datos experimentales y las curvas teóricas, normalizadas
como se ha indicado anteriormente, de agua de mar sintética con diferentes
concentraciones de ácidos fúlvicos (1, 2 y 5 mg/L).

Cuando se añade ácido fúlvico a una muestra de agua de mar sintética, las pendientes
de las curvas disminuyen, las curvas SSCP se aplanan, al igual que ocurría en el caso de
agua de mar real, en la que se observó presencia de ligandos heterogéneos. De este modo,
queda demostrado que un cambio en la pendiente de la curva es una clara indicación de
presencia de ligandos heterogéneos en la disolución.

218
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Tabla 3.19. Valores medios del tiempo de transición límite *, potencial de deposición de
semi-onda E1/2 y constante de estabilidad condicional K’ obtenidos en agua de mar real a
diferentes valores de pH utilizando SSCP ([Pb(II)]=6·10 -7mol/L; n=3)
SSCP en agua de mar real
pH
* (s) E1/2 (V) K´a
Calibrado 16,39 ± 0,19b -0,48252 ± 0,01924d -
(pH 3,44)
2,7 13,28 ± 1,17c -0,48208 ± 0,01556e 11,86 ± 0,85

5 15,69 ± 1,83c -0,48525 ± 0,01582e 8,56 ± 0,74

6 15,75 ± 1,83c -0,48525 ± 0,01636e 8,84 ± 0,49

7 12,97 ± 1,54c -0,52975 ± 0,00141e 25,34 ± 2,00

8,6 8,02 ± 1,44c -0,54650 ± 0,00106e 158,42 ± 26,29

a
Valores de K’ obtenido de la ecuación para el desplazamiento del potencial de
semionda Ed,1/2 (ecuación (3.32))
*
b
Valor de  M ,corregido
d
Valor de E1/2,M
c *
Valores de  M e
Valores de E1/2,M+L
L

1,0

0,8
, corregido
NaNO, 3corregido

0,6
NaNO
M en
3

0,4
M en
/
/*

0,2

0,0
-0,2 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,1 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0 0,02

Ed - E0M (V)

Figura 3.23. Datos experimentales de SSCP medidos para una muestra sintética de agua
de mar a pH 8,6 con diferentes concentraciones de ácidos fúlvicos ([Pb(II)]=6·10 -7mol/L;
[ácidos fúlvicos]= 1 ( ), 2 ( ) y 5 mg/L ( ). ( , , : curvas teóricas ajustadas)

219
Capítulo 3

3.6.3. Comparación entre AGNES y SSCP

AGNES proporciona la concentración de metal libre directamente, según la ecuación
(3.56), mientras que SSCP proporciona el valor de la constante de estabilidad condicional
K’, mediante el desplazamiento del potencial de deposición de semi-onda (ecuación (3.32)).
Por lo tanto, para comparar los resultados es necesario calcular K’ a partir de la
concentración de metal libre utilizando la ecuación (3.27) en caso de AGNES, o de manera
inversa en el caso de SSCP.

El valor de la constante calculado vía AGNES se evalúa mediante la concentración de

metal libre en el seno de la disolución; sin embargo el obtenido por SSCP corresponde a
una media de las constantes de estabilidad a través de toda la capa de difusión (que
abarca desde el valor en el seno de la disolución hasta el valor en la superficie del
electrodo [Garcés y col., 1996]).

En las Tablas 3.20 y 3.21 se comparan los valores de K’ y concentración de metal libre
obtenidos mediante SSCP y AGNES para agua de mar sintética y agua de mar real, y se
comparan con la K’ calculada a partir de la concentración de metal libre proporcionada por
MINTEQ.

Tabla 3.20. Comparación de valores medios de concentración libre de metal y constante

de estabilidad condicional K’ obtenidos en agua de mar sintética utilizando AGNES y SSCP
([Pb(II)]=6·10 -7 mol/L; n=3)
AGNES (agua de mar sintética) SSCP (agua de mar sintética) MINTEQ
pH a b
CPb(II) libre (mol/L) K´ CPb(II) libre (mol/L) K´ K´

2,7 5,6·10-8 ± 9,4·10-10 9,66 ± 0,12 6,6·10-8 ± 9,0·10-9 8,14 ± 0,71 9,00

5 5,5·10-8 ± 8,0·10-10 9,68 ± 0,16 6,8·10-8 ± 1,7·10-9 7,88 ± 0,04 9,17

6 5,5·10-8 ± 9,7·10-10 9,90 ± 0,39 6,7·10-8 ± 1,4·10-9 7,96 ± 0,23 9,34

7 4,4·10-8 ± 1,4·10-9 12,90 ± 0,18 4,4·10-8 ± 5,9·10-9 12,52 ± 1,71 9,91

8,6 1,6·10-8 ± 1,5·10-9 37,80 ± 0,23 1,5·10-8 ± 5,9·10-9 38,57 ± 1,66 32,33
a
Valores calculados a partir de la concentración de Pb(II) libre encontrada en AGNES
b
Valores calculados a partir de la constante de estabilidad K’ encontrada en SSCP

220
 Estudio de especiación de Pb en agua de mar mediante AGNES y SSCP

Tabla 3.21. Comparación de valores medios de concentración libre de metal y constante

de estabilidad condicional K’ obtenidos en agua de mar real utilizando AGNES y SSCP
([Pb(II)]=6·10 -7 mol/L; n=3)
AGNES (agua de mar real) SSCP (agua de mar sintética) MINTEQ
pH a b
CPb(II) libre (mol/L) K´ CPb(II) libre (mol/L) K´ K´

2,7 5,5·10-8 ± 3,5·10-9 9,97 ± 0,40 4,7·10-8 ± 5,8·10-9 11,86 ± 0,85 9,00

5 5,4·10-8 ± 1,2·10-9 10,06 ± 0,23 6,3·10-8 ± 5,9·10-9 8,56 ± 0,74 10,54

6 4,7·10-8 ± 1,4·10-9 11,66 ± 0,27 6,1·10-8 ± 5,2·10-9 8,84 ± 0,49 11,50

7 3,1·10-8 ± 1,6·10-9 18,29 ± 0,96 2,3·10-8 ± 1,0·10-9 25,34 ± 2,00 15,67

8,6 1,06·10-8 ± 9,2·10-10 55,01 ± 4,70 3,8·10-8 ± 5,1·10-10 158,42 ± 26,29 53,55
a
Valores calculados a partir de la concentración de Pb(II) libre encontrada en AGNES
b
Valores calculados a partir de la constante de estabilidad K’ encontrada en SSCP

Los valores de K’ obtenidos por SSCP y AGNES para agua de mar sintética fueron
similares para todos los valores de pH, implicando que ambas técnicas son igualmente
válidas para calcular la constante de estabilidad condicional de plomo en muestras que
contengan ligandos inorgánicos, como pueden ser los iones de las sales presentes en agua
de mar.

En agua de mar real, los resultados obtenidos de K’ a pH 2,7; 5 y 6 con SSCP y AGNES
fueron comparables. Sin embargo, al aumentar el pH hacia valores básicos, existe una gran
diferencia entre los proporcionados por SSCP y por AGNES. La K’ obtenida en SSCP es
mucho más alta que la calculada por AGNES. En estas condiciones, la curva de SSCP se
aplana y se ensancha a lo largo del eje x, sin ajustarse a la curva teórica, por lo que los
datos de K’ no son reales ni comparables con aquéllos proporcionados por AGNES.

3.7. Conclusiones

En este capítulo se ha presentado la posibilidad de aplicar dos técnicas recientes al

análisis de la especiación de Pb(II) en muestras de agua de mar. Se han aplicado las
técnicas AGNES y SSCP simultáneamente tanto a agua de mar sintética como real y se han
comparado las constantes de estabilidad condicional y la concentración de metal libre
proporcionadas por ambos métodos.

221
Capítulo 3

Se ha encontrado que los resultados de AGNES concuerdan perfectamente con los

datos calculados a partir de MINTEQ. Además, existe una buena correlación entre los datos
proporcionados por SSCP y AGNES en muestras reales y sintéticas para todos los valores de
pH estudiados, con la excepción de los casos de pH 7 y 8,6 en agua de mar real. Este
hecho confirma que la metodología de cálculo utilizada en SSCP para determinar la
concentración libre de metal es válida para la muestra de agua de mar sintética a todos los
pH y para las muestras de agua de mar real a los pH 2,7; 5 y 6. En el caso de pH 7 y 8,6
se puede observar la influencia de los ligandos presentes en dicha muestra (que
posiblemente sean heterogéneos dada la forma de la curva experimental), y la curva
teórica no se puede ajustar de forma adecuada a los puntos experimentales, por lo que el
cálculo que se ha aplicado en SSCP para calcular la concentración libre de metal no es
válido en muestras con ligandos heterogéneos. En este tipo de sistemas complejos, SSCP
es capaz de detectar la presencia de ligandos heterogéneos mientras que AGNES mide sin
errores la concentración de metal libre en el seno de la disolución.

Por su parte, SSCP proporciona una mayor información sobre la especiación de Pb(II)
que AGNES, aunque esta segunda técnica es una herramienta muy útil en la determinación
de metal libre puesto que provee datos robustos independientemente de las características
del sistema. Por ello, el uso simultáneo de ambos métodos tiene grandes ventajas debido a
la información complementaria que facilitan.

222
 
 
 
 
 
 
 
 

Capítulo 4
Evaluación de la contaminación metálica en la
Bahía de Algeciras
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Evaluación de la contaminación metálica

en la Bahía de Algeciras

En este capítulo se estudia la calidad medioambiental de las aguas afectadas por una
intensa actividad antropogénica, mediante la evaluación de los niveles metálicos totales y
su especiación química. La zona de estudio seleccionada es la Bahía de Algeciras,
caracterizada por un impacto crónico persistente. En su entorno, existen industrias que, de
forma directa o indirecta, emplean diversos metales pesados, considerados, entre otros,
como contaminantes prioritarios según la lista aprobada en la decisión nº 2445/2001 del
Parlamento Europeo, por la que se modificó la Directiva Marco 60/2000/CE (DOCE, 2000).
Estos contaminantes pueden llegar al medio ambiente que rodea la zona y en concreto a
los sistemas acuáticos próximos. Por ello, se presenta un estudio integrado del impacto de
estas actividades sobre la Bahía de Algeciras, para lo que se propone la evaluación del nivel
de contaminación de algunos metales en las aguas, los sedimentos y la biota, tres
compartimentos ambientales que son los referenciados en las estrategias de trabajo de la
Directiva Marco de Aguas (Directiva 2000/60/CE) para la monitorización de las aguas
marinas.

Así, se incluye la cuantificación de los niveles totales y el fraccionamiento de las

especies químicas de As, Cr, Ni y Co en las muestras de la Bahía de Algeciras. Para ello, se
realizaron campañas de muestreo durante 2 años consecutivos, haciendo coincidir en el
tiempo la toma de muestra de aguas, sedimentos y especies de peces, cuya actividad
biológica se desarrolle en las zonas cercanas a los sedimentos y en la masa de agua, con
objeto de correlacionar los contenidos metálicos en los tres compartimentos ambientales.
225
Capítulo 4

Los muestreos se realizaron en las estaciones de invierno y verano, coincidiendo con los
ciclos biológicos de las especies a muestrear. Se tomaron las muestras en 4 zonas: una con
una posible afección por vertidos urbanos: Isla verde; y otras tres zonas próximas al sector
industrial pesado de la comarca: Desembocadura del río Palmones, Desembocadura del río
Guadarranque y Puente Mayorga. Asimismo se incluyó un punto de control localizado en la
Playa de Getares.

Los trabajos de investigación presentados en este capítulo se engloban dentro del

Proyecto de Investigación de Excelencia del Plan Andaluz de Investigación denominado
“Evaluación del efecto de la contaminación por actividades antropogénicas crónicas sobre el
medio litoral” (PAI 2006: P06-FQM-02075) concedido por la Junta de Andalucía, cuyo
objetivo global abarca el estudio del impacto de diversas actividades antropogénicas sobre
el medio litoral en una zona de gran actividad del suroeste de la Comunidad Andaluza (la
Bahía de Algeciras) mediante la evaluación de 4 grupos de contaminantes prioritarios según
la lista OSPAR de sustancias peligrosas: metales pesados y su especiación química (MP);
hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), policlorados dibenzo-para-dioxinas (PCDDs) y
polibromados difenilesteres (PBDE), en aguas, sedimentos y biota (especies biomonitoras
de contaminantes inorgánicos y/o orgánicos).

4.1. Antecedentes y descripción de la zona de estudio

La importancia de monitorizar y evaluar la contaminación metálica en muestras

acuáticas es incuestionable dado el efecto nocivo que supone su presencia a determinadas
concentraciones sobre la calidad medioambiental y sobre los organismos vivos. De igual
forma, la capacidad de algunos metales pesados de presentar el fenómeno de la
biomagnificación o bioacumulación, los convierten en sustancias prioritarias en el ámbito de
la política de aguas en la que se incluyen de forma explícita estos elementos así como
algunos de sus compuestos [Coquery y col., 2005].

La directiva Marco de Aguas de la Unión Europea (Directiva 60/2000/CE del Parlamento

Europeo y del Consejo sobre Política de Aguas, DOCE nº L327/1, de 22/12/2000) establece
un marco comunitario de actuación en el ámbito de la política de aguas por medio de una
estrategia combinada que comporta la formulación de normas armonizadas de calidad del
agua y el monitoreo o control de emisiones de los elementos que la definen (parámetros de
calidad ecológicos/biológicos, sustancias químicas prioritarias orgánicas/inorgánicas y
parámetros físico-químicos). El éxito de la implementación de esta normativa marco
depende de la disponibilidad de herramientas analíticas de bajo coste y de la tecnología
capaz de producir resultados de calidad [Allan et al., 2006].

226
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Como se ha indicado en el capítulo de introducción de esta tesis, los metales pesados

aparecen de forma natural en los ecosistemas acuáticos; sin embargo, altos niveles de los
mismos implican una contaminación, generalmente de origen humano. Las descargas
urbanas (incluso de aguas tratadas en depuradoras), industriales, agrícolas, etc. contienen
cantidades altas de metales pesados en comparación con sus valores naturales. La
actividad humana ha contribuido notablemente al aumento de los niveles de metales en las
aguas, sedimentos, flora y fauna, tanto marinas como epicontinentales. La presencia de
elevadas concentraciones de metales en el medio provoca efectos adversos sobre el medio
ambiente y la salud humana. Por todo ello, la contaminación progresiva del medio hídrico
por metales pesados y los efectos perjudiciales que ésta produce en la biota han dado
lugar a la necesidad de determinar la concentración de metales en diversas muestras
acuáticas que conforman estos ecosistemas.

La concentración de metales en la columna de agua es generalmente baja; por el

contrario, estos elementos se acumulan en los sedimentos y en los organismos acuáticos,
alcanzándose niveles importantes. La movilidad de los metales pesados desde los
sedimentos depende en gran medida de sus potenciales redox y modificaciones en el
medio pueden producir su resuspensión y disolución. Por tanto, el transporte físico y los
procesos físico-químicos determinan conjuntamente la distribución y velocidad de cambio
de las concentraciones de las formas químicas de los metales traza en sistemas acuáticos.

Para estudiar la relación existente entre la concentración de metales en los organismos

y en el medio que los rodea, se suelen realizar ensayos de toxicidad en el laboratorio y bajo
condiciones cuidadosamente controladas, que permiten obtener resultados precisos. Sin
embargo, tal y como se indicó en el capítulo de introducción, suelen ser poco
representativos de las condiciones reales en las que se encuentran estos organismos en el
medio natural, tanto en lo referente a las concentraciones de agentes potencialmente
tóxicos presentes en el agua como a su periodo de exposición. Además, de esta forma no
se tienen en cuenta las interacciones entre sí de los distintos contaminantes, ni las de éstos
con el medio físico y químico. Es por ello que, teniendo en cuenta estas circunstancias,
resulta más interesante abordar estudios de contaminación en ecosistemas reales y el
efecto que los metales producen en los seres vivos.

La Bahía de Algeciras es, junto con el estuario de Huelva, una de las áreas más
industrializadas del sur de España. La Bahía de Algeciras, localizada en el suroeste de la
costa mediterránea española, entre 36º 6’ 0’’ y 36º 11’ 0’’ Norte, y 5º 26’ 45’’ y 5º 21’ 0’’
Oeste, está delimitada por Punta del Carnero al oeste (cerca de la ciudad de Algeciras) y
Punta Europa al este (en Gibraltar). La bahía tiene unos 10 km de largo por 8 de ancho, lo
que se traduce en una superficie de 75 km2, con profundidades de hasta 400 m en el
centro de la bahía (Figura 4.1).

227
Capítulo 4

Río Guadarranque
Los Barrios
Río San Roque
Palmones

La Línea de
la Concepción

Gibraltar Algeciras

Algeciras

Bahía de Algeciras Actividades portuarias

Punta Europa
Industrias de acero inoxidable
Refinería petroquímica
Fábrica de papel
Planta de energía térmica

Getares Punta del Carnero

Figura 4.1. Situación geográfica de la zona de estudio

Punto de unión de dos mares y dos continentes, la Bahía de Algeciras se encuentra

englobada en el conjunto geológico conocido como Complejo del Campo de Gibraltar, el
cual constituye la entidad geológica más característica y ampliamente representada de la
provincia de Cádiz.

Este complejo está constituido principalmente por sedimentos arcillosos y areniscos de

edad cretácica y terciaria, depositados en ambientes marinos profundos. Se conocen
unidades tectónicas comparables en todo el norte de África, lo que significa que los
materiales del Campo de Gibraltar se depositaron en una extensa cuenca sedimentaria de
la que también formaron parte las cordilleras alpinas norteafricanas [Plan de Calidad
Ambiental del Campo de Gibraltar, 2001].

Respecto a su geomorfología, es un espacio donde existe una gran variedad de formas,

desde acantilados de muy lenta evolución, hasta los depósitos de arena modelados por la
acción de las corrientes de deriva y formaciones dunares de origen eólico, a lo cual se debe
añadir la relevancia de su morfología diluvial desarrollada por los depósitos de los ríos en
cuyas desembocaduras se encuentran pequeños estuarios y cordones arenosos de
infiltración [Plan de Calidad Ambiental del Campo de Gibraltar, 2001].
228
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

También hay que destacar la estrecha relación de este espacio con el Parque Natural
de los Alcornocales que se extiende por parte de los términos municipales de Algeciras y
Los Barrios.

La comarca del Campo de Gibraltar es una de las zonas más industrializadas de la

provincia de Cádiz y en ella se sitúa uno de los tejidos productivos más importantes de la
Comunidad Autónoma Andaluza. Esta comarca presenta una de las problemáticas
ambientales más complejas de toda la Comunidad Autónoma.

Grandes cantidades de contaminantes se vierten habitualmente a la Bahía de Algeciras

desde amplios núcleos urbanos, como son la ciudad de Algeciras, La línea de la Concepción
y Gibraltar, cuya principal contribución son las aguas urbanas residuales. La bahía también
se encuentra rodeada de una extensa área industrializada (una de las mayores en
Andalucía) con un número significativo de plantas petroquímicas y refinerías, además de las
plantas de fabricación de aceros, papel y centrales de energía térmica [Periáñez, 2012].

Los ríos Guadarranque y Palmones drenan sus aguas a la bahía, que a su vez recibe
contaminantes debido al intenso tráfico marítimo que existe en el Puerto de Algeciras, uno
de los mayores puertos de España. El agua en esta bahía cuenta con un alto grado de
renovación debido a su proximidad al Estrecho de Gibraltar, donde el Mar Mediterráneo y el
Océano Atlántico convergen, y a las fuertes corrientes que predominan en esta zona. Estos
factores, junto con la profundidad de sus aguas, hacen que los contaminantes se dispersen
de forma efectiva, de manera que sus efectos se ven considerablemente reducidos [Morillo
y col., 2007; Morillo y Usero, 2008].

La existencia de una industria generadora de un notable volumen de actividad, la

integración de importantes núcleos de población en torno a las fuentes de actividades
económicas, la importancia a nivel mundial del Puerto Bahía de Algeciras, la estratégica
situación geográfica de puente entre continentes y océanos, unida a un entorno natural
que conserva numerosos valores ambientales de carácter único, son sólo algunos de los
factores que motivan que las relaciones entre el desarrollo económico del Campo de
Gibraltar y la preservación del medio ambiente sean complejas.

4.1.1. Clasificación de las aguas de la Bahía de Algeciras

Al objeto de establecer las limitaciones de vertidos contaminantes, los objetivos de

calidad de las aguas litorales afectadas directamente por los mismos y el canon de vertidos,
las aguas litorales andaluzas fueron clasificadas en base a la normativa aplicable de la
Junta de Andalucía: Decreto 204/2005, de 27 de septiembre, publicada en BOJA núm. 208
de 2005, que tiene por objeto la revisión de las declaraciones de zonas sensibles y menos
sensibles en las aguas del litoral y de las cuencas hidrográficas intracomunitarias de la

229
Capítulo 4

Comunidad Autónoma de Andalucía efectuadas por el Decreto 54/1999, de conformidad

con lo dispuesto en el Real Decreto 509/1996 y el Real Decreto-Ley 11/1995. Según el
citado texto, se definen dos grupos de ecosistemas acuáticos: zonas sensibles y zonas
normales.

Zonas sensibles:
Se consideran como zonas sensibles aquellos medios acuáticos superficiales que teniendo
un intercambio de aguas escaso o que recibiendo nutrientes, sean eutróficos o puedan
llegar a serlo en un futuro próximo si no se adoptan medidas de protección, así como las
aguas dulces de superficie destinadas a la obtención de agua potable, que podrían
contener una concentración de nitratos superior a la que establecen las disposiciones
vigentes para este tipo de aguas si no se tomasen medidas de protección.

Se entiende por eutrofización el aumento de nutrientes en el agua, especialmente de los

compuestos de nitrógeno o de fósforo, que provoca un crecimiento acelerado de algas y
especies vegetales superiores, con el resultado de trastornos no deseados en el equilibrio
entre organismos presentes en el agua y en la calidad del agua a la que afecta.

Zonas normales:
Se consideran zonas normales aquellos medios acuáticos superficiales no definidos como
sensibles.

Según este Decreto, se consideran las aguas de la Bahía de Algeciras como zonas
normales.

4.1.2. Estudios previos de contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Desde el punto de vista ambiental, no existen muchos trabajos científicos de la zona
que se hayan dedicado a estudiar los niveles de la contaminación metálica en los tres
compartimentos ambientales (agua, sedimentos y peces), así como las correlaciones
existentes en dichos compartimentos.

Morillo y col., en 2007 estudiaron la movilidad de metales en los sedimentos de la

bahía y encontraron altos niveles de Ni y Cr que sobrepasaban los máximos permitidos, de
acuerdo con los niveles guías para la protección de la vida acuática [Morillo y col., 2007].

En el mismo año, Morales-Caselles y col., realizaron un estudio comparativo de la

calidad de los sedimentos en la Bahía de Algeciras (afectada por contaminación crónica) y
en el Parque Nacional de las islas Atlánticas de Galicia (afectada por contaminación aguda
tras el naufragio del Prestige en 2002). Observaron que el Ni y el Hg superaban los niveles
guías para la protección de la vida acuática en la Bahía de Algeciras, mientras que en

230
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Galicia fue el Cu el que sobrepasó ese estándar. Sin embargo, estudios anteriores al
episodio del Prestige habían demostrado que existían otras fuentes de este metal en la
zona, por lo que dicha contaminación con Cu podría no estar relacionada con el naufragio
[Morales-Caselles y col., 2007]. Posteriormente en 2008, Morales-Caselles y col.,
demostraron que el impacto asociado a episodios de contaminación crónicos eran
significativamente más peligrosos y contaminantes que aquellos que son agudos [Morales-
Caselles y col., 2008].

También en 2007, Cesar y col., compararon sedimentos de diferentes zonas del sur de
España y de Brasil. De nuevo, el Ni, junto con el Cu y el Zn fueron los metales que
sobrepasaron los límites permitidos en la Bahía de Algeciras. En general, se encontraron
valores más altos de los metales estudiados (Cd, Co, Cu, Ni, Pb, V y Zn) en la Bahía de
Algeciras que en los estuarios de Santos y São Vicente, en Brasil [Cesar y col., 2007].

Asimismo, otros autores han estudiado la contaminación metálica en la bahía utilizando

crustáceos como especies biomonitoras, que se definen como aquellas especies que
fácilmente acumulan metales pesados en sus tejidos, pueden ser analizadas para evaluar la
biodisponibilidad de dichos contaminantes en los ecosistemas y permiten estimar
extrapolaciones de comportamiento a otras especies [Morillo y Usero, 2008, Guerra-García
y col., 2009; Guerra-García y col., 2010].

La Consejería de Medio Ambiente de la Junta de Andalucía (CMAJA), junto con varios

grupos de investigación de la Universidad de Cádiz (UCA) y el Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC), impulsó en 2002 el Plan de calidad ambiental del Campo
de Gibraltar (PCACG) con la finalidad de identificar los principales problemas ambientales,
realizar un diagnóstico de la situación y proponer y afrontar las respuestas más adecuadas
para solucionarlos. Dentro de este plan de calidad ambiental, se estudió no solo la
concentración de metales pesados en aguas y sedimentos, sino también otros parámetros
de calidad biológica (fitoplancton, macrófitos e invertebrados), parámetros de
contaminación microbiológica (coliformes y estreptococos fecales) e indicadores físico-
químicos (como amonio, fosfatos, nitratos, materia orgánica,…). En dicho estudio, se
encontró que no existía contaminación metálica en las aguas de la bahía, pero sí en los
sedimentos recogidos próximos a la factoría Acerinox, destacando altos valores de cromo,
níquel y cobre [Plan de Calidad Ambiental del Campo de Gibraltar, 2006].

Puede decirse que son pocos los estudios realizados sobre la contaminación metálica
en la Bahía de Algeciras que estéán relacionados con las aguas y los sedimentos, pero se
dispone de muy poca información sobre el contenido metálico en peces, sobre la
especiación en muestras acuáticas y en sedimentos, así como la correlación entre los tres
compartimentos.

231
Capítulo 4

Por ello, en esta Tesis se aborda de forma integrada (agua, sedimentos y peces) la
evaluación de la contaminación metálica de la Bahía de Algeciras, realizando el estudio de
la especiación metálica en aguas y sedimentos, con objeto de definir su potencial
disponibilidad hacia la biota.

4.2. Metales estudiados en la Bahía de Algeciras

El agua de mar contiene de forma natural bajas concentraciones de metales pesados,

que no sólo no resultan perjudiciales para el ecosistema, sino que son necesarios para el
desarrollo de determinados organismos vivos. El problema surge cuando se produce un
aumento en su concentración. Estos elementos, que resultan beneficiosos o incluso
imprescindibles, se convierten en sustancias tóxicas para los organismos marinos e incluso
pueden acumularse en la cadena trófica, de modo que pueden convertirse en sustancias
tóxicas para el hombre.

Las aguas residuales contienen una cantidad variable en elementos de este tipo. La
presencia de estos metales estará condicionada al tipo de industria y de actividades que se
produzcan en los municipios de alrededor.

La lista de metales y metaloides incluidos en todas las normativas de calidad de aguas

y vertidos al litoral, incluyen un total de 20 elementos. La normativa andaluza (Orden de 14
de febrero de 1997, publicada en BOJA núm. 27 de 1997) considera necesario el control
ambiental de 11 metales: arsénico, cadmio, cobre, cromo (total), cromo (VI), estaño,
mercurio, níquel, plomo, selenio, titanio y cinc.

Es por ello que en este trabajo se decidió evaluar y biomonitorizar los metales
arsénico, níquel y cromo, además del cobalto que también es indicador de aguas
contaminadas por vertidos industriales, como parte del proyecto de investigación realizado
en el grupo de investigación y mencionado al comienzo de este capítulo.

4.2.1. Arsénico
El metaloide más importante como contaminante del agua es el arsénico, elemento
tóxico que ha sido el “villano” químico de más de un complot de asesinatos
[Frankenberger, 2001].

El arsénico es quebradizo, con estructura metálica cristalina, que presenta tres formas
alotrópicas de colores amarillo, negro y gris. El arsénico se encuentra ampliamente
distribuido en la naturaleza pudiendo encontrarse cantidades detectables tanto en suelos,

232
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

como en aguas superficiales, aguas subterráneas y otros medios. Se encuentra en la

corteza de la Tierra en un nivel medio de 2-5 mg/kg [Manahan, 2010]. Es un constituyente
natural de los minerales de plomo, cinc, oro y cobre. Fenómenos naturales tales como la
meteorización, la actividad biológica y la actividad volcánica junto con las aportaciones
antropogénicas son las responsables de la emisión de arsénico a la atmósfera, desde donde
se redistribuye a la superficie de la tierra mediante la lluvia y el viento [Cullen y Reimer,
1989; Bissen y Frimmel, 2003; Oremland y Stolz, 2003]. Algunos plaguicidas que se usaban
anteriormente, particularmente antes de la Segunda Guerra Mundial, contienen compuestos
de arsénico muy tóxicos. En aguas naturales, el arsénico se encuentra a nivel de trazas. La
concentración de este metal en aguas costeras, bahías y estuarios puede oscilar entre 1,0 –
1,04 g/L [Crompton, 2007].

La movilidad y biodisponibilidad del arsénico depende principalmente de la especie

química de arsénico presente, del pH del suelo o de las aguas subterráneas, de la presencia
de óxidos de manganeso e hierro y arcillas, del potencial redox y de la presencia de otros
iones competidores. Las especies más abundantes de arsénico en suelos y aguas son el
As(III) y el As (V) [Oremland y Stolz, 2003; Bradl y col., 2005].

Tanto As(III) como As(V) en aguas naturales normalmente se enlazan a oxígeno para
formar especies inorgánicas de arsenito (As(III) inorgánico) y arseniato (As(V) inorgánico),
respectivamente. Dependiendo del pH, As(III) puede existir como H3AsO3, H2AsO3-, HAsO32-
y/o AsO33-. En aguas anóxicas y ricas en sulfuros, el As(III) puede formar tioarsenitos.
As(V) ocurre usualmente como H3AsO4, H2AsO4-, y /o AsO43- dependiendo del pH. En agua
de mar oxigenada, el As se encuentra predominantemente como As(V) en forma de
HAsO42-. Además, pueden existir tioarseniatos en aguas anóxicas con contenido alto de
sulfuros [Henke, 2009; Gibbon-Walsh y col., 2012].

En aguas costeras, bahías y estuarios, As(V) inorgánico es la especia predominante.

Sin embargo, las aguas estuáricas pueden contener concentraciones importantes de As(III)
cuando se encuentran en condiciones anóxicas o con alta actividad biológica. Por otra
parte, altas actividades biológicas también pueden ser responsables de la formación de
especies organoarsénicas (como el ácido monometilarsónico o el dimetilarsínico). En
algunas zonas, estas especies pueden llegar a representar un 25% del total de arsénico en
aguas costeras marinas [Henke, 2009].

De todas las especies de As, la que presenta mayor toxicidad es el As(III). Esta especie
es 60 veces más tóxica que el As(V). Además, los compuestos inorgánicos de arsénico son
100 veces más tóxicos que los orgánicos [Jain y Ali., 2000].

El arsénico trivalente se absorbe más rápidamente que el arsénico pentavalente en los

sistemas biológicos, aunque ambos estados de oxidación inhiben los procesos energéticos
vinculados a las funciones de la mitocondria. Los compuestos de As(III) tienen una alta
233
Capítulo 4

afinidad por los grupos sulfhidrilo de las proteínas provocando la desactivación de las
enzimas. Por su parte los compuestos de As(V) compiten con los fosfatos en las reacciones
celulares pudiendo desacoplar la fosforilación oxidativa, de modo que no se conserven los
enlaces trifosfatos de alta energía de la adenosina. También se piensa que los compuestos
orgánicos del As ejercen efectos tóxicos en los organismos vivos a través de su
metabolización a la especie de trióxido de arsénico.

En los invertebrados acuáticos, tales como mejillones, crustáceos y moluscos, se ha

demostrado que la absorción de arsénico es directamente proporcional a la concentración
de As en el medio; por el contrario no parece que el arsénico se bioacumule en los peces.
Los peces son capaces de retener más del 99% del arsénico ingerido en forma orgánica. En
general, el arsénico no se biomagnifica a través de la cadena alimenticia y los factores de
bioconcentración observados para los organismos acuáticos son relativamente bajos,
excepto en el caso de las algas [Bradl y col, 2005]. Poco se sabe acerca de los mecanismos
de toxicidad del arsénico a niveles subletales en peces, sin embargo se ha observado que
bajas concentraciones de As afectan a procesos fisiológicos que están involucrados en los
procesos que regulan el estrés. Así, se observa que cuando aumenta la concentración de
especies nocivas de arsénico en los peces ocurre un crecimiento anormal, se reduce la
capacidad de aclimatación a los cambios en la temperatura y salinidad y se observan
cambios en la reproducción [Bears y col, 2006]. Aunque se ha observado que el arsénico se
acumula primero en la retina, el hígado y la piel de los peces, puede interferir con el
sistema inmune suprimiendo la producción de anticuerpos y citoquinas, haciéndolos más
susceptibles a las infecciones [Datta y col, 2009].

El arsénico en humanos puede causar intoxicación aguda y crónica. Los síntomas de

una intoxicación crónica de arsénico son la debilidad, la pérdida de reflejos, gastritis, colitis,
anorexia, pérdida de peso y de cabello. Una exposición prolongada a través de la comida o
el aire puede dar lugar a hiperqueratosis, hiperpigmentación, enfermedades
cardiovasculares, alteraciones en la periferia vascular y en el sistema nervioso, trastornos
circulatorios, uñas quebradizas, eccemas y daños en hígado y riñón. El arsénico se acumula
en el cabello, la piel, las uñas y los huesos. Una intoxicación aguda por arsénico puede
causar vómitos, sequedad en la boca y la garganta, calambres musculares, dolor
abdominal, cólico, hormigueo en pies y manos, piel húmeda y fría, alucinaciones, delirios y
diarrea. La muerte ocurre debido a un fallo renal antes de 24 horas, o en los días
siguientes debido a fallos multiorgánicos o por ataque al corazón. El arsénico es dañino a
nivel genético ya que inhibe los procesos de reparación del ADN. La absorción de arsénico
por vías aéreas causa cáncer de pulmón. La ingesta por vía oral provoca cáncer de vejiga,
insuficiencia renal, cáncer de hígado y cáncer de piel [Bissen y Frimmel, 2003].

El cuerpo humano puede desintoxicar una cierta cantidad de compuestos inorgánicos

de As(III) y As(V) a través de la metilación. Estos compuestos metilados se excretan por la
234
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

orina después de tres a cuatro días. La capacidad de metilación de los compuestos de

arsénico es limitada de 400 a 500 mg por día. Aunque la sensibilidad al arsénico es
diferente para cada individuo, los seres humanos que no están acostumbrados al consumo
de arsénico pueden morir con una absorción de arsénico entre 0,1 y 0,3 g por día.

4.2.2. Níquel
El níquel y sus compuestos se liberan a la atmósfera a través de fuentes naturales y
antropogénicas. Aunque el Ni es un elemento esencial en las plantas así como en la biota,
existe una gran preocupación por su toxicidad y su carencia. Muchos estudios han
concluido que existe un aumento significativo en las concentraciones de este metal pesado
en suelos agrícolas y en bosques, así como en los sedimentos de aguas subterráneas y
marinas desde el siglo pasado [Pacyna E.G. y Pacyna, J.M., 2001].

También se observa un aumento en las áreas alejadas de las fuentes antropogénicas

debido al transporte atmosférico de largo alcance, así se han detectado concentraciones
elevadas de este metal en la región ártica, en las zonas finlandesa, noruega y lapona
[Lindroos y col., 1996; Pacyna y Ottar, 1985].

Nriagu y Pacyna [Nriagu y Pacyna, 1988] dan una valoración de unas 24000-87000
toneladas de emisiones mundiales de Ni a la atmósfera en 1983, y unas descargas en los
suelos a través del polvo radiactivo, basuras, fertilizantes, lodo de aguas residuales,
partículas atmosféricas, etc., de unas 106000 a 544000 toneladas por año. En este
contexto, parece indicado que se tenga a este metal en consideración en los estudios
ambientales.

El níquel es abundante y más de un millón de toneladas son producidas anualmente en

todo el mundo por operaciones de minería, laminado, fundición y refinación. No obstante,
es también uno de los materiales más reciclados en la actual economía global. Si añadimos
a esto el hecho de que la mayoría de los productos que contienen níquel poseen una larga
vida útil, un promedio de más de 25 años, se tiene una sustancia con una gran
contribución al desarrollo sostenible [ENIA, 2006].

Aproximadamente el 65% del níquel consumido se emplea en la fabricación de acero

inoxidable austenítico y otro 12% en superaleaciones de níquel. El restante 23% se reparte
entre otras aleaciones, baterías recargables, catálisis, acuñación de moneda,
recubrimientos metálicos y fundición [Níquel, 2006].

Las fuentes importantes de Ni incluyen la minería, la producción de acero y aleaciones,

electroplateado, transportes, industrias químicas, equipamientos eléctricos y construcción.
[WHO, 2000]. Sin embargo, la fuente antropogénica principal de Ni es la quema de
combustibles fósiles, emitiendo 86110 toneladas de Ni en 1995, que es más de dos veces
235
Capítulo 4

las emisiones que se produjeron en 1983 para este metal (40833 toneladas) [Pacyna E.G. y
Pacyna, J.M., 2001].

En aguas naturales, el níquel se encuentra a nivel de trazas. La concentración de

níquel en mar abierto se encuentra en el rango 0,15 – 0,93 g/L, mientras que en aguas
costeras, bahías y estuarios puede oscilar entre 0,2 – 5,33 g/L [Crompton, 2007]. El
níquel en agua de mar se encuentra como Ni(II) y su forma mayoritaria es como catión
hidratado. Además, puede encontrarse como NiHCO3+, NiCl+ si el valor de pH es próximo a
7. Para valores de pH cercanos a 10, comienzan a formarse las especies NiOH+, Ni(OH)2, y
NiCO3 [vanLoon y Duffy, 2011]. Normalmente no forma especies organometálicas en aguas
oceánicas [Ure y Davidson, 2002].

El efecto adverso más común de exposición al níquel en seres humanos es una

reacción alérgica. Aproximadamente el 2% de hombres y el 11% de mujeres de la
población son sensibles al níquel. Algunas personas sensibilizadas reaccionan cuando
ingieren níquel en los alimentos o el agua, o cuando respiran polvo que contiene níquel.
Además, se ha confirmado que en personas que respiraron polvo que contenía altos niveles
de compuestos de níquel durante el trabajo en refinerías de níquel o en plantas de
procesamiento de níquel, se observó un aumento de cáncer de pulmón y de los senos
nasales [WHO, 2000].

El Departamento de Salud y Servicios Humanos (DHHS) ha determinado que es

razonable predecir que el níquel metálico es carcinogénico y que los compuestos de níquel
son sustancias reconocidas como carcinogénicas. La Agencia Internacional para la
Investigación del Cáncer (IARC) ha determinado igualmente que algunos compuestos de
níquel y posiblemente el níquel metálico son carcinogénicos en seres humanos. De forma
similar la EPA ha determinado los mismos efectos para los polvos de refinerías de níquel y
el sulfuro de este metal.

El níquel es también hepatotóxico, y los estudios demuestran que el cinc puede

prevenir la toxicidad del níquel inducida y mantener los niveles normales y la función de las
enzimas del hígado [Sidhu y col., 2004]. El níquel, como otros metales, puede inducir la
peroxidación lipídica y puede agotar el glutatión, muy probablemente a través de
mecanismos de estrés oxidativos [Kasprzak y col., 2003; Valko y col., 2005].

4.2.3. Cobalto
El cobalto es un sólido de color gris plateado a temperatura ambiente. Puede
encontrarse en diversos medios, como aire, agua superficial, agua subterránea, filtraciones
de vertederos de desechos peligrosos, suelos y sedimentos. Las fuentes de exposición al
cobalto son tanto naturales como antropogénicas. Las fuentes naturales incluyen el polvo
236
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

arrastrado por el viento, el agua marina pulverizada, los volcanes, los incendios forestales y
las emisiones biogénicas continentales y marinas. Entre las fuentes antropogénicas cabe
mencionar la quema de combustibles fósiles, los fangos de alcantarillado, los fertilizantes
fosfatados, la extracción y fusión de menas de cobalto, la preparación de aleaciones de
cobalto y las industrias que utilizan o elaboran compuestos de cobalto. El cobalto metálico
se utiliza junto con hierro y níquel para formar aceros especiales con propiedades
magnéticas. También se utiliza junto con cromo y wolframio en aceros Estelite, que se
utilizan para fabricar herramientas de corte de alta velocidad [Cobalt Development
Institute, 2004]. Recientemente se ha descubierto un nuevo método para la conversión
directa de calor en electricidad mediante el uso de un acero multiferroico que contiene
cobalto: Ni45Co5Mn40Sn10 [Srivastava y col., 2011]. Asimismo, se utiliza como pigmento en
vidrios, cerámicas y pinturas, y como catalizador en industrias de petróleo y en baterías.

El cobalto y sus compuestos inorgánicos no son volátiles y se liberan a la atmósfera

como partículas. El cobalto antropogénico procedente de la combustión se encuentra
fundamentalmente en forma de óxidos. Los sulfuros y arseniuros se liberan a la atmósfera
a partir de procesos de extracción y refinado.

Las concentraciones de cobalto medidas en la atmósfera son de alrededor de 1 ng/m3

o menos en zonas que carecen de fuentes de este elemento y en general son de menos de
10 ng/m3 en las zonas que sí las tienen, aunque también se han detectado concentraciones
más altas en estas últimas. Las concentraciones de cobalto en las aguas superficiales y
freáticas son bajas, inferiores a 1 g/L en zonas vírgenes y de 1–10 g/L en zonas
pobladas, pudiendo alcanzar valores mucho más elevados en zonas mineras y agrícolas, de
hasta varios cientos de mg por litro. La concentración de este metal en mar abierto se
encuentra en el rango 0,003 – 0,16 g/L, mientras que en aguas costeras, bahías y
estuarios puede oscilar entre 0,01 – 0,25 g/L [Crompton, 2007]. Al igual que el Ni, el Co
en agua de mar se encuentra como Co(II) y su forma mayoritaria es como catión
hidratado. Además, puede encontrarse como CoCO3 cuando el valor de pH es próximo a 7.
Para valores de pH cercanos a 10, predominan las especies Co3O4 y CoCO3 [vanLoon y
Duffy, 2011]. Normalmente no forma especies organometálicas en aguas oceánicas [Ure y
Davidson, 2002].

La inhalación de partículas de cobalto da lugar a su deposición en las vías respiratorias,

donde pueden quedar retenidas o pasar a la sangre tras su disolución, o bien transferirse al
tracto gastrointestinal por acción mucociliar y deglución. Se absorbe alrededor del 50% del
cobalto que entra en el sistema gastrointestinal. La absorción es mayor en las personas con
deficiencia de hierro. Las formas solubles en agua se absorben mejor que las insolubles. El
cobalto es esencial puesto que es el ión central en la molécula de la vitamina B12; por
consiguiente, se encuentra en la mayoría de los tejidos. Su acumulación total en el
organismo se estima en 1,1–1,5 mg, con 0,11 mg en el hígado. Se han observado
237
Capítulo 4

concentraciones más altas de cobalto en los pulmones tras la exposición por inhalación. No
hay estudios que describan su distribución en las personas tras la ingestión, pero diversos
estudios en animales indican que se retiene fundamentalmente en el hígado. En un estudio
de exposición humana controlada a aerosoles, el 40% de la acumulación inicial de óxido de
cobalto en los pulmones se retuvo seis meses después de la exposición. La excreción
urinaria aumenta con el tiempo tras la exposición por inhalación. El tamaño de las
partículas influye en la eliminación del cobalto inhalado, puesto que cuanto más grandes
son las partículas más cobalto pasa mecánicamente al tracto gastrointestinal. La
eliminación fecal es la principal vía de excreción en las personas tras la exposición oral [Kim
y col., 2006].

Se ha comprobado que el cobalto tiene efectos en la reproducción y el desarrollo de los

animales, produciendo degeneración y atrofia testicular en machos. Las ratas preñadas
expuestas a dosis de cloruro de cobalto produjeron crías recién nacidas con crecimiento
retardado y disminución de la supervivencia, pero no se observó ningún efecto teratogénico
[Kim y col., 2006].

La inhalación y la exposición cutánea al cobalto en humanos pueden dar lugar a

sensibilización. En trabajadores expuestos a diversas formas de cobalto se ha descrito
asma bronquial. Las personas que ingirieron cloruro de cobalto en concentraciones de 150
mg/día durante 22 días sufrieron policitemia y un aumento de la hemoglobina. También
hay estudios en los que se ha descrito cardiomiopatía en personas que habían consumido
grandes cantidades de cerveza que contenía sulfato de cobalto [Kim y col., 2006].

4.2.4. Cromo
El cromo en aguas proviene de fuentes naturales, como la erosión o el desgaste de
constituyentes rocosos, precipitaciones y deposición seca procedente de la atmósfera. En
aguas naturales, el cromo se encuentra a nivel de trazas. La concentración de cromo en
mar abierto se encuentra en el rango 0,005 – 1,26 g/L, mientras que en aguas costeras,
bahías y estuarios puede oscilar entre 0,095 – 3,3 g/L [Crompton, 2007]. Sin embargo, las
concentraciones de este metal en áreas contaminadas pueden llegar a ser un poco más
altas, debido a las descargas de aguas residuales procedentes de industrias metalúrgicas,
eletroplateado, curtido de cueros, torres de refrigeración, conservación de maderas,
industria de tintes, pinturas y papel [Khezami y Capart, 2005].

Las especies de cromo presentes en los efluentes dependen del proceso industrial en el
que se genere este metal. El cromo es un elemento que presenta un rango de estados de
oxidación que varía entre cromo divalente y cromo hexavalente, aunque las formas
mayoritarias en aguas naturales son la trivalente y hexavalente [Sander y col., 2003]. El

238
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

cromo trivalente es la forma más común que se puede encontrar en la naturaleza y,

probablemente, es la forma en que se encuentra el cromo en el material biológico. No hay
evidencia de la conversión del cromo hexavalente a trivalente en los sistemas biológicos,
sin embargo, el cromo hexavalente es capaz de cruzar las membranas celulares y luego ser
reducido a cromo trivalente [del Ramo y col., 1993].

El Cr(VI) es muy soluble en agua y se encuentra en las aguas naturales formando

compuestos estables tales como CrO42-, HCrO4- o Cr2O72-, dependiendo del pH. Tiene muy
poca tendencia a formar complejos con ligandos orgánicos o inorgánicos, lo que le permite
atravesar las membranas celulares. El Cr(III), sin embargo, presenta reacciones más
complicadas. Puede encontrarse en forma hidrolizada como Cr(H2O)4OH2+ y complejado,
además de encontrarse también adsorbido sobre materia coloidal. En presencia de ligandos
orgánicos, el Cr(III) tiene tendencia a formar complejos, que presentan cinéticas muy
lentas [Li y Xue, 2001; Sander y col., 2003; Pyrzynska, 2012]. Los compuestos de Cr(III)
en el agua tienen tendencia a precipitar desde valores de pH cercano a 4,5. La
precipitación y la adsorción del Cr en sedimentos están contraladas por una gran variedad
de factores, como el potencial redox, el estado de oxidación, el pH, los minerales
existentes, agentes complejantes, etc. Estos factores controlan los procesos de partición
entre el sedimento y el medio acuático. Las especies de Cr hexavalentes son especialmente
adsorbidas por óxidos de hierro, Al2O3, caolinita y montmorillonita. Las especies de Cr
trivalente se adsorben rápida y específicamente a óxidos de hierro y manganeso y a
minerales [Bradl y col., 2005].

El cromo, a diferencia del cadmio, mercurio y plomo, se considera un metal esencial. El

Cr(III) es un elemento traza esencial para el metabolismo de los mamíferos. Además, se
considera un factor importante en la tolerancia a la glucosa y se usa como control en
ciertos casos de diabetes. Se ha encontrado que reduce los niveles de colesterol en sangre
puesto que es capaz de disminuir la concentración en sangre de las lipoproteínas de baja
densidad (LDL). En contraposición al Cr(III), los compuestos de Cr(VI) son tóxicos para los
organismos dada su alta movilidad y solubilidad en agua [Mohana y Pittman Jr., 2006].

Los datos disponibles en organismos acuáticos muestran claramente que el Cr(VI) es

más tóxico en aguas dulces y blandas, y en general los organismos más jóvenes son más
sensibles. También se ha comprobado que las 96 horas de exposición utilizadas en la
mayoría de las pruebas de toxicidad son insuficientes para encontrar patrones estables de
mortalidad. Los organismos más sensibles son crustáceos y rotíferos de agua dulce y los
crustáceos marinos. También se ha comprobado en peces de agua dulce un incremento de
la toxicidad en aguas con valores bajos de pH. En peces marinos se produce un incremento
de la toxicidad del cromo hexavalente con la temperatura [del Ramo y col., 1993].

La exposición aguda a Cr(VI) en humanos causa nauseas, diarrea, daños en el hígado

y riñones, dermatitis, hemorragias internas y problemas respiratorios [Mohan y col., 2006].
239
Capítulo 4

La inhalación puede causar toxicidad aguda, irritación y úlceras en las fosas nasales y
problemas respiratorios (asma) [Mohan y col., 2005; Mohan y col., 2006; Kimbrough y col.,
1999]. Su ingestión puede afectar a la función hepática y renal. El contacto con la piel
puede resultar en envenenamiento y causar quemaduras severas. Si no se trata con
rapidez, puede llegar a producir úlceras y dermatitis alérgica crónica.

4.3. Toma de muestra

Al proceso de captación, conservación, transporte, manipulación y etiquetado de la

muestra, se le denomina toma de muestra.

La toma de muestra o muestreo de una zona potencialmente contaminada por

sustancias tanto orgánicas como inorgánicas tiene como objetivo la obtención de
información sobre la concentración de dichos compuestos, de manera que pueda
establecerse una comparación con los niveles de referencia propuestos para la protección
de la salud humana y los ecosistemas.

La importancia del muestreo radica en que la información sobre sustancias

contaminantes ha de ser significativa y fiable, de manera que la toma de decisiones sobre
el lugar potencialmente contaminado sea adecuada a su particular problemática, referida
principalmente a los riesgos que existan para la salud humana y la protección de los
ecosistemas.

Esta recogida de muestras debe realizarse atendiendo a una serie de pautas. Es

imprescindible una manipulación correcta de la muestra para evitar que los valores de los
parámetros determinados en los análisis difieran de los del sistema original y conducir con
ello a resultados irreales sobre el tipo y cantidad de los contaminantes presentes, es decir,
a un conocimiento falseado de dicho sistema y sus condiciones. Por ello, es necesario que
el procedimiento de toma de muestras permita la obtención de una serie de muestras
representativas del problema analítico planteado, de forma que el conjunto de éstas sean
representativas de la población estudiada.

La caracterización de un sistema hídrico supone la identificación de los contaminantes

presentes en él mismo y su cuantificación. Para ello, normalmente no se analiza el total del
sistema estudiado sino un volumen finito del mismo que se denomina muestra. Una
muestra debe cumplir las siguientes condiciones [González Benito y col., 2002]:

- Ser representativa del sistema en el momento del muestreo.

- Tener un volumen suficientemente pequeño como para facilitar su transporte y

manipulación sin que deje de representar adecuadamente al material de donde procede.
240
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Este objetivo implica que la concentración relativa de todos los componentes será la misma
en las muestras que en la población objetivo y éstas serán tratadas de tal forma que no se
produzcan alteraciones significativas en su composición antes de que se realicen las
pruebas correspondientes.

- Preservar los valores del parámetro o parámetros a determinar hasta el momento de su

análisis.

- Poseer una correcta identificación espacial, temporal y de manipulación.

Teniendo en cuenta estos aspectos, se detalla a continuación la metodología de toma

de muestra empleada para cada tipo de muestra a estudiar:

Las muestras de aguas y sedimentos fueron recogidas desde el barco de la Consejería

de Medio Ambiente de la Junta de Andalucía, llamado Isla de Tarifa (Figura 4.2).

Las muestras biológicas fueron capturadas al azar desde un barco de pesca particular
contratado para este fin, empleándose las técnicas de arrastre y marisqueo.

Figura 4.2. Embarcación de la Junta de Andalucía empleada en las campañas de muestreo

241
Capítulo 4

4.3.1. Muestras de agua

La toma de muestras de agua (Figura 4.3) se realizó en continuo, empleando un tubo
de teflón (6406-66 de Cole-Parmer Instrument Co. Illinois U.S.A) acoplado a una bomba
peristáltica portátil (MasterFlex E/S portable sampler nº 7571-05, Cole-Parmer Instrument
Co., Illinois U.S.A., con cabezal MasterFlex 7518-02), siguiendo el protocolo manos limpias-
manos sucias, anteriormente explicado en el Capítulo 2.
En cada punto de muestreo todo el sistema de bombeo se enjuagó durante unos
minutos con la propia agua antes de tomar la muestra definitiva. Las muestras de agua que
así lo precisaron fueron filtradas in situ a través de cartuchos de filtración con filtros de
membrana de 0,45 micras de tamaño de poro (Whatman groundwater filter capsule, 0,45
µm 29705-92, Cole-Parmer Instrument Co. Illinois U.S.A.), conectados en línea con la
bomba y el recipiente recolector. El agua se depositó en botellas de polietileno de baja
densidad, que fueron cerradas e introducidas en dos bolsas de plástico de cierre hermético.
Las botellas se conservaron en neveras de plástico refrigeradas con bloques de hielo hasta
su llegada al laboratorio. El protocolo para la toma de muestras de agua vino determinado
por el esquema de especiación que se iba a aplicar en el análisis de los metales objetos de
estudio en este trabajo. En cada punto de muestreo se tomaron las siguientes muestras:

- 500 mL de agua sin filtrar a la que se añadió tras la llegada al laboratorio 1 mL de HNO3
(calidad Suprapur, Merck (Alemania)) de modo que la concentración ácida fuera de 2 mL/L.
La muestra se dejó aproximadamente dos semanas a temperatura ambiente para que el
ácido pudiera lixiviar los metales que pudieran haberse adsorbido en las paredes del
recipiente de plástico durante el transporte. Posteriormente se congeló a -20ºC.

- 500 mL de agua filtrada in situ a la que se adicionó 1 mL de HNO3 (calidad Suprapur,

Merck (Alemania)) a la llegada al laboratorio, de modo que la concentración ácida fue
igualmente de 2 mL/L. La muestra también se dejó aproximadamente dos semanas a
temperatura ambiente, como en el caso anterior. Posteriormente fue congelada a -20ºC.

- 500 mL de agua filtrada a la que no se adicionó ningún reactivo y que fue congelada
inmediatamente tras la llegada al laboratorio a -20ºC.

- 500 ml de agua sin filtrar a la que se añadió 1 mL de HCl (calidad Suprapur, Merck
(Alemania)) a la llegada al laboratorio y se congeló.

- 500 mL de agua filtrada in situ a la que se añadió 1 mL de HCl (calidad Suprapur, Merck
(Alemania)) a la llegada al laboratorio y fue congelada hasta su análisis.

- 500 mL de agua sin filtrar, que fueron utilizados para el cálculo de la densidad del agua
por pesada y para evaluar la materia suspendida de las muestras. Para el cálculo de la
densidad se emplearon matraces de 10 mL previamente secos y tarados. Para la materia
suspendida se utilizaron dos porciones de aproximadamente unos 100 mL de agua que
242
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

fueron filtrados con bomba de vacío, empleando filtros de nylon de 0,45 m previamente
lavados, secados y tarados.

Manos limpias – manos sucias

Bomba peristáltica Tubo de teflón

Figura 4.3. Procedimiento de toma de muestra de agua

4.3.2. Muestras de sedimento

Las muestras de sedimentos se tomaron con ayuda de una draga tipo Eckman-Birge y
se depositaron dentro de dos bolsas de plástico de cierre hermético. Las muestras de
sedimento, al igual que las muestras de agua, se conservaron en neveras de plástico
refrigeradas con bloques de hielo hasta su llegada al laboratorio, momento en el que se

243
Capítulo 4

congelaron a -20ºC hasta que fueron pretratadas y analizadas siguiendo el protocolo de

análisis total y especiación.

En la Figura 4.4 se muestra el proceso de toma de muestra de sedimentos.

Figura 4.4. Procedimiento de toma de muestra de sedimentos

4.3.3. Muestras de peces

Las muestras biológicas fueron capturadas desde un barco de pesca particular
contratado para este fin, empleándose redes o trasmallo. Los peces se mantuvieron con

244
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

vida hasta que se diseccionaron en la misma área de captura, y se extrajeron los tejidos
objeto de estudio: branquias, músculo e hígado (Figura 4.5). Las muestras se conservaron
refrigeradas en nitrógeno líquido hasta su llegada al laboratorio, en donde fueron
conservadas a -80ºC.

Figura 4.5. Toma de muestra de peces

4.4. Protocolos de limpieza

Son muchas las dificultades que se presentan a la hora de estudiar la distribución y el

comportamiento de elementos traza, en concreto los metales pesados, en los ecosistemas
acuáticos dada la baja concentración que puede darse para algunos metales y dada la
complejidad que pueden presentar algunas matrices. Cuando se trata en concreto de
estudios de especiación de metales pesados en aguas, donde los niveles metálicos son
menores que en sedimentos y biota, es necesario tomar singulares precauciones desde el
punto de vista analítico para alcanzar resultados seguros, fiables y exactos, pues en este

245
Capítulo 4

caso las concentraciones metálicas suelen ser muy bajas. Es por ello que se ha de prestar
especial atención en evitar la contaminación de la muestra ambiental en cada una de las
etapas experimentales que componen el análisis. Estas etapas comprenden la toma de
muestra, el almacenamiento de la misma, la realización de una etapa de preconcentración
en algunos casos y la determinación analítica final de los elementos de interés. Todos estos
pasos implican una manipulación de la muestra que puede originar cambios en su
composición, que suelen ser por lo general, debidos a problemas de contaminación. Por
ello, hace algunas décadas se introdujeron técnicas de limpieza durante el muestreo y el
tratamiento de las muestras. Patterson y Settle (1976) se percataron de que las medidas
de las concentraciones ambientales de plomo eran con frecuencia erróneas debido a la
contaminación de las muestras y fueron los pioneros en desarrollar los primeros protocolos
de limpieza para el muestreo y manipulación de las muestras en el análisis elemental de
matrices ambientales.

Así por ejemplo, la introducción de este tipo de técnicas limpias, así como el desarrollo
experimentado por las técnicas analíticas instrumentales han permitido disminuir los límites
de detección demostrando que las concentraciones en aguas naturales no contaminadas
eran entre 10 y 1000 veces inferiores a las que habían sido determinadas con anterioridad
[Creasey y Flegal, 1999].

Por estas razones, durante toda la fase experimental se aplicaron condiciones de

limpieza para análisis de metales en muestras de sedimento y tejidos biológicos y
condiciones de ultralimpieza para el análisis de las aguas, tales como la utilización de
dobles guantes de plástico para el manejo del material y atmósferas limpias por medio de
campanas de flujo laminar Clase 100 (Crumair 9005-FL, con filtro absoluto HEPA, Cruma,
España) durante la manipulación de las muestras.

A continuación se detalla el procedimiento general de limpieza de material, así como el

protocolo específico de limpieza seguido en la toma de muestra.

4.4.1. Procedimiento general de limpieza de material

Entre las condiciones de limpieza, hay que destacar el lavado al que fue sometido todo
el material empleado en el laboratorio (matraces, pipetas, reactores de teflón, portafiltros,
embudos, probetas, etc). El protocolo seguido para las muestras de agua fue el siguiente:

1. El material se lavó inicialmente con agua y jabón.

2. Tras enjuagarse el material con agua corriente, se volvió a enjuagar con agua Milli-
RO. Posteriormente se lavó con HNO3 (2 mol/L) tanto por fuera como por dentro; para ello
se emplearon pequeñas porciones de ácido que se hicieron pasar por toda la superficie,
repitiendo la operación al menos tres veces. El ácido empleado se descartó.
246
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

3. Se enjuagó tres veces con agua Milli-RO para retirar los restos de ácido.

4. Posteriormente se procedió a sumergir el material en baño cerrado de HNO3 para

análisis (2 mol/L) durante al menos una semana. Este ácido se preparó utilizando agua
desionizada (Milli-Q) como disolvente y se renovó, al menos, una vez al mes en función de
su uso.

5. Tras sacarse del baño de ácido, el material se enjuagó cuatro veces con agua
desionizada (Milli-Q) y se secó en campana de flujo laminar.

6. Por último, se almacenó protegido dentro de bolsas de plástico transparente hasta

su utilización.

En el caso del muestreo de sedimentos y tejidos de peces, la limpieza del material

empleado no fue tan rigurosa. En este caso, el material fue limpiado 3 veces con agua Milli
Q, tras lo cual se sumergió en un baño cerrado de HNO3 para análisis (2 mol/L) durante un
día. Posteriormente, se enjuagó con agua Milli Q 3 veces.

4.4.2. Procedimiento de limpieza en la toma de muestra de aguas

El material utilizado en la toma de muestra de aguas comprende los tubos de recogida
de muestra, los cartuchos de filtración, los filtros de nylon y las botellas destinadas a
recoger y almacenar las muestras.

Tubos de toma de muestra

En la toma de muestra se utilizaron dos tipos de tubos: uno de teflón rígido de FEP
(6406-66 de Cole-Parmer Instrument Co. Illinois U.S.A) para la toma de muestras y varios
tubos flexibles de Tygon (6424-71 de Cole-Pamer Instrument Co. Illinois U.S.A.) (tubo C-
Flex) que se unen al de teflón rígido con el fin de ayudar en el avance del agua mediante el
movimiento peristáltico de la bomba. Estos tubos fueron elegidos dada su baja capacidad
de adsorción de metales y su alta resistencia al ataque ácido.

El tubo de teflón fue limpiado llenándolo con 3 mol/L de HCl para análisis mediante
ayuda de la bomba peristáltica, y manteniéndolo así por un periodo no inferior a seis
semanas hasta el momento de la toma de muestra. Para retener el ácido en el interior del
tubo se unieron los dos extremos con un pequeño trozo de tubo C-Flex. El tubo lleno de
ácido se guardó en una doble bolsa opaca, para preservarlo de posibles fuentes de
contaminación, hasta el momento de la toma de muestra.

Para realizar la limpieza de los tubos C-Flex, éstos se dividieron en porciones de 30 cm

de longitud que se mantuvieron dentro de un baño de 3 mol/L de HCl para análisis durante
una semana. Después de este tiempo se enjuagaron con agua desionizada (Milli-Q) dentro

247
Capítulo 4

de una campana de flujo laminar. Una vez enjuagados se guardaron en bolsas con cierre
hermético, que a su vez se almacenaron en una bolsa opaca. Estos tubos se conservaron
de este modo hasta la realización de la toma de muestra.

Cartuchos de filtración
La limpieza de los cartuchos de filtración utilizados ((Whatman groundwater filter
capsule, 0,45 µm 29705-92, Cole-Parmer Instrument Co. Illinois U.S.A.) se realizó en
diversas etapas: en primer lugar, con ayuda de la bomba, se llenaron los cartuchos con
metanol dejándose llenos durante 24 horas; para mantener los extremos unidos se empleó
un pequeño trozo de tubo flexible de C-Flex. Pasado el tiempo requerido, se vació el
metanol de los cartuchos y se lavaron con agua desionizada (Milli-Q) para retirar cualquier
resto, dejándose llenos de agua durante 24 horas. Posteriormente, se les retiró el agua
desionizada (Milli-Q) y se llenaron con HCl para análisis de concentración 0,5 mol/L,
manteniéndose así durante una semana. Luego, se vaciaron de HCl y se lavaron con agua
desionizada (Milli-Q) hasta retirar todo el resto de ácido. Es importante eliminar
completamente el ácido clorhídrico del interior de los cartuchos, pues en el siguiente paso
se utilizará ácido nítrico y la mezcla de ambos ácidos puede producir una degradación del
filtro. Tras dejar los cartuchos llenos de agua desionizada (Milli-Q) durante 24 horas, se
llenaron con disolución de ácido nítrico 0,5 mol/L, manteniéndose de esta manera dentro
de bolsas con cierre hermético, que a su vez se guardaron en el interior de una doble bolsa
opaca hasta su utilización. Los ácidos utilizados en esta limpieza pudieron ser reutilizados
unas 5 veces sin que se perjudicara la calidad de limpieza del material.

Filtros de nylon
Los filtros de nylon de 0,45 m fueron utilizados para obtener la materia suspendida de
las muestras de agua. Los filtros se trataron en primer lugar con agua desionizada (Milli-Q)
y luego se sumergieron en disolución de HNO3 para análisis de concentración 2 mol/L
durante una semana. Tras este periodo, se enjuagaron de nuevo con agua desionizada y se
secaron en estufa, a 105ºC hasta alcanzar un peso constante. Una vez secos, se guardaron
en botes de poliestireno de 30 mL.

Botes de polietileno de baja densidad

Estos botes de polietileno de baja densidad (código 203010, Eurotubo, Deltalab,
Barcelona) se utilizaron para recoger y almacenar las muestras de agua hasta su análisis. El
proceso de limpieza requirió la presencia de dos personas que siguieron el protocolo manos
limpias-manos sucias. En primer lugar, los botes se enjuagaron con agua desionizada (Milli-
Q) 5 veces y se llenaron con disolución de HCl para análisis de concentración 3 mol/L,
tapándose con su tapón y evitando que se creen burbujas en su interior. Así, se
sumergieron en una disolución de HCl para análisis 0,1 mol/L en el interior de un bidón en
el que se habían colocado previamente varias bolsas opacas que recubrían la pared del
248
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

recipiente para evitar la posible contaminación de los botes por contacto. Se cerraron las
bolsas y se precintó el bidón para evitar la salida de vapores ácidos. Los botes deben
permanecer en el interior del baño ácido al menos seis semanas. Pasado este tiempo, se
enjuagaron 5 veces con agua desionizada (Milli-Q) en el interior de una campana de flujo
laminar. Una vez enjuagados, se introdujeron en dobles bolsas de plástico con cierre
hermético. Los ácidos utilizados durante este proceso pudieron ser reutilizados 5 veces sin
que afectara a posteriores limpiezas.

4.5. Equipos y metodología

4.5.1. Equipos utilizados

Las medidas por Voltamperometría de Redisolución Catódica Adsortiva de Impulso
Diferencial (DPAdCSV) fueron realizadas con el equipo 757 VA Computrace Stand
(Metrohm, Suiza), controlado mediante el software VA Computrace 2.0 instalado en un
ordenador personal, con la interfase 5326 VA Computrace Interfase (Metrohm, Suiza).

Las medidas por Espectrometría de Masas con fuente de Plasma de Acoplamiento

Inductivo (ICP-MS) fueron llevadas a cabo utilizando el Espectrómetro de Masas X7 Series
(ICP-MS) (Thermo Elemental, Reino Unido).

Las medidas de Absorción Atómica por Generación de Hidruros (HGAAS) se realizaron

con el equipo de AAS Solaar M-Series Thermo Elemental acoplado al accesorio HG Unicam
VP90 (Thermo Elemental, Reino Unido).

La materia orgánica de las muestras de agua fue digerida mediante radiación UV con el
equipo de digestión 705 UV Digester (Metrohm, Suiza) de lámpara a alta presión de
mercurio (220V, 50Hz), empleando para ello cubetas de cuarzo.

El carbono orgánico disuelto (COD) en las muestras de agua fue evaluado usando un
equipo analizador de carbono, modelo 3100 (Analytik Jena, Alemania).

La digestión ácida de las muestras biológicas fue realizada mediante un microondas

Ethos 1600 Microwave Heating (Milestone, Italia).

Para la evaluación del contenido de materia orgánica en la materia suspendida se

empleó un horno mufla N 20/Hr (Nabertherm®, Alemania).

La agitación de las muestras durante el proceso de lixiviación se efectuó con un

agitador Promax 2020 Shaker (reciprocal motion) (Heidolph, Alemania) y los extractantes
fueron centrifugados en una centrifuga 4K10 Centrifuge (Sigma, Alemania).

249
Capítulo 4

Las muestras de tejidos de peces se liofilizaron mediante un equipo FreeZone® Triad

7400030 (Cole-Parmer, Illinois U.S.A).

Las medidas in situ de temperatura, salinidad, pH y oxígeno disuelto del agua se

realizaron con sonda multiparamétrica portátil Sension 156 (Hach Co., Estados Unidos).

Las medidas de pH realizadas en el laboratorio se realizaron en pH-metro MicropH

2001 equipado con un electrodo combinado de vidrio Ag/AgCl modelo 52-02 y
compensador de temperatura (Crison, España).

4.5.2. Metodología
El estudio de la contaminación metálica en la Bahía de Algeciras se realizó en dos
etapas: en la primera de ellas (Abril de 2007) se tomaron sedimentos de 17 puntos a lo
largo de toda la bahía y se analizó el contenido total metálico.

Una vez analizados esos 17 puntos, se identificaron aquéllos más representativos o

contaminados de la bahía, y se eligieron 5 para el estudio del contenido total y la
especiación en las aguas, peces y sedimentos a lo largo de 4 campañas de muestreo
consecutivas, que se detallarán en la siguiente sección.

A continuación se detalla la metodología utilizada para el análisis de los parámetros

generales, así como la concentración metálica y su especiación en las muestras de agua,
sedimentos y peces.

4.5.2.1. Análisis de parámetros generales

Los parámetros físico-químicos tales como pH, temperatura, salinidad, conductividad,
sólidos disueltos totales y oxígeno disuelto se midieron in situ mediante una sonda
multiparamétrica portátil, calibrada previamente en el laboratorio.

Además se evaluaron los siguientes parámetros en el laboratorio:

 Materia suspendida en el agua

Para calcular la cantidad de materia suspendida que contenían las muestras de agua,
se tomó un volumen conocido de agua y se filtró a vacío utilizando filtros de nylon de 0,45
m de tamaño previamente tarados. Los filtros se secaron en estufa a 105ºC hasta peso
constante. El contenido de materia suspendida se obtuvo por diferencia de peso seco del
filtro antes y después de filtrar el agua.

250
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

 Materia orgánica en la materia suspendida

El porcentaje de materia orgánica en la materia suspendida se calculó utilizando los

mismos filtros que se habían utilizado previamente para hallar la cantidad de materia
suspendida. De esta manera, una vez que la materia suspendida quedó retenida en los
filtros y éstos se secaron en la estufa, fueron posteriormente calcinados en un horno de
mufla Logotherm (Dinamarca) a 550ºC durante 3 horas. A partir de la pérdida de peso por
calcinación, se calculó la cantidad de materia orgánica contenida en la materia suspendida.

 Carbono orgánico disuelto (COD)

El carbono orgánico disuelto se midió sobre las muestras de agua filtradas y

acidificadas con HCl (calidad Suprapur, Merck (Alemania)). Para ello se empleó el equipo
analizador de carbono, modelo 3100 (Analytik Jena, Alemania) y se utilizó el procedimiento
previamente detallado en el apartado 3.5.2.1 del capítulo 3 de esta tesis.

 Materia orgánica en los sedimentos

El análisis de la materia orgánica se realizó sobre la fracción inferior a 2 mm

(eliminando los gruesos) como porcentaje de sólidos volátiles (SV) y fue determinada como
pérdida de peso por combustión en horno mufla a 550 ºC durante 30 min.

4.5.2.2. Especiación de As en aguas

La especiación de As en agua se realizó a partir del esquema que se presenta en la
Figura 4.6, el cual distingue entre la fracción de As total, As inorgánico y As orgánico, tanto
en la fase disuelta como en la particulada. La fracción de As orgánico es la que presenta
una menor toxicidad.

Para realizar la especiación de As en las aguas, las muestras fueron tratadas con dos
tipos de digestiones diferentes mediante microondas, una digestión con un ácido fuerte, en
la que se obtienen las especies de arsénico inorgánico (digestión A), y una segunda
digestión con una combinación de un ácido fuerte y un ácido oxidante, que provoca la
digestión de la materia orgánica e inorgánica, obteniéndose todo el arsénico de la muestra
(digestión B) [Niedzielski y col., 1999].

Digestión A: Arsénico Total Inorgánico

La noche anterior a ser medida, se sacó la muestra de agua acidificada con HCl
Suprapur y se dejó descongelar en el frigorífico. Al día siguiente, se le añadió una cantidad
suficiente de HCl para que la concentración final en la muestra de este ácido llegara a ser

251
Capítulo 4

1% en volumen. Así, las muestras se digirieron mediante microondas a 530 W durante 5

minutos, y fueron analizadas.

Digestión B: Arsénico Total

A las muestras de agua acidificadas con HCl, se les añadió HCl y HNO3 de forma que la
concentración final de ambos en las muestras fuera 1% v/v. Estas muestras se digirieron
mediante microondas a 530 W durante 5 min y se analizaron obteniendo la concentración
de As total.

Las digestiones A y B fueron aplicadas tanto a las muestras de agua filtrada como a las
no filtradas, obteniéndose por diferencia el valor de As inorgánico y orgánico en la materia
en suspensión. Las digestiones se realizaron tomando dos réplicas de 45 mL de agua
acidificada, que fueron digeridas y enrasadas a 50 mL. Posteriormente, los análisis de estas
muestras se realizaron empleando la técnica de análisis de espectroscopía de absorción
atómica con generación de hidruros (HGAAS).

Agua de mar

Filtrar 0,45 m

Metal Disuelto Fracción soluble

y Particulado

HCl/HNO3 HCl HCl/HNO3 HCl

Microondas Microondas Microondas Microondas
(digestión B) (digestión A) (digestión B) (digestión A)

As Total As Total As As Disuelto

Inorgánico Disuelto Inorgánico

As Total Orgánico = As Disuelto Orgánico =

As Total – As Total Inorg As Disuelto – As Disuelto Inorg

Figura 4.6. Esquema de fraccionamiento aplicado al análisis de As en las muestras de

agua

252
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

4.5.2.3. Especiación de Ni y Co en aguas

El esquema de fraccionamiento en muestras acuosas basado en cambios de pH ha sido
muy utilizado en las últimas décadas debido a su simplicidad y aplicabilidad [Duinker y
Kramer, 1977; Hasle y Abdullah, 1981; Fischer y col. 1984; Batley, 1987; Vicente-Martorell
y col., 2009].

El esquema de especiación (Figura 4.7) aplicado al análisis de Ni y Co en aguas separa

las especies en distintas fracciones: el metal total se fracciona en metal disuelto y metal
particulado, y a su vez el metal disuelto se separa en metal disuelto lábil y metal disuelto
poco/no lábil. Siguiendo este diagrama de especiación, las muestras se sometieron a los
siguientes pretratamientos y posteriores análisis.

Agua de mar a pH 2 Agua de mar a pH 2 Agua de mar a pH natural

No Filtrada Filtrada Filtrada

Digestión ácida Digestión ácida

HClO4/HNO3 HClO4/HNO3
(120ºC, 8h) (120ºC, 8h)

DPAdCSV
con DMG
DPAdCSV DPAdCSV
con DMG con DMG

Metal Total Metal Metal Disuelto

Disuelto Lábil

Metal Particulado = Metal disuelto poco/no Lábil =

Metal Total – Metal Disuelto Metal Dis – Metal Dis Lábil

Figura 4.7. Esquema de fraccionamiento aplicado a Ni y Co en las muestras de agua

Metal Total
La noche anterior a ser medida, se sacó la muestra no filtrada y acidificada con HNO3
del congelador y se descongeló en el interior del frigorífico. Posteriormente, se dejó

253
Capítulo 4

atemperar la muestra a la temperatura del laboratorio y se realizó un ataque ácido de 45

mL de muestra en reactores de teflón, empleando para ello el siguiente procedimiento:

 Se depositaron 45 mL de muestra en un reactor de teflón (PTFE) de 150 mL de

capacidad (BRAND, 1305 38, Weirtheim, Germany).

 Se añadieron 0,2 mL de HNO3 (Merck, calidad Suprapur) y 0,125 mL de HClO4 (Merck,

calidad Suprapur).

 Se calentó a 120ºC en la estufa durante 8 horas.

 Se enfrió a temperatura ambiente.

 Se arrastró la muestra con Milli-Q y se enrasó a 50 mL.

 Las muestras se conservaron en recipientes de poliestireno a 4ºC hasta su análisis.

La muestra se midió por voltamperometría de redisolución catódica adsortiva de pulso

diferencial (DPAdCSV) con electrodo de gota colgante de mercurio (HMDE), a pH 9,5 y
utilizando el método descrito por Metrohm [Application Bulletin, nº 231/2e]. Para ello se
tomaron 5 mL de la muestra digerida, se enrasaron a 10 mL con agua Milli-Q, se añadieron
0,5 mL de tampón NH4Cl/NH3 ([NH4Cl] = 2 mol/L y [NH3] = 6 mol/L) para ajustar el pH a
9,5 y se adicionaron 0,1 mL del reactivo dimetilglioxima (DMG) 0,05 mol/L disuelto en
etanol.

Metal Disuelto
Se procedió igual que con la muestra anterior en el procedimiento de descongelación y
de ataque ácido pero utilizando la muestra filtrada y acidificada con HNO3 Suprapur. La
muestra se midió por DPAdCSV, tal y como se ha descrito para la fracción de Metal Total.

Metal Particulado
Se obtuvo por diferencia entre la cantidad de Metal Total y Metal Disuelto.

Metal Disuelto Lábil

La noche anterior a ser medida, se sacó la muestra filtrada conservada a pH natural
del congelador y se descongeló en el interior del frigorífico. La muestra se midió por
DPAdCSV, al igual que la fracción de Metal Total, lo antes posible para evitar los equilibrios
de adsorción-desorción y precipitación-disolución de los metales.

Metal Disuelto Poco o No Lábil

Se obtuvo por diferencia entre la cantidad de Metal Disuelto y Metal Disuelto Lábil.

254
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Las condiciones electroquímicas de medida por DPAdCSV para Ni y Co se registran en la

Tabla 4.1

Tabla 4.1. Parámetros instrumentales característicos utilizados en la técnica DPAdCSV

para el análisis de Ni y Co
Parámetros electroquímicos Ni y Co
Potencial de deposición: Ed -700 mV
Tiempo de deposición: td 300 s
Amplitud de impulso: Uampl 50 mV
Tiempo de impulso: tpulse 0,04 s

Salto de potencial: Ustep 4 mV

Intervalo de tiempo para el
0,30 s
salto de potencial: tstep
Velocidad de barrido 13,3 mV/s

Potencial inicial de barrido -800 mV

Potencial final de barrido -1300 mV

4.5.2.4. Especiación de Cr en aguas

El esquema de especiación (Figura 4.8) aplicado al análisis de Cr en las aguas separa
las especies en distintas fracciones: el cromo total se fracciona en cromo disuelto y cromo
particulado; además se cuantifican el cromo disuelto activo (contribución de Cr(VI) disuelto
y Cr(III) disuelto activo), Cr(VI) disuelto, Cr(III) disuelto activo y Cr(III) disuelto no activo.
Este esquema de fraccionamiento ha sido ampliamente utilizado en la especiación de Cr en
aguas naturales [Boussemart y col., 1992; Li y Xue, 2001; Bobrowski y col., 2004; Jorge y
col., 2010]. Se basa en el análisis por voltamperometría de redisolución catódica adsortiva
de un complejo formado entre el Cr(III) y el ácido dietilentriaminopentacético (DTPA), con
la acción catalítica del nitrato.

En previos estudios se ha demostrado que la especie predominante de Cr(VI) en

disolución acuosa para valores de pH mayor que 6 es CrO42-, la cual es una especie
totalmente electroactiva por lo que puede ser analizada por voltamperometría alcanzando
porcentajes de recuperación de 100±3% [Li y Xue, 2001]. Sin embargo, la recuperación de
Cr(III) no siempre es cuantitativa, indicando que sólo un porcentaje de Cr(III) es
electroactivo. Según Bobrowski y colaboradores, las especies de Cr(III) activas incluyen el

255
Capítulo 4

Cr(III) libre y los complejos inorgánicos, mientras que el Cr(III) no activo está formado por
complejos orgánicos de cromo [Bobrowski y col., 2004]. Estas propiedades de cada una de
las especies de cromo resultan muy útiles para el estudio de especiación de este metal.

Por otra parte, se ha demostrado que la señal analítica producida al aplicar la técnica
voltamperométrica se debe a la reducción del complejo Cr(III)-DTPA adsorbido en el
electrodo de trabajo a Cr(II)-DTPA. En el caso de Cr(VI), la formación, adsorción y
reducción del complejo Cr(III)-DTPA requiere una etapa previa de reducción de Cr(VI) a
Cr(III), que se obtiene aplicando potenciales más negativos que -0,05 V. Esta reducción de
Cr(VI) a Cr(III) es irreversible, de forma que el Cr(VI) presente en la muestra, formará
inmediatamente después de su reducción un complejo con DTPA [Sander y col., 2003]. Por
tanto, la suma de las concentraciones de Cr(III) activo y Cr(VI) puede ser determinada por
voltamperometría de redisolución catódica adsortiva mediante la adición del ligando DTPA y
aplicando un potencial previo más negativo que -0,05 V (usualmente se utiliza un potencial
inicial de deposición de – 1 V, garantizando así que todo el Cr(VI) se haya reducido a
Cr(III) [Sander y col., 2002]). A esta suma de Cr(III) activo y Cr(VI) se conoce como
Cromo Activo. Asimismo, todas las fracciones de cromo se analizaron utilizando un
potencial de deposición de -1 V para que el Cr(VI) presente en las muestras diera una
señal electroactiva en el equipo y pudiera ser determinado.

Además, en estos estudios se comprobó que la estequiometría del complejo de Cr(III)

con DTPA en exceso utilizando el método espectrofotométrico de variaciones continuas, era
1:1 cuando la medida de absorbancia se realizaba inmediatamente después de la adición
del ligando. Sin embargo, cuando se dejaba pasar cierto tiempo (entre 15 y 30 minutos), y
en presencia de exceso de ligando, se formaba un segundo complejo con estequiometría
1:2 (metal:ligando). En este complejo el Cr(III) tiene sus 6 sitios de coordinación ocupados
por las dos moléculas de DTPA. De esta manera, el ión Cr(III) se encuentra protegido
estéricamente llegando a ser electroquímicamente inactivo [Sander, 2003]. Esta propiedad
del complejo Cr(III)-DTPA se usa para analizar la concentración de Cr(VI) en la muestra.

Según lo mencionado anteriormente, se pueden diferenciar las especies de cromo que

se detallan en la Figura 4.8.

256
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Agua de mar a pH 2 Agua de mar a pH natural

No Filtrada Filtrada

Digestión ácida DPAdCSV DPAdCSV

HClO4/HNO3 Tiempo tras adición Tiempo tras adición Digestión UV
(120ºC, 8h) de DTPA: 0 min de DTPA: 30 min H2O2 30%, 2h

DPAdCSV
Cr (VI) DPAdCSV
Tiempo tras adición Cr Disuelto Activo
Disuelto Tiempo tras adición
de DTPA: 0 min
de DTPA: 0 min

Cr Total
Cr(III) Disuelto Activo = Cr Disuelto
Cr Disuelto Activo – Cr(VI) Disuelto
Cr Particulado =
Cr Total – Cr Disuelto

Cr(III) Disuelto No Activo =

Cr Disuelto – Cr Disuelto Activo

Figura 4.8. Esquema de fraccionamiento aplicado al Cr en las muestras de agua

Siguiendo este diagrama de especiación, las muestras se sometieron a los siguientes

pretratamientos y posteriores análisis:

Cromo Total
La noche anterior a ser medida, se sacó del congelador la muestra no filtrada y
acidificada con HNO3 Suprapur y se descongeló en el interior del frigorífico. Posteriormente,
se atemperó la muestra a la temperatura del laboratorio y se realizó un ataque ácido de 45
mL de muestra en reactores de teflón, empleando para ello el mismo procedimiento que se
describió para el caso de Ni y Co.

La muestra se midió por DPAdCSV a pH 6,2 utilizando el método descrito por Metrohm
[VA Application Note nº V-82; Application Bulletin, nº 116/3e]. Para ello se tomaron 5 mL
de la muestra digerida, se enrasaron a 10 mL con agua Milli-Q y se añadieron 2,5 mL de
electrolito soporte+reactivo (preparado en 100 mL utilizando acetato de sodio de
concentración 0,2 mol/L, 0,05 mol/L de DTPA y 2,5 mol/L de nitrato de sodio), con un pH
final de 6,2. El tiempo de espera entre la adición del electrolito y la medida debió ser
257
Capítulo 4

mínimo para que el complejo Cr(III)-DTPA no se inactivara. Cuando la muestra se colocó

en el equipo, se aplicó un potencial de deposición de -1 V para que todo el Cr(VI) se
redujera a Cr(III) y formara complejo con la DTPA. De esta manera, tanto el Cr(III) como
el Cr(VI) fueron analizados, obteniéndose la fracción de cromo total.

Cromo Disuelto
La noche anterior a ser medida, se sacó la muestra filtrada conservada a pH natural
del congelador y se descongeló en el interior del frigorífico. Posteriormente, se atemperó la
muestra a la temperatura del laboratorio y se realizó una digestión oxidante con radiación
UV y H2O2. Para ello se tomaron 10 mL de muestra en tubos de cuarzo, se añadieron 50 L
de H2O2 y se digirieron durante 2 horas, en un equipo 705 UV Digester. Posteriormente, la
muestra se midió por DPAdCSV, tal y como se ha descrito para la determinación de Cromo
Total. Con este procedimiento de radiación UV y H2O2 se descompone la materia orgánica,
y procediendo de la misma manera que con la fracción de cromo total pero con la muestra
filtrada, se obtuvo el cromo disuelto, que incluye las especies de Cr(VI), Cr(III) activo y
Cr(III) no activo.

Cromo Disuelto Activo

La noche anterior a ser medida, se sacó la muestra filtrada conservada a pH natural
del congelador y se descongeló en el interior del frigorífico. Tras ser atemperada, se midió
por DPAdCSV, de la misma manera descrita para la determinación de Cromo Total, es decir
con adición de electrolito soporte conteniendo DTPA y medida inmediata. En este caso,
también se aplicó un potencial de deposición de -1 V para reducir todo el Cr(VI) a Cr(III) y
obtener así la fracción de cromo disuelto activo, que se corresponde con la suma de Cr(VI)
y Cr(III) activo.

Cromo(VI) Disuelto
La noche anterior a ser medida, se sacó la muestra filtrada conservada a pH natural
del congelador y se descongeló en el interior del frigorífico. Tras ser atemperada, se midió
por DPAdCSV, tal y como se ha descrito para la determinación de Cromo Total, pero en
este caso se debió de esperar un mínimo de 30 minutos entre la adición del
electrolito+reactivo y la medida, con el fin de que el complejo Cr(III)-DTPA quedara
inactivo. De esta manera se consiguió enmascarar el Cr(III) en la muestra. Tras la espera
de 30 minutos, se aplicó a la muestra un potencial de reducción de -1 V para que el Cr(VI)
se redujera a Cr(III) y se complejara con la DTPA, produciéndose el complejo Cr(III)-DTPA
activo que se midió en ese momento. De esta forma sólo se analizó la fracción de Cr(VI)
disuelto.

Cromo Particulado
Se obtiene por diferencia entre la cantidad de Cromo Total y Cromo Disuelto.
258
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Cromo(III) Disuelto Activo (Cr(III) libre y complejos inorgánicos)

Se obtuvo por diferencia entre la cantidad de Cromo Disuelto Activo y Cr(VI) Disuelto.

Cromo(III) Disuelto No Activo (complejos orgánicos de Cr(III)

Se obtuvo por diferencia entre la cantidad de Cromo Disuelto y Cromo Disuelto Activo.

Las condiciones electroquímicas de medida por DPAdCSV para Cr se registran en la Tabla

4.2

Tabla 4.2. Parámetros instrumentales característicos utilizados en la técnica DPAdCSV

para el análisis de Cr
Parámetros electroquímicos Cr
Potencial de reducción de
Cr(VI) a Cr(III) y de -1000 mV
deposición del complejo: Ed
Tiempo de deposición: td 20 s
Amplitud de impulso: Uampl 50 mV
Tiempo de impulso: tpulse 0,04 s

Salto de potencial: Ustep 6 mV

Intervalo de tiempo para el
0,10 s
salto de potencial: tstep
Velocidad de barrido 59,5 mV/s

Potencial inicial de barrido -1000 mV

Potencial final de barrido -1400 mV

4.5.2.5. Análisis del contenido total de metales en sedimentos

Los análisis de metales totales y su especiación en los sedimentos se realizaron sobre
la fracción fina de éstos. Para ello se realizó el pretratamiento de las muestras que se
detalla a continuación:

- La muestra se sacó del congelador, se disgregó y se dejó en el frigorífico hasta su

descongelación.

- El sedimento se colocó en vidrios de reloj y se secó en estufa a 40ºC hasta llegar a

sequedad total.

259
Capítulo 4

- Una vez seco, se hizo un tamizado previo del sedimento a través de un tamiz de acero
inoxidable de 2 mm de paso de luz de malla para eliminar los gruesos.

- Se tomaron pequeñas fracciones de la fracción obtenida y se molturaron en un mortero

de ágata hasta conseguir un polvo muy fino.

- Se tamizó el sedimento molturado a través de un tamiz de nylon de 63 m de paso de luz

de malla para separar la fracción más fina, la cual se almacenó en botes de polietileno de
50 mL de capacidad hasta su tratamiento y análisis.

Para evaluar el contenido metálico total de los sedimentos se aplicó un procedimiento

de digestión ácida mediante uso de radiación infrarroja. Las etapas a seguir fueron las
siguientes:

- Se pesaron con exactitud alrededor de 0,200 g de sedimento (fracción fina) en una placa
de teflón.

- Se añadieron 5 mL de HF al 48 % para digerir el sedimento y se dejó evaporar hasta

sequedad con radiación infrarroja. Este proceso se repitió una vez más.

- Después, se añadieron 5 mL de ácido nítrico al 65 % y se dejó que se evaporara hasta

sequedad (2 veces).

- El residuo seco digerido se extrajo con 20 mL de ácido clorhídrico 3,86 mol/L mediante
agitación magnética y calefacción a 85±5 ºC durante 1 hora.

- Se dejó enfriar la disolución obtenida hasta temperatura ambiente y se filtró con papel de
filtro Albet 1238.

- Se enrasó la disolución filtrada y las aguas de lavado hasta 50 mL.

- Se almacenó en recipientes de polietileno a 4 ºC hasta su análisis.

El análisis de metales en las muestras de sedimento se llevó a cabo por Espectrometría

de Masas con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-MS).

4.5.2.6. Especiación de metales en sedimentos

Los metales en el suelo pueden encontrarse bajo distintas formas: como ión libre, en
forma complejada en la disolución del suelo, adsorbidos o en forma intercambiable en la
fracción coloidal del suelo (arcilla, compuestos húmicos, hidróxidos de hierro, manganeso y
aluminio), o formando parte de minerales secundarios, primarios y complejos insolubles en
la fase sólida del suelo.

Inicialmente, se hizo un estudio de 17 puntos de muestreo en la Bahía de Algeciras, en

donde se evaluó el contenido de metal más fácilmente disponible del sedimento mediante
260
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

una extracción simple. Esta extracción se realizó por duplicado haciendo uso de dos
extractantes diferentes. Así, uno de ellos fue el ácido acético 0,11 mol/L, comúnmente
utilizado en el primer paso de la extracción secuencial BCR, que se explicará a
continuación, y el otro fue el agente complejante DTPA (ácido dietilentriaminopentacético)
0,005 mol/L junto con CaCl2 0,01 mol/L y el buffer TEA (trietanolamina) 0,1 mol/L a pH 7,3
[Lindsay and Norvel, 1978]. El DTPA se utilizó para lixiviar las formas móviles (complejas,
adsorbidas y carbonatadas) de los metales.

El procedimiento de extracción con DTPA fue el siguiente:

- Se pesaron 3 g de fracción fina del sedimento seco en un tubo de centrífuga.

- Se añadieron 15 mL del extractante (DTPA 0,005 mol/L, CaCl2 0,01 mol/L y TEA 0,1 mol/L
a pH 7,3) y se agitó mecánicamente durante 2 horas a 120 traslaciones por minuto.

- El sobrenadante se filtró por gravedad a través de papel de filtro de tamaño de poro 20-
25 m (Filter-Lab 1238, Filtros Anoia, Barcelona) y se acidificó con HNO3 suprapur para
preservar los metales en disolución.

- La fase líquida se conservó a 4 ºC hasta su análisis por ICP-MS.

Para el análisis de especiación de los sedimentos de los 5 puntos elegidos, se aplicó el

procedimiento de extracción secuencial para metales traza propuesto por el BCR (Programa
de Medición y Ensayo de la Comisión Europea) [Davidson y col., 1999]. Está basado en la
extracción con ácido acético (paso 1), cloruro de hidroxilamonio (paso 2) y ataque con
peróxido de hidrógeno y extracción con acetato amónico (paso 3). Por último, el residuo
obtenido fue tratado mediante digestión ácida.

El ácido acético libera los metales asociados con carbonato cálcico, caolinita, feldespato
potásico y ferrihidrita. El cloruro de hidroxilamonio libera los metales procedentes de
montmorillonita y dióxido de manganeso, así como el níquel del ácido húmico. Los óxidos
de hierro deben esperar a ser atacados por este agente reductor, pero la mayoría de los
metales ya han sido lixiviados por el primer extractante (ácido acético). Esto puede reflejar
la elevada capacidad de adsorción de la ferrihidrita. La tercera extracción con peróxido de
hidrógeno/acetato amónico posee la fuerza necesaria para digerir la materia orgánica y el
material sulfhídrico.

Con la aplicación del método del BCR se obtienen tres fases líquidas, que se
corresponden con la Fase 1 o intercambiable, la Fase 2 o reducible y la Fase 3 u oxidable.

La Fase 1 incluye los metales solubles en aguas y en ácidos débiles, intercambiables o

enlazados a carbonatos, que pueden pasar fácilmente a la columna de agua en
determinadas condiciones, por ejemplo cuando el pH disminuye. Es la fracción que

261
Capítulo 4

contiene los enlaces metal-sedimento más lábiles y, por tanto, la más fácilmente disponible
desde el punto de vista medioambiental.

La Fase 2 contiene los metales que son fácilmente reducibles, normalmente asociados
a los óxidos de hierro y manganeso. Estos metales pueden ser liberados a la columna de
agua si el sedimento cambia de un estado oxigenado a uno anóxico, hecho que podría ser
causado por la actividad de microorganismos presentes en el sedimento.

La Fase 3 incluye aquellos metales asociados a la materia orgánica y sulfhídrica que

son fácilmente oxidables. Estos metales pueden pasar al agua bajo condiciones oxidantes.
Dichas condiciones pueden ocurrir cuando el sedimento es resuspendido (bien mediante
dragados, corrientes, inundaciones o mareas) y las partículas entran en contacto con el
agua bien oxigenada.

La cantidad o concentración de los metales en estas asociaciones o fracciones se

encuentra influida por distintos factores, entre los que destacan la cantidad de iones en el
suelo/sedimento, el tipo y número de lugares de adsorción en la fase sólida, el tipo y la
concentración de los ligandos capaces de formar complejos con los metales presentes en el
suelo/sedimento, el pH, el potencial redox, la temperatura y el régimen de humedad. El
cambio en uno o varios de estos factores producirá una modificación en el equilibrio entre
las distintas fases y, por tanto, una transferencia de metal de unas a otras [González y col.,
2009].

A continuación se describe la metodología empleada en cada una de las fases.

Fase 1: fase intercambiable (metales solubles en agua y ácidos débiles, y enlazados a

carbonatos)
- Se pesó 1 g de fracción fina del sedimento seco en un tubo de centrífuga.

- Se añadieron 40 mL de ácido acético 0,11 mol/L, se tapó y se agitó mecánicamente

durante 16 horas a 150 traslaciones por minuto; no se debía demorar la agitación después
de añadir el ácido.

- Se centrifugó la suspensión durante 30 minutos (a 4000 rpm y 4 ºC de temperatura) y se

separó el extractante del residuo mediante una pipeta.

- La fase líquida se conservó a 4 ºC hasta su análisis.

- El residuo se lavó con 20 mL de agua Milli-Q agitando mecánicamente durante 15 minutos

y centrifugando durante 30 minutos (a 4000 rpm y 4 ºC de temperatura).

- Finalmente, se rechazó el sobrenadante y se conservó el residuo.

262
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Fase 2: fase reducible (metales fácilmente reducibles, asociados a óxidos de Fe y Mn)

- Se añadieron 40 mL de un agente reductor, el cloruro de hidroxilamonio 0,5 mol/L
(estabilizado a pH 1,5 con ácido nítrico y preparado en los días en los que se realiza la
extracción) al residuo de la Fase 1.

- Se tapó el tubo de centrífuga, se rompió el residuo por vibración y se realizó la lixiviación

agitando mecánicamente durante 16 horas a 150 traslaciones por minuto, sin demorar la
agitación tras la adición del cloruro.

- Se centrifugó la suspensión durante 30 minutos (a 4000 rpm y 4 ºC de temperatura) y se

separó el extractante del residuo mediante una pipeta.

- La fase líquida se conservó a 4 ºC hasta su análisis.

- El residuo se lavó con 20 mL de agua Milli-Q agitando mecánicamente durante 15 minutos

y centrifugando durante 30 minutos (a 4000 rpm y 4 ºC de temperatura).

- Finalmente, se rechazó el sobrenadante y se conservó el residuo.

Fase 3: fase oxidable (metales fácilmente oxidables asociados a la materia orgánica y

sulfhídrica)
- Se añadió con cuidado y en pequeñas cantidades 10 mL de peróxido de hidrógeno 8,8
mol/L al residuo de la Fase 2.

- Se rompió el residuo por vibración y se cubrió el tarro, dejándolo a temperatura ambiente

durante 1 hora, con agitación manual ocasional.

- La digestión continuó durante 1 hora más, a 85±2 ºC, con agitación manual ocasional la
primera media hora, usando un baño de agua (Precisterm de 20 L 6000141/6000388). La
siguiente media hora se destapó el bote, y se dejó que el volumen se redujera a menos de
3 mL.

- Se añadieron otros 10 mL de peróxido de hidrógeno 8,8 mol/L, se dejó a temperatura

ambiente durante 1 hora con agitación ocasional, y se evaporó 1 hora a 85 ºC hasta dejar
1 mL. No se llevó a sequedad.

- Posteriormente, se adicionaron 50 mL de acetato amónico 1 mol/L (acidificado a pH 2 con

ácido nítrico) al residuo frío, se tapó y se dejó en agitación durante 16 horas a 150
traslaciones por minuto.

- Se centrifugó la suspensión durante 30 minutos (a 4000 rpm y 4 ºC de temperatura) y se

separó el extractante del residuo mediante una pipeta.

- La fase líquida se conservó a 4 ºC hasta su análisis.

263
Capítulo 4

- El residuo se lavó con 20 mL de agua Milli-Q agitando mecánicamente durante 15 minutos

y centrifugando durante 30 minutos (a 4000 rpm y una temperatura de 4 ºC).

- Se rechazó el sobrenadante y se conservó el residuo.

- El residuo obtenido se secó en una estufa a 40 ºC hasta sequedad total.

Digestión ácida del residuo de la fase III

Para la digestión ácida del residuo, se pesaron con exactitud unos 0,200 g del mismo
procedente de la Fase 3 en una placa de teflón, y se aplicó el mismo procedimiento que se
utilizó en el análisis del contenido metálico total. La única diferencia es que una vez
finalizada la digestión, la disolución se enrasó en un matraz de 25 mL.

Es decir, siguiendo los pasos descritos se obtienen tres fases líquidas y una fase
residual que se corresponden con:

• Fase I: fase intercambiable, metales solubles en agua y en ácidos débiles, y asociados a

carbonatos.
• Fase II: fase reducible (óxidos de hierro y manganeso).
• Fase III: fase oxidable (materia orgánica y sulfhídrica).
• Fase IV o residual: Digestión ácida del residuo III.

Las fases obtenidas siguiendo este esquema de especiación fueron analizadas por
Espectrometría de Masas con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-MS).

4.5.2.7. Análisis del contenido total de metales en muestras biológicas

Las muestras biológicas fueron analizadas después de realizar un pretratamiento de los
tejidos mediante liofilización, para lo que se empleó el equipo “FreeZone® Triad 7400030”.
La liofilización es un proceso importante en la preparación, preservación y almacenamiento
de productos biológicos, farmacéuticos y alimentos. Es un proceso por el cual se elimina el
agua u otro disolvente del material congelado mediante la conversión directa del agua
congelada en vapor sin la formación intermedia de agua líquida (sublimación). Este proceso
se realiza mediante la absorción de calor por la muestra congelada con el fin de vaporizar
el hielo, el uso de una bomba de vacío para mejorar la eliminación del vapor de agua de la
superficie de la muestra, la transferencia del vapor de agua a un colector y la eliminación
de calor por el receptor, a fin de condensar el vapor de agua.

264
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

En la Figura 4.9 se detalla el ciclo de liofilización que se empleó con los tejidos de
peces. El proceso de liofilización constó de tres etapas, una primera etapa de
precongelación (que duró 3 horas hasta alcanzar una temperatura de -55 ºC), una etapa
de desecación primaria (en la cual se eliminó la mayor parte del agua de los tejidos, y que
duró 18 horas hasta alcanzar -40 ºC), y por último la etapa de desecación secundaria en la
que se eliminó el agua intersticial de los tejidos (que duró 22 horas y acabó cuando se
alcanzó la temperatura de 14 ºC).

Además de la liofilización, la metodología de análisis de las muestras biológicas incluyó

posteriormente una etapa de digestión ácida de la muestra para su disolución. Las
digestiones ácidas de las muestras descritas en la bibliografía científica se pueden clasificar
en tres tipos, digestión ácida y calentamiento a presión ambiental [Zhou y col., 1998;
Gladyshev y col., 2001; Mzimela y col. 2003], digestión ácida a alta presión mediante el
empleo de reactores de teflón [Rashed, 2001; Soltan y col. 2005] y digestión ácida asistida
por microondas [Aucoin y col., 1999; Karadede y Ünlü, 2000; Pyle y col., 2005]. Para
realizar estas digestiones se suele emplear HNO3 o una mezcla de HNO3 y HClO4 en
distintas relaciones de volumen. En la digestión asistida por microondas se suele emplear
HNO3 y en ocasiones se combina con el efecto oxidante del H2O2.

Temperatura

Tiempo
Tiempo
Temperatura

rampa
rampa fijo
fijo rampa
rampa fijo
fijo rampa
rampa fijo
fijo

Desecación
Desecación Desecación
Desecación
precongelación
Precongelación primaria secundaria
primaria secundaria

Figura 4.9. Representación esquemática del proceso de liofilización

265
Capítulo 4

En este estudio, para el pretratamiento de las muestras biológicas se optimizaron dos

métodos de digestión ácida específicos para los distintos tipos de tejidos biológicos basados
en el uso de microondas, un método para los tejidos de hígado y otro distinto para los
tejidos de branquias y músculo. Así, se emplearon 4 mL de ácido nítrico y 2 mL de agua
oxigenada para las muestras de hígado, con un mayor contenido en grasas, mientras que
las muestras de músculo y branquia solo precisaron el empleo de 7 mL de ácido nítrico.
Para ello se pesaron porciones comprendidas entre 0,1 y 0,3 g de peso de cada tejido. Para
la digestión ácida asistida por microondas se empleó un programa de tres etapas, una
primera etapa de 4 minutos a 200 vatios de potencia, una segunda etapa de 5 minutos a
400 vatios de potencia y una tercera etapa de 10 minutos a 600 vatios de potencia,
tomándose la temperatura de 200 ºC como temperatura de control durante todo el
proceso. Después de la digestión con microondas las muestras se dejaron enfriar y se
enrasaron hasta 25 mL con agua desionizada (Milli-Q), conservándose en botes de
poliestireno hasta su análisis.

El análisis de las muestras digeridas se realizó mediante la técnica de Espectrometría

de Masas con fuente de Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-MS).

4.5.2.8. Tratamiento estadístico de los datos

Con el objetivo de estudiar las diferencias espaciales y temporales en el contenido
metálico en agua, sedimentos y peces, así como estudiar las diferencias en el contenido
metálico entre las especies estudiadas y tejidos seleccionados se aplicó el análisis de la
varianza a los resultados obtenidos. Así mismo, para estudiar la relación existente entre las
variables estudiadas se aplicaron análisis de correlación. Para el tratamiento estadístico de
los datos este trabajo se ha utilizado el programa Statistica 7.0 (stat Soft. Inc., 2004).

Para la realización de estos análisis estadísticos se verificó la hipótesis de normalidad

de varianzas mediante el test de Shapiro-Wilk o bien el test de Kolmogorov-Smirnov. El
primer estadístico se emplea para distribuciones de datos pequeñas (n<30) mientras que el
segundo se utiliza en aquellas distribuciones con un gran número de datos (n>30). Para
verificar el supuesto de homogeneidad de las varianzas se utilizaron el test de Levene y el
test de Brown & Forsythe. En los casos en los que no se obtuvo normalidad se procedió a
realizar una transformación matemática de los datos, con el fin de conseguir datos
normales cuando fuera posible.

En función del tipo de distribución de los datos, paramétrica o no paramétrica, se han

empleado los estadísticos paramétricos del análisis de la varianza de una vía (ANOVA) y el
análisis de correlación de Pearson o los estadísticos no paramétricos de Kruskal-Wallis
(ANOVA), análisis de comparación múltiple y análisis de correlación de Spearman. El grado
de significación adoptado para evaluar estos análisis fue de p<0,05.
266
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

4.6. Análisis de blancos, límite de detección y validación de las técnicas

empleadas

Antes de iniciar el estudio de la concentración metálica en aguas, sedimentos y peces,

se llevó a cabo la validación de las técnicas empleadas en cada una de las metodologías,
así como el estudio de los blancos y el cálculo del límite de detección para cada uno de los
metales.

4.6.1. Ni, Co y Cr en aguas por DPAdCSV

Con el fin de evaluar la posible contaminación producida durante el pretratamiento y el
análisis de las muestras, se procedió al estudio de los blancos correspondientes a cada uno
de los protocolos realizados en el análisis de muestras de aguas. Para evaluar los blancos
correspondientes a cada fase del esquema de especiación se aplicó el mismo tratamiento
pero la muestra fue agua desionizada (Milli-Q). Las condiciones electroquímicas de medida
se registran en las Tablas 4.1 y 4.2. Los resultados para Ni y Co se detallan en la Tabla 4.3,
y en la Tabla 4.4, para Cr.

Además, se evaluó el límite de detección y cuantificación de la técnica de análisis de

estos metales por DPAdCSV, mediante la siguiente expresión:

3  sb
Límite de detección =
m

10  s b
Límite de cuantificación =
m

donde m es la pendiente de la recta de calibración y sb es la desviación estándar de la

señal analítica del blanco. Los límites de detección y cuantificación para el Ni, Co y Cr se
muestran en la Tabla 4.5.

Tabla 4.3. Blancos de Ni y Co para cada fase de la especiación en agua (g/L) (td=300 s;
n=3)
Fase de la especiación Ni Co
Total 0,25 ± 0,01 0,008 ± 0,001
Disuelto 0,35 ± 0,01 0,02 ± 0,01

Disuelto Lábil 0,014 ± 0,001 n.d.

267
Capítulo 4

Tabla 4.4. Blancos de Cr para cada fase de la especiación en agua (g/L)) (td=20 s; n=3)
Fase de la especiación Cr
Total 1,13 ± 0,01
Disuelto 0,53 ± 0,02
Disuelto Activo 0,55 ± 0,01
Cr(VI) Disuelto 0,50 ± 0,02

Tabla 4.5. Límites de detección de Ni, Co y Cr para las medidas de DPAdCSV (g/L) (td
para Ni y Co=300 s; td para Cr=20 s; n=10)
Ni Co Cr

Límite de detección (g/L) 0,007 0,004 0,007

Límite de cuantificación (g/L) 0,024 0,012 0,022

La validación del método se llevó a cabo mediante la medida de los niveles de Ni, Co y
Cr en la muestra de referencia SLEW-3 (agua de estuario, filtrada y acidificada hasta pH
1,6) entre cuyos metales certificados se encuentra el Ni (1,23 ± 0,07 g/L), el Co (0,042 ±
0,010 g/L) y el Cr (0,183 ± 0,019 g/L).

El análisis de la muestra se realizó por triplicado siguiendo el siguiente protocolo:

 Se pusieron unos 10 mL de muestra de referencia en tubos de cuarzo.

 Se añadieron a cada tubo 50 L de H2O2 (Merck, calidad suprapur).

 Las muestras se digirieron mediante irradiación con lámpara de mercurio de 550 W

durante 2 horas, evitando que la muestra superase la temperatura de 78 ºC para que
no hirviera y se produjeran pérdidas de muestra. Luego se dejaron enfriar a
temperatura ambiente y se conservaron en recipientes de poliestireno.

 Mediante pesada se adicionaron en la celda de medida 10 mL de muestra utilizando el

valor de densidad de la muestra para la transformación del peso en volumen.

 Se adicionó la disolución reguladora y la DMG en caso de Ni y Co, y en el caso del Cr

se adicionó el electrolito soporte, midiendo las muestras por DPAdCSV.

Los resultados del análisis de la muestra de referencia se encuentran en la Tabla 4.6.

Puede observarse que se obtuvieron porcentajes de recuperación muy próximos al 100%.

268
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Tabla 4.6. Validación del método de análisis del contenido de Ni, Co y Cr en aguas mediante
el empleo de la muestra de referencia de estuario SLEW-3 (n=3)
Valor observado Valor certificado
Metal Recuperación
(g/L) (g/L)
Ni 1,19 ± 0,02 1,23 ± 0,07 96,9%
Co 0,04 ± 0,01 0,04 ± 0,01 101,5%
Cr 0,17 ± 0,02 0,18 ± 0,02 94,5%

4.6.2. As en aguas por HGAAS

En el caso de As, también se evaluaron los blancos correspondientes a cada uno de los
protocolos realizados en cada fase de la especiación de las muestras de aguas. En todos los
casos los blancos se realizaron por sextuplicado. Para ello se aplicó el siguiente protocolo:

- 500 mL de agua MQ sin filtrar que se acidificaron con 1 mL de HCl (calidad Suprapur,
Merck) antes de proceder a su congelación.

- 500 mL de agua MQ filtrada a la que se le añadieron 1 mL de HCl (calidad Suprapur,

Merck) antes de proceder a su congelación.

Estas muestras fueron digeridas y analizadas tal como se ha descrito anteriormente en

la sección 4.5.2.2. En todos los casos los resultados obtenidos estuvieron por debajo del
límite de detección de la técnica empleada (HGAAS), que fue calculado para 10 muestras
de blanco, obteniéndose un valor de 0,098 g/L. Asimismo, también se calculó el límite de
cuantificación, que resultó ser de 0,327 g/L de As.

Para la validación del análisis de As en aguas por HGAAS, se procedió a realizar

ensayos de recuperación. Las pruebas de recuperación consisten en un diseño
experimental destinado a determinar la relación entre la cantidad de un analito hallada
experimentalmente, mediante un cierto método, y la cantidad real puesta o agregada en
ese experimento, empleando para ello muestras previamente analizadas. Constituye una
aplicación del conocido método de las adiciones estándar o de las adiciones de analito. En
este caso se ha optado por emplear solo dos puntos, correspondientes a la muestra antes y
después de agregado el analito. La interpretación que se hace en este caso es que la
diferencia entre ambas cantidades de analito determinadas debería corresponder
exactamente a la cantidad agregada si el método es exacto.

El As se añadió antes de proceder a la digestión de las muestras. Para ello, se tomaron

porciones de 500 mL de agua de mar filtrada y acidificada con HCl y se adicionaron en
todos los casos 2,5 g/L de metal. En la Tabla 4.7 se han recogido los valores obtenidos

269
Capítulo 4

para cada una de las muestras utilizadas en la validación. Los resultados dieron errores
inferiores al 2 %.

Tabla 4.7. Resultados de los ensayos de recuperación de As en aguas con adiciones de

2,5 µg/ L de As
Valor medido sin Valor medido con Recuperación
Muestra
adición (µg/L) adición (µg/ L) (%)
1 2,36 ± 0,12 4,90 ± 0,38 100,7
2 3,60 ± 0,23 6,01 ± 0,19 98,5
3 5,17 ± 0,46 7,65 ± 0,25 99,7

4.6.3. As, Ni, Co y Cr en sedimentos

Para analizar los blancos, calcular el límite de detección y validar las técnicas en el caso
de los sedimentos, se ha distinguido entre el procedimiento para determinar las cantidades
totales metálicas y el procedimiento para estudiar la especiación.

4.6.3.1. Contenido total de metales en sedimentos

Al igual que en el caso de las muestras de aguas, previa a la validación de la técnica se
estudiaron los blancos y los límites de detección. Se analizó el contenido total de As, Ni, Co
y Cr en 4 blancos utilizando el método de digestión total. La técnica de análisis empleada
fue el ICP-MS. Los contenidos metálicos de los blancos para los 4 metales fueron menores
que los límites de detección, que se detallan en la Tabla 4.8.

Tabla 4.8. Límites de detección (L.D.) de As, Ni, Co y Cr en el análisis de contenido

metálico total en sedimentos y concentración de los blancos (nL.D.=10, nblancos=4)
Concentración media del blanco
Metal L.D. (g/L)
± S.D. (g/L)
As 0,444 <L.D.
Ni 0,379 <L.D.
Co 0,101 <L.D.
Cr 0,712 <L.D.

270
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

La validación del método de digestión total se llevó a cabo mediante la medida de las
concentraciones de As, Ni, Co y Cr en una muestra de referencia certificada de sedimento
de estuario, denominada SRM 1646a. Para ello, se realizó la digestión total de una muestra
de este sedimento por duplicado siguiendo el método descrito en el apartado 4.5.2.5. Los
valores obtenidos se detallan en la Tabla 4.9. Se puede comprobar que se obtuvieron
porcentajes de recuperación muy adecuados que validan los análisis realizados durante
este estudio.

Tabla 4.9. Validación del método de análisis del contenido metálico total en la muestra de
referencia SRM 1646a (n=5)
Valor observado Valor certificado
Metal Recuperación
(mg/kg) (mg/kg)
As 5,20±0,50 6,23±0,21 83,5%
a
Ni 22,71±0,43 23 98,8%
a
Co 4,83±0,10 5 96,6%
Cr 37,05±1,12 40,9±1,9 90,6%
a
Valores informados en la descripción del material de referencia

4.6.3.2. Especiación de metales en sedimentos

Se analizaron los contenidos de As, Ni, Co y Cr en 4 blancos de preparación utilizando
el método de extracción secuencial BCR. La técnica de análisis empleada fue el ICP-MS. Los
contenidos metálicos de los blancos para los 4 metales en cada fase de la especiación, así
como los límites de detección se recogen en la Tabla 4.10. Los valores de blancos y límites
de detección para la fase 1 también fueron de aplicación en la extracción con ácido acético
en los 17 sedimentos iniciales.

Tabla 4.10. Límites de detección (L.D.) y concentración media y desviación estándar de

los blancos de As, Ni, Co y Cr en el análisis de especiación metálica en sedimentos
(nL.D.=10, nblancos=4)
L.D. (g/L)
Metal
Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4
As 0,269 0,002 0,618 2,284
Ni 0,454 1,281 1,242 0,286
Co 0,068 0,001 0,118 0,105
Cr 0,727 1,345 0,297 0,829

271
Capítulo 4

Tabla 4.10 (cont.). Límites de detección (L.D.) y concentración media y desviación

estándar de los blancos de As, Ni, Co y Cr en el análisis de especiación metálica en
sedimentos (nL.D.=10, nblancos=4)
Concentración media del blanco ± S.D. (g/L)
Metal
Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4
As <L.D. <L.D. <L.D. 11,206±4,678
Ni <L.D. 13,608±2,313 9,223±0,780 2,016±0,032
Co 0,069±0,039 0,205±0,188 0,190±0,167 <L.D.
Cr <L.D. 21,845±2,816 7,454±0,550 73,155±11,838

El método de análisis para determinar el contenido metálico de cada fase fue validado
utilizando la muestra de referencia certificada BCR-701, que es una muestra de sedimento
de lago que certifica cada una de las etapas del método de extracción secuencial para la
especiación metálica del BCR, así como las extracciones con ácido acético de los 17
sedimentos iniciales (dado que el procedimiento coincidía con la primera fase del BCR). Los
metales analizados fueron Ni y Cr, que son los que están certificados en la muestra de
referencia, realizando los análisis por duplicado. Los valores obtenidos se detallan en la
Tabla 4.11. De los datos obtenidos puede concluirse que se ha validado el método de
extracción secuencial BCR de manera satisfactoria para ambos metales en las tres fases. La
validación de la fase residual es equiparable a la realizada para el contenido total del
sedimento, puesto que el método empleado es el mismo.

Tablas 4.11. Validación del análisis del contenido metálico de las Fases 1, 2 y 3 del
esquema de extracción BCR de los sedimentos mediante el empleo de la muestra de
referencia certificada BCR-701 (n=4)
Valor observado Valor certificado
Fase Metal Recuperación
(mg/kg) (mg/kg)
Ni 16,13±0,14 15,4±0,9 104,8%
Fase 1
Cr 2,72±0,17 2,26±0,16 120,3%
Ni 24,73±2,44 26,6±1,3 93,0%
Fase 2
Cr 43,72±4,00 45,7±2,0 95,7%
Ni 15,30±2,16 15,3±0,9 99,9%
Fase 3
Cr 131,04±7,82 143±7 91,6%

272
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Respecto a las extracciones realizadas con DTPA, se estudiaron también los blancos y
los límites de detección para cada uno de los metales. Los resultados se encuentran en la
Tabla 4.12.

Tabla 4.12. Límites de detección (L.D.) de As, Ni, Co y Cr en el análisis de contenido

metálico en sedimentos y concentración de los blancos (nL.D.=10, nblancos=4) obtenidos en el
proceso de extracción con DTPA
Concentración media del blanco
Metal L.D. (g/L)
± S.D. (g/L)
As 2,1 <L.D.
Ni 2,4 <L.D.
Co 0,7 <L.D.
Cr 2,5 <L.D.

Para validar el procedimiento de análisis con DTPA no se encontró ninguna muestra de

referencia específica para esta metodología. Así, se procedió a evaluar la validez del
método mediante uso de ensayos de recuperación, con los cuales se obtuvieron se
obtuvieron resultados muy satisfactorios. Los porcentajes de recuperación encontrados
estuvieron comprendidos entre un 85 y un 105%.

4.6.4. As, Ni, Co y Cr en muestras biológicas

Antes de proceder a la validación del método, se realizaron 10 blancos de preparación
correspondientes a cada uno de los métodos empleados, y se evaluó el límite de detección
de la técnica ICP-MS para cada uno de los métodos de digestión ácida asistida por
microondas (Tabla 4.13).

Para realizar la validación del análisis de los niveles metálicos en la muestras biológicas
se analizaron las siguientes muestras de referencia de la National Research Council Canada
/Conseil national de recherches Canada: DORM-2 (dogfish muscle Certificated Reference
Material for Trace Metals) y DOLT-3 (dogfish liver Certificated Referente Material for Trace
Metals). La primera de éstas se empleó para validar el método de digestión de microondas
aplicado para los tejidos de músculo y branquias, mientras que la segunda se empleó para
validar el método de digestión ácida por microondas utilizado para los tejidos de hígado.
Los metales Co y Cr, no están certificados en la muestra DOLT-3 de hígado.

273
Capítulo 4

En las Tablas 4.14 y 4.15 se recogen los resultados obtenidos en el análisis de las
muestras de referencia biológicas. Como puede observarse se obtuvieron resultados muy
adecuados durante la validación, comparables con los valores certificados.

Tabla 4.13. Límites de detección (L.D.) y concentración media y desviación estándar de

los blancos de As, Ni, Co y Cr en el análisis de hígado, branquias y músculo por ICP-MS
(n=10)
L.D. (g/L) Concentración media del blanco (g/L)
Metal
Hígado Branquias y Músculo Hígado Branquias y Músculo
As 0,505 0,472 1,09±0,97 0,49±0,20
Ni 0,243 0,552 <L.D. <L.D.
Co 0,025 0,084 <L.D. <L.D.
Cr 0,139 0,285 0,24±0,15 <L.D.

Tabla 4.14. Validación del análisis del contenido metálico en músculo mediante el empleo
de la muestra de referencia certificada DORM-2 (dogfish muscle) (n=9)
Valor observado Valor certificado
Metal Recuperación
(mg/kg) (mg/kg)
As 18,20±1,37 18,0±1,1 101,0%
Ni 18,67±0,55 19,4±3,1 96,2%
Co 0,18±0,01 0,18±0,03 96,5%
Cr 34,30±0,74 34,7±5,5 98,8%

Tabla 4.15. Validación del análisis del contenido metálico en hígado mediante el empleo
de la muestra de referencia certificada DOLT-3 (dogfish liver) (n=8)
Valor observado Valor certificado
Metal Recuperación
(mg/kg) (mg/kg)
As 9,79±0,48 10,2±0,5 96,0%
Ni 2,75±0,06 2,72±0,35 101,2%
Co 0,27±0,01 - -
a
Cr 4,15±0,20 3,5 -
a
Valores informados en la descripción del material de referencia
274
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

4.7. Estudios previos y selección de los puntos de muestreo

La toma de muestras constituye una de las etapas más importantes en el proceso de

resolución de problemas analíticos. Así, la forma en como se diseña y ejecuta la toma de
muestra determina el grado de adecuación de la interpretación de los resultados finales de
un análisis, respecto de los fines establecidos para la población objetivo.

Los grados de significación y fiabilidad de la información a obtener en un sitio

potencialmente contaminado están estrechamente relacionados con la adecuación del
muestreo a las peculiares características ambientales de cada sitio. Esto es así porque
dependiendo del muestreo, el valor estadístico obtenido para cada contaminante reflejará
con mayor o menor precisión el valor real existente en el sitio. Por tanto, la selección de los
puntos de muestreo es crucial, y de ella depende en gran medida que las decisiones
tomadas sobre una zona potencialmente contaminada sean eficaces para abordar y
solucionar su problemática.

En el caso de los sistemas naturales, esta etapa adquiere aún más importancia, ya que
implica hacerlo bajo ciertos criterios según la información que se desee obtener tanto
desde un punto de vista espacial como temporal. Evidentemente, cuanto mayor sea el
número de estaciones y frecuencia en que se muestrea, mayor será el nivel de probabilidad
que se puede alcanzar en el estudio. Sin embargo, cuanto mayor es el número de muestras
recogidas, paralelamente aumenta también el tiempo y coste del análisis, sin que por ello
se obtenga, en muchos casos, más información significativamente relevante.

Para la realización de este estudio y la consecución de los objetivos planteados se

eligieron en Abril de 2007, 17 puntos de muestreo a lo largo de la costa de la Bahía de
Algeciras (Figura 4.10), que previsiblemente representan situaciones distintas de
contaminación con características naturales y antropológicas diferentes, y corresponden a
la mayor parte del ecosistema. En estos puntos sólo se tomaron muestras de sedimento,
con objeto de conocer desde el punto de vista metálico los lugares con niveles más
significativos, para posteriormente hacer un estudio integrado en solo cinco puntos,
muestreando aguas, sedimentos y peces de forma sistemática.

275
Capítulo 4

Río Guadarranque
Los Barrios
Río San Roque
Palmones
7.1
6.1 La Línea de
6.2 8.1 la Concepción
7.2
5.1
5.2 9.1

4.2 9.2
4.1
10.1
3.1 3.2

Gibraltar
Algeciras

2.1 2.2
Actividades portuarias
Industrias de acero inoxidable
Bahía de Algeciras
Punta Europa Refinería petroquímica
Fábrica de papel
Planta de energía térmica

1.1

Getares Punta del Carnero

Figura 4.10. Situación geográfica de los puntos de muestreo

Las características de cada punto son las siguientes:

 Punto 1.1: se corresponde con una zona de contaminación prácticamente nula prevista
en la playa de Getares, ubicada en una zona muy cercana al Estrecho de Gibraltar, lo
cual propicia que sus aguas estén generalmente limpias. Este punto se tomará como
punto control.

 Puntos 2.1 y 2.2: es una zona de previsible contaminación urbana frente al muelle de
Isla Verde. Se trata de una zona de vertidos de aguas residuales urbanas sin depurar,
procedente de la ciudad de Algeciras y con influencia del tráfico marítimo del puerto de
Algeciras. En 2007, fecha en las que se comenzaron los estudios presentes en este
capítulo, se inició la construcción de una estación depuradoras de aguas residuales en
esta zona, pero no fue hasta 2011 cuando se puso por primera vez en funcionamiento
[Rus Pezzi, 2011]. Por tanto, durante todos los muestreos llevados a cabo en este
trabajo, las aguas residuales urbanas procedentes de la ciudad de Algeciras llegaban
sin depurar a la bahía.

276
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

 Puntos 3.1, 3.2, 4.1 y 4.2: zona cercana también al puerto de Algeciras, con gran
influencia del tráfico marítimo, y afectada también por las aguas residuales de la
ciudad de Algeciras.

 Puntos 5.1, 5.2, 6.1, 6.2: zona cercana al río Palmones, con influencia industrial, dada
su cercanía a la empresa Acerinox (dedicada a la fabricación de aceros inoxidables) y a
la central térmica, fluvial procedente del río Palmones y urbana por las ciudades
próximas de Los Barrios y Algeciras.

 Puntos 7.1 y 7.2: son puntos, con influencia industrial de la refinería petroquímica
Cepsa y la central térmica, urbana y del río Guadarranque.

 Punto 8.1: zona cercana a Puente Mayorga, con influencia portuaria y de la central
térmica.

 Punto 9.1, 9.2 y 10.1: zona influenciada por actividades pesqueras y transporte
marítimo.

El contenido total de As, Ni, Co y Cr en los sedimentos recogidos en estos puntos de

muestreo, así como el porcentaje de materia orgánica encontrado fue analizado y puede
observarse en la Figura 4.11. Los datos se encuentran en la Tabla A.1 del Anexo 2.1.

Tal y como indican las gráficas, el porcentaje de materia orgánica en los sedimentos
varió entre un 7 y un 15% con un valor medio del 10%, destacando el punto 7.2 con la
máxima carga orgánica.

Con respecto al contenido metálico, puede decirse que el cromo es el metal que estaba
en mayor abundancia en los sedimentos, seguido del níquel. Además, pudieron identificarse
las zonas con más concentración para estos metales: puntos 2.1 para As, 6.1 y 6.2 para Ni
y Cr, y 7.1 para Co, localizados alrededor de Isla Verde, Palmones y Guadarranque.

Además del contenido total, se estudió también la concentración de metal más

disponible con la finalidad de evaluar la potencial toxicidad de dichos metales. Para ello se
utilizaron dos extractantes diferentes: ácido acético (primer paso del método de extracción
secuencial BCR) y DTPA+CaCl2+TEA. Los datos se encuentran en el Anexo 2.2, en las
Tablas A.2 y A.3, respectivamente, y pueden observarse en la Figura 4.12.

277
278
Capítulo 4

Co (mg/kg) Ni (mg/kg) As (mg/kg)

0
5
10
15
20
25

0
5
10
15
20
25
0
25
50
75
100
125
150
1.1 1.1 1.1
2.1 2.1 2.1
2.2 2.2 2.2

en los 17 puntos de muestreo

3.1 3.1 3.1
3.2 3.2 3.2
4.1 4.1 4.1
4.2 4.2 4.2
5.1 5.1 5.1
5.2 5.2 5.2
6.1 6.1 6.1
6.2 6.2 6.2
7.1 7.1 7.1
7.2 7.2 7.2
8.1 8.1 8.1
9.1 9.1 9.1
9.2 9.2 9.2
10.1 10.1 10.1

Figura 4.11. Contenido metálico total de As, Ni y Co (mg/kg) en sedimentos muestreados

 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

300
250
200
Cr (mg/kg)

150
100
50
0
1.1
2.1
2.2
3.1
3.2
4.1
4.2
5.1
5.2
6.1
6.2
7.1
7.2
8.1
9.1
9.2
10.1
20
% Materia Orgánica

15

10

0
1.1
2.1
2.2
3.1
3.2
4.1
4.2
5.1
5.2
6.1
6.2
7.1
7.2
8.1
9.1
9.2
10.1
Figura 4.11 (cont.). Contenido metálico total de Cr (mg/kg) y % de materia orgánica en
sedimentos muestreados en los 17 puntos de muestreo

0,14
0,12
0,10
As (mg/kg)

0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
1.1
2.1
2.2
3.1
3.2
4.1
4.2
5.1
5.2
6.1
6.2
7.1
7.2
8.1
9.1
9.2
10.1

Ácido acético DTPA+CaCl2+TEA

Figura 4.12. Contenido metálico más disponible de As (mg/kg) en los 17 puntos de

muestreo obtenido por extracción con ácido acético y DTPA+CaCl2+TEA
279
Capítulo 4

10,0

8,0
Ni (mg/kg)

6,0

4,0

2,0

0,0
1.1
2.1
2.2
3.1
3.2
4.1
4.2
5.1
5.2
6.1
6.2
7.1
7.2
8.1
9.1
9.2
10.1
5,0

4,0
Co (mg/kg)

3,0

2,0

1,0

0,0
1.1
2.1
2.2
3.1
3.2
4.1
4.2
5.1
5.2
6.1
6.2
7.1
7.2
8.1
9.1
9.2
10.1

0,8
0,7
Cr (mg/kg)

0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1.1
2.1
2.2
3.1
3.2
4.1
4.2
5.1
5.2
6.1
6.2
7.1
7.2
8.1
9.1
9.2
10.1

Ácido acético DTPA+CaCl2+TEA

Figura 4.12 (cont.). Contenido metálico más disponible de Ni, Co y Cr (mg/kg) en los 17
puntos de muestreo obtenido por extracción con ácido acético y DTPA+CaCl2+TEA
280
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

El ácido acético resultó ser un extractante más efectivo que el DTPA para la mayoría de
los sedimentos recogidos en la Bahía de Algeciras, excepto en el caso del As. Con estos
estudios, se comprobó que los puntos con mayor disponibilidad metálica fueron los
correspondientes a 6.1 para Ni y Cr y 7.1 y 7.2 para Co.

Así pues, teniendo en cuenta las concentraciones metálicas totales encontradas en los
17 puntos de muestreo, los niveles más disponibles y su disposición geográfica, se eligieron
aquéllos 5 que por una u otra razón podían representar mejor el ecosistema, para realizar
un estudio más exhaustivo sobre el contenido metálico total y su especiación en muestras
de agua, peces y sedimentos. Esta reducción de puntos de muestreo se justifica en base a
que los métodos de especiación tanto de aguas como de sedimentos que fueron aplicados
son muy laboriosos, por lo que los puntos de muestreo no pueden ser muchos. Estos 5
puntos fueron los siguientes:

P1: Playa de Getares (punto 1.1): punto de control, alejado de la zona central de la
bahía, con cierta cantidad de As disponible.

P2: Isla Verde (punto 2.1): punto con la mayor concentración de As total.

P3: Palmones (punto 6.1): punto con los niveles de Ni y Cr total más elevados, y
concentraciones de Ni y Cr disponibles muy significativos.

P4: Guadarranque (punto 7.1): punto con la mayor concentración de Co total y nivel
de Co disponible.

P5: Puente Mayorga (punto 8.1): punto geográfico significativo por actividad portuaria
y cercanía a la central térmica, con una concentración media de As disponible.

En la Figura 4.13 se muestra la localización de dichos puntos de muestreo. Las

campañas de toma de muestras se planificaron para estudiar la variabilidad espacio-
temporal relacionada con los ciclos biológicos. Así, y después de este muestreo previo, se
realizaron cuatro campañas durante dos años consecutivos, tomando las muestras de
aguas, sedimentos y peces en el periodo de otoño-invierno y en el de primavera-verano.

En la Tabla 4.16 se recogen la nomenclatura, coordenadas geográficas y muestras

tomadas en cada una de los puntos de muestreo seleccionados. En la Tabla 4.17 se indican
las fechas en las que se han llevado a cabo las distintas campañas de toma de muestra. En
la Figura 4.14 se ilustran los puntos de muestreo en fotografías tomadas desde el barco
utilizado en los muestreos.

281
Capítulo 4

Getares
1
Punta Europa
Isla Verde
Gibraltar 2 Algeciras

Puerto de Algeciras

Puente Mayorga
5
Guadarranque Palmones
4 3
Río Palmones

Río Guadarranque
Polígono industrial Polígono industrial
Guadarranque Palmones

Figura 4.13. Puntos de muestreo en la Bahía de Algeciras

Tabla 4.16. Localización geográfica de los puntos de muestreo en la Bahía de Algeciras

Estaciones de Coordenadas
Nomenclatura
muestreo Norte Oeste
Playa de Getares 1 36º05´28.31´´ 5º26´10.93´´
Isla Verde 2 36º07´8.43´´ 5º25´37.60´´
Palmones 3 36º10´19.51´´ 5º25´27.14´´

Guadarranque 4 36º10´32.21´´ 5º24´27.47´´

Puente Mayorga 5 36º 10´32.23´´ 5º23´23.24´´

282
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Tabla 4.17. Fecha de las campañas de toma de muestra de aguas, sedimentos y peces
llevadas a cabo en la Bahía de Algeciras
Muestreo de aguas y Muestreo de
Campañas
sedimentos peces
Muestreo 1 30/10/2007 13/11/2007
Muestreo 2 08/05/2008 30/04/2008
Muestreo 3 04/11/2008 21/10/2008
22/05/2009 (aguas)
Muestreo 4 19/05/2009
26/06/2009 (sedimentos)

Punto de muestro 1: Playa de Getares Punto de muestro 2: Isla Verde

Punto de muestro 3: Palmones Punto de muestro 4: Guadarranque

Figura 4.14. Fotos tomadas en los puntos de muestreo desde la embarcación

283
Capítulo 4

Punto de muestro 5: Puente Mayorga

Figura 4.14 (cont.). Fotos tomadas en los puntos de muestreo desde la embarcación

4.8. Estudio de los parámetros físico-químicos en la Bahía de Algeciras

Los ciclos meteorológicos, como el régimen de precipitaciones, temperatura, radiación

solar y viento, ejercen un efecto muy importante sobre el caudal de los aportes fluviales,
composición y producción biológica, lo que a su vez repercute sobre aquellas áreas
costeras que reciben estas aguas. La Bahía de Algeciras presenta un clima mediterráneo
subtropical en la parte sureste y este, mediterráneo oceánico en la suroeste y mediterráneo
semi-continental en el resto, con temperaturas medias anuales de 17 ºC [Plan de Calidad
Ambiental del Campo de Gibraltar, 2006]. Las precipitaciones registradas durante los años
en los que se realizaron los muestreos en la estación de Tarifa, estación meteorológica más
próxima a la Bahía de Algeciras, se recogen en la Figura 4.15 [Boletín Hidrológico,
http://servicios2.marm.es/sia/visualizacion/descargas/series.jsp]. En ella se indican con
líneas discontinuas los meses en los que se han realizado los muestreos. Se observa
claramente que las precipitaciones tuvieron lugar aproximadamente entre los períodos de
noviembre a abril, lo que supone aportes fluviales después del primer y tercer muestreo
realizados.

284
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

100
90
80
Precipitaciones (mm)

70
60
50
40
30
20
10
0
noviembre-07

mayo-08

noviembre-08

mayo-09
abril-08

junio-08
julio-08
octubre-07

diciembre-07

enero-08

agosto-08

abril-09

junio-09
febrero-08
marzo-08

septiembre-08
octubre-08

diciembre-08
enero-09

febrero-09
marzo-09
Figura 4.15. Precipitaciones semanales registradas en la estación meteorológica de Tarifa
durante el periodo 2007-2009

A continuación se recogen los resultados obtenidos del estudio realizado en el

ecosistema acuático de la Bahía de Algeciras, por el cual se determinaron las características
físico-químicas de la zona. En el estudio se han diferenciado los parámetros medidos in situ
durante la toma de muestra y aquellos que se midieron en el laboratorio.

4.8.1. Parámetros medidos in situ

Los valores obtenidos de las medidas de los parámetros realizados in situ se
registraron para todos los muestreos y para cada estación de muestreo (Getares, Isla
Verde, Palmones, Guadarranque y Puente Mayorga). Así pues, se estudió la evolución de la
temperatura, pH, salinidad, sólidos disueltos totales (TDS), conductividad y oxígeno
disuelto en el agua (expresado en mg/L y % de saturación) (Tabla 4.18). Para resumir los
datos de manera más sencilla, se representó cada parámetro en las Figuras 4.16, 4.17,
4.18, 4.19, 4.20 y 4.21, respectivamente.

285
Capítulo 4

Tabla 4.18. Valores de los parámetros físico-químicos medidos in situ en cada uno de los
puntos de muestreo
Muestreo Parámetro Punto de muestro
1 2 3 4 5
1 Temperatura (ºC) 21,2 22,1 20,1 21,3 21,0
pH 8,34 8,27 8,25 8,24 7,03
Salinidad (‰) 35,6 35,5 37,2 35,2 34,4
TDS (g/L) 34,4 34,2 36,0 33,9 33,1
Conductividad (mS/cm) 54,1 53,8 56,4 53,3 52,3
O2 disuelto (mg/L) 4,0 4,1 4,0 4,0 4,1
O2 disuelto (% saturación) 47,7 48,3 43,7 45,2 44,5
2 Temperatura (ºC) 18,3 19,7 20,2 20,9 18,9
pH 8,42 8,42 8,56 8,51 8,58
Salinidad (‰) 34,8 33,9 32,4 33,8 33,5
TDS (g/L) 33,8 32,5 31,1 32,5 32,4
Conductividad (mS/cm) 52,8 51,6 49,6 51,5 51,3
O2 disuelto (mg/L) 6,6 7,0 6,9 6,9 6,9
O2 disuelto (% saturación) 85,8 90,4 88,8 89,6 88,5
3 Temperatura (ºC) 14,9 15,9 15,4 15,3 14,3
pH 7,98 8,03 8,06 8,04 8,07
Salinidad (‰) 32,9 32,8 32,2 31,2 32,4
TDS (g/L) 31,7 32,8 32,2 31,2 30,4
Conductividad (mS/cm) 50,3 51,7 51 49,6 48,5
O2 disuelto (mg/L) 5,7 5,4 4,7 5,3 4,6
O2 disuelto (% saturación) 77,5 75,1 67,7 73,5 66,8
4 Temperatura (ºC) 18,2 18,3 18,2 18,6 18,5
pH 7,11 6,96 7,58 7,37 7,42
Salinidad (‰) 30,1 29,3 30,3 29,5 29,7
TDS (g/L) 29,1 28,2 28,9 28,5 28,6
Conductividad (mS/cm) 47,0 45,4 46,6 45,5 45,6
O2 disuelto (mg/L) 7,5 7,2 7,9 7,5 7,7
O2 disuelto (% saturación) 88,0 83,5 95,5 88,4 94,0

Temperatura
La temperatura es una variable física que influye en los ecosistemas acuáticos,
regulando los procesos vitales de los organismos vivos, y afectando a otros parámetros
físico-químicos abióticos, como son la solubilidad y el estado físico de nutrientes, solubilidad
de gases y de sales, densidad de las aguas, cinética de las reacciones, desplazamientos de
equilibrios, etc. Todos ellos son factores que afectan a la distribución, diversidad y actividad
metabólica de los seres vivos que integran un ecosistema. Los valores de temperatura
dependen fundamentalmente de la absorción de radiación en las capas superficiales y son
función de la época del año, la hora del día, la profundidad del medio y el caudal en
286
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

cuencas fluviales. La influencia más importante es la disminución de la solubilidad del

oxígeno al aumentar la temperatura y la aceleración de los procesos de putrefacción
[Orozco-Barrenetxea y col., 2008]

Los datos de temperatura del agua en todas las campañas de muestreo se

mantuvieron entre 14,3 y 22,1 ºC, no observándose estacionalidad en los resultados. En la
campaña de muestreo realizada en otoño de 2008 (muestreo 3) se registraron las
temperaturas más bajas en todos los puntos de muestreo, con un valor medio calculado
para este muestreo igual a 15 ºC. Este descenso de temperaturas era de esperar puesto
que según la Agencia Estatal de Meteorología, en el mes de noviembre de 2008 se
alcanzaron temperaturas ambientes mucho más frías que en los años anteriores.

25

20
Temperatura (ºC)

15

10

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.16. Temperatura de las aguas en los puntos de muestreo

pH
El pH de las aguas es otro factor abiótico que se debe tener en cuenta a la hora de
determinar la especiación química y la solubilidad de varias sustancias orgánicas e
inorgánicas. El pH interviene en procesos biológicos mediados por enzimas (ej. fotosíntesis,
respiración); regula la disponibilidad de nutrientes esenciales que limitan el crecimiento
microbiano en muchos ecosistemas (ej. NH4+, PO43- y Mg2+) e influye en la movilidad de
metales pesados. Es por ello que las variaciones bruscas en el pH pueden ocasionar
desequilibrios en las comunidades de organismos y provocar cambios en la especiación de
los compuestos, muchos de los cuales cambian su efecto o toxicidad sobre los organismos
vivos según la especie química en que se encuentren.

287
Capítulo 4

El valor de pH en un ecosistema acuático depende fundamentalmente del equilibrio

carbónico y de la actividad de los microorganismos presentes. La secuencia de equilibrios
de disolución de CO2 en un agua, y la subsiguiente disolución de carbonatos e
insolubilización de bicarbonatos alteran drásticamente el pH. Además, la actividad
fotosintética provoca una disminución de la cantidad de CO2 y un aumento del pH, mientras
que la respiración de los organismos heterótrofos aumenta la cantidad de dióxido de
carbono y produce una disminución del pH.

En el caso de aguas oceánicas, donde el sistema de amortiguación de carbonato-

bicarbonato opera efectivamente, el pH varía dentro de unos límites estrechos (7,5 - 8,4)
[Kennish, 1986]. En aguas cercanas a la costa, el pH de agua de mar se puede alejar del
valor promedio indicado por efecto de la actividad fotosintética, la respiración celular y el
efecto de descargas de origen antropogénico. En zonas donde exista una intensa actividad
vegetal, puede llegar a alcanzar valores cercanos a 9, y en zonas donde exista un fuerte
consumo de oxígeno y producción de CO2, los valores pueden oscilar entre 7,6 y 7,9, e
incluso evolucionar hacia pH más ácidos. El pH de lagos alcalinos puede tener valores
mayores a 10 u 11, mientras que el pH en algunas ciénagas o pantanos puede ser menores
de 4,0. Los valores de pH imperativos establecidos por la Junta de Andalucía para las aguas
clasificadas como normales, como las de estos puntos de muestreo, se encuentran entre 6
y 9 (BOJA núm. 27, de 1997).

En la Figura 4.17 se observa que los valores de pH registrados en las aguas se

mantuvieron a lo largo del estudio dentro del rango habitual de las aguas naturales,
oscilando entre 7,0 y 8,6. Es de destacar que durante la última campaña de muestreo, se
detectaron los valores ligeramente más bajos de pH, aunque no se observó variación
estacional de forma global.

10
9
8
7
6
pH

5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.17. Valores de pH de las aguas en los puntos de muestreo

288
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Salinidad, Conductividad y Sólidos disueltos totales

La cantidad de sales que contiene un sistema acuático está relacionada con parámetros
como salinidad (en ‰), sólidos disueltos totales (en g/L) o conductividad (en mS/cm). Los
sólidos disueltos totales (TDS) son una medida de las sustancias orgánicas e inorgánicas,
en forma molecular, ionizada o micro-granular, que contiene el agua. Para considerarse
TDS, las sustancias deben ser lo suficientemente pequeñas como para pasar una filtración
del tamaño de dos micras. Existe una correlación directa entre los tres términos, de manera
que cuanto mayor sean los sólidos disueltos totales o la salinidad, mayor será la
conductividad. El valor medio de salinidad en agua de mar es de 35 g/L [Orozco-
Barrenetxea y col., 2008].

La Orden de 14 de febrero de 1997 establece objetivos de calidad de estos parámetros

en aguas litorales andaluzas, estableciendo un rango de variación que es función de los
valores de salinidad/conductividad normales medidos en aguas no afectadas por vertidos y
seleccionadas como estaciones de referencia para este fin. En este estudio, la estación
considerada de referencia fue el punto de la Playa de Getares, y para aguas consideradas
normales, el valor imperativo de conductividad es de 0,9 MN – 1,1 MN, siendo MN la media
normal de la conductividad en la zona no afectada por vertidos. Por tanto, a partir de los
valores de conductividad del punto de Getares, utilizando los factores 0,9 y 1,1 se definió
cada uno de los intervalos de conductividad dentro de los cuales debían de estar los valores
de las restantes muestras (Tabla 4.19):

Tabla 4.19. Intervalos de valores imperativos de conductividad según la Orden de 14 de

febrero de 1997 tomando como referencia los valores del punto de muestreo de la Playa de
Getares
Conductividad x 0,9 Conductividad x 1,1
Muestreo
(mS/cm) (mS/cm)
1 48,69 59,51
2 47,52 58,08
3 45,27 55,33
4 42,30 51,70

En las Figuras 4.18, 4.19 y 4.20 se registraron los valores correspondientes al

contenido salino, en forma de salinidad, sólidos disueltos totales y conductividad,
respectivamente. No se observaron diferencias importantes entre las distintas estaciones
de muestreo y las cuatro campañas de muestreo realizadas, siendo los valores medios de
salinidad, sólidos disueltos totales y conductividad próximos a 33‰, 33 g/L y 50 mS/cm,
289
Capítulo 4

respectivamente. Estos valores se encuentran dentro de los rangos habituales para aguas
naturales. Cabe señalar que en el último muestreo realizado se obtuvieron los valores más
bajos, con una media de 30‰, 30 g/L y 46 mS/cm. En todos los muestreos, los datos de
conductividad estuvieron dentro de los valores imperativos establecidos por la Junta de
Andalucía para aguas clasificadas como normales, indicados en la Tabla 4.19.

40
35
30
Salinidad (%o)

25

20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.18. Valores de salinidad de las aguas en los puntos de muestreo

40
35
30
25
TDS (g/L)

20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.19. Valores de sólidos totales disueltos de las aguas en los puntos de muestreo

290
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

60

50
Conductividad (mS/cm)

40

30

20

10

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.20. Valores de conductividad de las aguas en los puntos de muestreo

Oxígeno disuelto
Históricamente, el oxígeno disuelto ha sido el parámetro de mayor interés en el estudio
de calidad de aguas. Entre los gases disueltos, el oxígeno es el que juega el papel más
importante en la calidad biótica de las aguas, puesto que es indispensable para la
respiración de los organismos, facilita la degradación de la materia orgánica e interviene en
la realización de los ciclos bioquímicos. El oxígeno es un gas muy relevante en la dinámica
de aguas, su solubilidad depende de varios factores, como la temperatura, presión,
coeficiente de solubilidad, tensión de vapor, salinidad y composición fisicoquímica del agua.
El porcentaje de saturación depende de la turbulencia, de la superficie de contacto entre
gas y agua y de su contenido salino, estando inversamente relacionado con la temperatura
y salinidad. Las aguas corrientes superficiales no contaminadas suelen estar saturadas de
oxígeno, con una concentración de oxígeno disuelto entre 6,5 y 8 mg/L. Valores más bajos
pueden indicar presencia de contaminación por materia orgánica, puesto que la
descomposición bacteriana de la misma implica una demanda de oxígeno disuelto. En este
caso, las aguas se vuelven sépticas y de mala calidad para la vida de algunas especies
acuáticas. Concentraciones por debajo de 5 mg/L pueden afectar al desarrollo de las
comunidades, y por debajo de 2 mg/L pueden llevar a la muerte de los peces e
invertebrados bentónicos.

La legislación ambiental andaluza establece los objetivos de calidad de este parámetro

en términos de porcentaje de saturación, de forma que para aguas normales el valor
imperativo de oxígeno disuelto es de 70%.

291
Capítulo 4

En la Figura 4.21 se muestran los valores de oxígeno disuelto en las aguas

muestreadas y se observa una mayor variabilidad de este parámetro entre muestreos,
destacando la baja cantidad de O2 disuelto en los muestreos 1 y 3, que se corresponden
con la estación de otoño, previa a las precipitaciones en la zona. De este modo los valores
medios de oxígeno disuelto obtenidos del muestreo primero al cuarto fueron 4,05±0,04;
6,84±0,18; 5,13±0,48 y 7,56±0,27, expresados en mg/L, y 45,9±2,0, 88,6±1,7, 72,1±4,7
y 89,9±4,9, en % de saturación. Como se deduce de estos valores, el oxígeno disuelto
tiene una tendencia estacional en las aguas de la Bahía de Algeciras, siendo su contenido
mayor en los meses de primavera. Estos datos se encuentran en consonancia con los
publicados anteriormente [Plan de calidad ambiental del campo de Gibraltar, 2005], según
los cuales los máximos de los procesos fotosintéticos en las costas de la Bahía de Algeciras
se producen fundamentalmente en la época estival, fundamentalmente de abril a julio. Los
valores de oxígeno disuelto en todas las estaciones de muestreo durante el muestreo 1 y
en algunas en el muestreo 3 están por debajo del valor imperativo establecido por la Junta
de Andalucía. Estas concentraciones tan bajas de oxígeno en los muestreos 1 y 3 indican
procesos de degradación de materia orgánica, con cierta hipoxia en las aguas.

9
8
7
O2 disuelto (mg/L)

6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.21. Valores de oxígeno disuelto de las aguas en los puntos de muestreo

4.8.2. Parámetros generales

Además de los parámetros físico-químicos que se midieron in situ, también se
realizaron las medidas en el laboratorio de la materia en suspensión en las aguas y su
contenido orgánico, el carbono orgánico disuelto, y el contenido de materia orgánica en los
sedimentos. Los resultados se muestran en la Tabla 4.20. Además, se representó cada
parámetro en las Figuras 4.22, 4.23, 4.24 y 4.25.
292
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Tabla 4.20. Valores de materia en suspensión y contenido orgánico en aguas y

sedimentos
Muestreo Parámetro Punto de muestro
1 2 3 4 5
1 Materia en suspensión en
0,027 0,024 0,024 0,032 0,040
agua (g/L)
Materia orgánica en
32,9 17,2 26,5 25,7 35,0
materia en suspensión (%)
COD en agua
1,72 1,52 1,39 1,53 6,23
(mg/L)
Materia orgánica en los
16,1 17,8 12,3 11,6 10,2
sedimentos (%)
2 Materia en suspensión en
0,014 0,015 0,016 0,015 0,016
agua (g/L)
Materia orgánica en
12,8 18,2 13,4 20,2 19,0
materia en suspensión (%)
COD en agua
0,41 0,59 0,67 0,72 0,56
(mg/L)
Materia orgánica en los
2,6 5,3 1,8 1,7 1,5
sedimentos (%)
3 Materia en suspensión en
0,029 0,017 0,022 0,024 0,019
agua (g/L)
Materia orgánica en
19,4 12,6 17,9 21,4 17,8
materia en suspensión (%)
COD en agua
1,74 1,03 0,66 1,67 1,52
(mg/L)
Materia orgánica en los
4,1 7,6 6,8 7,6 15,7
sedimentos (%)
4 Materia en suspensión en
0,021 0,022 0,023 0,022 0,020
agua (g/L)
Materia orgánica en
12,8 16,1 14,6 12,6 7,1
materia en suspensión (%)
COD en agua
0,92 2,51 0,41 1,05 1,14
(mg/L)
Materia orgánica en los
3,1 5,7 2,4 4,5 4,4
sedimentos (%)

Materia en suspensión
La materia en suspensión, o sólidos en suspensión (SS), es un parámetro descriptivo
de la materia particulada, orgánica e inorgánica, presente en el agua. Se definen los sólidos
en suspensión como la porción de sólidos retenidos por un filtro de tamaño de poro de 0,45
µm que posteriormente se seca a 103-105ºC hasta peso constante [Orozco-Barrenetxea y
293
Capítulo 4

col., 2008]. La presencia de material en suspensión en agua de mar puede deberse tanto a
causas antropogénicas (como la presencia de vertidos de diferente naturaleza, sólidos
flotantes, etc.) como a fuentes naturales (como partículas de sedimento, microorganismos,
etc.).

La normativa andaluza establece objetivos de calidad de este parámetro respecto a

valores medios de una zona considerada como referencia, la cual no debe estar afectada
por vertidos. Para aguas consideradas normales, el valor imperativo de sólidos en
suspensión, es de 1,2 MN, siendo MN el valor medio en aguas no afectadas por los
vertidos, que como se ha indicado en este estudio fue el punto de muestreo de la Playa de
Getares.

En la Figura 4.22 se muestran los datos de sólidos en suspensión para las diferentes
campañas y puntos de muestreo. La carga de sólidos en suspensión observadas en las
estaciones de la Bahía de Algeciras se mantiene dentro del intervalo de 0,014 a 0,04 g/L. El
contenido de materia suspendida fue similar al encontrado en sistemas acuáticos próximos
como la Bahía de Cádiz [Vicente-Martorell y col., 2009], estando en todos los casos
alrededor de 0,025 g/L. Durante el primer muestreo se obtuvieron los mayores valores de
materia en suspensión, siendo sin embargo, el muestreo segundo el que presentó los
valores más pequeños (0,015 g/L). En todos los casos los datos respetan los valores
imperativos establecidos por la Junta de Andalucía, excepto la estación de Puente Mayorga
durante el muestreo 1, cuyo valor de sólidos en suspensión es de 1,48 veces el valor de
MN.

0,05

0,04
Sólidos en Suspensión

0,03
(g/L)

0,02

0,01

0,00
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.22. Contenido de sólidos en suspensión de las aguas en los puntos de muestreo

294
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Materia orgánica en la materia en suspensión

El contenido en materia orgánica tiene una tendencia algo similar a la materia en
suspensión (Figura 4.23), con valores mayores en el primer muestreo (valor medio de
27,4%); el menor contenido de materia orgánica se observó en el cuarto muestreo con una
media de 12,7%, siendo el contenido medio de materia orgánica en los muestreos segundo
y tercero de 16,7 y 17,8%, respectivamente. A su vez, estos datos coincidieron de forma
inversa con la tendencia observada para el oxígeno disuelto. En el muestreo 1 se
obtuvieron los mínimos valores de este parámetro, lo que podría ser debido a la presencia
de una mayor cantidad de materia orgánica. Por lo contrario, en el muestreo 4 fue donde
se obtuvieron los niveles mayores de oxígeno disuelto, asociado a una menor
contaminación por materia orgánica. El contenido de materia orgánica fue similar al
encontrado en sistemas acuáticos próximos como la Bahía de Cádiz [Vicente-Martorell y
col., 2009].

40
35
% de Materia Orgánica

30
en Sólidos en
Suspensión

25
20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.23. Contenido de materia orgánica en los sólidos en suspensión de las aguas en
los puntos de muestreo

Carbono orgánico disuelto

El contenido en carbono orgánico disuelto fue también analizado sobre las muestras de
agua filtradas. Este parámetro varió entre 0,41 y 6,23 mg/L, con el siguiente
comportamiento: muestreo 1 > muestreo 3 > muestreo 4 > muestreo 2 (Figura 4.24).
Entre puntos de muestreo el comportamiento no fue muy diferente, con la excepción de las
muestras de Puente Mayorga e Isla Verde con valores más destacados que los restantes en
el primer muestreo (valor más alto de COD de 6,23 mg/L) y en el último (valor de COD de

295
Capítulo 4

2,51 mg/L), respectivamente. El valor de COD en Puente Mayorga en el primer muestreo

supera incluso el valor imperativo del parámetro carbono orgánico total, establecido como
3 mg/L para aguas normales. Exceptuando este punto de muestreo, los restantes valores
fueron similares al encontrado en sistemas acuáticos próximos como la Bahía de Cádiz
[Carrasco y col., 2003].

5
COD (mg/L)

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.24. Contenido de carbono orgánico disuelto de las aguas en los puntos de
muestreo

Materia orgánica en sedimentos

La materia orgánica en los sedimentos es un parámetro muy significativo para la
evaluación de la toxicidad de los sedimentos, puesto que juega un papel importante en la
disponibilidad de los contaminantes tantos orgánicos como inorgánicos en los sedimentos.
Además, la materia orgánica tiene una fuerte influencia en las propiedades químicas y
físicas de los sedimentos, como su capacidad de retención de aguas, capacidad de
intercambio iónico, etc. Una de sus principales características es que la materia orgánica
puede interactuar con la arcilla, iones metálicos, óxidos e hidróxidos para formar
asociaciones solubles o insolubles, que influirán en la biodisponibilidad de los metales
asociados a los sedimentos [Rosas Rodríguez, 2001].

En la Figura 4.25 se ha representado el porcentaje de materia orgánica de los

sedimentos, para todas las campañas y todas las estaciones de muestreo. Se puede
observar que el porcentaje de materia orgánica fue mayor en el primer y tercer muestreo,
correspondiendo con la estación de otoño, después de la actividad biológica del verano,
296
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

oscilando entre 4,1 y 17,8%, Los datos en primavera fueron menores, entre 1,5 y 5,7%,
estando comprendidos dentro de los valores normales en sedimentos de este tipo de
ecosistemas [Carrasco y col., 2003; Vicente-Martorell y col., 2009].

20
18
16
% de Materia Orgánica

14
en Sedimentos

12
10
8
6
4
2
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.25. Contenido de materia orgánica de los sedimentos en los puntos de muestreo

Para definir mejor el ecosistema, se estudió la existencia de posibles correlaciones

entre todos los parámetros físico-químicos observados en la Bahía de Algeciras. Una vez
caracterizadas las distribuciones de estas variables como no paramétricas, se empleó la
correlación de Spearman, obteniéndose correlaciones positivas y significativas (p<0,05; R
Spearman >0,7) para salinidad, sólidos disueltos totales y conductividad, evidenciando el
carácter salino del ecosistema. El oxígeno disuelto correlacionó negativamente con la
salinidad, sólidos disueltos totales y conductividad, no haciéndolo con el contenido orgánico
como se comentó en el análisis de la tendencia de los resultados obtenidos. Así, el COD
correlacionó positivamente con los sólidos en suspensión, el % de materia orgánica en los
sólidos en suspensión y el % de materia orgánica en sedimentos.

4.9. Distribución y biodisponibilidad de As, Ni, Co y Cr en la Bahía de

Algeciras

A continuación se detallan los niveles metálicos de As, Ni, Co y Cr en las aguas,

sedimentos y tejidos de peces de la Bahía de Algeciras. Asimismo, también se estudia la

297
Capítulo 4

especiación metálica con objeto de definir la potencial disponibilidad hacia la biota,

evaluando además las posibles influencias estacionales y espaciales que pudieran existir.

4.9.1. Contenido metálico en agua

La distribución de metales en el medio acuático se encuentra controlada por procesos
naturales, como pueden ser las aportaciones atmosféricas o de los ríos, erosión de los
suelos, actividades biológicas, drenaje de aguas, y por actividades antropogénicas, como la
descarga de aguas residuales urbanas e industriales [Carman y col., 2007]. Además, su
biodisponibilidad para los organismos acuáticos depende en gran medida de las formas
químicas en que se encuentren. Es por ello que se ha decidido realizar el estudio no sólo de
las concentraciones metálicas totales sino también de sus especies químicas en las aguas.

4.9.1.1. Concentración total en agua

Tal y como se ha indicado en la metodología de análisis de aguas, se realizó el estudio
de la concentración metálica total en aguas, y se diferenció entre el metal disuelto, que es
más disponible, y el metal particulado. Los valores de concentración total, concentración
disuelta y concentración en la materia en suspensión, de los metales As, Ni, Co y Cr en las
aguas se encuentran en las Tablas A.5, A.6, A.7 y A.8 del Anexo 4.1.

Las concentraciones totales se encuentran dentro de los intervalos siguientes: As:

0,494 – 0,795 g/L; Ni: 0,137 – 0,574 g/L; Co: 0,022 – 0,752 g/L y Cr: 0,200 – 0,555
g/L (Figura 4.26). Los valores medios de metales encontradas son los siguientes: As:
0,6±0,1 g/L, Ni: 0,3±0,1 g/L, Co: 0,1±0,2 g/L y Cr: 0,4±0,1 g/L. Así, se pueden
ordenar de mayor a menor concentración media como [As]> [Cr] > [Ni] > [Co].

298
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

1,0

0,8

0,6
As (g/L)

0,4

0,2

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

1,0

0,8

0,6
Ni (g/L)

0,4

0,2

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.26. Concentración total de As y Ni en aguas en las 5 estaciones de la Bahía de

Algeciras

299
Capítulo 4

1,0

0,8

0,6
Co (g/L)

0,4

0,2

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

1,0

0,8

0,6
Cr (g/L)

0,4

0,2

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.26 (cont.). Concentración total de Co y Cr en aguas en las 5 estaciones de la

Bahía de Algeciras

En el caso del As, los niveles se encontraron entre 0,494 y 0,795 g/L, existiendo
pequeñas variaciones entre los puntos de muestreo, destacando la estación de Puente
Mayorga con valores ligeramente superiores en el muestreo segundo y cuarto.

Los valores de Ni total analizados en las muestras de aguas estuvieron dentro del
rango 0,137 y 0,574 g/L. De ellos puede decirse que no existe mucha diferencia entre las
estaciones de muestreo durante las dos primeras campañas. Sin embargo hay que destacar
300
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

la presencia de mayores valores de Ni en las estaciones de Palmones y Guadarranque en el

muestreo 3, así como en la estación de Guadarranque en el muestreo 4. El nivel de Ni en
estos puntos puede ser debido a la presencia cercana de la empresa Acerinox y a la
Refinería Cepsa. El punto 1 (Playa de Getares) fue catalogado inicialmente como punto
limpio y de control, pero presentó los valores de Ni más altos en los dos primeros
muestreos. Es posible que esto sea debido al accidente que sufrió el buque frigorífico Sierra
Nava en enero de 2007 provocando un derrame de 170 toneladas de fuel a 20 metros de la
costa de la Playa de Getares. Siete meses después, el chatarrero New Flame naufragó tras
chocar con un petrolero y se partió por la mitad, derramando igualmente el contenido de
sus tanques. Por ello, en octubre de 2007 (primera campaña de muestreo) los niveles de Ni
fueron mayores que los esperados, pero han ido disminuyendo progresivamente durante
los siguientes muestreos dado el alto grado de renovación de aguas que existe en la Bahía
de Algeciras y las labores de limpieza que se llevaron a cabo en la zona. Portella y col. han
descrito la presencia de niveles elevados de Ni(II), Fe(II) y V(IV) en fuel [Portella y col.,
2006].

Respecto a las concentraciones de Co total, los datos estuvieron comprendidos entre

0,022 y 0,153 g/L, excepto en la estación de Guadarranque donde cabe destacar el alto
nivel de Co (alrededor de 0,6 y 0,8 g/L en los muestreos 1 y 3, respectivamente). Es
posible que sea debido a un vertido puntual de la refinería.

En el caso de los niveles de Cr, los valores, comprendidos entre 0,200 y 0,555 g/L,
indican que los niveles de metal total tuvieron una tendencia a ser mayores en los puntos
de Isla Verde y Guadarranque, excepto en el cuarto muestreo donde se igualan los valores
en las estaciones de Isla Verde, Palmones y Guadarranque. Parece ser que son estos
puntos los que de una forma más o menos variable presentaron niveles de este metal
significativos.

Con objeto de estudiar la influencia estacional y espacial que puedan presentar los
metales en las aguas de la Bahía de Algeciras se realizó el análisis de la varianza (ANOVA)
de los resultados obtenidos. Así, se observó que para ningún metal existía diferencia
significativa entre los diferentes muestreos llevados a cabo, ni existía influencia estacional
para un valor de p<0,05. Sin embargo, y tras el estudio no paramétrico de Kruskall-Wallis
sí se encontraron diferencias significativas entre los puntos de muestreo para As
(p=0,0144) y Co (p=0,0052). Así, en el caso del As, y mediante el test de comparación
múltiple se observaron diferencias significativas entre los puntos 3 (Palmones) y 5 (Puente
Mayorga), y para el caso del Co, se encontraron entre los puntos 1 (Getares) y 4
(Guadarranque).
Con respecto a las relaciones entre metales puede decirse que se observaron
correlaciones negativas entre el As y el Ni (R=-0,5422; p=0,014), y entre el Cr y el Co (R=
- 0,5748; p=0,008). Aún así, los coeficientes de correlación no fueron muy elevados.
301
Capítulo 4

Igualmente, se estudió si existía relación entre el contenido metálico total en las aguas
y los parámetros físico-químicos, encontrándose que ninguno de los metales estaba
relacionado con estos parámetros. Esto indicó que el comportamiento de los metales en la
bahía no parecía estar influenciado por procesos asociados a estos parámetros.

Comparando estos valores de concentración total metálica en aguas con los

encontrados en otros ecosistemas acuáticos, se puede decir que:

- Los valores de concentración de As en las aguas de la Bahía de Algeciras son

similares a las concentraciones observadas en la Bahía de Cádiz (zona menos
industrializada), donde los valores variaban en el rango 0,16-1,96 g/L. Sin embargo, están
por debajo de los niveles encontrados en la Ría de Huelva (conocido como uno de los
estuarios más contaminados de Europa por metales pesados), en donde el As se halla en el
intervalo 2,6-9,3 g/L [Vicente Martorell, 2010].

- Los valores de Ni se encuentran por debajo de los observados en la Ría de Huelva, en

donde el Ni estaba comprendido entre 2,1 y 13 g/L [Morillo y Usero, 2008]. Además, estos
autores también estudiaron las concentraciones de Ni en aguas de la Bahía de Algeciras
durante el primer semestre del año 2007, encontrando valores de 0,4-1 g/L, ligeramente
superiores a los encontrados en este estudio.

- Los valores de Co se encuentran dentro de los encontrados en otros ecosistemas,

como el estuario del Río Hudson en Estados Unidos, donde los valores de Co totales en
aguas se encuentran entre 0,028 y 3,231 g/L, y los de la Bahía de San Francisco, en
Estados Unidos, donde oscilan entre 0,027 y 4,235 g/L [Tovar-Sánchez y col., 2004].
También se han analizado los valores de Co disuelto y particulado en toda la costa de
Portugal, resultando que el Co total en la zona del estuario del Río Guadiana oscila entre
los valores 0,0326 y 0,194 g/L [Santos-Echeandía y col., 2012], valores muy similares a
los encontrados en este estudio.

- Con respecto al Cr, no se han encontrado en la bibliografía datos concentraciones

totales en aguas, sino en la fracción disuelta. En la siguiente sección se explicará la
distribución metálica entre las fases disueltas y particuladas. Los datos encontrados en la
Bahía de Algeciras de Cr disuelto estuvieron comprendidos entre 0,096 y 0,346 g/L. En
otros ecosistemas, como el estuario del Río Severn y el canal de Bristol (Reino Unido) se
han encontrado concentraciones de Cr disuelto entre 0,5 y 3,5 g/L, según la salinidad. Así,
para zonas más lejanas al estuario con salinidad de 30‰ los valores medios encontrados
fueron de 0,5 g/L [Jonas y Millward, 2010], similares a los hallados en este estudio. En el
golfo de Tailandia por ejemplo, los valores de Cr variaron entre 0,002 y 0,719 g/L [Censi y
col., 2006] y en la Bahía de Florida estuvieron comprendidos entre 0,031 y 0,421 g/L
[Caccia y Millero, 2003]. Todos ellos son valores muy similares a las concentraciones
encontradas en la Bahía de Algeciras durante este estudio.
302
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

4.9.1.2. Distribución metálica entre la fase disuelta y particulada

El esquema de especiación utilizado permite realizar una primera distinción entre los
niveles metálicos en la fracción disuelta y en la particulada, considerándose esta última
como la fase menos disponible para la biota. El porcentaje de distribución de los metales
analizados entre la fase disuelta y particulada en porcentaje se muestra en la Figura 4.27.

100%

80%

60%
As

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

80%

60%
Ni

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Fracción particulada Fracción disuelta

Figura 4.27. Distribución del contenido de As y Ni entre las fracciones disuelta y

particulada en agua

303
Capítulo 4

100%

80%

60%
Co

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

80%

60%
Cr

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Fracción particulada Fracción disuelta

Figura 4.27 (cont.). Distribución del contenido de Co y Cr entre las fracciones disuelta y
particulada en agua

En la Figura 4.27 se observa que todos los metales, en condiciones generales,

aparecen en diversas ocasiones distribuidos en la fase disuelta más que en la fase
particulada, sobre todo para Ni y Cr, hecho que es de esperar dado los bajos niveles de
sólidos en suspensión que presentan las aguas. El As muestra elevados porcentajes en la
fase disuelta durante los muestreos en primavera (63,8 – 85,5%), mientras que en otoño
304
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

los porcentajes fueron menores (23,9 – 69,9%). En cuanto al Ni, aparece mayoritariamente
en forma disuelta (52,7 – 97,9%), excepto en la Playa de Getares en el muestreo 2, donde
la fase particulada representa un 70% del contenido total y en Guadarranque y Puente
Mayorga en el muestreo 3, con valores de 36,5% y 44,4%, respectivamente. Respecto al
Co, los datos presentan una mayor variabilidad que en el caso de Ni, puesto que existen
muestras con un gran porcentaje de metal particulado y otras con un elevado porcentaje
disuelto, próximo al 100%, como en el punto de Isla Verde en el segundo y tercer
muestreo. En general, los porcentajes de cobalto en la fase disuelta varían en el rango 9,1
– 100%. En cuanto al fraccionamiento del Cr, cabe destacar que se encontraron niveles de
metal disuelto superiores al 50% para la mayoría de las estaciones de muestreo (51,8 –
97,4%), excepto en Puente Mayorga en los muestreos 1, 2 y 3, Playa de Getares e Isla
verde en el muestreo 2 y Guadarranque en el muestreo 3, en los que la fracción particulada
fue predominante, llegando a alcanzar valores de hasta un 80% en Puente Mayorga
durante el muestreo 2.

De esta manera, los metales puede ordenarse de mayor a menor porcentaje en la

fracción disuelta, y por tanto, mayor a menor biodisponibilidad, como sigue: Ni > Cr > As >
Co, siendo sus porcentajes medios en la fase disuelta: 67,7%, 63,4%, 56,1% y 49,4%,
respectivamente.

Asimismo, para poder describir el reparto entre la fase particulada y la disuelta de un

metal en un sistema acuático, se define el parámetro Kd, denominado coeficiente de
reparto, como la relación existente entre la concentración de dicho metal en la fase
particulada (expresada en mg/kg) y su concentración en la fase disuelta (expresada en
mg/L). Así, la expresión: Kd (L/kg) = [Mparticulado] / [Mdisuelto], proporciona la razón entre el
contenido metálico en la materia en suspensión y la cantidad de metal disuelto en las
aguas. El coeficiente de reparto para As se encuentra comprendido en el intervalo 7406 –
139726 L/kg; para Ni, 1347 – 171645; para Co, 0 – 303379; y para Cr, 1038 – 260168
(Tabla 4.21), con medias de 50895; 32954; 93255 y 48560 L/kg, para As, Ni, Co y Cr
respectivamente. Los mayores coeficientes de reparto se han obtenido para Co y As,
indicando así su afinidad para ser transportados con la fase sólida, y su menor
biodisponibilidad en comparación con el Ni y el Cr. Los valores para Ni, Co y Cr son
similares a los encontrados en puntos de muestreo de ecosistemas estuáricos y bahías que
tenían una salinidad del orden de 30 g/L [Chiffoleau y col., 1994; Comber y col., 1995;
Hatje y col., 2003; Tovar-Sánchez y col., 2004; Takata y col. 2010]. Los coeficientes de
reparto de As son mayores que los encontrados en la Ría de Huelva, en la Bahía de Cádiz y
en el estuario del río Támesis en Reino Unido [Millward y col., 1997a; Vicente Martorell,
2010]. Sin embargo, se parecen a los encontrados en el estuario Humber de Reino Unido
[Millward y col., 1997b]. Todos estos datos de Kd se comparan en la Tabla 4.22.

305
Capítulo 4

Además, se representó el logaritmo decimal de los valores de Kd para cada uno de los
metales frente a los sólidos en suspensión y para cada muestreo con el objetivo de estudiar
su evolución. Las gráficas se muestran en las Figuras 4.28, 4.29, 4.30 y 4.31.

Los valores de Kd no evolucionaron significativamente con la concentración de sólidos

en suspensión (SS). En las Figuras 4.28-4.31 se observa una ligera subida para As con la
materia en suspensión, una tendencia a no incrementarse el valor de Kd con los SS para
Co, y una pequeña disminución para Ni y Cr. Para estos dos metales, el incremento de los
SS se traduce en un aporte mayor de estos metales en su forma disuelta a la columna de
agua, aumentando así su disponibilidad. Por el contrario, aunque en poca medida, el
incremento de materia en suspensión favorece la distribución del As en la fase particulada,
con un ligero aumento de los valores de Kd. En el caso de Co, la distribución metal
particulado/metal disuelto no está afectada por el aumento de los sólidos en suspensión.

Tabla 4.21. Valores de los coeficientes de reparto Kd (L/kg) entre la materia suspendida y
la columna de agua para As, Ni, Co y Cr en las aguas de la Bahía de Algeciras
Estación Coeficiente de reparto Kd (L/kg)
Muestreo de
muestreo As Ni Co Cr
1 22910 11250 204464 100733
2 117227 40659 134559 31881
1 3 49159 7761 39990 1038
4 100632 5478 78471 20548
5 72847 3151 246904 27517
1 39946 171645 97354 86137
2 25944 29316 0 77937
2 3 20366 11719 219701 48652
4 25703 43298 303379 51972
5 25143 1347 38539 260168
1 14939 19336 36958 32070
2 139726 23663 300 41886
3 3 43632 41505 52764 3266
4 117002 53294 83802 53110
5 123719 91759 241128 69305
1 14908 6412 8928 17418
2 20112 7743 33198 7440
4 3 7406 39875 13763 6854
4 14681 31396 20811 6466
5 21900 18479 10087 26798

306
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Tabla 4.22. Comparación de valores de Log Kd (L/kg) de varios ecosistemas acuáticos

encontrados en la bibliografía con los encontrados en la Bahía de Algeciras

Ecosistema acuático As Ni Co Cr Referencias

Estuario del Támesis Millward y

3,00
(Reino Unido) col., 1997a
Millward y
Estuario Humber col., 1997b;
3,30-4,40 3,70 4,20
(Reino Unido) Comber y
col., 1995
Estuario Mersey (Reino Comber y
4,30 5,57
Unido) col., 1995
Tovar-
Estuario del Hudson
4,76-4,91 Sánchez y
(EEUU)
col., 2004
Tovar-
Bahía de San Francisco
5,00-5,50 Sánchez y
(EEUU)
col., 2004
Bahía de Sagami Takata y
4,36-5,90
(Japón) col. 2010
Bahía de Wakasa Takata y
5,48-6,30
(Japón) col. 2010
Estuario del Puerto Hatje y col.,
3,8-4,8
Jackson (Australia) 2003
Estuario del Sena Chiffoleau y
4,20-4,40 5,00
(Francia) col., 1994
Vicente
Bahía de Cádiz
0-3,34a Martorell,
(España)
2010
Vicente
Ría de Huelva
2,00-3,78 Martorell,
(España)
2010
Bahía de Algeciras
3,87-5,15 3,13-5,24 3,95-5,48 3,02-5,42 Este estudio
(España)
a
El valor de 0 corresponde al valor de Kd y no al Log(Kd)

307
Capítulo 4

6,0
LOG Kd (L/kg) en As

5,0

4,0

y = 0,0111x + 4,311
3,0 R2 = 0,036

2,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Sólidos en suspensión (mg/L)

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.28. Coeficientes de partición de As (expresados como Log Kd (L/kg)) en función

de los sólidos en suspensión durante los 4 muestreos

6,0
LOG Kd (L/kg) en Ni

5,0

4,0

3,0 y = -0,0319x + 4,9714

R2 = 0,1615
2,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Sólidos en suspensión (mg/L)

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.29. Coeficientes de partición de Ni (expresados como Log Kd (L/kg)) en función

de los sólidos en suspensión durante los 4 muestreos
308
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

6,0
LOG Kd (L/kg) en Co

5,0

4,0

y = 0,0068x + 4,6365
3,0 R2 = 0,008

2,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Sólidos en suspensión (mg/L)

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.30. Coeficientes de partición de Co (expresados como Log Kd (L/kg)) en función

de los sólidos en suspensión durante los 4 muestreos

6,0
LOG Kd (L/kg) en Cr

5,0

4,0

3,0 y = -0,024x + 4,9439

R2 = 0,0735
2,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Sólidos en suspensión (mg/L)

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.31. Coeficientes de partición de Cr (expresados como Log Kd (L/kg)) en función

de los sólidos en suspensión durante los 4 muestreos
309
Capítulo 4

Del mismo modo que es importante identificar las tendencias estacionales o espaciales
que muestran las concentraciones totales de los metales en las aguas, lo es conocer si
existen tendencias estacionales o espaciales en las fases disuelta y particulada en las
aguas. Por ese motivo se realizaron los correspondientes estudios del análisis de la varianza
sobre el porcentaje de la fracción disuelta o particulada. Al ser complementarias, cualquiera
de las dos fracciones es válida para este estudio, habiéndose realizado éste con la fracción
disuelta. No se observaron diferencias significativas entre los puntos de muestreo para las
fracciones disueltas de los metales estudiados. Sin embargo, según el análisis de las
varianzas de Kruskal-Wallis y el test de comparación múltiple, sí se encontraron diferencias
significativas para la fracción disuelta de As entre los muestreos 1 y 2, y los muestreos 1 y
4. Además, según el análisis de las varianzas también se encontraron diferencias, aunque
no muy significativas, para las fracciones disueltas de Co (en la que p fue ligeramente
mayor a 0,05) y Cr (en la que p fue ligeramente menor a 0,05). No obstante, y realizando
el test de comparación múltiple se observó más claramente que existían diferencias
significativas entre los muestreos 1 y 4 para el Co disuelto, no resultando así para el caso
del Cr disuelto. Estas discrepancias entre tests pueden surgir cuando los tamaños de la
muestra son algo reducidos, por lo que los resultados para la fracción disuelta de Co y de
Cr no son concluyentes.

Por otra parte, se estudió la posible influencia estacional, encontrándose para las
fracciones disueltas de As y Co diferencias significativas entre las estaciones, siendo mayor
esta fracción, por lo general, en los muestreos de primavera.

Además, se han estudiado las correlaciones que se establecen entre las fracciones
disueltas de los metales, observándose que la fracción disuelta de As estaba relacionada de
manera positiva con la fracción disuelta de Co, indicando que son metales con un similar
comportamiento. Aún así, las correlaciones no fueron muy significativas puesto que los
coeficientes de correlación no fueron mayores de 0,7 en valor absoluto.

4.9.1.3. Especiación metálica en aguas

Tal y como se ha indicado anteriormente, se realizó la especiación de los metales As,
Ni, Co y Cr en las aguas de la Bahía de Algeciras. Los resultados se detallan en las Tablas
A.5, A.6, A.7 y A.8 del Anexo 4.1.

Especiación de Arsénico
La especiación de As en agua
previamente en la Figura 4.6, el cual
particulada orgánica e inorgánica así
las formas inorgánicas tienen mayor
310
se realizó a partir del esquema que se ha descrito
separa las especies de As en las siguientes fracciones:
como disuelta orgánica e inorgánica. En ambos casos,
toxicidad que las orgánicas, y las formas particuladas
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

son menos disponibles que las formas disueltas. Por tanto, en función de estos niveles se
puede determinar el grado de toxicidad y/o disponibilidad de este metal. En las Figuras
4.32 y 4.33 se han representado estos resultados, expresados tanto en g/L como en tanto
por ciento del total correspondiente.

Como ya se ha mencionado en el apartado anterior, el As disuelto se encuentra en

mayor proporción que el As particulado, con lo que se ve favorecida la disponibilidad de
este metal. A esto hay que añadir que, con algunas excepciones, la mayoría de las
muestras de agua presentaron un mayor porcentaje de As disuelto inorgánico, sobre todo
en la estación de muestreo de Puente Mayorga en todos los muestreos, Palmones en el
muestreo 3, Isla Verde en el muestreo 2, Getares en el muestreo 1 y Guadarranque en el
segundo y cuarto muestreo, donde aproximadamente el 100% de este metal estaba en
forma inorgánica. Además, parece que el As disuelto total presentó una tendencia
estacional, con mayores concentraciones en los muestreos de primavera que en los de
otoño. Este comportamiento estacional es opuesto en el As particulado. En este caso, el As
particulado inorgánico es mayoritario en el punto de Palmones, durante los 4 muestreos, en
Guadarranque en los muestreos de otoño y en Getares en el muestreo 2.

Especiación de Ni y Co
La especiación de Ni y Co se realizó a partir del esquema representado en la Figura
4.7, según el cual se establece la distribución de las especies metálicas en cinco fracciones
diferentes: metal total, metal disuelto, metal particulado, metal disuelto lábil y metal
disuelto poco/no lábil.

Las formas químicas disueltas están más disponibles que las particuladas, y dentro de
las disueltas, las especies que son libres o que presentan asociaciones lábiles son las que
representan la mayor biodisponibilidad metálica de un ecosistema acuático.

En el apartado anterior se ha evaluado la distribución metálica correspondiente con las

fracciones particulada y disuelta. En este apartado, se describirá la distribución metálica en
la fase disuelta, distinguiendo entre la fracción lábil y la poco o no lábil.

En la Figura 4.34 se han representado los resultados de la especiación de la fase

disuelta, expresados tanto en g/L como en tanto por ciento del total correspondiente.

En este estudio, se observó que la cantidad de Ni lábil varió en función del muestreo,
siendo su distribución mayor en los muestreos de primavera. De hecho, en la Playa de
Getares (muestreo 1 y 3), Isla Verde (muestreo 4), Palmones (muestreo 2 y 4) y
Guadarranque (muestreos 1 y 2) la forma de Ni predominante es como Ni poco o no lábil.
Pero para todos los restantes puntos, fue el Ni lábil la fase predominante, que es la más
disponible.

311
Capítulo 4

Respecto a la especiación de Co, los datos se muestran en la Figura 4.35. Para este
metal se observó un valor puntual más elevado de metal disuelto en el punto de
Guadarranque en los muestreos de primavera, aunque el metal poco lábil es mayor que el
lábil.

Para los restantes puntos, y en general, el Co se encuentra en su fase poco o no lábil,

excepto en Palmones, en el muestreo 3, y Getares, Guadarranque y Puente Mayorga, en el
muestreo 4, siendo en estas ocasiones más disponibles. Para concluir, se puede decir que
de los metales cuya especiación fue estudiada, éste fue el que presentó menores niveles de
concentración y a su vez menor disponibilidad, y esta disponibilidad no fue mayor en las
estaciones de primavera como ocurrió para As o Ni, aunque se verá posteriormente que los
niveles guía para este metal son menores que para el resto, por lo que aunque tenga
menores concentraciones, estos valores superan los niveles usuales descritos en la
bibliografía de forma destacada.

Especiación de Cr
En relación a la especiación de Cr en agua hay que indicar que además de obtener las
fracciones de metal disuelto y particulado, se evaluaron las fracciones de Cr disuelto activo,
(dentro de la cual se diferenció entre Cr(VI) disuelto y Cr(III) disuelto activo) y Cr(III)
disuelto no activo (Figura 4.8). El estado de oxidación VI es el que presenta una mayor
toxicidad y el cromo disuelto activo es el más disponible. En la Figura 4.36 se representan
los niveles de Cr(VI) disuelto y Cr(III) disuelto, sin diferenciar entre activo y no activo,
expresados tanto en g/L como en tanto por ciento del contenido disuelto. En la Figura
4.37, se representan los niveles de Cr(III) disuelto activo y Cr(III) disuelto no activo,
también expresados en g/L y en tanto por ciento del contenido de Cr(III) disuelto.

De la Figura 4.36 se obtiene que gran parte de las muestras de agua tienen el cromo
disuelto en su estado de oxidación III, excepto durante el tercer muestreo donde los
porcentajes de Cr(VI) superan ligeramente los de Cr(III). Además, cabe destacar que en
aquellos puntos donde se incrementa la concentración de Cr disuelto, lo hace
incrementando el Cr(III).

Como puede verse en la Figura 4.37 el Cr(III) disuelto activo presenta mayores
concentraciones que el no activo la mayoría de las muestras, implicando así que
predominan los complejos inorgánicos de Cr(III), por lo que son bastante disponibles para
la biota acuática en la mayoría de los puntos de muestreo. Sin embargo, cuando se
incrementa la concentración de Cr(III) sube el porcentaje de cromo inactivo.

312
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

0,6

0,5

0,4
As (g/L)

0,3

0,2

0,1

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

80%

60%
As

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Fracción disuelta orgánica Fracción disuelta inorgánica

Figura 4.32. Especiación de As disuelto en aguas y porcentaje de distribución entre las

fracciones disueltas orgánica e inorgánica

313
Capítulo 4

0,6

0,5

0,4
As (g/L)

0,3

0,2

0,1

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

80%

60%
As

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Fracción particulada orgánica Fracción particulada inorgánica

Figura 4.33. Especiación de As particulado en aguas y porcentaje de distribución entre las

fracciones particuladas orgánica e inorgánica

314
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

0,4

0,3
Ni (g/L)

0,2

0,1

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

80%

60%
Ni

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Fracción poco/no lábil Fracción lábil

Figura 4.34. Especiación de Ni disuelto en aguas y porcentaje de distribución entre las

fracciones disueltas poco/no lábil y lábil

315
Capítulo 4

0,3

0,2
Co (g/L)

0,1

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

80%

60%
Co

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Fracción poco/no lábil Fracción lábil

Figura 4.35. Especiación de Co disuelto en aguas y porcentaje de distribución entre las

fracciones disueltas poco/no lábil y lábil

316
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

0,4

0,3
Cr (g/L)

0,2

0,1

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

80%

60%
Cr

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Cr(III) disuelto Cr(VI) disuelto

Figura 4.36. Especiación de Cr disuelto en aguas y su porcentaje de distribución entre

Cr(III) y Cr(VI) disuelto

317
Capítulo 4

0,4

0,3
Cr (g/L)

0,2

0,1

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

80%

60%
Cr

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Cr(III) disuelto activo Cr(III) disuelto no activo

Figura 4.37. Especiación de Cr disuelto en aguas y su porcentaje de distribución entre

Cr(III) disuelto activo y Cr(III) disuelto no activo

318
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Con objeto de estudiar estadísticamente la posible influencia espacial y estacional, en

los resultados obtenidos en el estudio de la especiación de metal disuelto, se han aplicado
los correspondientes análisis de comparación de las varianzas. Estos análisis desvelaron
que no existe diferencia significativa para ninguna fracción de los metales estudiados entre
muestreos, puntos de muestreo o estaciones.

Por otra parte, se estudió la posible relación existente entre todas las fases de la
especiación, incluyendo las fracciones disuelta y particulada. Se observó que existía
correlación positiva significativa entre la fracción de As disuelto con la de Cr(III) disuelto no
activo, y entre la fracción de Ni disuelto lábil con la fracción disuelta de Co, aunque el
coeficiente de correlación fue, en ambos casos, menor de 0,7. Por último, se observaron
correlaciones negativas entre la fracción de As particulado inorgánico con la fracción de
Cr(III) disuelto activo, entre la fracción de Ni disuelto lábil con la de Cr(III) disuelto no
activo, entre la fracción de Cr(VI) disuelto con la de Cr(III) disuelto activo, y entre la
fracción de Cr(VI) disuelto con la de Cr(III) disuelto no activo, aunque igualmente los
coeficientes de correlación fueron menores de 0,7 en valor absoluto.

4.9.2. Contenido metálico en sedimentos

Los sedimentos son una parte esencial de los ecosistemas acuáticos y juegan un papel
importante en la distribución de los contaminantes en el medio. El estudio de la calidad de
los sedimentos proporciona información sobre la salud del ecosistema. Así, actividades
antropogénicas en áreas costeras, como la Bahía de Algeciras, implican frecuentemente
una entrada de contaminantes al medio, provocando la disminución de la calidad de los
sedimentos. Los sedimentos actúan como sumidero de contaminantes, de forma que
pueden llegar a afectar a las comunidades biológicas [Tolun y col., 2001].

Los sedimentos acumulan mayores cantidades de metales pesados que el agua,

causando serios problemas debido a su toxicidad y bioacumulación [Morillo y col., 2007;
Larner y col., 2008] y reflejando mejor la calidad del ecosistema. El comportamiento de los
metales en los sedimentos, al igual que en las aguas, depende de su forma química, que a
su vez afecta a su movilidad, biodisponibilidad y toxicidad. Por tanto la determinación del
contenido total metálico no es un indicador particularmente útil de la calidad de los
sedimentos. Por ejemplo, algunos metales se encuentran en formas químicas que no
pueden ser asimilados por la biota, y por tanto no conllevan ningún riesgo para los
organismos acuáticos. Así, la cuantificación de las diferentes especies químicas en las que
se encuentran los metales proporciona un mejor indicador de calidad del medio.

319
Capítulo 4

4.9.2.1. Concentración total en sedimentos

Los niveles de concentración totales de los metales en sedimentos en la Bahía de
Algeciras se muestran en la Figura 4.38. Los valores de las concentraciones, se encuentran
dentro de los intervalos siguientes: As: 5,0 – 24,3 mg/kg; Ni: 27,2 – 198,1 mg/kg; Co: 7,1
– 30,1 mg/kg y Cr: 44,7 – 394,7 mg/kg. El contenido medio es: As: 10,6 mg/kg; Ni: 83,7
mg/kg; Co: 13,8 mg/kg y Cr: 175,4 mg/kg. A partir de estos datos, se pueden ordenar los
metales de mayor a menor contenido medio en la bahía: [Cr] > [Ni] > [Co] > [As].

25

20
As (mg/kg)

15

10

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

200

160
Ni (mg/kg)

120

80

40

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4
Figura 4.38. Concentración total de As y Ni en sedimentos en las estaciones de la Bahía
de Algeciras para cada campaña de muestreo
320
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

35

30

25
Co (mg/kg)

20

15

10

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

400
350
300
Cr (mg/kg)

250
200
150
100
50
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.38 (cont.). Concentración total de Co y Cr en sedimentos en las estaciones de la

Bahía de Algeciras para cada campaña de muestreo

321
Capítulo 4

Con respecto a la Figura 4.38 se puede observar que, en la Bahía de Algeciras,

destacan en general que los valores de concentración para Ni y Cr han sido superiores en
la estación situada en Palmones, donde está ubicada la empresa Acerinox, ya que son
metales ampliamente utilizados en industrias de aceros inoxidables.

En el caso del As, la estación que presentó mayor nivel de concentración en

sedimentos fue Isla Verde. Comparando estos datos con los encontrados para las aguas, se
vio cómo en este punto se obtuvieron valores considerables de Kd, pudiendo verse
favorecida la transferencia del metal de la columna de agua al sedimento, debido a su
afinidad para ser transportados con la fase sólida.

Para los restantes metales, esta relación entre Kd y los niveles en sedimentos no fue
tan evidente. Así, para Cr los mayores valores de Kd se detectaron fundamentalmente en
Puente Mayorga, mientras que la acumulación en los sedimentos destacó en Palmones o
Guadarranque, probablemente por su cercanía a la empresa Acerinox y a la refinería, y
como consecuencia de aportes que rápidamente llegan al sedimento y no dependen de
procesos de intercambio con la columna de agua.

Respecto a la variación de los niveles en los diversos puntos muestreados, se puede

observar que en los 4 metales se mantiene la misma tendencia entre puntos del contenido
metálico total en los cuatro muestreos. Es decir, la comparación entre los puntos deja el
mismo resultado entre muestreos, variando levemente el valor de concentración, con pocas
excepciones, como la concentración de Ni en Puente Mayorga en el muestreo 2 y 4 que no
desciende en comparación a los niveles de Guadarranque como ocurre en los muestreos 1
y 3. También existe alguna pequeña variación en el punto con mayor concentración de Co,
oscilando entre Palmones y Guadarranque, según el muestreo, ocurriendo también para Cr.

De la misma manera que para las aguas, también se estudiaron las posibles influencias
espaciales y estacionales que podían presentar los metales en los sedimentos. Así,
aplicando los tests estadísticos correspondientes se observó que no existían diferencias
significativas entre muestreos ni estaciones para ningún metal. Sin embargo, sí se
encontraron diferencias significativas entre los puntos 1 y 3 para el Ni (p=0,008), Co
(p=0,019) y Cr (p=0,003), y entre los puntos 1 y 4 para el Co (p=0,023). De hecho, el
punto 1 de Getares para estos metales es el que menos concentración presenta, mientras
que los puntos 3 (Palmones) y 4 (Guadarranque) son los que tienen mayor concentración.

Las correlaciones de Pearson más significativas se encontraron entre los metales Ni y

Cr, y Ni y Co, de forma positiva y con coeficientes de correlación muy elevados de 0,918
(p=0,000) y 0,713 (p=0,000). Igualmente, se estudió si existía relación entre el contenido
metálico total en sedimentos y los parámetros físico-químicos, encontrándose que ninguno
de los metales estaba relacionado con estos parámetros. Esto indicó que su

322
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

comportamiento en la bahía no se veía influenciado por procesos de este tipo, siendo más
bien la influencia antropogénica la que definía el comportamiento metálico.

Comparando los valores observados en los sedimentos de la Bahía de Algeciras con los
encontrados en otros ecosistemas acuáticos, se puede decir que:

- Los valores de concentración de As encontrados en los sedimentos de la Bahía de

Algeciras son similares a las concentraciones observadas en la Bahía de Cádiz, donde los
valores variaban en el rango 6,77-14,48 mg/kg. Sin embargo, están muy por debajo de los
niveles encontrados en la Ría de Huelva, en donde el As se halla en el intervalo 85,1-615,4
mg/kg [Vicente Martorell, 2010].

- Los valores de Ni y Cr están por encima de los encontrados en otros ecosistemas,

como en la Bahía de Bohai en China, en la que los intervalos variaban entre 23,4 y 52,7
mg/kg para el Ni y 60,1-224,5 mg/kg para el Cr [Gao y Chen, 2012], o la Bahía de Cádiz,
en donde los intervalos fueron 2,2-39,3 mg/kg para el Ni, y 8,14-42 mg/kg para el Cr
[Morillo y col., 2007]. Estos últimos autores también estudiaron las concentraciones de Ni y
Cr en sedimentos de Algeciras, obteniendo valores de 16-100 mg/kg para Ni y 20-148
mg/kg para el Cr [Morillo y col., 2007], algo menores que los encontrados en este estudio.
Además, los valores de Ni en sedimentos de la costa de Galicia fueron de 1,04-16,2 mg/kg
[Morales-Caselles y col., 2007], también muy por debajo a los encontrados en la Bahía de
Algeciras en este estudio.

- Los valores de Co también están por encima de los observados en la costa de Galicia
(que estuvo afectada por un vertido puntual de petróleo en 2002 debido al accidente del
buque Prestige), en donde los valores de Co en sedimentos se encontraban en la mayoría
de los puntos de muestreo por debajo del límite de detección y con un máximo de 2 mg/kg
[Morales-Caselles y col., 2007].

4.9.2.2. Especiación metálica en sedimentos

Los procesos de extracción secuencial han sido desarrollados para evaluar las
fracciones metálicas presentes en los sedimentos. Aunque requieren bastante tiempo,
proporcionan información detallada sobre el origen, disponibilidad físico-química y
biológica, movilización y transporte de los metales traza. Como se ha indicado
anteriormente, el esquema de extracción secuencial metálica de sedimentos, propuesto por
el Programa de Medición y Ensayo de la Comisión Europea (BCR), y aplicado en el presente
estudio para los metales As, Ni, Co y Cr, separa las especies metálicas en tres fases: la fase
intercambiable (metales solubles en agua y ácidos débiles, y asociados a carbonatos), la
fase reducible (metales asociados a óxidos de hierro y manganeso) y la fase oxidable
(metales asociados a la materia orgánica y sulfhídrica), dejando un residuo sólido con el
323
Capítulo 4

contenido inerte del sedimento. Las especies metálicas presentes en la primera fase son las
que constituyen la fracción más lábil y disponible en el sedimento, les sigue los metales
asociados a óxidos de hierro y manganeso, y los asociados a la materia orgánica y
sulfhídrica. Por último, las especies que aparecen en el residuo sólido son las menos
disponibles.

Los datos del estudio de la especiación se detallan en la Tabla A.9 del Anexo 4.2 y se
muestran en la Figura 4.39, donde se representan las concentraciones y los porcentajes de
cada fase que se encontraron con respecto al contenido total.

A partir de estos datos se pueden hacer una serie de observaciones que se recogen a
continuación:

En la Figura 4.39 se aprecia que el As se encontraba en la Bahía de Algeciras de forma

mayoritaria en el residuo sólido, siendo su contenido de As del 75-80% del total en casi
todos los casos, excepto Guadarranque en otoño de 2007 y Palmones, Guadarranque y
Puente Mayorga en la primavera de 2008, donde predominó la fase reducible, e incluso
metal intercambiable, aunque su concentración era muy baja.

En cuanto al Ni, la fase mayoritaria fue el residuo sólido que alcanzó entre el 80 y 90%
del contenido total. En relación a las otras fases de la especiación, hay bastantes
sedimentos con Ni en la fase oxidable, por lo que no existe ninguna tendencia a pasar a la
columna de agua siendo poco disponible para la biota acuática, aunque en las estaciones
de Palmones, Guadarranque y Puente Mayorga existe cierto porcentaje de metal
intercambiable.

El Co se distribuyó también en el residuo sólido, pero en menor porcentaje, siendo su

contenido del 60-70%, teniendo además un porcentaje de aproximadamente el 10% en la
mayoría de los puntos de Co en la fase oxidable. Además, en los puntos de Palmones y
Guadarranque, se detectó metal en la fase intercambiable de forma destacada, por lo que
en estas estaciones potencialmente puede tender el metal a pasar a la columna de agua,
siendo por tanto más disponible para la biota acuática. Por último, cabe destacar que en la
estación de Guadarranque el Co predominó en los extractos de las fases 1, 2 y 3,
destacando, por ello, del resto.

Respecto al Cr, se encontró en la Bahía de Algeciras de forma mayoritaria en el residuo

sólido, siendo su contenido del 90% del total en casi todos los casos. Dentro de las fases
de la extracción secuencial, el Cr aparecía principalmente asociado a la materia orgánica y
sulfhídrica.

324
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

40

30
As (mg/kg)

20

10

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

75%

50%
As

25%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Residuo Fase Oxidable Fase Reducible Fase Intercambiable

Figura 4.39. Concentración y porcentaje de distribución de As en cada fase del esquema

de extracción en sedimentos de la Bahía de Algeciras

325
Capítulo 4

175

150

125
Ni (mg/kg)

100

75

50

25

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

75%

50%
Ni

25%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Residuo Fase Oxidable Fase Reducible Fase Intercambiable

Figura 4.39 (cont.). Concentración y porcentaje de distribución de Ni en cada fase del

esquema de extracción en sedimentos de la Bahía de Algeciras

326
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

35

30

25
Co (mg/kg)

20

15

10

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

75%

50%
Co

25%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Residuo Fase Oxidable Fase Reducible Fase Intercambiable

Figura 4.39 (cont.). Concentración y porcentaje de distribución de Co en cada fase del

esquema de extracción en sedimentos de la Bahía de Algeciras

327
Capítulo 4

400

300
Cr (mg/kg)

200

100

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

100%

75%

50%
Cr

25%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Residuo Fase Oxidable Fase Reducible Fase Intercambiable

Figura 4.39 (cont.). Concentración y porcentaje de distribución de Cr en cada fase del

esquema de extracción en sedimentos de la Bahía de Algeciras

328
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

En general se puede decir que en la Bahía de Algeciras el Ni y el Cr son metales muy

poco biodisponibles en los sedimentos, estando asociados principalmente a la fase residual,
lo cual significa que se encuentran fuertemente incluidos en la estructura cristalina de los
sedimentos y es muy difícil que se removilicen a menos que se den condiciones muy
extremas. Otros autores también encontraron este tipo de comportamiento para el Ni y el
Cr en otros ecosistemas acuáticos [Sahuquillo y col., 2003; Morillo y col., 2007].

Si se comparan estos resultados con los obtenidos para la especiación de estos dos
metales en agua se observa que son los dos metales más disponible en las aguas ya que se
presenta mayoritariamente en la fracción disuelta, sin embargo en los sedimentos se
encuentra en la fase inerte lo que indica que en la bahía no se produce la removilización de
Ni y Cr desde los sedimentos a las aguas; su presencia en las mismas probablemente es
debida a aportes externos que la contaminan.

De acuerdo con los resultados obtenidos, la disponibilidad de los metales en los

sedimentos sigue el siguiente orden: Co > As > Ni > Cr, orden prácticamente inverso al
que presenta el contenido total de metal en el sedimento. Así, el Cr es el metal con mayor
concentración en el sedimento y el que se ha evaluado como menos disponible.

Con respecto a la especiación metálica en sedimentos también se realizaron tests

estadísticos para evaluar las variaciones espaciales y estacionales. Así, se realizaron los
estudios para todas las fracciones de la especiación, utilizando para ello los porcentajes de
distribución, evaluando previamente su normalidad y la homocedasticidad de las varianzas.
Con respecto a los muestreos, no hubo diferencias significativas para ninguna fracción,
excepto para la del As oxidable, con la que se obtuvo un valor de p<0,05 en el análisis de
la varianza de Kruskal-Wallis, pero no se observó diferencia significativa cuando se realizó
el test posterior de comparación múltiple para estudiar entre qué muestreos existía la
diferencia. Por tanto, no fueron concluyentes los resultados para esta fracción metálica.

Por otra parte, se observaron diferencias significativas entre los puntos de muestreo 1
y 4, y 2 y 4 para la fracción de As reducible, que fue significativamente mayor en el punto
4 con respecto a los puntos 1 y 2. Los puntos 2 y 4 también fueron estadísticamente
diferentes para la fracción de As residual, siendo el punto 2 el que presentaba mayor
porcentaje de esta fracción. Se observaron diferencias significativas entre el punto 2 y 3
para la fracción de Ni intercambiable, predominando ésta en el punto 3. Asimismo, también
se observaron diferencias significativas entre el punto 2 y 4 para las fracciones de Ni
reducible, oxidable y residual. Las fracciones de Ni reducibles y oxidables fueron mayores
en el punto 4, mientras que la residual fue mayor en el punto 2. Con respecto al Co, se
encontraron diferencias significativas entre los puntos 1 y 4, y 2 y 4 para las fracciones
intercambiable, reducible y residual. En este caso, el punto 4 fue el que presentaba una
mayor fracción de Co intercambiable y reducible, mientras que en los puntos 1 y 2
predominó la fracción residual de este metal. Para el Cr no se observaron diferencias
329
Capítulo 4

significativas entre puntos de muestreo. No existieron tampoco diferencias significativas

entre estaciones para ninguna fracción metálica en sedimentos.

Cuando se estudiaron las posibles correlaciones entre las fases de la especiación, y

aplicando el test de Spearman (las distribuciones fueron no paramétricas), se encontraron
correlaciones entre la mayoría de las fracciones metálicas. Las más significativas fueron las
siguientes: correlaciones positivas para As intercambiable con As reducible, As reducible
con Co intercambiable y con Co reducible, Ni reducible con Cr reducible, Ni residual con Co
residual y Co reducible con Cr reducible. Las correlaciones negativas fueron As
intercambiable con As residual, As reducible con As residual y con Co residual, As residual
con Co intercambiable, Ni reducible con Ni residual, Ni oxidable con Ni residual y Co
residual, Ni residual con Co reducible y Cr reducible, Co intercambiable con Co residual, Co
reducible con Co residual y Cr oxidable con Cr residual. En resumen, las principales
correlaciones positivas se dieron entre las fases intercambiable y reducible, mientras que
las negativas se dieron entre estas fases y la fase residual del esquema de extracción
secuencial.

4.9.3. Contenido metálico en muestras biológicas

En general, la fauna de los ecosistemas acuáticos se organiza en tres grupos en
función de la zona donde viven [Artolachipi Acero y col., 2006]:

Pelágicas
Engloba a los animales capaces de nadar activamente a una velocidad que les permite ir
contra corriente, pudiendo efectuar desplazamientos verticales y horizontales e incluso
realizar largas migraciones. Es un nivel constituido por invertebrados marinos (cefalópodos
y de determinados crustáceos decápodos) y vertebrados marinos, mamíferos marinos y
peces adultos. La ictiofauna está formada principalmente por pequeños pelágicos
planctívoros (boquerones y sardinas) y sus predadores (lubina, caballa, atunes blanco y
rojo, pez espada, etc.).

Nectobentónicas o demersales
Son especies ligadas al fondo, ya sea porque encuentran sus posibles presas en el fondo o
bien porque encuentran en el bentos refugio ante posible depredadores. Son animales
generalmente carnívoros adaptados a desplazamientos rápidos y cortos. Su coloración
suele ser mixta entre la típica de las especies pelágicas y la críptica de los organismos
bentónicos. Fundamentalmente se distingue una ictiofauna de hábitos alimenticios
carnívoros, cuerpo fusiforme y con vejiga natatoria (merluza, hurta, voraz, pargo, etc.),
cefalópodos (choco, choquito, calamar, etc.) y crustáceos (gamba, langostino, bogavante,
etc.).
330
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Bentónicas
Son aquellas especies fuertemente ligadas al fondo, en el que se pasan gran parte de su
vida, siendo muy limitados los desplazamientos sobre él. Suelen ser especies territoriales,
solitarias y con características morfológicas adaptadas a este modo de vida (colores
crípticos para camuflarse en el fondo, estructuras especializadas a la sujeción al sustrato,
ausencia de vejiga natatoria y cuerpo aplanado en los peces, etc.). Destaca la presencia de
ictiofauna (rodaballo, lenguado, acedía, diversas especies de rayas, etc.), cefalópodos
(pulpo), crustáceos (galera, centollo, buey de mar, etc.) y gasterópodos (cañaílla, bígaro,
etc.) ya en los fondos cercanos a la costa.

En las distintas campañas de muestreo realizadas se capturaron, por las técnicas de

pesca anteriormente citadas, una amplia variedad de especies de peces. De entre las
capturas realizadas se decidió analizar para cada muestreo los peces que se indican a
continuación:

Muestreo 1:
Getares: 1 sargo, 3 lenguados
Isla Verde: captura sin éxito
Palmones: 1 rubio
Guadarranque: captura sin éxito
Puente Mayorga: 1 rubio, 1 lenguado

Muestreo 2:
Getares: 14 lenguados, 1 sargo
Isla Verde: 3 lenguados
Palmones: 1 lenguado, 12 rubios
Guadarranque: 1 lenguado
Puente Mayorga: 3 lenguados

Muestreo 3:
Getares: 6 lenguados, 1 rubio, 4 rascacios
Isla Verde: 4 rascacios
Palmones: 2 rubios, 4 lenguados
Guadarranque: 3 rubios, 2 rascacios
Puente Mayorga: 1 rubio, 2 lenguados

331
Capítulo 4

Muestreo 4:
Getares: 7 lenguados, 1 rascacio, 1 sargo
Isla Verde: 2 sargos
Palmones: captura sin éxito
Guadarranque: 1 rubio, 2 lenguados, 3 rascacios
Puente Mayorga: captura sin éxito

En algunos puntos no se obtuvieron ejemplares durante el muestreo a pesar del

interés de los pescadores en ello. No obstante, se obtuvieron muy diversos ejemplares para
realizar el estudio.

En el Anexo 3, en la Tabla A.4 se muestran el tamaño y peso de los peces capturados

en las distintas campañas de muestreo.

En este estudio se han seleccionado especies fuertemente ligadas al fondo

(bentónicas) como son los lenguados (Solea senegalensis) y especies cuyo hábitat está
ligeramente ligado al fondo marino como ocurre con las especies neobentónicas o
demersales, como rubios (Trigloporus lastoviza), rascacios (Scorpaena porcus) y sargos
(Diplodus sargas sargus).

- Lenguado: Solea senegalensis (Kaup, 1858)

El lenguado, Solea senegalensis, pertenece a la familia de los Soleidos, que comprende
unos treinta géneros (todos ellos dextrógiros) de cuerpo oval y alargado, con la cabeza
redonda y poco saliente, caracterizados por poseer un hocico redondo y carnoso, con una
pequeña boca arqueada y que se abre hacia abajo, sin dientes palatinos; la mandíbula
superior está más desarrollada que la inferior. Los ojos son muy pequeños y próximos y se
sitúan en el flanco derecho. Las escamas del tronco continúan por la cabeza.

La especie Solea senegalensis, perteneciente a la fauna bentónica, se caracteriza por

tener el tubo nasal anterior del lado ciego alejado del borde cefálico; la aleta pectoral
derecha redondeada y subsimétrica con una membrana interracial negra, el último radio de
las aletas dorsal y anal está unido al pedúnculo caudal por una membrana y la aleta dorsal
se inicia por delante del ojo dorsal. La coloración de fondo del lado ocular es variable,
adaptándose miméticamente al entorno predominante en el sustrato: normalmente varía
de un marrón verdoso oscuro a un marrón rojizo claro, casi anaranjado; presenta ocelos de
color azul de tamaño variable, dispuestos en filas longitudinales, a veces no muy claros,
que desaparecen rápidamente con la muerte del animal; manchas marrón oscuro
dispuestas en la línea media del cuerpo, de tamaño mediano, y otras más pequeñas en filas
transversales. Los ojos son de color verde metálico en vivo (Figura 4.40).

La distribución geográfica de la especie Solea senegalensis se limita a la costa oeste

africana y a la costa europea del Atlántico y Mediterráneo Occidental. En el Atlántico, se
332
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

extiende desde Senegal hasta la península Escandinava. En el Mediterráneo, se localiza en

el sur de España y al norte de Túnez [Arellano y col., 2005].

El lenguado es un teleósteo con sexos separados, sin caracteres sexuales externos

diferenciales, madurando por primera vez entre el tercer y cuarto año de vida (25-30 cm de
longitud). El índice de fecundidad de la hembra, en la naturaleza, alcanza el millón de
óvulos por kilogramos. La época de puesta se sitúa entre marzo y abril, pudiendo
extenderse hasta el mes de junio. Los huevos miden entre 0,9 y 1,5 mm, son pelágicos y la
temperatura del agua durante la época de puesta suele ser superior a 16ºC. La larva
pelágica y simétrica, durante los dos primeros años, mide en el momento de la eclosión
entre 2,5 y 3,1 mm. Las larvas en la naturaleza (10-15 m de profundidad) son arrastradas
por las corrientes hacia la costa, realizan la metamorfosis (se vuelven disimétricas) y
descienden hasta el fondo. Los lenguados cultivados miden 16,6 ± 2,1 cm y pesan 40,3 ±
2,5 g, un año después de la eclosión. Son animales de hábitos básicamente nocturnos,
predadores bentónicos (anélidos, moluscos) viven enterrados en la arena durante el día, y
su ritmo de crecimiento es regular teniendo unos 300 g y 30 cm al tercer año, pudiendo
alcanzar una talla máxima de 60 cm y 800 g de peso [Arellano y col., 2005].

Figura 4.40. Solea Senegalensis (Kaup, 1858)

- Rubio: Trigloporus lastoviza (Bonnaterre, 1788)

El rubio, Trigloporus lastoviza, es un pez de la familia de los Triglidae. Es de coloración

rojiza, con aletas pectorales también rojizas, su cara interna con manchas oscuras y la
externa violácea manchada de azul. La línea lateral está cubierta de ásperas escamas.
Armado de placas córneas espinosas. Esta especie alcanza unos 40 cm de longitud. Tiene
la cabeza maciza, fuerte, acorazada por placas óseas y fuertes espinas operculares y en el

333
Capítulo 4

rostro. Se valen de sus largos radios libres pectorales, que le sirven de órganos sensoriales,
para detectar las presas enterradas en el fondo (Figura 4.41). Son carnívoros.

Viven sobre el fondo, entre los 50 y los 200 metros de profundidad, en fondos
arenosos, limosos o fangosos. Durante los veranos se acercan a las costas.

Su área de distribución se centra en el Atlántico, costas africanas hasta Gran Bretaña y

Mediterráneo [Boudaya, 2000].

Figura 4.41. Trigloporus lastoviza (Bonnaterre, 1788)

- Rascacio: Scorpaena porcus (Linnaeus, 1758)

El rascacio, Scorpaena porcus, es un pez de la familia de los Escorpénidos. Es un pez

robusto, de hasta 25 cm de longitud y de color críptico, por lo tanto muy variable, aunque
suele ser pardo o negruzco con tintes rojizos y manchas claras. Las diferentes especies se
distinguen por los apéndices que presentan en la cabeza, sus pliegues dérmicos y por su
tamaño. Su boca es muy amplia y sobrepasa la vertical del ojo. Tienen la cabeza grande,
cubierta de espinas y apéndices dérmicos, con una fosa nucal. Los ojos son ovalados y
tienen apéndices supraorbitales tan largos como el diámetro del ojo. Tiene dos espinas
preorbitales y otras dos supraorbitales. También tienen un apéndice en las aberturas
nasales. La aleta caudal presenta 3 bandas transversales oscuras, y entre los radios 8 y 9
de la dorsal, presenta una mancha oscura (Figura 4.42).
334
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Son especies sedentarias, con glándulas venenosas, indolentes y dotadas de poca

movilidad. Vive sobre fondos preferentemente rocosos o coralinos, en los que permanecen
estáticos y mimetizados para capturar a sus presas.

Su distribución geográfica se limita a las costas marroquíes, el Mar Mediterráneo y

desde las Islas Británicas a las Azores [Linnaeus, 1758; Valledor de Lozoya, 1994].

Figura 4.42. Scorpaena porcus (Linnaeus, 1758)

- Sargo: Diplodus sargus sargus (Linnaeus, 1758)

El sargo común, Diplodus sargas sargus, es un pez de la familia de los Espáridos, muy
común en el Mar Mediterráneo. El nombre del género viene del griego diplos y odous,
palabras que significa doble y diente, en alusión a que tienen dos tipos de dientes: incisivos
y molares.

El sargo tiene el cuerpo comprimido lateralmente y ovalado. Alcanza una longitud

media de 25 cm, con un máximo de 40 cm. Su color es gris, claro u oscuro según sus
necesidades de camuflaje, con reflejos plateados. Los jóvenes tienen bandas oscuras
verticales en costados, que se van difuminando con la edad y llegan a desaparecer en los
ejemplares grandes, la última de ellas en el mismo pedúnculo de la cola es la más gruesa y
oscura, ésta no desaparece. Tiene una docena de espinas en la aleta dorsal y tres espinas
en la anal. La aleta caudal tiene una orla negra. La boca es más larga que el diámetro del

335
Capítulo 4

ojo. Los dientes incisivos son planos y afilados mientras que los molares posteriores trituran
(Figura 4.43).

Se distribuyen por toda la costa este del océano Atlántico hasta Sudáfrica, así como
por todo el mar Mediterráneo y el mar Negro.

De jóvenes viven en bancos numerosos de pequeños sargos muy cerca de la orilla,

frecuentes en puertos, arrecifes y junto a las rocas de rompiente, así como en prados de
Posidonia, a veces penetran en aguas salobres. Los adultos son solitarios y viven en el mar
entre los 0 y los 50 m de profundidad. Frecuentan la zona del rompeolas, sobre todo de
madrugada.

Al igual que otros muchos espáridos, los sargos son hermafroditas. Se alimenta de
moluscos y otros pequeños invertebrados bentónicos que desentierra del sedimento.
Tritura las conchas de los moluscos con sus fuertes molares [Riede, 2004].

Figura 4.43. Diplodus sargus sargus (Linnaeus, 1758)

Los resultados obtenidos en el análisis de los metales estudiados para cada uno de los
tejidos y en todos los puntos de muestreo se recogen en la Tabla 4.23, expresados como
media en mg/kg de peso seco. Los valores completos se encuentran detallados en la Tabla
A.10 del Anexo 4.3.

336
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Tabla 4.23. Intervalos y valores medios de concentración de los metales estudiados en

muestras biológicas para cada estación de muestreo (mg/kg de peso seco)
Estación de Intervalos y valores medios (mg/kg)
Tejido
Muestreo As Ni Co Cr
Hígado (4,32-225,33) (0,02-13,85) (0,07-6,35) (<LD-16,65)
(n=32) 33,09±45,96 0,62±2,42 0,66±1,18 0,59±2,93
Playa de Branquias (0,31-21,53) (<LD-1,84) (0,02-1,84) (<LD-2,62)
Getares (n=40) 5,66±3,86 0,52±0,47 0,25±0,28 0,74±0,65
Músculo (3,85-84,66) (<LD-2,34) (0,01-0,73) (<LD-0,69)
(n=40) 36,63±21,88 0,17±0,37 0,06±0,11 0,27±0,18
Hígado (3,37-168,58) (0,02-0,36) (0,11-4,04) (<LD-0,56)
(n=8) 34,73±56,02 0,19±0,12 1,12±1,26 0,09±0,19
Branquias (3,34-44,25) (0,07-1,48) (0,12-0,72) (0,01-2,40)
Isla verde
(n=9) 12,73±12,10 0,49±0,41 0,36±0,19 0,54±0,72
Músculo (7,57-165,93) (<LD-0,32) (0,02-0,26) (0,02-0,39)
(n=8) 47,66±52,81 0,10±0,13 0,08±0,08 0,22±0,12
Hígado (2,50-71,33) (0,02-0,69) (0,18-4,55) (<LD-0,75)
(n=18) 21,56±18,54 0,24±0,21 1,88±1,27 0,10±0,18
Branquias (<LD-37,63) (<LD-1,14) (<LD-0,96) (<LD-2,48)
Palmones
(n=18) 14,12±10,72 0,57±0,28 0,52±0,23 0,94±0,74
Músculo (<LD-130,32) (<LD-0,43) (<LD-3,48) (<LD-0,51)
(n=21) 27,75±29,41 0,05±0,10 0,25±0,74 0,14±0,12
Hígado (1,30-28,99) (0,03-1,43) (0,04-10,29) (<LD-0,11)
(n=11) 11,80±8,95 0,42±0,44 1,62±3,13 0,04±0,04
Branquias (2,38-20,02) (0,20-2,66) (0,13-1,66) (<LD-1,74)
Guadarranque
(n=12) 7,30±5,51 0,75±0,71 0,61±0,44 0,64±0,55
Músculo (8,34-58,56) (<LD-0,43) (0,02-0,21) (0,10-1,99)
(n=11) 27,28±16,32 0,14±0,18 0,12±0,06 0,48±0,53
Hígado (5,22-376,73) (<LD-0,54) (0,12-11,04) (0,05-0,23)
(n=7) 82,88±131,83 0,27±0,23 1,90±4,04 0,13±0,08
Puente Branquias (1,83-79,79) (0,06-0,73) (0,19-6,70) (0,09-1,28)
Mayorga (n=8) 20,10±25,24 0,35±0,25 1,21±2,25 0,56±0,43
Músculo (18,36-135,06) (<LD-0,56) (0,01-0,13) (0,11-0,61)
(n=7) 73,88±49,87 0,14±0,21 0,04±0,04 0,32±0,21

Hay que destacar que durante el muestreo 1 no se tomaron peces en las estaciones 2
y 4, ni de las estaciones 3 y 5 en el muestreo 4.

Como se observa en los datos de la Tabla 4.23, el As se acumuló en el hígado y los

músculos, seguido de las branquias en menor medida. Los niveles de As en los peces
fueron similares en todos las estaciones de muestreo excepto en Puente Mayorga, próximo
al sector industrial, donde se obtuvieron los mayores valores medios de As de este estudio
337
Capítulo 4

en el tejido de hígado durante el muestreo 1 en otoño de 2007 (376,73 mg/kg) y en

Getares durante el muestreo 2 en primavera de 2008 (225,33 mg/kg). También destacó el
punto de Isla Verde en el muestreo 2 en hígado (168,58 mg/kg) y en músculo (165,93
mg/kg). En general, el contenido de As en los peces fue mayor en primavera que en otoño.

A partir de los valores medios, se concluye que la mayor acumulación de Ni en los

peces ocurría principalmente en las branquias e hígado y en menor medida en músculo.
Con respecto a los puntos de muestreo no se observaron grandes diferencias entre puntos
aunque hay que indicar que los mayores niveles de Ni fueron hallados en hígado de peces
capturados en Getares durante el muestreo 2 (13,85 mg/kg), así como en branquias de
peces capturados en Guadarranque durante el muestreo 4 (2,66 mg/kg). En general, no se
observó influencia estacional en los niveles de Ni.

Respecto a los niveles de Co, se observó que el metal se acumulaba preferentemente

en los tejidos de hígado, seguido de las branquias y músculo. Los valores más elevados se
hallaron en las estaciones de muestreo de Guadarranque y Puente Mayorga (próximos los
dos al sector industrial de la comarca) en los tejidos de hígado (11,04 mg/kg en
Guadarranque y 10,29 mg/kg en Puente Mayorga) y branquias (6,70 mg/kg en Puente
Mayorga).

Atendiendo a los valores medios, se pueden ordenar los niveles de Cr encontrados en

los distintos tejidos de mayor a menor como sigue: branquias > músculo > hígado,
aunque hubo ocasiones en las que no se observó este orden. Así en la estación de Getares
para los peces capturados en el muestreo 2, se observó una mayor acumulación de este
metal en hígado (16,65 mg/kg), aunque este valor parece un dato anómalo. Además,
destacaron los valores obtenidos en las branquias, en Getares, Isla Verde y Palmones
(2,62; 2,4 y 2,48 mg/kg, respectivamente).

Para estudiar las diferentes especies de peces que fueron capturadas durante los
muestreos, se calcularon los valores medios de As, Ni, Co y Cr para cada una de ellas en
los tejidos de hígado, branquias y músculo (Tabla 4.24), y se han representado las cajas de
Box-Whisker correspondientes en las Figuras 4.44, 4.45, 4.46 y 4.47.

338
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Tabla 4.24. Intervalos y valores medios de concentración de los metales estudiados en

muestras biológicas para cada especie de pez
Intervalos y valores medios (mg/kg)
Pez Tejido
As Ni Co Cr
Hígado (1,30-376,73) (<LD-13,85) (0,04-2,72) (<LD-16,65)
(n=40) 46,13±71,39 0,56±2,16 0,39±0,51 0,52±2,62
Branquias (0,31-79,79) (<LD-2,66) (0,02-6,70) (0,04-2,62)
Lenguado
(n=46) 9,60±13,13 0,60±0,55 0,36±0,96 0,89±0,71
Músculo (<LD-165,93) (<LD-0,56) (<LD-0,09) (<LD-0,61)
(n=46) 53,46±34,16 0,11±0,14 0,03±0,02 0,26±0,18
Hígado (3,37-20,90) (0,02-0,79) (0,27-4,04) (<LD-0,06)
(n=11) 8,29±5,48 0,20±0,23 0,99±1,09 0,03±0,03
Branquias (2,38-8,89) (0,07-1,25) (0,12-0,72) (0,01-0,81)
Rascacio
(n=15) 4,20±2,14 0,42±0,29 0,38±0,17 0,33±0,26
Músculo (3,85-42,03) (<LD-0,43) (0,03-0,26) (0,03-0,69)
(n=15) 15,34±10,90 0,10±0,14 0,11±0,07 0,29±0,17
Hígado (2,50-71,33) (0,02-1,43) (0,14-11,04) (0,06-0,23)
(n=20) 20,81±17,65 0,30±0,31 3,22±2,97 0,06±0,07
Branquias (<LD-37,63) (<LD-1,14) (<LD-1,66) (<LD-2,48)
Rubio
(n=21) 14,03±9,46 0,49±0,31 0,69±0,38 0,69±0,65
Músculo (4,68-82,57) (<LD-0,43) (0,06-3,48) (0,04-1,99)
(n=21) 22,10±16,89 0,06±0,11 0,27±0,74 0,28±0,43
Hígado (8,58-23,25) (0,05-0,71) (0,11-1,97) (<LD-0,10)
(n=5) 16,46±6,21 0,32±0,25 0,82±0,69 0,06±0,04
Branquias (4,27-13,25) (0,24-1,34) (0,12-1,84) (0,04-0,85)
Sargo
(n=5) 8,89±3,70 0,60±0,45 0,58±0,71 0,54±0,19
Músculo (4,77-29,92) (<LD-2,34) (0,01-0,73) (<LD-0,48)
(n=5) 18,64±12,49 0,65±0,95 0,18±0,31 0,25±0,17

Mediana 25%-75% Min-Max

400 0
350 0
300 0
250 0
200 0
150 0
100 0
50 0
0 0
S L RU RA S L RU RA S L RU RA

Hígado Branquias Músculo

Figura 4.44. Caja de Box-Whisker de As (mg/kg) en sargos (S), lenguados (L), rubios
(Ru) y rascacios (Ra) de la Bahía de Algeciras, para hígado, branquias y músculo
339
Capítulo 4

Mediana 25%-75% Min-Max

16
14
12
10
8
6
4
2
0
S L RU RA S L RU RA S L RU RA

Hígado Branquias Músculo

Figura 4.45. Caja de Box-Whisker de Ni (mg/kg) en sargos (S), lenguados (L), rubios (Ru)
y rascacios (Ra) de la Bahía de Algeciras, para hígado, branquias y músculo

Mediana 25%-75% Min-Max

12

10

S L RU RA S L RU RA S L RU RA

Hígado Branquias Músculo

Figura 4.46. Caja de Box-Whisker de Co (mg/kg) en sargos (S), lenguados (L), rubios
(Ru) y rascacios (Ra) de la Bahía de Algeciras, para hígado, branquias y músculo

Mediana 25%-75% Min-Max

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
S L RU RA S L RU RA S L RU RA

Hígado Branquias Músculo

Figura 4.47. Caja de Box-Whisker de Cr (mg/kg) en sargos (S), lenguados (L), rubios (Ru)
y rascacios (Ra) de la Bahía de Algeciras, para hígado, branquias y músculo

340
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Se observó que el As se acumulaba mayoritariamente en hígados y músculos de las 4

especies, encontrándose la mayor concentración de este metal en lenguados. En cuanto al
Ni, presentó una tendencia a acumularse en hígados y branquias de lenguados, rascacios y
rubios, mientras que en sargos los mayores niveles se encontraron en branquias y músculo.
Las especies que presentaron una mayor concentración de Ni fueron el lenguado y el
sargo. El Co por su parte se acumulaba preferentemente en hígados y branquias de todas
las especies, destacando la alta concentración que se encontró en el hígado de los rubios.
Por último, el Cr se acumulaba en hígados y branquias de los lenguados, y en branquias y
músculos de rascacios, rubios y sargos. La especie que presentó una mayor concentración
de Cr fue el lenguado. En general puede afirmarse que el lenguado en la Bahía de Algeciras
se vio más afectado por la contaminación metálica de As, Ni y Cr, mientras que el Co
afectaba más al rubio. Según los datos obtenidos, se pueden ordenar lo metales según la
concentración encontrada en los peces en el siguiente orden: As >> Co > Ni ≥ Cr. Este
orden fue inverso al encontrado para el contenido de metal total en el sedimento, pero se
relaciona directamente con los niveles de metales más disponibles en este compartimento.

A partir de los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente las diferencias entre

los distintos tejidos estudiados, encontrándose que todos fueron diferentes de forma
significativa entre sí para los 4 metales, a excepción de las branquias e hígado en el caso
del Co, donde no se encontró diferencia alguna. Además, también se estudió si existían
diferencias significativas en la acumulación metálica entre las especies, hallándose
diferencias entre lenguados y rascacios, y rascacios y rubios para el As, y entre lenguados y
rascacios, y lenguados y rubios para el Co. Estos datos estadísticos corroboraron los
resultados presentados en la Tabla 4.24, en donde se observaron para el As mayores
concentraciones medias en lenguados y rubios, y menores concentraciones en rascacios.
Para el Co, los valores medios mayores se encontraron en los rubios, mientras que los más
bajos se hallaron en lenguados. Para el Ni y el Cr no se encontraron diferencias
significativas entre las especies.

Los siguientes estudios estadísticos que se llevaron a cabo se realizaron de forma

conjunta para aquellos metales en los que no se encontraron diferencias entre las especies
(Ni y Cr); sin embargo aquellos metales (As y Co) que presentaron diferencias en su
acumulación entre las especies requirieron de estudios individualizados para cada especie,
ya que no se podría asumir que las conclusiones de los estudios realizados de manera
conjunta fueran igualmente válidos para las dos especies.

Asi, se evaluó la posible influencia espacial y temporal de los metales Ni y Cr en las 4

especies de peces, diferenciando entre los tres tejidos. Los resultados obtenidos se pueden
resumir como sigue:

- Comparación entre muestreos: para Ni existieron diferencias significativas entre los

muestreos 3 y 4 en el caso de las branquias; para músculo el muestreo 4 fue diferente
341
Capítulo 4

al 2 y al 3. En el caso de hígados no se encontraron diferencias significativas entre

muestreos. Para el Cr se encontró que el muestreo 3 era diferente a todos los
restantes en el caso de las branquias; para el hígado se encontraron diferencias entre
los muestreos 1 y 3, y para músculo el muestreo 2 era diferente al 1 y al 4.

- Comparación entre puntos de muestreo: no existieron diferencias entre puntos de

muestreo para el Ni con respecto a la acumulación en branquias, hígado y músculo, ni
tampoco para el Cr con respecto a branquias e hígado. Sin embargo, se observó que el
punto de muestreo 3 era diferente a los puntos 1 y 4 con respecto a la acumulación en
músculo, siendo el punto 3 el que presentaba una menor concentración de Cr en
músculo, y el punto 4 el que presentaba una mayor concentración de este metal en
dicho tejido.

Para el As y el Co se evaluó la posible influencia espacial y temporal diferenciando

entre los tejidos estudiados y las especies de peces que presentaban diferencias
significativas entre sí. Así, no se detectaron diferencias entre puntos de muestreo para los
tejidos de lenguados, rascacios o rubios tanto para As como Co. Sí se dieron algunas
diferencias entre muestreos, aunque solo para tejidos de lenguados, tales como:

- Para As se encontró que el muestreo 2 era diferente al 3 y 4 en el caso de las

branquias; para hígado se encontraron diferencias significativas entre el muestreo 2 y
el 4; en el caso de músculo, se encontró diferencia significativa entre los muestreos 2 y
3. Para el Co se encontró que el muestreo 4 era diferente al 2 y al 3 en el caso de las
branquias; para el hígado se encontraron diferencias entre los muestreos 3 y 4; y para
músculo el muestreo 1 fue diferente al 4.

Se compararon los niveles medios encontrados en peces de la Bahía de Algeciras con

otros ecosistemas, encontrando la siguiente información:

- Existen estudios de niveles metálicos en tejidos de lenguados que se realizaron en un

ecosistema próximo al de la Bahía de Algeciras, como es la Bahía de Cádiz. En esta bahía
se encontraron valores medios de As en hígado, branquias y músculo de 21,53; 24,88 y
34,33 mg/kg, respectivamente. También se estudiaron estos niveles en la Ría de Huelva
resultando ser de 14,56 mg/kg en hígado, 13,83 mg/kg en branquias y 10,61 mg/kg en
músculo [Vicente Martorell, 2010]. Tanto los valores medios en Cádiz como en Huelva
resultaron ser ligeramente más bajos que los encontrados en los lenguados de la Bahía de
Algeciras durante este estudio.

- Los valores de Ni en lenguados de la Bahía de Cádiz, para hígado, branquias y

músculo fueron 0,785±0,051 mg/kg, 0,785±0,039 mg/kg y 0,050±0,007 mg/kg,
respectivamente [Galindo y col., 2012]. Estos valores medios son similares a los
encontrados en nuestro estudio.

342
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

- Las concentraciones de Co encontradas en el hígado, branquias y músculo de

lenguados de la Bahía de Cádiz fueron 0,045±0,006 mg/kg, 0,096±0,002 mg/kg y
0,014±0,003 mg/kg, respectivamente [Galindo y col., 2012]. Estos valores encontrados
para hígado y branquias en lenguados de la Bahía de Cádiz son mucho menores a los
hallados en este estudio. Sin embargo, las concentraciones medias en músculo son
similares en ambos ecosistemas.

- Los valores de Cr en lenguados de la Bahía de Cádiz para hígado, branquias y

músculo fueron 0,545±0,118 mg/kg, 0,467±0,013 mg/kg y 0,0144±0,0001 mg/kg,
respectivamente [Galindo y col., 2012]. Comparando estos valores con los resultados en
este estudio se puede observar que las concentraciones medias para hígados son similares
en ambos ecosistemas, sin embargo las concentraciones encontradas en branquias y
músculo en la Bahía de Cádiz son menores que las encontradas en la Bahía de Algeciras en
este estudio.

- Por otra parte, se han estimado las concentraciones de As en hígados y músculo de

sargos de la Ría Formosa, en el sur de Portugal. Estas concentraciones oscilaban entre
12,24±0,81 mg/kg para hígado, y 12,19±1,48 mg/kg para músculo [Ferreira y col., 2008],
valores muy similares a los encontrados en este estudio para los sargos de la Bahía de
Algeciras.

4.10. Comparación del contenido metálico

En la sección anterior se ha estudiado la distribución metálica en las aguas y

sedimentos, así como su acumulación en los tejidos de 4 especies de peces. En esta
sección, con el objetivo de conocer el grado de contaminación que presenta el ecosistema
de la Bahía de Algeciras, se explican los estudios comparativos de los resultados obtenidos
que se han realizado en cada uno de los compartimentos medioambientales analizados. En
primer lugar, se han comparado entre sí las 5 estaciones de muestreo seleccionadas
mediante unos índices de contaminación que se detallarán a continuación. Y en segundo
lugar, se ha realizado la comparación de los resultados obtenidos para cada metal con
aquellos niveles de referencia o legales recogidos en la bibliografía.

4.10.1. Comparación entre los puntos de muestreo

Un índice de un ecosistema es un indicador que informa sobre las condiciones y/o
características del sistema de tal manera que la información que suministre sea
interpretada con facilidad. Para comparar el contenido metálico en los cinco puntos de

343
Capítulo 4

muestreo, en agua, sedimento y tejidos de peces, se ha calculado el índice de

contaminación metálica (MPI: metal pollution index), usando la siguiente ecuación [Usero y
col., 1996; Usero y col., 1997; Usero y col., 2005, Chaudhuri y col., 2007]:

MPI  Cf1  Cf2  ....Cfn 

1n

donde Cfn es la concentración del metal n en la muestra. Este índice ha sido ampliamente
utilizado en estudios de biomonitorizacion en ecosistemas acuáticos [Giusti, 1999], estudios
de contaminación en sedimentos [Roychoudhury y col., 2006; Das y Chakrapani, 2011;
Varol, 2011] así como en estudios atmosféricos y con vegetales [Sharma y col., 2008].

En las Figuras 4.48 y 4.49 se recogen los índices de contenido metálico en aguas, los
cuales han sido calculados utilizando los valores de As, Ni, Co y Cr total y disuelto para las
5 estaciones de muestreo. Cada término Cf representa la concentración metálica media
calculada para las 4 campañas de muestreo. Con estos índices se observa claramente que
los puntos de muestreo de Palmones y Guadarranque presentan un contenido metálico
mayor que el resto de las estaciones estudiadas. Esta conclusión era de esperar puesto que
estas dos estaciones se encuentran cercanas a la zona industrial de la Bahía de Algeciras.

El índice de contenido metálico en sedimentos se representa en la Figura 4.50. En este

caso se observa que en los sedimentos de las estaciones de Palmones, Guadarranque y
Puente Mayorga exista una mayor contaminación metálica.

0,5

0,4
MPI (g/L)

0,3

0,2

0,1

0,0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Aguas (Total)
Figura 4.48. Índice de contaminación metálica para el contenido total en agua en las
estaciones de muestreo estudiadas
344
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

0,3

0,2
MPI (g/L)

0,1

0,0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Aguas (Fase disuelta)

Figura 4.49. Índice de contaminación metálica para el contenido disuelto en agua en las
estaciones de muestreo estudiadas

50,0

40,0
MPI (mg/kg)

30,0

20,0

10,0

0,0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Sedimentos

Figura 4.50. Índice de contaminación metálica para sedimentos en las estaciones de

muestreo estudiadas
345
Capítulo 4

En las Figuras 4.51 a 4.54 se muestran los índices de contenido metálico para los
tejidos de peces, calculados éstos como valor medio para cada especie y como valor medio
para cada uno de los tejidos individuales. Los índices de contenido metálico medio para
cada especie son mayores en las estaciones de muestreo de Guadarranque y Puente
Mayorga, siendo el lenguado la especie que presenta una mayor contaminación en las
estaciones de Getares e Isla Verde, y el rubio, en Palmones, Guadarranque y Puente
Mayorga.

A partir de los MPI calculados para cada tejido se pueden ordenar éstos por orden de
acumulación como sigue branquias > hígado > músculo, para lenguados; branquias >
músculo ≥ hígado para rascacio y sargo; e hígado > branquias > músculo para rubios.

En general, se puede concluir que el hígado y las branquias son los tejidos diana, en
los que se produce de manera más significativa la acumulación de los metales
biodisponibles en el medio, y cuyo contenido permite diferenciar entre ecosistemas con
distinto grado de contaminación. Mientras que la bioacumulación en el músculo es menos
importante y por tanto es menos discriminante para evaluar diferencias de contaminación
entre ecosistemas.

2,0

1,5
MPI (mg/kg)

1,0

0,5

0,0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Especies de peces

Lenguado Rascacio Rubio Sargo

Figura 4.51. Índice de contaminación metálica media para lenguados, rascacios, rubios y
sargos en las estaciones de muestreo estudiadas

346
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

2,5

2,0
MPI (mg/kg)

1,5

1,0

0,5

0,0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Hígado
Lenguado Rascacio Rubio Sargo
Figura 4.52. Índice de contaminación metálica media para hígado de lenguados,
rascacios, rubios y sargos en las estaciones de muestreo estudiadas

2,5

2,0
MPI (mg/kg)

1,5

1,0

0,5

0,0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Branquias

Lenguado Rascacio Rubio Sargo

Figura 4.53. Índice de contaminación metálica media para branquias de lenguados,

rascacios, rubios y sargos en las estaciones de muestreo estudiadas
347
Capítulo 4

2,5

2,0
MPI (mg/kg)

1,5

1,0

0,5

0,0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Músculo

Lenguado Rascacio Rubio Sargo

Figura 4.54. Índice de contaminación metálica media para músculo de lenguados,

rascacios, rubios y sargos en las estaciones de muestreo estudiadas

A continuación, con objeto de estimar el impacto antropogénico sobre los sedimentos

de la Bahía de Algeciras y comparar el alcance de la contaminación metálica de los
sedimentos entre los distintos puntos de muestreo, se han calculado los siguientes
indicadores de contaminación, en los que se tiene en cuenta los niveles de fondo
ampliamente aceptados, como los valores medios de rocas sedimentarias continentales
(Tabla 4.25) o abundancia en la corteza terrestre [Turekian y Wedepohl, 1961;
Christophoridis y col., 2009; Wedepohl, 1995]:

Factor de enriquecimiento (EF: enrichment factor)

M x  Fe b
EF 
Mb  Fe x

donde Mx y Fex son las concentraciones de metal (mol/L) y Fe en la muestra y Mb y Feb son
los niveles de fondo del metal y de Fe en esquistos, respectivamente. El hierro o el
aluminio se utilizan como elementos de normalización para reducir las posibles variaciones
en los datos producidas por heterogeneidad en los sedimentos. Este elemento de

348
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

referencia debe presentar una variabilidad mínima de ocurrencia o concentraciones muy

altas en el ecosistema de estudio [Abraham y Parker, 2008; Christophoridis y col., 2009].
Por ello, se han evaluado los contenidos totales de hierro en los sedimentos y se han
aplicado estos valores en el cálculo del factor de enriquecimiento.

Factor de contaminación (CF: contamination factor)

El factor de contaminación es una herramienta muy útil para el seguimiento de la

contaminación durante un periodo de tiempo determinado [Turekian y Wedepohl, 1961;
Loska y col., 1997]. Se calcula de la siguiente manera:

Concentración de metal en la muestra

CF 
Nivel de fondo

Índice de geoacumulación (Igeo: geoaccumulation index)

El índice de geoacumulación se basa en datos geoquímicas y hace posible la

clasificación de las zonas según su grado de contaminación. Igeo se calcula con la siguiente
ecuación:

 Cn 
I geo  log 2  
 1,5  B 
 n 

donde Cn es la concentración medida del metal y Bn es el nivel de fondo de esquistos

continentales. El factor 1,5 incluye las posibles variaciones de los datos debido a efectos
litogénicos [Christophoridis y col., 2009; Abrahim y col., 2008; Loska y col., 1997;
Anagnostou y col. 1997]. Los criterios de estos indicadores de contaminación se explican
en la Tabla 4.26.

Tabla 4.25. Valores medios de roca sedimentaria continental (mg/kg) [Turekian y

Wedepohl, 1961]
Concentración en
Metal
esquistos (mg/kg)
As 13
Ni 68
Co 19
Cr 90
Fe 47000
349
Capítulo 4

Tabla 4.26. Criterio de indicadores de contaminación en sedimentos basados en EF, CF e

Igro
Estado de Estado de Estado de
EF CF Igeo
contaminación contaminación contaminación
Presencia de
>1 fuentes ≥6 Muy alto >5 Extremadamente alto
antropogénicas
Alto-extremada-
3≤CF<6 Considerable 4-5
mente alto
1≤CF<3 Moderado 3-4 Alto
Sin fuentes
<1 <1 Bajo 3-3 Moderado-alto
antropogénicas
1-2 Moderado
No contaminado-
0-1
moderado
<0 No contaminado

Los indicadores EF, CF e Igeo fueron obtenidos para cada metal en cada punto,
utilizando la concentración media calculada para los 4 muestreos. En las Tablas 4.27, 4.28
y 4.29 se muestran los valores de cada indicador para cada estación de muestreo y en la
Figura 4.55 se representan los datos gráficamente para una mayor claridad.

Los valores del indicador EF son todos mayores que 1 (excepto en el caso del As en la
estación de Palmones) indicando que existe influencia antropogénica en los sedimentos.
Los valores más altos de EF se encuentran para Ni y Cr en Guadarranque, Palmones y
Puente Mayorga, y para As en Isla Verde, indicando influencias industriales significativas
procedente de la empresa Acerinox y la refinería Cepsa en el caso de Cr y Ni, y una
influencia urbana y de tráfico marítimo en el caso del As. En el caso del Co, los valores de
EF son próximos a 1 para todas las estaciones de muestreo, indicando una ligera presencia
de fuentes antropogénicas.

Los valores de CF permiten clasificar los sedimentos de la siguiente forma:

a. Considerablemente contaminados (3≤CF<6): Cr en Palmones.

b. Moderadamente contaminados (1≤CF<3): As en Isla Verde, Ni en Palmones,

Guadarranque y Puente Mayorga, Co en Guadarranque y Cr en todos los puntos de
muestreo menos Playa de Getares.

c. Con baja contaminación (CF<1): el resto de los puntos de muestreo.

Los resultados de Igeo son menos restrictivos, caracterizando los sedimentos de la Bahía
de Algeciras en su mayoría como no contaminados, excepto para el Cr en Palmones, donde
existe un estado de contaminación moderado.
350
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Estos indicadores de contaminación muestran que los sedimentos de la Bahía de

Algeciras se encuentran todavía en un estado poco contaminado, excepto para los metales
Ni y Cr en las estaciones próximas a zonas industriales.

Tabla 4.27. Valores de los indicadores EF para cada metal en las 5 estaciones de
muestreo
Estación de
As Ni Co Cr
muestreo
Playa de
2,19 1,15 1,08 1,69
Getares
Isla Verde 3,13 1,65 1,34 2,94
Palmones 0,77 2,90 1,33 4,91
Guadarranque 1,19 3,18 2,22 4,94
Puente Mayorga 1,72 2,87 1,27 4,01

Tabla 4.28. Valores de los indicadores CF para cada metal en las 5 estaciones de
muestreo
Estación de
As Ni Co Cr
muestreo
Playa de
0,84 0,44 0,42 0,65
Getares
Isla Verde 1,26 0,67 0,54 1,18
Palmones 0,55 2,08 0,95 3,52
Guadarranque 0,59 1,58 1,10 2,45
Puente Mayorga 0,83 1,39 0,61 1,94

Tabla 4.29. Valores de los indicadores Igeo para cada metal en las 5 estaciones de
muestreo
Estación de
As Ni Co Cr
muestreo
Playa de
-0,83 -1,76 -1,84 -1,20
Getares
Isla Verde -0,25 -1,17 -1,47 -0,34
Palmones -1,45 0,47 -0,65 1,23
Guadarranque -1,35 0,07 -0,45 0,71
Puente Mayorga -0,85 -0,11 -1,29 0,37

351
Capítulo 4

Factor de Enriquecimiento (EF) 4

0
1 2 3 4 5
4
Factor de Contaminación (CF)

0
1 2 3 4 5
2
Índice de Geoacumulación (Igeo )

-1

-2
1 2 3 4 5

Estaciones de muestreo
As Ni Co Cr
Figura 4.55. Indicadores de contaminación EF, CF e Igeo para As, Ni, Co y Cr en las 5
estaciones de muestreo
352
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Una vez estudiados los niveles de As, Ni, Co y Cr en la columna de agua, en

sedimentos y en peces, se procedió a estudiar el enriquecimiento de dichos metales en la
biota a partir de sus cantidades presentes en las aguas.

Los estudios de bioacumulación de diferentes contaminantes pueden ayudar en la

identificación de la biodisponibilidad de compuestos químicos en ecosistemas marinos [van
Gestel y van Brummelen, 1996; Martín-Diaz y col., 2006]. Con el fin de estimar la
capacidad de las especies para bioacumular los metales del medio en el que viven, y por
tanto, la biodisponibilidad de éstos, se estudió el enriquecimiento de los metales en la biota
por medio del factor de concentración (CF: concentration factor) y el ratio de
enriquecimiento (ER: enhancement ratio), que no deben confundirse con los explicados
anteriormente.

El factor de concentración [Fostner, 1976] o bioconcentración [DeForest y col., 2007]

se define como la relación existente entre la concentración de un metal en un organismo y
su concentración en cualquier compartimento del ecosistema donde se encuentre, como
puede ser la fracción de metal total disuelto en agua de mar [Morel, 1983] o la fase
intercambiable en los sedimentos [Luoma y Bryan, 1978]. Este factor se utiliza
habitualmente para estimar la evolución de la contaminación a lo largo del tiempo y, tal y
como propusieron Conti y colaboradores [Conti y col., 2002] es un indicador muy útil para
comparar los niveles de contaminación entre sitios diferentes. Sin embargo, la comparación
de la contaminación metálica mediante CF entre puntos de distintos ecosistemas (inter-
comparación) está afectada por el diseño del muestreo, la variabilidad espacio-temporal y
las variables biológicas inherentes al organismo bajo estudio [Langston y Spence, 1995].
Como consecuencia, los estudios de bioacumulación demuestran que el vínculo entre CF y
la contaminación real en las aguas es pobre si los sitios que se comparan tienen diferentes
condiciones geoquímicas, hidrodinámicas y ambientales [Moriarty, 1999].

Por su parte, Muse y colaboradores demostraron que el factor (ratio) de

enriquecimiento ER, definido como la relación entre la concentración de metal en el
organismo y la concentración de metal disuelto lábil en agua, puede proporcionar un mejor
significado medioambiental y superar las limitaciones que presenta el CF en la evaluación
de la contaminación marina [Muse y col., 2006].

En este capítulo se han calculado ambos factores para cada metal, y se ha distinguido
entre las especies bentónicas (lenguado) y las demersales (rascacio, rubio y sargo). En el
caso del arsénico, el cálculo de ER se ha realizado utilizando los valores de concentración
de dicho metal en la fracción disuelta inorgánica, que es la más tóxica y la que presenta un
mayor riesgo para la biota. En el caso del Cr, los valores de concentración utilizados para
calcular ER fueron los de cromo disuelto activo, por ser la más biodisponible. Para Ni y Co
se utlizaron los valores de concentración de metal disuelto lábil. Los datos se detallan en la

353
Capítulo 4

Tabla A.11, del Anexo 5 y se muestran para mayor claridad en las Figuras 4.56, 4.57, 4.58
y 4.59.

450
400
350
CF y ER para As

300
250
200
150
100
50
0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Lenguados

120

100
CF y ER para As

80

60

40

20

0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Rascacios, Rubios y Sargos

CF Hígado CF Branquias CF Músculo

ER Hígado ER Branquias ER Músculo

Figura 4.56. Factores de concentración y enriquecimiento (mg/kg de tejido/g/L de agua)

para As en lenguados, rascacios, rubios y sargos en las 5 estaciones de muestreo
354
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

12

10
CF y ER para Ni

0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Lenguados

5
CF y ER para Ni

0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Rascacios, Rubios y Sargos
CF Hígado CF Branquias CF Músculo
ER Hígado ER Branquias ER Músculo

Figura 4.57. Factores de concentración y enriquecimiento (mg/kg de tejido/g/L de agua)

para Ni en lenguados, rascacios, rubios y sargos en las 5 estaciones de muestreo

355
Capítulo 4

250

200
CF y ER para Co

150

100

50

0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Lenguados

700

600

500
CF y ER para Co

400

300

200

100

0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Rascacios, Rubios y Sargos

CF Hígado CF Branquias CF Músculo

ER Hígado ER Branquias ER Músculo

Figura 4.58. Factores de concentración y enriquecimiento (mg/kg de tejido/g/L de agua)

para Co en lenguados, rascacios, rubios y sargos en las 5 estaciones de muestreo

356
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

7
CF y ER para Cr 6

0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Lenguados

4
CF y ER para Cr

0
1 2 3 4 5
Estaciones de muestreo
Rascacios, Rubios y Sargos

CF Hígado CF Branquias CF Músculo

ER Hígado ER Branquias ER Músculo

Figura 4.59. Factores de concentración y enriquecimiento (mg/kg de tejido/g/L de agua)

para Cr en lenguados, rascacios, rubios y sargos en las 5 estaciones de muestreo

357
Capítulo 4

Como primera observación, se deduce que ambos factores (CF y ER) presentan una
parecida tendencia entre ellos. Sin embargo, tal y como era de esperar, el ratio de
enriquecimiento es mayor puesto que se ha calculado con respecto a la fracción lábil de
metal en las aguas, que es menor que la fracción total disuelta utilizada en el cálculo del
factor de concentración.

A partir de los datos obtenidos para As, se puede concluir que se produce una mayor
bioacumulación en lenguados que en rascacios, rubios y sargos. Las 4 especies de peces
sufren una mayor concentración metálica en músculo y en hígado. La estación de muestreo
donde los lenguados presentan una mayor acumulación de As es en Isla Verde y Puente
Mayorga, puntos donde existe una mayor contaminación de As en aguas, peces y
sedimentos. Sin embargo, para rascacios, rubios y sargos, existe una mayor
bioacumulación en Palmones, Guadarranque y Puente Mayorga.

En el caso del Ni también se ha encontrado una mayor acumulación en lenguados que

en el resto de las especies. Las branquias son los tejidos donde se acumula más el Ni,
seguido del hígado. Los factores CF y ER son mayores en las estaciones de Isla Verde y
Guadarranque para lenguados, y Palmones, Guadarranque y Puente Mayorga para
rascacios, rubios y sargos.

Para el Co, exceptuando el ER en hígados de las especies demersales, los valores de

ambos factores son mayores en lenguados. Se observa claramente una mayor acumulación
en los peces de la estación de Isla Verde y Puente Mayorga.

Respecto al Cr, se observa que los valores de estos factores son mayores en
lenguados, al igual que para el resto de los metales. Se puede observar claramente que se
acumula principalmente en las branquias de lenguados, y en las branquias y músculos de
rascacios, rubios y sargos. La estación que presenta mayores CF y ER es la de Palmones
para hígado y branquias, y las de la Playa de Getares y Puente Mayorga para músculo.

El hecho de que en los lenguados se produzca una mayor acumulación de metal es

esperable dado que este pez es una especia bentónica, cuyo hábitat está fuertemente
ligada a los fondos marinos y los sedimentos, que, como se ha mencionado anteriormente,
se comportan como sumideros de especies metálicas.

358
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

4.10.2. Comparación con valores de referencia

4.10.2.1. Comparación con valores de referencia en las muestras de agua

A continuación se realiza una comparación de los niveles metálicos obtenidos en este
estudio con los valores de fondo, naturales y valores guías de concentración de metales en
agua de mar disponibles en la bibliografía, con el objetivo de valorar el grado de
contaminación de la Bahía de Cádiz (Tabla 4.30). La comparación no se realiza para la
especiación metálica en agua debido a la ausencia de legislación y niveles guías que hagan
referencia a estos valores, excepto para el caso del Cr, en donde se distingue entre Cr(III)
y Cr(VI).

Tabla 4.30. Valores de fondo, naturales y valores guía de concentración de metales para
agua de mar (µg/L)
Valores Criterio NOAA-
de fondo EPA de calidad Objetivos de Calidad de las aguas
Concentración
[Förstner de aguas [US (BOJA núm. 27 14/2/1997)
Metal natural
y EPA 2002]a
[Azcue, 1993]
Wittman, Clasificación de Valores
1983] CMCb CCCc
aguas litorales imperativos
2,1 1,3-2,5 69 36 Limitadas 50
As
Normales 25
Limitadas 50
Ni 0,2 0,02-0,7 74 8,2
Normales 25
Limitadas -
Co 0,04 0,02 - -
Normales -
10300e Limitadas 20d/6f
Cr 0,08d 0,09 d -0,55d 50f
1100f Normales 10d/4f
a
Referido a metal disuelto
b
CMC (criterio de máxima concentración): estimación de la máxima concentración de una sustancia en
el agua a la cual pueda ser expuesta una comunidad acuática “puntualmente” sin que se produzca
ningún efecto no recomendable.
c
CCC (criterio de concentración continua): estimación de la concentración máxima de una sustancia a
la cual puede ser expuesta una comunidad acuática indefinidamente sin que produzca ningún efecto
no recomendable.
d
Valores para Cr total
e
Valores para Cr(III)
f
Valores para Cr(VI)

En la Tabla 4.30 se recogen valores de fondo y concentraciones naturales de As, Ni, Co

y Cr que han sido descritos para agua de mar. Igualmente, se recogen los niveles de
referencia para evaluar el impacto sobre la vida acuática: las concentraciones CMC y CCC
propuestas por NOAA referidas a metales disueltos, los cuales se definen como:

359
Capítulo 4

 Concentraciones CMC (criterio de máxima concentración): se definen como la

estimación de la máxima concentración de una sustancia en el agua a la cual pueda ser
expuesta una comunidad acuática “puntualmente” sin que se produzca ningún efecto no
recomendable.
 Concentraciones CCC (criterio de concentración continua): se consideran aquellas que
corresponden a la estimación de la concentración máxima de una sustancia a la cual
puede ser expuesta una comunidad acuática indefinidamente sin que produzca ningún
efecto no recomendable.

Por último, también se han incluido los valores imperativos legislados por la Junta de
Andalucía (Orden de 14 de febrero de 1997, BOJA núm. 27, de 1997) para la calidad de las
aguas litorales andaluzas, referidos al contenido metálico total en agua de mar. En esta
orden se definen las aguas de la Bahía de Algeciras como aguas normales.

En las Figuras 4.60, 4.61, 4.62 y 4.63 se representan las concentraciones totales en
agua para cada uno de los metales en los 4 muestreos, comparándolos con estos valores
de referencia.

As (g/L)
CMC
69

36 CCC

25 Valor imperativo

2,5
Valores 2,1 Valor de fondo
naturales
1,3
1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.60. Comparación de las concentraciones totales de As (g/L) en aguas con los
niveles de referencia (CMC: criterio de máxima concentración; CCC: criterio de
concentración continua)

360
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Ni (g/L)
CMC
74

25 Valor imperativo

8,2 CCC

1,0

0,8
0,7
0,6
Valores 0,4
naturales
0,2 Valor de fondo
0,02
0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.61. Comparación de las concentraciones totales de Ni (g/L) en aguas con los
niveles de referencia (CMC: criterio de máxima concentración; CCC: criterio de
concentración continua)

Co (g/L)
1,0

0,8

0,6

0,4

0,2
Valor de fondo
0,0 Valor natural
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.62. Comparación de las concentraciones totales de Co (g/L) en aguas con los
niveles de referencia (CMC: criterio de máxima concentración; CCC: criterio de
concentración continua)

361
Capítulo 4

Cr (g/L)
10300 CMC Cr(III)

1100 CMC Cr(VI)

50 CCC Cr(VI)

10 Valor imperativo

1,0

0,8

0,6
0,55
0,4
Valores
naturales
0,2
0,09
Valor de fondo
0,0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.63. Comparación de las concentraciones totales de Cr (g/L) en aguas con los
niveles de referencia (CMC: criterio de máxima concentración; CCC: criterio de
concentración continua)

La comparación de los datos con los de la Tabla 4.30 refleja que las concentraciones
encontradas para As en aguas se encuentran dentro de los valores de fondo y naturales,
por lo que a pesar de su disponibilidad, estudiada en el apartado anterior, los niveles no
representan un carácter preocupante para este metal.

En relación a los valores de concentración de Cr y Ni, las concentraciones totales se

sitúan por encima de los valores de fondo; pero se mantienen dentro del rango de las
concentraciones naturales. No se sobrepasa en ningún muestreo los valores descritos de
CMC y CCC, ni los valores imperativos establecidos por la Junta de Andalucía para las aguas
clasificadas como normales.

Por último, para el caso de Co, la estación de Guadarranque en otoño de 2007 y 2008
presenta unos valores mucho más altos que las concentraciones naturales observadas en
agua de mar, aunque no se disponen de niveles guía para este metal por lo que no se
pueden evaluar los posibles efectos que tienen sobre la vida acuática.

362
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

En general, se puede concluir que si bien la disponibilidad de los metales estudiados en

estas aguas es alta, los niveles de metales disueltos no parecen indicar un riesgo para la
vida de este ecosistema. Al parecer, la renovación de estas aguas debido a las posibles
corrientes y la tendencia de estos metales a pasar al sedimento (sobre todo para As, Ni y
Cr) pueden contribuir a ello.

4.10.2.2. Comparación con valores de referencia en las muestras de

sedimentos
En el caso de las muestras de sedimentos, se han comparado los datos de contenido
total con los valores medios en sedimentos, utilizándose como referencia de éstos las
concentraciones medias calculadas por Turekian y Wedepohl para esquistos (rocas
sedimentarias) [Turekian y Wedepohl, 1961], valores que constituyen una de las
referencias más utilizadas puesto que fueron elegidas para definir los indicadores de
contaminación de sedimentos. También se han comparado con los niveles guía para la
protección de la vida acuática descritos en la bibliografía. La comparación no se realiza para
la especiación metálica debido a la ausencia de legislación y niveles guías que hagan
referencia a estos valores.

En la Tabla 4.31 se recogen valores medios y concentraciones naturales que han sido
descritos para sedimentos. Igualmente, se recogen los niveles guía para la protección de la
vida acuática (ISQG y PEL) y los niveles NS&T con efectos biológicos (ERL y ERM). Estos
datos están descritos para contenidos totales y no para las distintas fases de la
especiación.

Tabla 4.31. Valores medios y niveles guía de calidad para las concentraciones metálicas
en sedimentos (mg/kg)

Niveles guía para la

Valores medios de protección de la vida
Niveles NS&T con
roca sedimentaria acuática: sedimentos
efectos biológicos
Metal continental marinos [Canadian
[Buchman, 2008]
[Turekian y Sediment Quality
Wedepohl, 1961] Guidelines, 2002]

ISQG PEL ERL ERM

As 13 7,24 41,6 8,2 70
Ni 68 15,9 42,8 20,9 51,6
a
Co 19 - - NT NTa

Cr 90 52,3 160 81 370

a
NT: estos elementos no son tóxicos incluso a altas concentraciones
363
Capítulo 4

Las definiciones de estos niveles son las siguientes:

ISQG (Interim Sediment Quality Guidelines): Valor guía de calidad del sedimento.

PEL (Probable Effect Level): Nivel con efectos probables sobre la vida acuática.

ERL (Effects Range Low): Concentración con efectos biológicos bajos. Por debajo de este
nivel, el sedimento no se considera tóxico puesto que solo presentan efectos adversos
menos del 10% de los organismos estudiados.

ERM (Effects Range Medium): Concentración con efectos biológicos considerables. Por
encima de este nivel, el sedimento se considera tóxico, puesto que más del 75% de
organismos estudiados presentan efectos adversos.

En las Figuras 4.64, 4.65, 4.66 y 4.67 se representan las concentraciones totales en
sedimentos para cada uno de los metales en los 4 muestreos, comparándolos con estos
valores de referencia.

As (mg/kg)

70 ERM

41,6 PEL

25

20

15
Valores medios
10
ERL
ISQG
5

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.64. Comparación de las concentraciones totales de As (mg/kg) en sedimentos

con los niveles de referencia (ISQG: Valor guía de calidad del sedimento, PEL: Nivel con
efectos probables sobre la vida acuática, ERL: Concentración con efectos biológicos bajos,
ERM: Concentración con efectos biológicos considerables)

364
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

Ni (mg/kg)

250

200

150

100
Valores medios
ERM
50 PEL
ERL
0 ISQG
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.65. Comparación de las concentraciones totales de Ni (mg/kg) en sedimentos

con los niveles de referencia (ISQG: Valor guía de calidad del sedimento, PEL: Nivel con
efectos probables sobre la vida acuática, ERL: Concentración con efectos biológicos bajos,
ERM: Concentración con efectos biológicos considerables)

Co (mg/kg)
35
30
25
20 Valores medios
15
10
5
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.66. Comparación de las concentraciones totales de Co (mg/kg) en sedimentos

con los niveles de referencia (ISQG: Valor guía de calidad del sedimento, PEL: Nivel con
efectos probables sobre la vida acuática, ERL: Concentración con efectos biológicos bajos,
ERM: Concentración con efectos biológicos considerables)

365
Capítulo 4

Cr (mg/kg)

450
400
ERM
350
300
250
200
PEL
150
100 Valores medios
ERL
50 ISQG
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4

Figura 4.67. Comparación de las concentraciones totales de Cr (mg/kg) en sedimentos

con los niveles de referencia (ISQG: Valor guía de calidad del sedimento, PEL: Nivel con
efectos probables sobre la vida acuática, ERL: Concentración con efectos biológicos bajos,
ERM: Concentración con efectos biológicos considerables)

La comparación de los datos de Co con los datos de la Tabla 4.31 sitúa los niveles de
este metal en los sedimentos de la Bahía de Algeciras dentro de los valores medios y
naturales descritos, excepto en la estación de Palmones durante el muestreo 1 y la de
Guadarranque en los muestreos 1 y 3, donde la concentración obtenida de Co supera
ligeramente el valor medio de roca sedimentaria continental.

Sin embargo, los metales As, Ni y Cr superan algunos de los niveles guía de calidad de
sedimentos: en el caso del As, se superan los niveles ISQG y ERL en la mayoría de los
puntos de muestreo. En el caso del Ni, se superan los niveles de ISQG y ERL en las 5
estaciones durante todos los muestreos. Por su parte, los valores de ERM y PEL son
superados en las estaciones de Palmones, Guadarranque y Puente Mayorga en los cuatro
muestreos, así como en la estación de Isla Verde en el muestreo de otoño de 2007. El PEL
también se supera en Isla Verde en el muestreo de otoño de 2008. En el caso del Cr, se
superan los valores ISQG y ERL en todas las estaciones durante los 4 muestreos (excepto
en la estación de Playa de Getares). El nivel PEL es superado en las estaciones de
Palmones y Guadarranque en todos los muestreos, y en Puente Mayorga en los muestreos
de primavera 2008 y 2009. El nivel ERM se supera únicamente en la estación de Palmones
en el muestreo realizado en la primavera de 2008.

Por tanto, puede decirse que As, Ni y Cr pueden presentar problemas de toxicidad
debido a sus niveles en los sedimentos. En el caso del As, la disponibilidad era mayor en
Palmones, Guadarranque y Puente Mayorga, por lo que habrá que tener en cuenta ambos

366
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

resultados (toxicidad del contenido total y porcentaje de metal más disponible). Hay que
destacar que para Ni, en el punto de Palmones, donde se sobrepasaron los niveles
recomendados de toxicidad, el metal se encontraba de forma disponible, lo que lo hacía
potencialmente tóxico. Y por último, para el Cr, si bien supera los niveles de toxicidad
recomendados en cuanto a contenido total, hay que destacar que era poco disponible.

De todo ello se deduce que en los sedimentos analizados se pueden considerar como
tóxicos y disponibles los metales As, Cr y Ni, fundamentalmente en el punto de Palmones y,
en menor medida, en Guadarranque.

Por otro lado, Choueri y col. desarrollaron en 2009 nuevos niveles guías de calidad de
sedimentos específicos para el Golfo de Cádiz, que resultan más restrictivos que los
nacionales e incluso los internacionales [Choueri y col., 2009]. Estos niveles se calcularon
utilizando una serie de datos físico-químicos, toxicológicos y de estructuras de comunidades
bentónicas. Así, generaron datos para Cd, Co, Cu, Ni, Pb, V y Zn. En la Tabla 4.32 se
muestran los niveles de calidad para el Ni y el Co, que son dos de los metales estudiados
en esta tesis. Según estos autores, las concentraciones por debajo del nivel de calidad
inferior se consideran no perjudiciales para la biota acuática. Por ello, los sedimentos que
contengan niveles menores se consideran como no contaminados. Por otra parte, las
concentraciones por encima del nivel máximo son potencialmente tóxicas para el
ecosistema, considerándose los sedimentos como altamente contaminados. Por último, en
el rango de concentraciones situado entre los dos límites, no son predecibles respuestas
biológicas, por lo que los sedimentos que contengan estas cantidades se consideran
moderadamente contaminados.

Tabla 4.32. Niveles guía de calidad para metales en el Golfo de Cádiz (mg/kg de peso
seco) [Choueri y col., 2009]
Niveles guía de sedimentos
Metal
No contaminado Moderadamente contaminado Altamente contaminado
Ni ≤8,9 8,9-42,3 ≥42,3
Co ≤6,8 6,8-14,0 ≥14,0

Comparando los resultados encontrados en los sedimentos de la Bahía de Algeciras con

los citados niveles guías, se llega a las siguientes conclusiones: Los sedimentos en los
puntos de muestreo de Palmones, Guadarranque y Puente Mayorga durante todos los
muestreos, así como Isla Verde en los tres primeros, superan el valor de 42,3 mg/kg para
Ni, considerándose éstos como sedimentos altamente contaminados. Los sedimentos
recogidos en los restantes puntos de muestreo (Getares durante todos los muestreos e Isla
367
Capítulo 4

Verde durante el último muestreo) manifiestan un carácter moderadamente contaminado.

En cuanto al Co, los puntos de Palmones y Guadarranque en todos los muestreos, así como
Isla Verde en el primero, superan el valor de 14 mg/kg, por lo que se consideran
sedimentos altamente contaminados. Los puntos restantes (Getares y Puente Mayorga en
todos los muestreos e Isla Verde en los tres últimos) muestran sedimentos moderadamente
contaminados.

4.10.2.3. Comparación con valores de referencia en las muestras de peces

Según el Convenio sobre la protección del medio marino del Noroeste Atlántico
(OSPAR) [OSPAR, 2009] no se han podido calcular valores de fondo para metales en peces
dada la limitada cantidad de datos que se tienen. Tampoco se han encontrado en la
bibliografía niveles máximos permitidos o niveles guías en tejidos de peces, sino solamente
en la criatura completa. Así, por ejemplo, el máximo permitido de As, según estándares de
Singapur, Malasia y Australia es 1 mg/kg de peso húmedo [Muñoz y col., 2000]; mientras
que el máximo permitido de Cr, según la legislación brasileña es de 0,1 mg/kg de peso
húmedo [Tarley y col., 2001]. Por todo ello, no se pueden comparar los valores obtenidos
en nuestro estudio con niveles guía de calidad, aunque han sido previamente comparados
con resultados obtenidos en otros ecosistemas acuáticos.

4.11. Conclusiones

La contaminación metálica (As, Ni, Co y Cr) en las aguas, peces y sedimentos de la

Bahía de Algeciras ha sido evaluada en este trabajo. Las concentraciones de metal
encontradas en agua fueron mayores para el As, seguido del Cr, Ni y Co. En los
sedimentos, las concentraciones pueden ordenarse como: Cr > Ni > Co > As. Estas
concentraciones fueron comparadas con valores de fondo y niveles guía, encontrándose
que dichos valores no eran superados para ningún metal en el caso de las aguas; por el
contrario, sí lo fueron de manera severa para el Cr y el Ni en los sedimentos. Además, se
realizó el estudio de especiación tanto en aguas como en sedimentos, obteniendo
información de la biodisponibilidad de cada metal. De manera general, el Ni y el Cr fueron
los más disponibles en aguas, mientras que en sedimentos lo fueron el As y el Co.

El efecto de esta contaminación fue estudiado mediante la evaluación de la

acumulación de dichos metales en 4 especies de peces (lenguado, rascacio, rubio y sargo).
Para ello, se analizaron las concentraciones de As, Co, Ni y Cr en hígado, branquias y
músculo. El contenido metálico en peces puede ser ordenado de la siguiente manera:
As >> Co > Ni ≥ Cr. Se encontraron altas concentraciones de As y Co principalmente en
368
 Contaminación metálica en la Bahía de Algeciras

hígados, mientras que el Ni y Cr se acumularon más en branquias. Los lenguados se vieron

más afectados por la contaminación metálica que las demás especies.

Aunque las muestras de agua no superaban los límites permitidos, se ha demostrado

que la contaminación producida por actividades industriales, los desechos urbanos de la
ciudad de Algeciras y las actividades marítimas del Puerto de Algeciras están afectando a
los sedimentos y peces de este ecosistema. Según los índices de contaminación existe una
contaminación moderada de As, Ni y Cr en la Bahía de Algeciras, que tendrá que tenerse
en cuenta en un futuro para proponer medidas de remediación.

369
 Conclusiones

Conclusiones generales

Teniendo en cuenta todos los resultados que se han obtenido de la investigación

llevada a cabo en esta Tesis, se pueden enumerar como principales conclusiones las que se
muestran a continuación:

1. Se ha desarrollado una nueva metodología de preconcentración de trazas de Cu(II)

mediante extracción en fase sólida, utilizando discos SDB previamente modificados con el
ligando orgánico quelatante Saliciloilhidrazona del Piridoxal (PSH). Para el estudio de las
condiciones óptimas de este nuevo método se ha realizado una estrategia estadística en
dos etapas: optimización univariante y diseño de experimentos factorial fraccionario. El
nuevo método presenta un buen límite de detección y un amplio rango lineal de trabajo,
así como aplicabilidad a muestras de agua con matriz salina, ya sea de agua de mar o de
estuario.

2. Se ha evaluado la aplicabilidad de las técnicas AGNES (Redisolución en Ausencia de

Gradiente y en Equilibrio Nernstiano) y SSCP (Cronopotenciometría de Redisolución de
Barrido) para el estudio respectivo de la concentración de Pb(II) libre y su especiación,
en muestras de agua de mar sintética y real. Se ha encontrado que los resultados de
AGNES concuerdan perfectamente con los datos calculados a partir de MINTEQ. Además,
371
Conclusiones

se ha confirmado que la metodología de cálculo utilizada en SSCP para determinar la

concentración de metal libre es válida para muestras en ausencia de ligandos
heterogéneos. En este tipo de sistemas complejos, SSCP es capaz de establecer la
presencia de ligandos heterogéneos mientras que AGNES mide, sin errores, la
concentración de metal libre en el seno de la disolución. Por ello, el uso simultáneo de
ambos métodos tiene grandes ventajas debido a la información complementaria que
facilitan.

3. Por último, también se ha realizado un estudio integrado de impacto medioambiental en

la Bahía de Algeciras, zona afectada por una intensa actividad antropogénica. Para ello,
se han evaluado los niveles metálicos totales y su especiación química, en muestras de
agua, sedimento y peces tomados en 5 puntos de la bahía. Los estudios realizados
pueden resumirse de la siguiente manera:

- Se han establecido los niveles totales de metales (As, Cr, Ni y Co, metales muy
significativos de la industria siderúrgica y petroquímica) presentes en las aguas y los
sedimentos, así como su distribución en las distintas fracciones químicas
(especiación) en ambos compartimentos medioambientales. Los resultados muestran
que el As presenta un contenido total en agua mayor que el resto de los metales,
mientras que en los sedimentos, el metal mayoritario era el Cr. En algunas muestras
de sedimentos los niveles guía de calidad fueron superados. Con respecto a la
especiación, se ha encontrado que el Ni y el Cr son los más biodisponibles en las
aguas, mientras que en los sedimentos lo fueron el As y el Co.

- Asimismo, se han cuantificado los niveles de concentración de metales en tejidos de

hígado, músculo y branquias en peces de interés comercial para estudiar el efecto
que la contaminación química ejerce sobre estas especies. Los peces estudiados
fueron lenguados, rascacios, rubios y sargos. Se ha llegado a la conclusión de que
los peces presentan altas concentraciones de As, seguido de Co, que se acumulan
principalmente en hígados, mientras que el Ni y el Cr se acumularon más en
branquias. La especie más afectada por la contaminación metálica es el lenguado.

- Para una valoración global del estado de contaminación presente en la Bahía de

Algeciras, se han calculado índices de contaminación metálica, según los cuales, las
zonas de Palmones y Guadarranque son las que presentan mayor contaminación
metálica, tanto para aguas como para sedimentos y peces. Además, se han
calculado índices de contaminación específicos para sedimentos, los cuales muestran
que la bahía está, en general, moderadamente contaminada de As, Ni y Cr.

372
 Conclusiones

- Además, se han correlacionado los niveles metálicos en el medio biótico con el

medio abiótico, identificando las formas químicas más biodisponibles, y en
consecuencia con mayor potencial tóxico, para los metales estudiados.

Puede concluirse que la investigación llevada a cabo en esta Tesis ha dado lugar al
desarrollo de un nuevo método de análisis de Cu(II) en aguas naturales mediante
extracción en fase sólida, así como la nueva aplicabilidad de las técnicas AGNES y SSCP al
estudio de Pb(II) en agua de mar. Asimismo, se ha realizado un estudio desde el punto de
vista de la investigación aplicada que consiste en la evaluación de la contaminación
ambiental en la Bahía de Algeciras para conocer el estado de sus aguas, sedimentos y
peces.

373
 Anexos

Anexos

Anexo 1. Preparación de disoluciones y reactivos

En todos los capítulos se hizo uso de disoluciones de metales de diferentes

concentraciones. Además, en el Capítulo 2 se utilizaron disoluciones reguladoras de
acético/acetato a pH 3,5; 4; 4,5; 5 y 5,5. En el Capítulo 3, se usaron dos disoluciones
reguladoras (MES y MOPS) y varias disoluciones acuosas de NaNO3 de diferentes
concentraciones. En el Capítulo 4, se hizo uso de la disolución reguladora cloruro
amónico/amoniaco a pH 9,5, así como varias disoluciones durante la realización del
procedimiento de especiación metálica con DTPA y BCR en sedimentos. A continuación se
detalla la preparación específica de cada una de estas disoluciones:

Disoluciones de metales: Las disoluciones de los metales utilizados fueron preparadas por
dilución de patrones de 1000 mg/L (Merck, Alemania) enrasando con agua desionizada
Milli-Q. A todas las disoluciones de metal se les añade HNO3 para su conservación, en una
relación de 50L de HNO3 concentrado Suprapur por cada 25 mL de disolución. La
disolución de Cr de 1000 mg/L se preparó disolviendo 0,283 g de K2Cr2O7 (Merck,
Alemania) en agua Milli-Q y enrasando hasta 100 mL. Las disoluciones patrón de As se
prepararon disolviendo (As2O3) en HCl al 30% de calidad Suprapur (Merck, Alemania) en
10% de volumen final, neutralizando con una disolución de NaOH 1 mol/L hasta pH 7,00.

Disolución reguladora acético/acetato a pH 4,5, con una concentración de 4 mol/L

(AcH/AcNa): se pesan 240 g de ácido acético glacial 100% de calidad Suprapur (Merck,
Alemania) y se añade una cantidad suficiente de hidróxido sódico de calidad para análisis
(Merck, Alemania) hasta que el pH sea el adecuado. Finalmente se enrasa con agua
desionizada Milli-Q (Millipore) en un matraz aforado de 1 L. Para las restantes disoluciones
reguladoras de esta naturaleza, se ajustó su pH utilizando cantidades apropiadas de NaOH.

Disolución reguladora ácido 2-morfolino etano sulfónico (MES) a pH 6 con una

concentración de 0,2 mol/L: se pesan 2,133 g de MES (Fluka, Microselect, >99.5%) y se
375
Anexos

añade una cantidad suficiente de agua para disolverlo. Luego se añade NaOH 1 mol/L de
calidad para análisis (Riedel-de Haën) hasta que el pH suba a 6. Finalmente se enrasa con
agua desionizada Milli-Q (Millipore) en un matraz aforado de 50 mL.

Disolución reguladora ácido 3-morfolino propano sulfónico (MOPS) a pH 7 con una

concentración de 0,2 mol/L: se pesan 2,093 g de MOPS (Fluka, Microselect, >99.5%) y se
añade una cantidad suficiente de agua para disolverlo. Luego se añade NaOH 1 mol/L de
calidad para análisis (Riedel-de Haën) hasta que el pH suba a 7. Finalmente se enrasa con
agua desionizada Milli-Q (Millipore) en un matraz aforado de 50 mL.

Disolución acuosa de nitrato sódico (NaNO3) con una concentración de 0,01 mol/L: se
pesan 0,425 g de NaNO3 de calidad para análisis (Merck, Alemania) y se disuelven
enrasando con agua desionizada Milli-Q en un matraz aforado de 500 mL.

Disolución acuosa de NaNO3 con una concentración de 0,1 mol/L: se pesan 4,25 g de
NaNO3 de calidad para análisis (Merck, Alemania) y se disuelven enrasando con agua
desionizada Milli-Q en un matraz aforado de 500 mL.

Disolución acuosa de NaNO3 con una concentración de 0,55 mol/L: se pesan 23,357 g de
NaNO3 de calidad para análisis (Merck, Alemania) y se disuelven enrasando con agua
desionizada Milli-Q en un matraz aforado de 500 mL.

Disolución reguladora cloruro amónico/amoniaco a pH 9,5, con una concentración de 6

mol/L (NH4Cl/NH3): se añade un volumen de 45 mL de amoniaco 25% de calidad Suprapur
(Merck, Alemania) a 21 mL de ácido clorhídrico 30% de la misma calidad y se enrasa con
agua Milli-Q (Millipore) en un matraz aforado de 100 mL.

Disolución de dimetilgioxima (DMG) 0,05 mol/L: se pesaron 0,058 g de dimetilgrlioxima de

calidad para análisis (Merck, Almenia) y se disolvieron con etanol enrasando a 10 mL.

Disolución de DTPA 0,05 mol/L + acetato de sodio 0,2 mol/L + nitrato de sodio 2,5 mol/L:
se pesan 1,96 g de DTPA de calidad para análisis (Merck, Alemania), 1,64 g de nitrato de
sodio de calidad Suprapur (Merck, Alemania) y 21,3 g de nitrato de sodio de calidad
Suprapur (Merck, Alemania) y se disuelven enrasando hasta un volumen de 100 mL.

Disolución de DTPA 0,005 mol/L + CaCl2 0,01 mol/L + TEA 0,1 mol/L: se pesan 1,967 g de
DTPA, 1,47 g de CaCl2.2H2O y 14,92 g de TEA, y se disuelven en 900 mL de agua Milli-Q,
se ajusta el pH a 7,3 utilizando HCl 1 mol/L de calidad Suprapur, Merck (Alemania) y se
enrasó hasta 1 L.

Disolución de ácido clorhídrico 3,86 mol/L: Se tomaron 320 mL de ácido clorhídrico fumante
37% de calidad para análisis (Merck, Alemania) y se enrasó hasta 1 L con agua desionizada
(Milli-Q).

376
 Anexos

Disolución de ácido acético 0,11 mol/L: Se tomaron 6,25 mL de ácido y se enrasaron hasta
1 L con agua desionizada (Milli-Q).

Disolución de cloruro de hidroxilamonio 0,5 mol/L ajustado a pH 1,5: Se disolvieron 34,75 g

de cloruro de hidroxilamonio en 500 mL de agua desionizada Milli-Q, se ajusta el pH a 1,5,
utilizando HNO3 al 65% de calidad Suprapur, Merck (Alemania) y se enrasó hasta 1 L con
agua desionizada (Milli-Q).

Disolución de acetato amónico 1 mol/L ajustado a pH 2: se disuelven 77 g de acetato

amónico de calidad para análisis, en 500 mL de agua desionizada Milli-Q, se ajusta el pH a
2, utilizando HNO3 al 65% de calidad Suprapur, Merck (Alemania) y se enrasó hasta 1 L
con agua desionizada (Milli-Q).

Anexo 2. Datos de los estudios previos en los 17 puntos de muestreo

Anexo 2.1. Datos de concentración de metal total en las muestras de sedimento

Tabla A.1. Concentración de metal total en sedimentos (mg/kg)
Puntos As (mg/kg) Ni (mg/kg) Co (mg/kg) Cr (mg/kg)
1.1 11,395±1,100 18,816±1,219 6,038±0,478 30,207±1,563
2.1 22,735±1,839 26,833±1,422 9,826±0,396 50,841±1,538
2.2 17,379±0,781 36,341±2,331 10,075±0,281 68,257±2,696
3.1 9,151±0,737 55,022±1,324 9,087±0,328 93,282±1,802
3.2 21,257±1,324 56,906±2,745 14,898±0,304 92,586±1,931
4.1 8,769±0,756 57,291±1,331 9,659±0,407 91,763±1,809
4.2 9,699±1,054 61,536±2,636 11,088±0,487 97,912±2,900
5.1 7,870±0,922 80,929±2,225 13,087±0,400 142,844±3,284
5.2 7,640±0,883 77,675±4,476 12,714±0,408 139,124±5,062
6.1 8,214±1,240 143,900±4,263 15,799±0,596 250,892±2,247
6.2 11,944±0,860 141,478±0,818 16,097±0,412 238,298±2,578
7.1 8,002±1,082 88,586±3,157 21,646±0,702 172,283±4,810
7.2 10,739±1,827 83,761±1,860 14,912±0,281 139,788±1,947
8.1 10,651±0,576 55,722±2,061 7,381±0,285 91,007±1,224
9.1 9,346±0,393 51,121±2,173 5,742±0,329 89,135±2,136
9.2 8,69±0,595 45,905±2,466 5,377±0,214 77,339±1,332
10.1 11,470±1,363 21,454±1,661 7,164±0,496 37,134±0,817

377
Anexos

Anexo 2.2. Datos de concentración de la especiación metálica en las muestras de

sedimento
Tabla A.2. Concentración de metal (mg/kg) extraído con ácido acético 0,11 mol/L en
sedimentos
Puntos As (mg/kg) Ni (mg/kg) Co (mg/kg) Cr (mg/kg)
1.1 0,032±0,001 0,460±0,015 0,315±0,011 <L.D.
2.1 0,0331±0,0002 0,682±0,063 0,260±0,006 0,008±0,004
2.2 0,033±0,001 0,784±0,038 0,262±0,015 0,023±0,007

3.1 0,033±0,002 1,136±0,091 0,791±0,069 0,002±0,007

3.2 0,033±0,001 0,910±0,077 0,526±0,037 0,005±0,005

4.1 0,034±0,001 1,869±0,062 1,673±0,018 0,252±0,013

4.2 0,032±0,001 2,248±0,091 1,614±0,058 0,182±0,028

5.1 0,0338±0,0005 4,545±0,101 2,849±0,066 0,345±0,010

5.2 0,0321±0,0003 4,956±0,125 2,869±0,055 0,283±0,027

6.1 0,035±0,002 9,491±0,409 2,973±0,121 0,739±0,060

6.2 0,031±0,001 4,997±0,210 2,624±0,141 0,270±0,031

7.1 0,032±0,001 2,225±0,031 4,309±0,096 0,174±0,013

7.2 0,029±0,001 2,210±0,038 4,199±0,099 0,175±0,015

8.1 0,0309±0,0004 0,693±0,030 0,263±0,014 0,003±0,002

9.1 0,0312±0,0002 0,935±0,101 0,248±0,015 0,016±0,006

9.2 0,029±0,033 1,166±0,057 0,321±0,007 0,027±0,007

10.1 0,029±0,001 0,453±0,058 0,294±0,011 < L.D.

378
 Anexos

Tabla A.3. Concentración de metal (mg/kg) extraído con DTPA+CaCl2+TEA en sedimentos

Puntos As (mg/kg) Ni (mg/kg) Co (mg/kg) Cr (mg/kg)
1.1 0,06±0,01 0,15±0,02 0,135±0,004 0,0245±0,0002
2.1 0,09±0,02 0,28±0,02 0,28±0,01 0,019±0,001
2.2 0,09±0,01 0,35±0,02 0,204±0,016 0,03679±0,00007

3.1 0,08±0,01 0,51±0,03 0,37±0,02 0,016±0,001

3.2 0,12±0,01 0,58±0,02 0,46±0,02 0,025±0,001

4.1 0,076±0,005 0,59±0,01 0,45±0,01 0,014±0,003

4.2 0,102±0,008 0,96±0,02 0,55±0,01 0,033±0,003

5.1 0,04±0,01 1,53±0,01 0,83±0,02 0,01838±0,00002

5.2 0,06±0,01 1,91±0,03 0,904±0,013 0,028±0,001

6.1 0,08±0,02 7,94±0,08 2,38±0,06 0,059±0,005

6.2 0,06±0,01 1,55±0,05 0,63±0,02 0,03145±0,000003

7.1 0,04±0,01 0,73±0,03 1,59±0,05 0,016±0,001

7.2 0.09±0.01 0.74±0.03 0.65±0.03 0.026±0.001

8.1 0.06±0.01 0.275±0.001 0.165±0.002 0.025±0.003

9.1 0.03±0.01 0.35±0.01 0.107±0.005 0.002±0.002

9.2 0.036±0.012 0.42±0.03 0.138±0.008 0.065±0.002

10.1 0.075±0.005 0.060±0.001 0.12±0.01 0.021±0.004

379
Anexos

Anexo 3. Datos biológicos de los peces

Tabla A.4. Datos de longitud y peso de los peces analizados

Punto de Longitud
Muestreo Pez Especie Peso (g)
muestreo (cm)
1 Getares 1 Sargo 143 21
1 Getares 4 Lenguado 236 29
1 Getares 5 Lenguado 115 23
1 Getares 7 Lenguado 225 28
1 Palmones 1 Rubio 355 32
1 Puente Mayorga 1 Rubio 76 19,6
1 Puente Mayorga 2 Lenguado 359 32,5
2 Getares 1 Lenguado 135 24,1
2 Getares 2 Lenguado 135,6 23,9
2 Getares 3 Lenguado 114,1 21,2
2 Getares 4 Lenguado 170,4 25,9
2 Getares 5 Lenguado 149,1 25
2 Getares 6 Lenguado 152,8 25,8
2 Getares 8 Lenguado 182,9 27,5
2 Getares 9 Lenguado 111,9 23
2 Getares 10 Lenguado 130 24,5
2 Getares 11 Lenguado 133,6 23,5
2 Getares 12 Lenguado 273,8 30,5
2 Getares 13 Lenguado 198,9 27,9
2 Getares 14 Sargo 77,2 7,5
2 Getares 15 Lenguado 223 29,2

2 Getares 17 Lenguado 201 28,2

2 Isla Verde 3 Lenguado 241,9 28,7

2 Isla Verde 4 Lenguado 286,6 31,6

2 Isla Verde 5 Lenguado 385,5 36,8

2 Palmones 3 Lenguado 196,9 27,5

380
 Anexos

Tabla A.4 (cont.). Datos de longitud y peso de los peces analizados

Punto de Longitud
Muestreo Pez Especie Peso (g)
muestreo (cm)
2 Palmones 6 Rubio 339,2 34,5
2 Palmones 7 Rubio 400 37
2 Palmones 8 Rubio 371 34
2 Palmones 8 Rubio 371 38
2 Palmones 9 Rubio 326,6 32,1
2 Palmones 10 Rubio 352,75 33,9
2 Palmones 11 Rubio 290,6 31,2
2 Palmones 12 Rubio 318,6 34,1
2 Palmones 13 Rubio 348,2 32,6
2 Palmones 14 Rubio 400 39
2 Palmones 15 Rubio 305,8 31,9
2 Palmones 16 Rubio 290,3 38,3
2 Palmones 17 Rubio 299,4 31,6
2 Guadarranque 2 Lenguado 213,4 27,9
2 Puente Mayorga 1 Lenguado 235 28,5
2 Puente Mayorga 3 Lenguado 171,9 26
3 Getares 1 Lenguado 173,9 25,4
3 Getares 3 Lenguado 150 24,6
3 Getares 4 Lenguado 256 31
3 Getares 6 Lenguado 237 28,6
3 Getares 7 Lenguado 237 28,5

3 Getares 8 Rascacio 344,95 25,8

3 Getares 10 Rascacio 206,33 20

3 Getares 11 Lenguado 348 35

3 Getares 12 Rascacio 324 25

3 Getares 12 Rascacio 324 25

3 Getares 13 Rascacio >440 34,6

3 Getares 13 Rascacio >440 34,3

381
Anexos

Tabla A.4 (cont.). Datos de longitud y peso de los peces analizados

Punto de Longitud
Muestreo Pez Especie Peso (g)
muestreo (cm)
3 Isla Verde 7 Rascacio >440 31
3 Isla Verde 8 Rascacio 238,5 28
3 Isla Verde 9 Rascacio 341 26
3 Palmones 1 Rubio 174,82 26,3
3 Palmones 3 Lenguado 196 26
3 Palmones 4 Lenguado 74,9 20
3 Palmones 5 Rubio 177 27
3 Palmones 6 Lenguado 148 26
3 Palmones 7 Lenguado 217,38 29,5
3 Guadarranque 1 Rubio 175,1 25,8
3 Guadarranque 2 Rascacio 133 18,5
3 Guadarranque 4 Rascacio 108 18
3 Guadarranque 5 Rubio 134,8 23
3 Guadarranque 6 Rubio 135 24
3 Puente Mayorga 2 Lenguado >440 36
3 Puente Mayorga 3 Lenguado 42,7 35,1
3 Puente Mayorga 4 Lenguado 137 28
4 Getares 1 Lenguado 193,2 25,7
4 Getares 2 Lenguado 193,2 25,7
4 Getares 3 Lenguado 130,2 24
4 Getares 4 Lenguado 121,7 25

4 Getares 5 Lenguado 165,7 25,7

4 Getares 6 Lenguado 117,4 23,3

4 Getares 7 Lenguado 82 20,4

4 Getares 9 Rascacio 149 20

4 Getares 10 Sargo 149 20

4 Isla Verde 2 Sargo 59,8 36

4 Isla Verde 3 Sargo 152,5 21

382
 Anexos

Tabla A.4 (cont.). Datos de longitud y peso de los peces analizados

Punto de Longitud
Muestreo Pez Especie Peso (g)
muestreo (cm)
4 Guadarranque 1 Lenguado 202 27
4 Guadarranque 4 Rubio 112,5 22,3
4 Guadarranque 9 Rascacio 117,9 17
4 Guadarranque 10 Rascacio 88,4 16,2
4 Guadarranque 11 Rascacio 101,4 17,2

Anexo 4. Base de datos de los metales en cada uno de los compartimentos

acuáticos

Anexo 4.1. Datos de concentración de la especiación metálica en las muestras de agua

Tabla A.5. Datos de concentración de la especiación metálica de As en agua (g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

1 Getares Total 0,625 ± 0,024

1 Getares Particulada orgánica 0,237 ± 0,053
1 Getares Particulada inorgánica 0,000
1 Getares Disuelta orgánica 0,010 ± 0,047
1 Getares Disuelta inorgánica 0,378 ± 0,047
1 Isla Verde Total 0,684 ± 0,048
1 Isla Verde Particulada orgánica 0,188 ± 0,136
1 Isla Verde Particulada inorgánica 0,318 ± 0,028
1 Isla Verde Disuelta orgánica 0,082 ± 0,025
1 Isla Verde Disuelta inorgánica 0,097 ± 0,028
1 Palmones Total 0,556 ± 0,024
1 Palmones Particulada orgánica 0,000
1 Palmones Particulada inorgánica 0,302 ± 0,047
1 Palmones Disuelta orgánica 0,062 ± 0,053
1 Palmones Disuelta inorgánica 0,192 ± 0,047

1 Guadarranque Total 0,665 ± 0,024

383
Anexos

Tabla A.5 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de As en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

1 Guadarranque Particulada orgánica 0,000

1 Guadarranque Particulada inorgánica 0,506 ± 0,024
1 Guadarranque Disuelta orgánica 0,115 ± 0,048
1 Guadarranque Disuelta inorgánica 0,044 ± 0,001
1 Puente Mayorga Total 0,702 ± 0,024
1 Puente Mayorga Particulada orgánica 0,204 ± 0,042
1 Puente Mayorga Particulada inorgánica 0,320 ± 0,023
1 Puente Mayorga Disuelta orgánica 0,004 ± 0,034
1 Puente Mayorga Disuelta inorgánica 0,174 ± 0,023
2 Getares Total 0,740 ± 0,001
2 Getares Particulada orgánica 0,000
2 Getares Particulada inorgánica 0,268 ± 0,034
2 Getares Disuelta orgánica 0,264 ± 0,034
2 Getares Disuelta inorgánica 0,208 ± 0,024
2 Isla Verde Total 0,627 ± 0,007
2 Isla Verde Particulada orgánica 0,174 ± 0,090
2 Isla Verde Particulada inorgánica 0,000
2 Isla Verde Disuelta orgánica 0,000
2 Isla Verde Disuelta inorgánica 0,453 ± 0,048
2 Palmones Total 0,550 ± 0,001
2 Palmones Particulada orgánica 0,000
2 Palmones Particulada inorgánica 0,135 ± 0,072
2 Palmones Disuelta orgánica 0,207 ± 0,087
2 Palmones Disuelta inorgánica 0,208 ± 0,072
2 Guadarranque Total 0,494 ± 0,048
2 Guadarranque Particulada orgánica 0,095 ± 0,064

2 Guadarranque Particulada inorgánica 0,040 ± 0,034

384
 Anexos

Tabla A.5 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de As en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

2 Guadarranque Disuelta orgánica 0,000

2 Guadarranque Disuelta inorgánica 0,359 ± 0,024
2 Puente Mayorga Total 0,795 ± 0,001
2 Puente Mayorga Particulada orgánica 0,228 ± 0,059
2 Puente Mayorga Particulada inorgánica 0,000
2 Puente Mayorga Disuelta orgánica 0,000
2 Puente Mayorga Disuelta inorgánica 0,567 ± 0,048
3 Getares Total 0,556 ± 0,025
3 Getares Particulada orgánica 0,006 ± 0,062
3 Getares Particulada inorgánica 0,162 ± 0,056
3 Getares Disuelta orgánica 0,214 ± 0,024
3 Getares Disuelta inorgánica 0,174 ± 0,024
3 Isla Verde Total 0,616 ± 0,025
3 Isla Verde Particulada orgánica 0,058 ± 0,063
3 Isla Verde Particulada inorgánica 0,379 ± 0,028
3 Isla Verde Disuelta orgánica 0,162 ± 0,027
3 Isla Verde Disuelta inorgánica 0,017 ± 0,012
3 Palmones Total 0,496 ± 0,051
3 Palmones Particulada orgánica 0,0738 ± 0,034
3 Palmones Particulada inorgánica 0,167 ± 0,024
3 Palmones Disuelta orgánica 0,007 ± 0,034
3 Palmones Disuelta inorgánica 0,248 ± 0,024
3 Guadarranque Total 0,600 ± 0,025
3 Guadarranque Particulada orgánica 0,000
3 Guadarranque Particulada inorgánica 0,440 ± 0,028
3 Guadarranque Disuelta orgánica 0,125 ± 0,050
3 Guadarranque Disuelta inorgánica 0,035 ± 0,012
3 Puente Mayorga Total 0,707 ± 0,025
3 Puente Mayorga Particulada orgánica 0,112 ± 0,049

385
Anexos

Tabla A.5 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de As en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

3 Puente Mayorga Particulada inorgánica 0,384 ± 0,035

3 Puente Mayorga Disuelta orgánica 0,000
3 Puente Mayorga Disuelta inorgánica 0,211 ± 0,024
4 Getares Total 0,734 ± 0,051
4 Getares Particulada orgánica 0,152 ± 0,066
4 Getares Particulada inorgánica 0,023 ± 0,035
4 Getares Disuelta orgánica 0,266 ± 0,034
4 Getares Disuelta inorgánica 0,293 ± 0,024
4 Isla Verde Total 0,668 ± 0,102
4 Isla Verde Particulada orgánica 0,204 ± 0,130
4 Isla Verde Particulada inorgánica 0,000
4 Isla Verde Disuelta orgánica 0,038 ± 0,073
4 Isla Verde Disuelta inorgánica 0,426 ± 0,073
4 Palmones Total 0,565 ± 0,076
4 Palmones Particulada orgánica 0,000
4 Palmones Particulada inorgánica 0,082 ± 0,055
4 Palmones Disuelta orgánica 0,209 ± 0,054
4 Palmones Disuelta inorgánica 0,274 ± 0,048
4 Guadarranque Total 0,561 ± 0,001
4 Guadarranque Particulada orgánica 0,135 ± 0,070
4 Guadarranque Particulada inorgánica 0,000
4 Guadarranque Disuelta orgánica 0,000
4 Guadarranque Disuelta inorgánica 0,426 ± 0,048
4 Puente Mayorga Total 0,779 ± 0,025
4 Puente Mayorga Particulada orgánica 0,239 ± 0,043
4 Puente Mayorga Particulada inorgánica 0,000
4 Puente Mayorga Disuelta orgánica 0,000
4 Puente Mayorga Disuelta inorgánica 0,540 ± 0,001

386
 Anexos

Tabla A.6. Datos de concentración de la especiación metálica de Ni en agua (g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

1 Getares Total 0,378 ± 0,016

1 Getares Particulada 0,087 ± 0,022
1 Getares Disuelta lábil 0,083 ± 0,001
1 Getares Disuelta poco/no lábil 0,207 ± 0,016
1 Isla Verde Total 0,285 ± 0,005
1 Isla Verde Particulada 0,141 ± 0,006
1 Isla Verde Disuelta lábil 0,106 ± 0,001
1 Isla Verde Disuelta poco/no lábil 0,039 ± 0,003
1 Palmones Total 0,294 ± 0,007
1 Palmones Particulada 0,047 ± 0,027
1 Palmones Disuelta lábil 0,133 ± 0,005
1 Palmones Disuelta poco/no lábil 0,115 ± 0,027
1 Guadarranque Total 0,271 ± 0,003
1 Guadarranque Particulada 0,040 ± 0,004
1 Guadarranque Disuelta lábil 0,102 ± 0,002

1 Guadarranque Disuelta poco/no lábil 0,129 ± 0,003

1 Puente Mayorga Total 0,233 ± 0,004

1 Puente Mayorga Particulada 0,026 ± 0,011

1 Puente Mayorga Disuelta lábil 0,164 ± 0,003

1 Puente Mayorga Disuelta poco/no lábil 0,042 ± 0,010

2 Getares Total 0,367 ± 0,028

2 Getares Particulada 0,260 ± 0,029

2 Getares Disuelta lábil 0,102 ± 0,004

2 Getares Disuelta poco/no lábil 0,004 ± 0,006

2 Isla Verde Total 0,232 ± 0,015

2 Isla Verde Particulada 0,070 ± 0,016

2 Isla Verde Disuelta lábil 0,133 ± 0,004

2 Isla Verde Disuelta poco/no lábil 0,029 ± 0,007

387
Anexos

Tabla A.6 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de Ni en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

2 Palmones Total 0,276 ± 0,015

2 Palmones Particulada 0,043 ± 0,016
2 Palmones Disuelta lábil 0,034 ± 0,002
2 Palmones Disuelta poco/no lábil 0,198 ± 0,005
2 Guadarranque Total 0,240 ± 0,016
2 Guadarranque Particulada 0,093 ± 0,018
2 Guadarranque Disuelta lábil 0,055 ± 0,001
2 Guadarranque Disuelta poco/no lábil 0,091 ± 0,008
2 Puente Mayorga Total 0,149 ± 0,001

2 Puente Mayorga Particulada 0,003 ± 0,005

2 Puente Mayorga Disuelta lábil 0,087 ± 0,005

2 Puente Mayorga Disuelta poco/no lábil 0,058 ± 0,007

3 Getares Total 0,284 ± 0,011

3 Getares Particulada 0,102 ± 0,013

3 Getares Disuelta lábil 0,051 ± 0,002

3 Getares Disuelta poco/no lábil 0,131 ± 0,007

3 Isla Verde Total 0,137 ± 0,008

3 Isla Verde Particulada 0,040 ± 0,010

3 Isla Verde Disuelta lábil 0,079 ± 0,001

3 Isla Verde Disuelta poco/no lábil 0,018 ± 0,005

3 Palmones Total 0,484 ± 0,006

3 Palmones Particulada 0,229 ± 0,014

3 Palmones Disuelta lábil 0,157 ± 0,002

3 Palmones Disuelta poco/no lábil 0,097 ± 0,013

3 Guadarranque Total 0,536 ± 0,010

3 Guadarranque Particulada 0,298 ± 0,012

3 Guadarranque Disuelta lábil 0,113 ± 0,002

388
 Anexos

Tabla A.6 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de Ni en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

3 Guadarranque Disuelta poco/no lábil 0,125 ± 0,007

3 Puente Mayorga Total 0,197 ± 0,009
3 Puente Mayorga Particulada 0,125 ± 0,009
3 Puente Mayorga Disuelta lábil 0,041 ± 0,003
3 Puente Mayorga Disuelta poco/no lábil 0,030 ± 0,005
4 Getares Total 0,189 ± 0,012
4 Getares Particulada 0,022 ± 0,014
4 Getares Disuelta lábil 0,159 ± 0,006
4 Getares Disuelta poco/no lábil 0,008 ± 0,010
4 Isla Verde Total 0,245 ± 0,009

4 Isla Verde Particulada 0,035 ± 0,012

4 Isla Verde Disuelta lábil 0,081 ± 0,002

4 Isla Verde Disuelta poco/no lábil 0,129 ± 0,009

4 Palmones Total 0,294 ± 0,014

4 Palmones Particulada 0,140 ± 0,015

4 Palmones Disuelta lábil 0,064 ± 0,002

4 Palmones Disuelta poco/no lábil 0,089 ± 0,007

4 Guadarranque Total 0,574 ± 0,019

4 Guadarranque Particulada 0,232 ± 0,024

4 Guadarranque Disuelta lábil 0,202 ± 0,004

4 Guadarranque Disuelta poco/no lábil 0,141 ± 0,016

4 Puente Mayorga Total 0,146 ± 0,009

4 Puente Mayorga Particulada 0,040 ± 0,014

4 Puente Mayorga Disuelta lábil 0,102 ± 0,002

4 Puente Mayorga Disuelta poco/no lábil 0,004 ± 0,011

389
Anexos

Tabla A.7. Datos de concentración de la especiación metálica de Co en agua (g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

1 Getares Total 0,022 ± 0,002

1 Getares Particulada 0,019 ± 0,002
1 Getares Disuelta lábil <LD
1 Getares Disuelta poco/no lábil 0,0035 ± 0,0002
1 Isla Verde Total 0,035 ± 0,001
1 Isla Verde Particulada 0,027 ± 0,002
1 Isla Verde Disuelta lábil <LD
1 Isla Verde Disuelta poco/no lábil 0,008 ± 0,001
1 Palmones Total 0,099 ± 0,002
1 Palmones Particulada 0,049 ± 0,002
1 Palmones Disuelta lábil 0,0205 ± 0,0003
1 Palmones Disuelta poco/no lábil 0,030 ± 0,001
1 Guadarranque Total 0,559 ± 0,010
1 Guadarranque Particulada 0,398 ± 0,010
1 Guadarranque Disuelta lábil 0,031 ± 0,002

1 Guadarranque Disuelta poco/no lábil 0,130 ± 0,004

1 Puente Mayorga Total 0,047 ± 0,001

1 Puente Mayorga Particulada 0,043 ± 0,001

1 Puente Mayorga Disuelta lábil <LD

1 Puente Mayorga Disuelta poco/no lábil 0,0043 ± 0,0002

2 Getares Total 0,032 ± 0,001

2 Getares Particulada 0,018 ± 0,002

2 Getares Disuelta lábil <LD

2 Getares Disuelta poco/no lábil 0,013 ± 0,002

2 Isla Verde Total 0,0460 ± 0,0003

2 Isla Verde Particulada 0,000

2 Isla Verde Disuelta lábil <LD

2 Isla Verde Disuelta poco/no lábil 0,0466 ± 0,0004

390
 Anexos

Tabla A.7 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de Co en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

2 Palmones Total 0,122 ± 0,008

2 Palmones Particulada 0,095 ± 0,008
2 Palmones Disuelta lábil 0,0012 ± 0,0001
2 Palmones Disuelta poco/no lábil 0,026 ± 0,001
2 Guadarranque Total 0,143 ± 0,007
2 Guadarranque Particulada 0,117 ± 0,007
2 Guadarranque Disuelta lábil 0,012 ± 0,001
2 Guadarranque Disuelta poco/no lábil 0,014 ± 0,002
2 Puente Mayorga Total 0,107 ± 0,002

2 Puente Mayorga Particulada 0,041 ± 0,002

2 Puente Mayorga Disuelta lábil 0,0216 ± 0,0003

2 Puente Mayorga Disuelta poco/no lábil 0,0447 ± 0,0005

3 Getares Total 0,044 ± 0,002

3 Getares Particulada 0,023 ± 0,002

3 Getares Disuelta lábil <LD

3 Getares Disuelta poco/no lábil 0,021 ± 0,002

3 Isla Verde Total 0,034 ± 0,006

3 Isla Verde Particulada 0,0002 ± 0,006

3 Isla Verde Disuelta lábil 0,010 ± 0,001

3 Isla Verde Disuelta poco/no lábil 0,024 ± 0,002

3 Palmones Total 0,153 ± 0,002

3 Palmones Particulada 0,082 ± 0,002

3 Palmones Disuelta lábil 0,056 ± 0,003

3 Palmones Disuelta poco/no lábil 0,016 ± 0,003

3 Guadarranque Total 0,752 ± 0,008

3 Guadarranque Particulada 0,499 ± 0,009

3 Guadarranque Disuelta lábil 0,114 ± 0,010

391
Anexos

Tabla A.7 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de Co en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

3 Guadarranque Disuelta poco/no lábil 0,139 ± 0,010

3 Puente Mayorga Total 0,064 ± 0,002
3 Puente Mayorga Particulada 0,053 ± 0,003
3 Puente Mayorga Disuelta lábil 0,005 ± 0,001
3 Puente Mayorga Disuelta poco/no lábil 0,006 ± 0,002
4 Getares Total 0,030 ± 0,002
4 Getares Particulada 0,005 ± 0,002
4 Getares Disuelta lábil 0,013 ± 0,001
4 Getares Disuelta poco/no lábil 0,012 ± 0,001
4 Isla Verde Total 0,0286 ± 0,0002

4 Isla Verde Particulada 0,012 ± 0,001

4 Isla Verde Disuelta lábil <LD

4 Isla Verde Disuelta poco/no lábil 0,017 ± 0,001

4 Palmones Total 0,064 ± 0,003

4 Palmones Particulada 0,015 ± 0,005

4 Palmones Disuelta lábil 0,0044 ± 0,0001

4 Palmones Disuelta poco/no lábil 0,044 ± 0,004

4 Guadarranque Total 0,053 ± 0,003

4 Guadarranque Particulada 0,016 ± 0,004

4 Guadarranque Disuelta lábil 0,029 ± 0,001

4 Guadarranque Disuelta poco/no lábil 0,008 ± 0,003

4 Puente Mayorga Total 0,037 ± 0,002

4 Puente Mayorga Particulada 0,006 ± 0,002

4 Puente Mayorga Disuelta lábil 0,028 ± 0,002

4 Puente Mayorga Disuelta poco/no lábil 0,003 ± 0,002

392
 Anexos

Tabla A.8. Datos de concentración de la especiación metálica de Cr en agua (g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

1 Getares Total 0,200 ± 0,015

1 Getares Particulada 0,012 ± 0,022
1 Getares Cr(VI) disuelto 0,093 ± 0,018
1 Getares Cr(III) disuelto activo 0,073 ± 0,030
1 Getares Cr(III) disuelto no activo 0,022 ± 0,029
1 Isla Verde Total 0,422 ± 0,011
1 Isla Verde Particulada 0,184 ± 0,020
1 Isla Verde Cr(VI) disuelto 0,093 ± 0,017
1 Isla Verde Cr(III) disuelto activo 0,106 ± 0,026
1 Isla Verde Cr(III) disuelto no activo 0,040 ± 0,026
1 Palmones Total 0,310 ± 0,015
1 Palmones Particulada 0,008 ± 0,021
1 Palmones Cr(VI) disuelto 0,127 ± 0,010
1 Palmones Cr(III) disuelto activo 0,079 ± 0,030
1 Palmones Cr(III) disuelto no activo 0,097 ± 0,032
1 Guadarranque Total 0,493 ± 0,002
1 Guadarranque Particulada 0,194 ± 0,018

1 Guadarranque Cr(VI) disuelto 0,118 ± 0,006

1 Guadarranque Cr(III) disuelto activo 0,093 ± 0,023

1 Guadarranque Cr(III) disuelto no activo 0,088 ± 0,029

1 Puente Mayorga Total 0,344 ± 0,018

1 Puente Mayorga Particulada 0,181 ± 0,020

1 Puente Mayorga Cr(VI) disuelto 0,091 ± 0,003

1 Puente Mayorga Cr(III) disuelto activo 0,046 ± 0,025

1 Puente Mayorga Cr(III) disuelto no activo 0,026 ± 0,026

2 Getares Total 0,304 ± 0,009

2 Getares Particulada 0,168 ± 0,013

2 Getares Cr(VI) disuelto 0,104 ± 0,018

393
Anexos

Tabla A.8 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de Cr en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

2 Getares Cr(III) disuelto activo 0,024 ± 0,031

2 Getares Cr(III) disuelto no activo 0,008 ± 0,027
2 Isla Verde Total 0,555 ± 0,008
2 Isla Verde Particulada 0,297 ± 0,008
2 Isla Verde Cr(VI) disuelto 0,106 ± 0,019
2 Isla Verde Cr(III) disuelto activo 0,119 ± 0,029
2 Isla Verde Cr(III) disuelto no activo 0,032 ± 0,021
2 Palmones Total 0,478 ± 0,009
2 Palmones Particulada 0,209 ± 0,018
2 Palmones Cr(VI) disuelto 0,076 ± 0,017
2 Palmones Cr(III) disuelto activo 0,071 ± 0,027
2 Palmones Cr(III) disuelto no activo 0,122 ± 0,025
2 Guadarranque Total 0,520 ± 0,010
2 Guadarranque Particulada 0,225 ± 0,026
2 Guadarranque Cr(VI) disuelto 0,107 ± 0,006
2 Guadarranque Cr(III) disuelto activo 0,059 ± 0,020
2 Guadarranque Cr(III) disuelto no activo 0,129 ± 0,030
2 Puente Mayorga Total 0,495 ± 0,016
2 Puente Mayorga Particulada 0,399 ± 0,017

2 Puente Mayorga Cr(VI) disuelto 0,061 ± 0,020

2 Puente Mayorga Cr(III) disuelto activo 0,016 ± 0,027

2 Puente Mayorga Cr(III) disuelto no activo 0,019 ± 0,020

3 Getares Total 0,408 ± 0,010

3 Getares Particulada 0,196 ± 0,019

3 Getares Cr(VI) disuelto 0,113 ± 0,012

3 Getares Cr(III) disuelto activo 0,024 ± 0,017

3 Getares Cr(III) disuelto no activo 0,074 ± 0,020

394
 Anexos

Tabla A.8 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de Cr en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

3 Isla Verde Total 0,426 ± 0,017

3 Isla Verde Particulada 0,180 ± 0,027
3 Isla Verde Cr(VI) disuelto 0,173 ± 0,019
3 Isla Verde Cr(III) disuelto activo 0,061 ± 0,021
3 Isla Verde Cr(III) disuelto no activo 0,012 ± 0,023
3 Palmones Total 0,287 ± 0,011
3 Palmones Particulada 0,019 ± 0,013
3 Palmones Cr(VI) disuelto 0,173 ± 0,009
3 Palmones Cr(III) disuelto activo 0,033 ± 0,017
3 Palmones Cr(III) disuelto no activo 0,062 ± 0,016
3 Guadarranque Total 0,538 ± 0,020
3 Guadarranque Particulada 0,298 ± 0,021
3 Guadarranque Cr(VI) disuelto 0,178 ± 0,015
3 Guadarranque Cr(III) disuelto activo 0,050 ± 0,015
3 Guadarranque Cr(III) disuelto no activo 0,011 ± 0,006
3 Puente Mayorga Total 0,477 ± 0,017
3 Puente Mayorga Particulada 0,271 ± 0,028
3 Puente Mayorga Cr(VI) disuelto 0,123 ± 0,008
3 Puente Mayorga Cr(III) disuelto activo 0,059 ± 0,020
3 Puente Mayorga Cr(III) disuelto no activo 0,024 ± 0,028
4 Getares Total 0,324 ± 0,010
4 Getares Particulada 0,087 ± 0,029
4 Getares Cr(VI) disuelto 0,109 ± 0,004
4 Getares Cr(III) disuelto activo 0,067 ± 0,009
4 Getares Cr(III) disuelto no activo 0,061 ± 0,028

4 Isla Verde Total 0,392 ± 0,016

4 Isla Verde Particulada 0,055 ± 0,022

395
Anexos

Tabla A.8 (cont.). Datos de concentración de la especiación metálica de Cr en agua

(g/L)

Muestreo Punto de muestreo Fracción Concentración (g/L)

4 Isla Verde Cr(VI) disuelto 0,165 ± 0,014

4 Isla Verde Cr(III) disuelto activo 0,089 ± 0,016
4 Isla Verde Cr(III) disuelto no activo 0,083 ± 0,018
4 Palmones Total 0,383 ± 0,014
4 Palmones Particulada 0,052 ± 0,023
4 Palmones Cr(VI) disuelto 0,180 ± 0,012
4 Palmones Cr(III) disuelto activo 0,071 ± 0,021
4 Palmones Cr(III) disuelto no activo 0,081 ± 0,026
4 Guadarranque Total 0,395 ± 0,021
4 Guadarranque Particulada 0,048 ± 0,026
4 Guadarranque Cr(VI) disuelto 0,093 ± 0,012
4 Guadarranque Cr(III) disuelto activo 0,162 ± 0,029
4 Guadarranque Cr(III) disuelto no activo 0,092 ± 0,030
4 Puente Mayorga Total 0,302 ± 0,010
4 Puente Mayorga Particulada 0,106 ± 0,020
4 Puente Mayorga Cr(VI) disuelto 0,073 ± 0,014
4 Puente Mayorga Cr(III) disuelto activo 0,091 ± 0,022

4 Puente Mayorga Cr(III) disuelto no activo 0,032 ± 0,024

396
 Anexos

Anexo 4.2. Datos de concentración de la especiación metálica en las muestras de

sedimentos
Tabla A.9. Datos de concentración de especiación: As, Ni, Co y Cr en sedimentos (mg/kg)
Punto de
Muestreo Fracción As Ni Co Cr
muestreo
1 Getares Intercambiable 0,233 0,709 0,177 <LD
1 Getares Reducible 1,045 0,303 0,243 0,412
1 Getares Oxidable 0,925 1,458 1,392 7,190
1 Getares Residuo 12,870 36,872 10,850 63,738
1 Isla Verde Intercambiable 0,488 0,704 0,912 <LD
1 Isla Verde Reducible 0,764 0,730 0,415 <LD
1 Isla Verde Oxidable 1,583 2,890 3,394 7,702
1 Isla Verde Residuo 35,780 91,774 19,922 227,420
1 Palmones Intercambiable 0,368 10,406 4,098 1,355
1 Palmones Reducible 0,904 14,863 2,881 19,100
1 Palmones Oxidable 0,400 10,354 1,609 24,379
1 Palmones Residuo 4,422 72,646 12,154 220,103
1 Guadarranque Intercambiable 0,317 4,044 12,936 0,529
1 Guadarranque Reducible 1,941 11,241 6,796 8,054

1 Guadarranque Oxidable 0,698 10,710 3,800 16,448

1 Guadarranque Residuo 1,490 77,995 7,920 206,190

1 Puente Mayorga Intercambiable 0,431 0,961 0,835 0,138

1 Puente Mayorga Reducible 1,229 0,699 0,252 <LD

1 Puente Mayorga Oxidable 0,953 4,047 1,701 5,604

1 Puente Mayorga Residuo 7,724 88,090 10,928 169,472

2 Getares Intercambiable 0,317 0,438 0,469 1,815

2 Getares Reducible 0,676 <LD 0,670 0,000

2 Getares Oxidable 0,899 5,217 2,094 3,392

2 Getares Residuo 7,103 25,615 5,934 44,736

2 Isla Verde Intercambiable 0,497 0,574 0,615 <LD

2 Isla Verde Reducible 1,862 0,034 0,184 <LD

397
Anexos

Tabla A.9 (cont.). Datos de concentración de especiación: As, Ni, Co y Cr en sedimentos

(mg/kg)
Punto de
Muestreo Fracción As Ni Co Cr
muestreo
2 Isla Verde Oxidable 1,024 1,612 1,418 7,252
2 Isla Verde Residuo 21,063 65,617 11,736 164,573
2 Palmones Intercambiable 0,140 4,856 2,810 0,476
2 Palmones Reducible 0,805 9,990 2,164 8,145
2 Palmones Oxidable 0,200 8,361 1,273 10,867
2 Palmones Residuo 1,216 134,311 12,884 344,192
2 Guadarranque Intercambiable 0,307 2,902 3,931 0,919
2 Guadarranque Reducible 0,591 10,474 2,783 7,735
2 Guadarranque Oxidable 0,304 9,222 1,429 11,117
2 Guadarranque Residuo 0,146 49,966 5,133 127,999
2 Puente Mayorga Intercambiable 0,208 1,770 1,603 0,733
2 Puente Mayorga Reducible 1,305 18,511 2,627 9,770
2 Puente Mayorga Oxidable 0,356 11,230 1,001 8,009

2 Puente Mayorga Residuo 1,488 65,681 6,066 228,244

3 Getares Intercambiable 0,313 1,124 0,271 0,169

3 Getares Reducible 0,624 0,722 0,062 <LD

3 Getares Oxidable 0,719 2,221 1,305 5,332

3 Getares Residuo 16,836 55,434 9,776 111,438

3 Isla Verde Intercambiable 0,448 1,266 0,587 0,122

3 Isla Verde Reducible 0,647 0,161 0,106 <LD

3 Isla Verde Oxidable 0,942 2,770 1,912 8,700

3 Isla Verde Residuo 27,740 98,673 13,847 256,171

3 Palmones Intercambiable 0,248 3,486 1,666 0,783

3 Palmones Reducible 1,242 10,082 2,002 10,256

3 Palmones Oxidable 0,227 8,404 1,282 13,315

3 Palmones Residuo 4,295 79,653 8,481 206,086

3 Guadarranque Intercambiable 0,175 2,524 5,432 0,420

398
 Anexos

Tabla A.9 (cont.). Datos de concentración de especiación: As, Ni, Co y Cr en sedimentos

(mg/kg)
Punto de
Muestreo Fracción As Ni Co Cr
muestreo
3 Guadarranque Reducible 1,856 10,271 5,332 10,002
3 Guadarranque Oxidable 0,465 10,030 3,464 13,554
3 Guadarranque Residuo 7,452 75,665 7,385 203,756
3 Puente Mayorga Intercambiable 0,446 2,427 0,808 0,265
3 Puente Mayorga Reducible 1,631 10,151 2,036 6,295
3 Puente Mayorga Oxidable 0,674 7,547 1,177 8,320
3 Puente Mayorga Residuo 10,575 69,671 8,151 153,956
4 Getares Intercambiable 0,325 1,155 0,254 0,235
4 Getares Reducible 0,766 1,397 0,047 <LD
4 Getares Oxidable 0,594 2,055 0,847 3,169
4 Getares Residuo 10,924 44,634 7,100 89,870
4 Isla Verde Intercambiable 0,467 1,435 0,413 0,389
4 Isla Verde Reducible 0,766 0,145 0,078 <LD

4 Isla Verde Oxidable 0,852 1,477 1,167 6,185

4 Isla Verde Residuo 22,696 66,280 9,986 167,525

4 Palmones Intercambiable 0,228 3,341 1,936 0,712

4 Palmones Reducible 0,920 5,291 1,861 5,128

4 Palmones Oxidable 0,144 6,261 1,114 9,950

4 Palmones Residuo 5,994 51,933 8,377 153,534

4 Guadarranque Intercambiable 0,266 1,473 1,564 0,791

4 Guadarranque Reducible 0,911 11,889 1,805 9,137

4 Guadarranque Oxidable 0,175 7,522 0,746 6,836

4 Guadarranque Residuo 2,398 45,298 3,629 148,054

4 Puente Mayorga Intercambiable 0,292 1,650 0,469 0,168

4 Puente Mayorga Reducible 1,333 9,085 2,350 7,916

4 Puente Mayorga Oxidable 0,492 7,952 0,843 7,848

4 Puente Mayorga Residuo 7,652 56,753 6,224 128,534

399
Anexos

Anexo 4.3. Datos de concentración de concentración metálica en las muestras de peces

Tabla A.10. Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)
Punto de Nº
Muestreo Especie1 Tejido2 As Ni Co Cr
muestreo pez
1 Getares 1 S H 20,145 0,049 0,105 0,081
1 Getares 1 S B 4,268 1,341 1,838 0,846
1 Getares 1 S M 4,768 2,337 0,728 0,480
1 Getares 4 L H 13,926 0,118 0,186 0,291
1 Getares 4 L B 4,288 0,454 0,276 1,496
1 Getares 4 L M 27,78 <LD 0,072 0,270
1 Getares 5 L H 12,638 0,065 0,136 0,225
1 Getares 5 L B 4,116 0,157 0,181 0,979
1 Getares 5 L M 14,868 0,126 0,035 0,504
1 Getares 7 L H 20,488 0,041 0,098 0,118
1 Getares 7 L B 5,533 0,096 0,109 0,856
1 Getares 7 L M 20,188 <LD 0,052 0,211
1 Palmones 1 Ru H 2,499 0,129 1,015 0,037
1 Palmones 1 Ru M 4,680 0,110 0,115 0,505
1 Puente Mayorga 1 Ru H 19,953 0,536 0,737 0,226

1 Puente Mayorga 1 Ru B 15,120 0,108 0,194 0,188

1 Puente Mayorga 1 Ru M 18,36 0,079 0,133 0,347

1 Puente Mayorga 2 L H 376,725 0,467 0,187 0,176

1 Puente Mayorga 2 L B 26,655 0,725 0,247 1,277

1 Puente Mayorga 2 L M 135,056 0,264 0,050 0,612

2 Getares 1 L H 15,359 0,168 0,27 <LD

2 Getares 1 L B 5,185 0,429 0,228 0,358

2 Getares 1 L M 41,322 0,165 0,050 0,254

2 Getares 2 L B 7,758 0,307 0,161 1,005

2 Getares 2 L M 46,770 <LD 0,017 0,074

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo

400
 Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie1 Tejido2 As Ni Co Cr
muestreo pez
2 Getares 3 L H 225,328 13,847 2,716 16,65
2 Getares 3 L B 6,999 1,690 0,191 1,030
2 Getares 3 L M 26,245 0,161 0,04 0,253
2 Getares 4 L H 18,328 0,09 0,416 0,062
2 Getares 4 L M 49,267 0,001 0,043 0,106
2 Getares 5 L H 94,26 0,334 0,532 0,186
2 Getares 5 L B 8,602 0,193 0,267 0,425
2 Getares 5 L M 84,664 0,257 0,029 0,039
2 Getares 5 L B 5,471 0,378 0,191 0,718
2 Getares 6 L B 7,009 1,087 0,241 1,713
2 Getares 6 L M 59,272 0,206 0,039 0,366
2 Getares 8 L H 69,842 0,119 0,441 0,119
2 Getares 8 L B 8,776 0,239 0,278 0,667
2 Getares 8 L M 58,082 0,072 0,041 0,23
2 Getares 9 L B 4,582 <LD 0,207 0,371

2 Getares 9 L M 24,495 <LD 0,007 0,036

2 Getares 10 L H 11,868 0,122 0,114 0,012

2 Getares 10 L B 4,186 0,883 0,145 2,079

2 Getares 10 L M 35,001 0,089 0,024 0,377

2 Getares 11 L H 15,929 0,034 0,188 0,051

2 Getares 11 L B 6,533 0,101 0,226 0,450

2 Getares 11 L M 39,534 <LD 0,007 0,006

2 Getares 12 L B 8,75 0,977 0,453 0,682

2 Getares 12 L M 72,277 0,234 0,03 0,171

2 Getares 13 L H 16,311 0,075 0,214 0,082

2 Getares 13 L B 3,674 0,296 0,128 0,647

2 Getares 13 L M 30,868 0,046 0,025 0,363

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo
401
Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie1 Tejido2 As Ni Co Cr
muestreo pez
2 Getares 14 S H 19,002 0,180 0,603 0,065
2 Getares 14 S B 13,253 0,244 0,203 0,418
2 Getares 14 S M 28,195 <LD 0,012 <LD
2 Getares 15 L H 88,966 0,042 0,263 0,016
2 Getares 15 L B 9,045 0,909 0,257 0,439
2 Getares 15 L M 75,101 0,109 0,061 0,447
2 Getares 17 L H 138,046 0,357 0,462 0,099
2 Getares 17 L B 21,525 0,410 0,144 1,064
2 Getares 17 L M 50,776 0,001 0,017 0,260
2 Isla Verde 3 L H 168,581 0,204 0,108 0,036
2 Isla Verde 3 L B 11,497 1,480 0,489 2,395
2 Isla Verde 3 L M 77,512 <LD 0,015 0,024
2 Isla Verde 4 L B 10,448 0,383 0,126 0,328
2 Isla Verde 4 L M 46,398 0,158 0,045 0,351
2 Isla Verde 5 L B 44,253 0,388 0,323 0,375
2 Isla Verde 5 L M 165,927 <LD 0,020 0,115

2 Palmones 3 L H 55,378 0,072 0,275 0,059

2 Palmones 3 L B 21,651 0,535 0,308 1,753

2 Palmones 3 L M 130,318 <LD 0,004 0,038

2 Palmones 6 Ru H 9,985 0,103 2,522 0,022

2 Palmones 6 Ru B 6,953 0,352 0,445 0,293

2 Palmones 6 Ru M 9,285 0,433 0,060 0,111

2 Palmones 7 Ru H 71,327 0,062 1,373 0,194

2 Palmones 7 Ru B 36,811 0,380 0,496 0,348

2 Palmones 7 Ru M 27,576 <LD 0,119 0,062

2 Palmones 8 Ru B 37,627 0,652 0,776 1,319

2 Palmones 8 Ru M 40,938 <LD 0,155 0,197

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo
402
 Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie1 Tejido2 As Ni Co Cr
muestreo pez
2 Palmones 8 Ru M 82,574 0,104 3,477 0,04
2 Palmones 9 Ru H 16,984 0,263 1,691 0,175
2 Palmones 9 Ru B 16,35 0,596 0,728 0,708
2 Palmones 9 Ru M 29,994 0,012 0,165 0,118
2 Palmones 10 Ru H 6,363 0,430 4,549 0,009
2 Palmones 10 Ru B 5,468 0,659 0,574 1,078
2 Palmones 10 Ru M 5,584 0,025 0,078 0,058
2 Palmones 11 Ru H 9,059 0,131 2,114 0,062
2 Palmones 11 Ru B 11,499 1,137 0,701 2,478
2 Palmones 11 Ru M 12,057 <LD 0,113 0,083
2 Palmones 12 Ru H 18,368 0,152 3,631 0,040
2 Palmones 12 Ru B 17,309 0,501 0,529 0,614
2 Palmones 12 Ru M 33,856 0,034 0,056 0,097
2 Palmones 13 Ru H 21,182 0,021 1,146 <LD
2 Palmones 13 Ru B 20,91 0,619 0,554 0,595
2 Palmones 13 Ru M 29,144 <LD 0,061 0,067
2 Palmones 14 Ru H 48,743 0,033 3,288 0,042

2 Palmones 14 Ru B 20,085 0,791 0,808 0,828

2 Palmones 14 Ru M 25,532 <LD 0,133 0,153

2 Palmones 15 Ru H 12,951 0,124 1,562 0,046

2 Palmones 15 Ru B 10,449 0,419 0,619 0,931

2 Palmones 15 Ru M 21,967 <LD 0,144 0,248

2 Palmones 16 Ru H 10,712 0,249 2,482 0,063

2 Palmones 16 Ru B 14,247 0,958 0,956 1,782

2 Palmones 16 Ru M 13,953 0,242 0,107 0,065

2 Palmones 17 Ru H 23,653 0,152 1,865 0,075

2 Palmones 17 Ru B 16,837 0,349 0,582 0,568

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo
403
Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie1 Tejido2 As Ni Co Cr
muestreo pez
2 Palmones 17 Ru M 20,797 <LD 0,078 0,092
2 Guadarranque 2 L H 23,893 0,142 0,231 0,078
2 Guadarranque 2 L B 6,801 0,231 0,270 0,201
2 Guadarranque 2 L M 58,561 0,045 0,041 0,373
2 Puente Mayorga 1 L H 76,941 0,042 0,199 0,223
2 Puente Mayorga 1 L B 79,794 0,283 6,703 0,571
2 Puente Mayorga 1 L M 116,518 <LD 0,017 0,176
2 Puente Mayorga 3 L H 28,002 <LD 0,244 0,055
2 Puente Mayorga 3 L B 8,640 0,055 0,190 0,488
2 Puente Mayorga 3 L M 112,899 0,019 0,010 0,206
3 Getares 1 L H 17,005 0,191 0,170 <LD
3 Getares 1 L B 5,412 0,044 0,242 0,25
3 Getares 1 L M 34,832 0,044 0,078 0,153
3 Getares 3 L H 21,223 0,323 0,449 0,121
3 Getares 3 L M 34,163 <LD 0,041 0,326
3 Getares 4 L H 46,965 0,437 0,288 <LD
3 Getares 4 L B 2,100 0,385 0,386 1,953
3 Getares 4 L M 75,106 0,071 0,018 0,062

3 Getares 6 L B 4,215 0,756 0,232 0,042

3 Getares 6 L M 37,460 0,413 0,067 0,510

3 Getares 7 Ra H 20,900 0,249 0,387 0,044

3 Getares 7 L B 4,584 0,074 0,316 0,554

3 Getares 7 L M 47,406 0,014 0,094 0,223

3 Getares 8 Ra H 13,354 0,127 1,464 <LD

3 Getares 8 Ra B 2,633 0,478 0,407 0,319

3 Getares 8 Ra M 8,216 <LD 0,047 0,524

3 Getares 8 Ra B 4,990 0,488 0,364 0,719

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo

404
 Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie Tejido As Ni Co Cr
muestreo pez
3 Getares 9 Ru H 10,363 0,211 0,754 0,009
3 Getares 9 Ru B 2,930 0,001 0,257 <LD
3 Getares 10 Ra H 4,323 0,015 0,267 <LD
3 Getares 10 Ra B 2,611 0,312 0,317 0,108
3 Getares 10 Ra M 16,584 <LD 0,052 0,026
3 Getares 11 L H 26,092 0,461 0,236 0,004
3 Getares 11 L B 1,795 0,061 0,2 0,181
3 Getares 11 L M 45,893 <LD 0,006 0,096
3 Getares 12 Ra H 5,58 0,020 0,345 <LD
3 Getares 12 Ra B 3,526 0,184 0,326 0,048
3 Getares 12 Ra M 7,199 0,029 0,106 0,692
3 Getares 12 Ra M 7,516 0,190 0,053 0,342
3 Getares 13 Ra B 2,905 0,196 0,214 0,077
3 Getares 13 Ra M 3,846 0,072 0,13 0,231
3 Getares 13 Ra M 6,541 0,025 0,061 0,111
3 Isla Verde 7 L H 7,827 0,024 0,721 <LD
3 Isla Verde 7 Ra B 6,23 0,065 0,312 0,351
3 Isla Verde 7 Ra M 7,567 <LD 0,067 0,391
3 Isla Verde 8 Ra H 5,752 0,207 1,139 <LD
3 Isla Verde 8 Ra B 8,894 0,430 0,718 0,214
3 Isla Verde 8 Ra M 16,787 0,107 0,26 0,256

3 Isla Verde 9 Ra H 3,365 0,047 0,683 <LD

3 Isla Verde 9 Ra B 3,344 0,369 0,434 0,182

3 Isla Verde 9 Ra M 12,327 <LD 0,101 0,142

3 Isla Verde 10 Ra H 10,838 0,122 4,038 0,049

3 Isla Verde 10 Ra B 8,839 0,147 0,116 0,009

3 Palmones 1 Ru B 6,05 0,606 0,389 0,37

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo

405
Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie Tejido As Ni Co Cr
muestreo pez
3 Palmones 1 Ru M 9,881 0,034 0,124 0,157
3 Palmones 3 L H 14,812 0,147 0,175 0,016
3 Palmones 3 L M 36,494 0,035 0,075 0,117
3 Palmones 4 L H 9,299 0,482 0,226 0,272
3 Palmones 4 L B 2,093 0,517 0,333 2,444
3 Palmones 4 L M 9,403 0,005 0,025 0,232
3 Palmones 5 Ru H 11,515 0,346 3,593 <LD
3 Palmones 5 Ru B <LD <LD <LD <LD
3 Palmones 5 Ru M 16,145 <LD 0,059 0,164
3 Palmones 6 L H 28,548 0,690 0,634 0,754
3 Palmones 6 L B 5,012 0,910 0,254 0,175
3 Palmones 6 L M 22,472 0,026 0,046 0,389
3 Palmones 7 L H 16,639 0,687 1,703 <LD
3 Palmones 7 L B 4,837 0,191 0,290 0,667
3 Palmones 7 L M <LD <LD <LD <LD
3 Guadarranque 1 Ru H 28,985 1,433 10,294 0,11
3 Guadarranque 1 Ru B 13,134 0,232 0,840 0,173
3 Guadarranque 1 Ru M 17,182 <LD 0,096 1,986
3 Guadarranque 2 Ra H 3,702 0,154 0,39 0,019
3 Guadarranque 2 Ra B 3,506 0,486 0,594 0,197

3 Guadarranque 2 Ra M 42,025 <LD 0,181 0,134

3 Guadarranque 4 Ra M 36,494 <LD 0,146 0,27

3 Guadarranque 4 L H 4,764 0,788 0,52 0,071

3 Guadarranque 4 Ra B 3,461 0,195 0,591 0,321

3 Guadarranque 5 Ru H 16,312 0,233 4,321 <LD

3 Guadarranque 5 Ru B 12,348 0,350 1,093 0,509

3 Guadarranque 5 Ru M 13,325 <LD 0,12 0,437

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo

406
 Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie Tejido As Ni Co Cr
muestreo pez
3 Guadarranque 6 Ru H 14,056 0,519 0,136 <LD
3 Guadarranque 6 Ru B 9,973 0,226 1,658 0,004
3 Guadarranque 6 Ru M 22,975 <LD 0,212 0,101
3 Puente Mayorga 1 Ru H 54,318 0,474 11,036 0,11
3 Puente Mayorga 1 Ru B 14,105 0,278 1,365 0,204
3 Puente Mayorga 2 L H 19,03 0,299 0,123 0,046
3 Puente Mayorga 2 L B 1,833 0,195 0,283 0,089
3 Puente Mayorga 2 L M 20,383 0,070 0,023 0,163
3 Puente Mayorga 3 L H 5,216 0,075 0,783 0,049
3 Puente Mayorga 3 L B 8,391 0,650 0,432 1,072
3 Puente Mayorga 3 L M 82,723 <LD 0,026 0,612
3 Puente Mayorga 4 L B 6,264 0,470 0,246 0,553
3 Puente Mayorga 4 L M 31,252 0,558 0,028 0,108
4 Getares 1 L H 8,456 0,045 0,071 0,088
4 Getares 1 L B 3,818 0,643 0,061 0,267
4 Getares 1 L M 35,846 0,239 0,015 0,588
4 Getares 2 L H 23,487 0,126 0,146 0,049
4 Getares 2 L B 5,545 0,811 0,135 0,456
4 Getares 2 L M 64,190 0,402 0,029 0,333
4 Getares 2 S H 23,245 0,709 1,971 0,095
4 Getares 3 L B 5,018 0,845 0,062 0,512

4 Getares 3 L B 14,880 0,431 0,126 0,493

4 Getares 3 L M 50,811 0,114 0,007 0,398

4 Getares 4 L H 10,766 0,312 0,071 0,157

4 Getares 4 L B 4,203 0,520 0,039 2,509

4 Getares 4 L M 62,143 0,137 0,012 0,099

4 Getares 4 Ru H 8,898 0,483 6,347 0,036

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo

407
Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie Tejido As Ni Co Cr
muestreo pez
4 Getares 5 L H 14,351 0,117 0,137 <LD
4 Getares 5 L B 2,117 1,836 0,107 1,131
4 Getares 5 L M 37,748 0,276 0,018 0,590
4 Getares 6 L B 0,314 0,136 0,016 0,189
4 Getares 6 L M 48,583 0,179 0,011 0,170
4 Getares 7 L B 3,607 1,650 0,148 2,619
4 Getares 7 L M 34,636 0,314 0,026 0,383
4 Getares 9 Ra H 12,161 0,049 0,574 0,061
4 Getares 9 Ra B 3,798 0,482 0,136 0,357
4 Getares 9 Ra M 11,664 0,260 0,025 0,415
4 Getares 10 S H 11,341 0,351 0,703 <LD
4 Getares 10 S B 5,871 0,248 0,118 0,426
4 Getares 10 S M 5,434 0,340 0,010 0,274
4 Isla Verde 2 S B 10,527 0,659 0,437 0,396
4 Isla Verde 2 S M 29,915 0,319 0,069 0,239
4 Isla Verde 3 S H 8,576 0,290 0,735 0,040
4 Isla Verde 3 S B 10,524 0,514 0,295 0,614
4 Isla Verde 3 S M 24,880 0,238 0,057 0,241
4 Isla Verde 3 L H 47,409 0,364 0,116 <LD
4 Isla Verde 6 L H 25,500 0,252 1,396 0,560
4 Guadarranque 1 L H 16,262 0,048 0,210 0,035
4 Guadarranque 1 L B 3,755 1,115 0,133 1,739

4 Guadarranque 1 L M 47,910 0,405 0,017 0,488

4 Guadarranque 2 L H 9,351 0,026 0,039 <LD

4 Guadarranque 2 L B 20,023 2,661 0,131 0,907

4 Guadarranque 4 Ru B 6,364 1,016 0,830 1,550

4 Guadarranque 4 Ru M 8,340 0,227 0,084 0,690

1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo

408
 Anexos

Tabla A.10 (cont.). Datos de concentración de As, Ni, Co y Cr en peces (mg/kg)

Punto de Nº
Muestreo Especie Tejido As Ni Co Cr
muestreo pez
4 Guadarranque 7 L H 1,296 0,045 0,040 0,003
4 Guadarranque 9 Ra H 3,965 0,395 0,428 0,061
4 Guadarranque 9 Ra B 2,382 1,249 0,299 0,809
4 Guadarranque 9 Ra M 20,629 0,433 0,185 0,244
4 Guadarranque 10 Ra B 2,720 0,579 0,411 0,783
4 Guadarranque 10 Ra M 16,184 0,330 0,098 0,282
4 Guadarranque 11 Ra H 7,268 0,791 1,170 0,052
4 Guadarranque 11 Ra B 3,124 0,621 0,500 0,502
4 Guadarranque 11 Ra M 3,124 0,621 0,500 0,502
1
S: Sargo; L: Lenguado; Ru: Rubio; Ra: Rascacio
2
H: Hígado; B: Branquias; M: Músculo

Anexo 5. Factores de concentración y enriquecimiento de As, Ni, Co y Cr en

peces

Tabla A.11. Factores de concentración y enriquecimiento (mg/kg de tejido/g/L de agua)

para As, Ni, Co y Cr en tejidos de lenguados, rascacios, rubios y sargos
Punto de As Ni Co Cr
Especie Tejido
muestreo CF ER CF ER CF ER CF ER
Getares L H 75,7 130,0 1,0 1,8 15,6 73,4 0,4 0,6
Getares L B 13,3 22,7 3,0 5,7 12,2 57,6 4,5 5,7
Getares L M 100,7 172,9 0,7 1,2 2,2 10,1 1,4 1,7
Getares Ra, Ru, S H 30,0 51,6 1,2 2,3 78,4 369,1 0,2 0,2
Getares Ra, Ru, S B 10,4 17,8 2,1 4,0 26,7 125,5 1,7 2,2
Getares Ra, Ru, S M 22,1 38,0 1,7 3,3 7,8 36,8 1,6 2,0
Isla Verde L H 195,7 255,2 1,4 2,1 22,2 233,7 0,6 0,7
Isla Verde L B 69,3 90,3 4,9 7,5 11,9 124,9 3,8 4,5
Isla Verde L M 303,3 395,5 0,3 0,5 1,0 10,6 0,6 0,7
Isla Verde Ra, Ru, S H 22,4 29,2 1,1 1,7 62,6 658,4 0,1 0,1
Isla Verde Ra, Ru, S B 25,3 33,0 2,4 3,7 14,6 153,9 1,1 1,3
Isla Verde Ra, Ru, S M 57,4 74,9 0,9 1,3 4,2 44,2 0,9 1,1
Palmones L H 70,9 108,2 1,9 4,3 12,2 29,5 0,8 1,1

409
Anexos

Tabla A.11 (cont.). Factores de concentración y enriquecimiento (mg/kg de tejido/g/L

de agua) para As, Ni, Co y Cr en tejidos de lenguados, rascacios, rubios y sargos
Punto de As Ni Co Cr
Especie Tejido
muestreo CF ER CF ER CF ER CF ER
Palmones L B 23,9 36,4 2,4 5,5 6,0 14,5 4,3 6,2
Palmones L M 113,0 172,4 0,1 0,1 0,6 1,5 0,5 0,8
Palmones Ra, Ru, S H 57,6 87,9 0,8 1,7 48,0 116,0 0,2 0,3
Palmones Ra, Ru, S B 44,8 68,4 2,6 5,9 11,8 28,5 2,9 4,2
Palmones Ra, Ru, S M 68,2 104,1 0,3 0,6 6,4 15,4 0,5 0,7
Guadarranque L H 40,3 53,8 0,9 1,8 1,7 4,5 0,1 0,2
Guadarranque L B 36,9 49,3 5,6 11,3 1,5 3,8 3,2 4,4
Guadarranque L M 192,9 257,5 0,9 1,9 0,2 0,6 1,5 2,0
Guadarranque Ra, Ru, S H 44,9 59,9 2,5 5,0 23,4 60,1 0,1 0,2
Guadarranque Ra, Ru, S B 23,0 30,6 2,3 4,7 6,4 16,3 1,8 2,5
Guadarranque Ra, Ru, S M 78,0 104,1 0,5 1,0 1,2 3,1 1,7 2,3
Puente
L H 270,5 271,3 1,3 1,8 10,9 22,4 0,7 0,8
Mayorga
Puente
L B 58,6 58,8 3,0 4,0 47,8 98,6 4,1 4,8
Mayorga
Puente
L M 222,3 222,9 1,1 1,5 0,9 1,9 1,9 2,2
Mayorga
Puente
Ra, Ru, S H 99,3 99,6 3,8 5,1 208,4 429,9 1,0 1,2
Mayorga
Puente
Ra, Ru, S B 39,1 39,2 1,5 2,0 27,6 56,9 1,2 1,4
Mayorga
Puente
Ra, Ru, S M 49,1 49,2 0,6 0,8 4,7 9,7 2,1 2,5
Mayorga

410
 Referencias

Referencias

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444
 
 
 
 
 
 
 
 

English summary
Contents 
 
Objectives 
 
Chapter 1: Introduction. Heavy metals in the environment 
 
Chapter 2: Solid phase extraction of copper traces in natural waters 
 
Chapter  3:  Lead  electrochemical  speciation  analysis  in  seawater  by  using 
AGNES and SSCP techniques 
 
Chapter 4: Assessment of the metal pollution in Algeciras Bay 
 
Conclusions 
 
References 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 English summary

Objectives

The importance of monitoring and assessing metal pollution in water samples is

unquestionable given the adverse effects resulting from their presence at certain
concentrations on environmental quality and on living organisms. Furthermore, the ability
of some heavy metals to biomagnificate or bioaccumulate, make them priority substances
in the field of water policy, which explicitly include these elements and some of its
compounds (Directive 2008/105/EC of the European Parliament and of the Council, of 16
December 2008).

The EU Water Framework Directive (Directive 2000/60/CE, of the European

Parliament and of the Council, of 23 October de 2000) establishes a framework for
community action in the field of water policy, whose purpose is to prevent and reduce
pollution, promote sustainable water usage, environmental protection, improve the
quality of aquatic ecosystems and mitigate the effects of floods and droughts. The
successful implementation of this policy framework will depend on the availability of
low-cost analytical tools and the technology to produce high-quality results.

The main objective of the present Doctoral Thesis is the study of new analytical
advances applied to the control of heavy metal pollution, mainly in aquatic ecosystems.
To this end, the concept of metal speciation will be taken into account.

449
English summary

Thus, this work has been focused on two important aspects: the development of
new methodologies for analysis of heavy metals, and the study of the anthropogenic
metal pollution in Andalusian coastal waters.

In order to achieve these aims, the following specific objectives have been
followed:

1. Development and application of new suitable methodologies for determining trace

levels of heavy metals in environmental samples with complex matrices, such as
seawater. This section is divided into two different studies:

- Development of a new preconcentration technique for Cu(II) by solid phase

extraction, using membrane disks which have been previously modified with an
organic chelating reagent.

- Study of the applicability of the techniques Absence of gradients and Nernstian

equilibrium stripping (AGNES) and Scanned stripping chronopotentiometry (SSCP) in
real seawater for the determination of free Pb(II) concentration and its speciation.

2. Environmental impact assessment in waters affected by intense anthropogenic

activity by evaluating levels of total metal and chemical speciation. The selected area
of study is Algeciras Bay, characterized by a chronic persistent impact. In its
surroundings, there are industries that directly or indirectly usually make use of heavy
metals, which are considered as priority pollutants. Therefore, the aim of this study is
to assess the level of contamination of some metals in water, sediments and biota.
These three environmental compartments are referenced in Water Framework
Directive for the monitoring of marine waters. Specifically the following studies are
proposed:

- Evaluation of the total levels of metals (As, Cr, Ni and Co, very significant metal in
steel and petrochemical industry) present in water and sediments, and evaluate their
distribution in different chemical fractions (speciation) in both compartments.

- Quantification of the concentration levels of metals in tissues of liver, muscle and gills
in fish of commercial interest.

- Identifying the more bioavailable chemical forms and therefore more potentially toxic
of the metals studied.

450
 English summary

Introduction: Heavy metals in the

environment

All life forms on Earth depend on water. The significance of water as an integral part of
the environment arises in the fact that it is an essential part of all living systems and is the
medium from which life evolved and in which life exists. Water covers 73% of the Earth’s
surface, almost three times as much as the continents. Over 97% of the world’s water is
seawater, unsuitable for drinking and for most agricultural purposes. Three-quarters of the
fresh water is trapped in glaciers and icecaps. Lakes and rivers are one of the main sources
of drinking water, even though taken together they constitute less than 0.1% of the total
water supply [Baird and Cann, 2005; Manahan, 2010; vanLoon and Duffy, 2011].

Water is also crucial to agriculture and economy and dictates the location of many
industrial facilities. It is used in vast amounts for a wide variety of purposes, such as
energy production, irrigation, refrigeration and washing. That is why ensuring availability of
adequate amounts of water of appropriate quality is a vital task in protecting the
environment [Pérez-Bendito and Rubio, 1999].

Human settlements and industries have long been concentrated along rivers, estuaries,
and coastal zones due to the predominance of waterborne trade. Historically, water
pollution was not a major problem until large centres of human population developed
[Radojevic and Bashkin, 2006]. Over the years, there has been a growth in population,
industries and agriculture. As a result, water quality has been affected. Industrial
discharges, domestic sewage, land drainage and oil spills are the primary sources of water
pollution.
451
English summary

Pollution is commonly defined as the addition of a substance by human activity to the

environment, which can cause injury to human health or damage to natural ecosystems.
The major categories of water pollutants are: radioactivity, organic chemicals, heavy
metals, acids and nutrients [Radojevic and Bashkin, 2006].

Special interest needs to be given to the group of heavy metals. This term refers to
any metallic chemical element that has a relatively high density (usually specific density of
more than 5 g/cm3) [Berkowitz et al., 2008].

The key principles that differentiate inorganic metal compounds from other chemicals
are [Fairbrother et al., 2007]:

1. Metals are naturally occurring constituents in the environment and vary in

concentrations across geographic regions.

2. All environmental media have naturally occurring mixtures of metals, and metals
are often introduced into the environment as mixtures.

3. Some metals are essential for maintaining proper health of humans, animals,
plants, and microorganisms.

4. The environmental chemistry of metals strongly influences their fate and effects on
human and ecological receptors.

5. The toxicokinetics and toxicodynamics of metals depend on the metal, the form of
the metal or metal compound, and the organism’s ability to regulate and/or store
the metal.

Heavy metals are conservative pollutants. Unlike organic wastes, metals cannot be
degraded in the environment by chemical or biological processes. They can, however, react
in the environment, but the resulting metal-containing compounds may be even more toxic.
Besides, plants and animals can regulate their metal content only over a limited range, and
metals that cannot be excreted remain in the body and are continually added to over the
life of the organism. This is known as bioaccumulation, an important feature of metals.
Besides, animals feeding of bioaccumulators have a diet enriched in these conservative
materials and as they also are unable to excrete them, they acquire an even greater
concentration of the substance. This is called the biomagnification process. Its chief
significance is that top predators, including humans, may be exposed to very large
concentrations of a conservative substance in their food. Therefore, heavy metals are a
potential human health risk, as well as a threat to natural resources [Clark, 2001].

In trace amounts, some heavy metals, such as Co, Cu, Ni, Se or Zn, are essential to all
organisms to accomplish specific catalytic functions, while some other like As, Cd, Pb, Hg,
Cr and Al are key elements due to their extreme toxicity even at low concentrations.

452
 English summary

However, at levels exceeding these requirements, all metals can disturb the metabolism by
binding non-specifically to biomolecules and inflicting oxidative damage, due to their ability
to catalyze redox reactions. This can result in the deactivation of essential enzymatic
reactions, damage to cellular structures (especially membranes), and DNA modification
(mutagenesis). In humans, exposure to high levels of metals can cause acute toxicity
symptoms, while long-term exposure to lower levels can trigger allergies and even cancers
[Berkowitz et al., 2008]. For this reason, heavy metals are regarded with great concern and
some of them have been classified as priority pollutants by the EU Commission and the US-
EPA [Tercier-Waeber and Taillefert, 2008].

The distribution of metals within the aquatic environment is governed by complex

processes affected by anthropogenic activities or natural processes including riverine or
atmospheric inputs, floor erosion, biological activities, water drainage and discharge of
urban and industrial wastewater [Carman et al., 2007]. Metal concentration in the water
column is generally low due to their low solubility. By contrast, metals accumulate in
sediments and aquatic organisms, reaching significant levels, with concentration factors
between 103 and 105 with respect to the dissolved phase. That is why sediments are
considered as sinks and, therefore, reservoirs of heavy metals in the aquatic environment.

Metals exist in the aqueous environment in a variety of forms: as aquo complexes that
are fully protonated or partially deprotonated, as complexes with inorganic ligands such as
chloride and carbonate, and as complexes with naturally occurring organic molecules
including discrete molecules that have low molar mass like citrate, as well as
macromolecules such as fulvic acid. The particular species distribution of a metal, as well as
its mobility, bioavailability, toxicity, bioaccumulation and biodegradability, depends not only
on its concentration but also on their physico-chemical associations with natural systems.
Other bulk aqueous solution properties including pH, ionic strength and redox status,
particle surfaces for adsorption and colloidal matter also play a role in defining species
distribution [vanLoon and Duffy, 2011].

As an obvious result, much recent research has been aimed at developing analytical
methods not for determining the total contents of elements but rather for answering these
two questions [Pérez-Bendito and Rubio, 1999]:

(a) In what forms are the elements present in the sample?

(b) What is the content of each form in the sample?

Chemical speciation is essential for discussing the chemical reactivity of trace

constituents in the environment, such as biological availability and toxicity, and the
geochemical behaviour of chemical species.

453
English summary

There is no generally accepted definition of speciation. Ure and Davidson in 2002

defined the term speciation as either the process of identifying and quantifying the
different, defined species forms or phases present in a material, or the description of the
amounts and kinds of these species, form or phases present [Ure and Davidson, 2002].
IUPAC published a document on chemical speciation terminology (IUPAC, 2000, Guidelines
for terms related to chemical speciation and fractionation of trace elements. Definitions,
structural aspects and methodological approaches) which recommends the term chemical
species as the form of an element defined as to isotopic composition, electronic or
oxidation state, and/or complex or molecular structure. Speciation analysis is an analytical
process for identifying and/or measuring the quantities of one or more individual chemical
species in a sample, and speciation of an element implies to know the distribution of an
element amongst defined chemical species in a system. The term fractionation, which is
distinguished from speciation, is a process involving the separation of an analyte or a group
of analytes from a certain sample according to physical (e.g., size, solubility) or chemical
(e.g., binding, reactivity) properties [Templeton et al., 2000; Hirose, 2006].

The interaction of metals with biota is highly dependent on their chemical forms, being
the impact of some metals strongly related to their oxidation state and/or organic or
inorganic structure, rather than to their total concentration. That is why speciation studies
are of interest to chemists doing research on the evaluation and chemical treatment of
waters, soils, and sediments, to biologists inquiring about the influence of species on
animals and plants, and to geochemists investigating the transport of elements in the
environment. However, the most important reason for speciation analysis is to identify the
metal species that have adverse effects on living organisms [Gonzalvez et al., 2009].

Taking into account all the facts mentioned above, new strategies for the
establishment of natural waters quality is essential. Thus, one of the aims of this work is
the development of new analytical methods to quantify heavy metals in environmental
samples; while the other objective is to study the distribution of heavy metals in different
compartments of aquatic environment in the Algeciras Bay and to assess bioavailability and
potential impact on aquatic biota.

454
 English summary

Solid phase extraction of copper traces

in natural water

Copper is an essential trace metal to all aquatic biota and human beings, but even a
small excess amount of it is extremely toxic to aquatic organisms [Das and Khangarot,
2011]. Among the different physiological and biochemical disturbances induced by copper,
it was shown that exposure to this metal negatively affects glycolysis [Carvalho and
Fernandes, 2008], Krebs cycle [Couture and Kumar, 2003], ionic and osmotic regulation
[Pinho et al., 2007], oxygen consumption and growth [Manyin and Rowe, 2009], among
others. Most of these effects can be directly or indirectly associated with an insufficient
production of energy to maintain cell metabolism and homeostasis. At extreme conditions,
this situation can even lead to death [Lauer et al., 2012].

Copper is a ubiquitous trace metal and occurs in soil, water, air and in the biosphere.
Freshwaters (pristine streams, rivers and lakes) contain 0.11-200 g/L total dissolved
copper. Coastal, bays and estuary waters contain copper concentration from about 0.0069-
20.0 g/L and open ocean water contains 0.0063-2.8 g/L [Crompton, 2007].

Copper is found in many wastewater sources including printed circuit board

manufacturing, electronics plating, wire drawing, copper polishing, paint and wood
preservative manufacturing and printing operations [Zamani et al., 2007].

Thus, the separation and isolation of low levels of copper from natural waters and its
determination has special importance. Spectrophotometric methods and flame atomic
absorption spectroscopy (FAAS) are very available techniques in many laboratories so they

455
English summary

are frequently used for determination of heavy metals, such as copper. FAAS is usually less
subjected to interferences than electrothermal atomic absorption (ETAAS) or inductively-
coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) (difficulties in the determination are caused
by matrix interferences, principally high salt content). However, its sensitivity can be
insufficient with some environmental samples containing subtraces amounts of copper
(detection limit of 0.02 mg/L copper in water without interferences by EPA method 220.1,
Methods for the Chemical Analysis of Water and Wastes (EPA/600/4-79/020)).

Consequently, a separation, preconcentration and matrix simplification step prior to

copper determination by FAAS is normally necessary.

Many techniques have been proposed to preconcentrate trace metals from matrices
that adversely influence atomic absorption spectrometric detection. The various pre-
concentration procedures include liquid-liquid extraction, coprecipitation, ion-pair extraction
and liquid membrane technology [Morizono et al., 2011; Duran et al., 2011; Shen and Yu,
2009, Aouarram et al., 2007]. These classical methods of extraction are expensive, time-
consuming, laborious and environmentally unfriendly.

Solid phase extraction (SPE) as an alternative to separation/preconcentration

procedures overcomes many drawbacks of liquid-liquid extraction. Some advantages of SPE
are simplicity, rapidity, ease of recovery of the solid phase, ability to attain a high
concentration factor and environmentally friendly [Shabani et al., 2009; Das et al., 2012].

Solid-phase extraction is a widely used sample-preparation technique for the isolation,

preconcentration and matrix simplification of selected analytes in samples with
unfavourable properties for direct analysis. The analytes are transferred to the solid phase
where they are retained for the duration of the sampling process. The solid phase is then
isolated from the sample and the analytes recovered by elution using a liquid or fluid, or by
thermal desorption into the gas phase [Poole, 2003]. The solid phase consists of a
particulate sorbent packed into columns of short length (called “cartridges”) or immobilized
in the form of a thin disk. Both formats use the same sorbent technology, but disks were
conceived to tackle several problems encountered in the use of cartridges. Namely, slow
sample processing rates, low tolerance to blockage by particles, the inadequate and
variable packing density of cartridges, to minimize non-specific matrix adsorption, and to
miniaturize sampling devices for processing small sample volumes [Poole et al., 2000].

An SPE method always consists of three to four successive steps. First, the solid
sorbent should be conditioned using an appropriate solvent. This step is crucial, as it
enables the wetting of the packing material and the solvation of the functional groups. In
addition, it removes possible impurities initially contained in the sorbent or the packaging.
The second step is the percolation of the sample through the solid sorbent. During this
step, the analytes are concentrated on the sorbent. The analytes to be extracted are
456
 English summary

partitioned between a solid phase and a liquid phase (sample) and must have a greater
affinity for the solid phase than for the sample matrix. drying step may also be advisable,
especially for aqueous matrices, to remove traces of water from the solid sorbent. This will
eliminate the presence of water in the final extract, which, in some cases, may hinder the
subsequent concentration of the extract and/or the analysis. The final step consists in the
elution of the analytes of interest by an appropriate solvent, without removing retained
matrix components [Camel, 2003; Buszewski y Szultka, 2012].

Numerous materials can be used as SPE sorbents. Classically, they are divided into
silica-based, carbon-based and macroporous polymeric sorbents. Of these, polymeric
sorbents are the most suitable because of their chemical stability and broad range of
physico-chemical characteristics [Fontanals y col., 2007]. In fact, silica-based sorbents are
unstable at pH extremes (2 > pH > 10) and have relatively low capacity [Pyrzynska, 2012];
while the traditional polymeric sorbent (poly(styrene-divinylbenzene), SDB) has the
important advantage of being stable in the whole range of pH [Buszewski y Szultka, 2012].
The selectivity of the disks can be improved by immobilization of suitable reagents onto the
solid sorbent.

The aim of this work was the use of the reagent pyridoxal salicyloylhydrazone (PSH)
(Figure E.1) as a selective modifying agent of the SDB disk for the highly selective
extraction, preconcentration and determination of very low trace amounts of copper ion in
seawater using SPE and determination by FAAS. Heterocyclic hydrazones, including PSH,
are an important group of ligands which have attracted attention on medicinal chemists
due to their remarkable antiviral, antibacterial and antimalarial effects, and antitubercular
activities [Fattorusso y col., 2008; Sankar y Pandiarajan, 2010; Sharma y col., 2011]. These
biological activities are based on their ability to form stable chelates with the transition
metal ions which can be retained on disks.

N OH O OH

N
H 3C N
H
OH

Figure E.1. Pyridoxal salicyloylhydrazone (PSH)

This reagent has been used in the spectrophotometric determination of several metals
as nickel, zinc, iron or zirconium [Gallego y col., 1982] and in the stripping voltammetric
determination of nickel [Aouarram y col., 2010], but nothing has been previously reported
457
English summary

about the use as a potential modifier of membrane disks. In this study, PSH has been
proposed for copper determination because of its good binding capacity to this ion.

The continuous variation (Job’s method) and the mole ratio methods (at constant
metal concentration and at constant ligand concentration) were applied in order to study
the stoichiometry of the Cu(II)-PSH complex. Methanol solutions of copper chelate buffered
at pH 4.5 were prepared and their absorbances were measured at 420 nm with visible
spectrophotometer. The copper/PSH ratio was found to be 2:3. The stability constant of the
complex was also determined using both methods curves and the mean value obtained was
K = (5,11 ± 0,8)·1021 (mol/L)-4.

2.1. Methodology
The methodology used for SPE was as follows: Extractions were performed with 47
mm diameter x 0.5 mm thickness 3M-EmporeTM SDB-XC membrane disks containing
poly(styrene-divinylbenzene) (16-m particles, 80-Å pure size). The composition of the
disks is 90% w/w poly(styrene-divinylbenzene) and 10% w/w PTFE fibers and their surface
area is 450 m2/g. The structure of SDB-XC provides unique selectivity, especially in the
retention of moderately polar analytes and displaying aromatic interactions allowing the
retention of PSH.

Before sample extraction, a preconditioning step, cleaning and conditioning of disks

were carried out in order to ensure an optimal extraction of copper ion. Thus, after
installing the membrane disk in the filtration apparatus, it was rinsed with 5 mL methanol
with the aim of preconditioning the disk and making the pass of following solvents easier.
Cleaning step consisted in washing the membrane disk with 10 mL of a 1 mol/L HNO3, 10
mL methanol and 10 mL acetonitrile by applying a slight vacuum to remove all metallic and
organic contaminants that could come from manufacturing process and the environment.
After all the solvents had passed through the disk, it was dried by passing air for a few
minutes. Conditioning step began by introducing a solution of PSH dissolved in methanol to
the reservoir of the apparatus. This solution was drawn slowly through the disk without
vacuum so that the whole disk surface was soaked. When the ligand had completely
penetrated inside the membrane and methanol had been evaporated at room temperature,
the disk was washed with 25 mL of water under vacuum and dried by passing air through
it. By this way, the membrane disk was modified by PSH and ready for sample extraction.

Then, the modified membrane disk was washed with 25 mL of water in order to prewet
its surface before the extraction of Cu(II) ions. Then, the sample containing copper traces
was passed through the disk under vacuum. The surface of the disk must be wet during all
extraction process. After the extraction, bulk water was removed from the disk and the
apparatus by sucking air through the disk under full vacuum for about 3 minutes. With this
458
 English summary

procedure, copper ions are quantitatively adsorbed on the modified disk. After the
extraction, the adsorbed copper was stripped from the modified membrane disk using a
proper acid solution. The copper concentration was determined at 324.8 nm by FAAS using
a Solaar-M Series spectrometer (Unicam, UK).

In order to re-use the disk, a last cleaning step was carried out. Thus, the membrane
disk was rinsed with 10 mL of 1 mol/L HNO3, 10 mL of methanol and 10 mL of water by
appling vacuum until the disk was completely dried before storing.

2.2. Results and discussion

2.2.1. Optimisation of the method
Some preliminary experiments were performed in order to investigate the quantitative
retention of Cu(II) ions by poly(styrene-divinylbenzene)membrane disks in the absence and
presence of PSH. It was found that, while the membrane disk itself did not show any
tendency for the retention of Cu(II) ions (<1%), the membrane disk modified by PSH was
capable to quantitatively retain Cu(II) ions in the sample solution.

The optimisation of the method was achieved by following a strategy study based on
two stages: first, a set of preliminary experiments were carried out by using the univariate
method in order to help to establish the ranges of critical variables; second, a fractional
factorial design 33-1 was employed to locate the optimum conditions for copper analysis.

(a) Univariate method

Choice of eluent
In order to choose the most effective eluent the retained copper ions were stripped
with varying concentrations of different acids. The recovery for samples containing 20 g of
Cu(II) in a 500 mL solution at pH 4.5 using 5 mg of PSH are summarized in Table E.1. The
quantitative elution of copper from the modified membrane disk could be accomplished by
using 5-10 mL of 0.5 mol/L HCl, or 10 mL of 1 mol/L HCl. Also, 10 mL of 1 or 2 mol/L HNO3
were adequate. Acetic acid could not produce a quantitative stripping of these metallic ions,
even at high concentrations. Subsequent quantitative elutions of the complex were carried
out with 10 mL of 1 mol/L HNO3 rather than HCl because nitrate ion is reported to be a
more acceptable matrix for FAAS and ETAAS measurements than chloride [Welz, 1985].

Effect of pH on the adsorption of Cu(II)

The effect of pH of the sample on the copper recovery using a modified disk with 5 mg
of PSH was studied as follows: 500 mL solutions containing 20 g Cu(II) were adjusted in
the pH range 3.5-5.5 by using 4 mol/L acetic acid/sodium acetate buffers. The resulting

459
English summary

solutions were passed through the modified membranes and then stripped with 10 mL of 1
mol/L HNO3. The obtained results are shown in Figure E.2. Maximum retention of metal
was achieved at the pH range of 4.5-5. Therefore, a pH 4.5 was chosen for the following
determinations.

Table E.1. Copper ions recovery from the modified membrane disks using different
stripping acid solutions (samples contained 20 g Cu2+ ions in 500 mL water at pH 4.5)
a
% Recovery for each acid concentration
Stripping acid solution
0.5 mol/L 1 mol/L 2 mol/L

10 mL HNO3 93.2 101.0 102.1

5 mL HNO3 91.7 95.7 93.7

10 mL HCl 100.7 101.4 96.4

5 mL HCl 100.3 96.8 95.7

10 mL CH3COOH 7.1 28.0 83.4

a
R.S.D. ≤ 1.2% for three replicate experiments

102%

98%
Cu(II) recovery

94%

90%

86%

82%
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
pH

Figure E.2. Effect of aqueous phase pH on extraction of copper ion (conditions: Cu(II)
amount: 20 g; sample volume: 500 mL; eluent: 10 mL of 1 mol/L HNO3; immobilised PSH
amount: 5 mg; n=3)

460
 English summary

Effect of flow rates

It was found that adsorption of the metal ion was quantitative and reproducible in the
range 10-20 mL/min. Thus, the flow rate of sample selected for all studies was 10 mL/min.
On the other hand, quantitative stripping of copper ions from the disk was achieved in a
flow rate range of 1-10 mL/min using 10 mL of 1 mol/L HNO3. At higher values of flow rate,
greater volumes of nitric acid are necessary to reach a quantitative stripping. Because of it,
the flow rate during the stripping was maintained at 5 mL/min throughout the experiments.

Effect of PSH amount

In order to investigate the amount of PSH on the quantitative recovery of Cu(II) by the
membrane disk, the solid-phase extraction was conducted by varying the amount of ligand
from 0 to 7.5 mg using 1 mg/mL PSH solutions in methanol (Figure E.3). The extraction of
copper ions was quantitative above 2.5 mg of ligand. Hence, for subsequent studies 2.5 mg
PSH sorbed on SDB disk was used.

100%

75%
Cu(II) recovery

50%

25%

0%
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Amount of PSH (mg)

Figure E.3. Effect of immobilised PSH amount on extraction of copper ion (conditions:
Cu(II) amount: 20 g; sample volume: 500 mL; pH: 4.5; eluent: 10 mL of 1 mol/L HNO3;
n=3)

(b) Experimental design: multivariate method

To select the optimum conditions for pH, amount of ligand immobilised on the disk and
time for immobilisation, a reduced factorial design was employed (fractional factorial design
33-1). With this kind of design the factors can be efficiently evaluated using a small fraction
461
English summary

of the experiments of the full factorial design. A total of ten experiments were carried out
including three repetitions of the central point. The variables were represented at three
levels, high, medium and low, denoted by (+1), (0), (−1), respectively.

The different variables and levels evaluated and the Pareto chart are shown in Table
E.2 and Figure E.4, respectively. The results of each experiment can be found in Table E.3.

Table E.2. Factor levels and selected values for the fractional factorial design 33-1 (samples
containing 20 g Cu2+ ions in 500 mL; 2.5 mg of immobilised PSH on the disk)
Low Level Medium Level High Level
Variable
(-1) (0) (+1)
Volume of HNO3 (mL) 5 10 15
pH of the sample 3.5 4.5 5.5
Concentration of HNO3 ( mol/L) 0.5 1 1.5

Pareto Chart of Standardized Effects

Variable: Cu Recovery (%)

pH(Q) 3.90

[HNO 3](Q) 1.72

[HNO 3](L) -0.84

V HNO 3(Q) 0.55

V HNO 3(L) 0.45

pH(L) -0.12

p=0.05
Standardized Effect Estimate (A bsolute Value)

Figure E.4. Pareto chart for fractional factorial design 33-1

462
 English summary

Table E.3. Variable levels and results of the experimental design 33-1 (random order for
experiments)

Volume of HNO3 concentration % Cu

Experiment pH
HNO3 (mL) (mol/L) Recovery
2 5 4.5 1.5 77.6
5 10 4.5 1 99.4
3 5 5.5 1 70.3
8 15 4.5 0.5 86.5
4 10 3.5 1.5 64.2
7 15 3.5 1 72.8
6 10 5.5 0.5 67.6
9 15 5.5 1.5 73.1
1 5 3.5 0.5 76.2
10 10 4.5 1 99.2
11 10 4.5 1 99.5

According to the Pareto chart, it can be concluded that the pH showed a significant
quadratic positive effect at confidence level of 95% being 4.5 the optimum value. Three-
dimensional (3D) plots for the measured responses were formed based on the model
polynomial functions to assess the change of the response surface. The relationship
between the response (Cu ions recovery) and the independent variables (pH, volume and
concentration of HNO3) can be understood by these plots. In Figure E.5 it can be seen that
the higher recovery is obtained when pH 4.5 and 10-15 mL of HNO3 are used. In Figure E.6
the best response is achieved when pH 4.5 and 1 mol/L HNO3 are used. Figure E.7 shows
the maximum recovery for 1 mol/L HNO3 and 10-15 mL of HNO3. Thus, the optimum
conditions were: pH 4.5 and 10 or 15 mL of 1 mol/L HNO3. 10 mL were selected to diminish
the elution volume.

463
English summary

100

Cu Recovery (%) 90
80
70
60
50
40
1
1

0
0
pH

95
NO
3

-1 VH 90
85
80

Figure E.5. Response surface plots (3D) showing the effect of pH and volume of HNO3

100
90
Cu Recovery (%)

80
70
60
50
40
1
1

0
0
[H
NO

95
pH
3

90
]

-1
85
80

Figure E.6. Response surface plots (3D) showing the effect of pH and concentration of
HNO3

464
 English summary

105
100
Cu Recovery (%) 95
90
85
80
75
70
65
1
1

0
0
[H
NO

95
NO
3
VH
3
]

90
-1
85
80

Figure E.7. Response surface plots (3D) showing the effect of concentration and volume
of HNO3

2.2.2. Analytical performance

Once the variables were optimised, the performance characteristics of the proposed
method were studied:

The reusability and stability of the modified disk was tested by monitoring recovery of
copper ions for several cycles. It was found that the use of the same disk modified with 2.5
mg of PSH resulted in no change in the recovery of 40 μg/L Cu(II) ion for at least 20 times
with a RSD of 1.2% (n=20). This indicates that the modified disk has a good reusability for
continuous usage.

The maximum capacity of the membrane disk was determined by passing 500 mL of an
aqueous solution containing 350 g copper at pH 4.5 through the disk, followed by
determination of the retained metal ions by FAAS. The maximum capacity was found to be
65.6±2.1 g of copper ion on the disk modified with 2.5 mg of PSH.

The linear dynamic range of the proposed method for Cu(II) ions was found in a
concentration range of 1-60 μg/L, being very appropriate for copper analysis in water
samples. The correlation coefficient and equation of the linear regression (n=10) were
R2=0.9982 and Absorbance (324.8 nm) = 0.0038 + 0.0047 [Cu(II)] (μg/L), respectively.
465
English summary

The break-through volume was checked by dissolving 5 g of copper in different

volumes (50, 100, 250, 500, 750, 1000 mL) of aqueous phase. The recovery of copper was
tested following the proposed procedure. It was observed that the sorption of copper was
quantitative for the studied range, being the breakthrough volume of 1000 mL. Thus, a
preconcentration factor of 100 using 10 mL of eluent was easily achievable being
comparable with other SPE methods.

The reproducibility of the proposed method for the extraction and determination of
copper was investigated and the recovery average of metal ion obtained from ten replicate
experiments using different disks was found to be 99.0±2.1% for 40 μg/L Cu(II) in the
sample. The precision of the method calculated by using the student’s t test for these ten
replicates was 1.5% at confidence level of 95%.

The detection limit (DL) of the method, calculated as 3 times the standard deviation of
blank samples (n=5), was 4 ng/L Cu(II) and the quantification limit (QL), calculated as 10
times the standard deviation, was 14 ng/L Cu(II).

The effect of diverse ions on sorption of copper was investigated. Thus, aqueous
solutions (500 mL) containing 20g Cu(II) and different inorganic salts present in seawater
(synthetic seawater composition) were taken and the proposed procedure was followed.
Furthermore, the influence of other trace metals present in seawater was evaluated using
higher concentrations as the usually found in this kind of samples [Grasshoff et al., 1983].
The results summarized in Table E.4 and E.5 showed that 20g of Cu(II) ions in the binary
mixtures are retained quantitatively by the PSH-modified membrane disk, indicating the
applicability of this method to complex samples.

The accuracy of the method was evaluated by the determination of Cu(II) in a certified
reference lake water TM-DWS-2. The method was also applied successfully to the analysis
of dissolved Cu(II) in two real seawater samples collected from the southwest coast of
Spain (Huelva Estuary). Samples were filtered and UV digested in order to remove
suspended and organic matter. The results (Table E.6) showed a very good agreement
between the experimental and certified values for reference water with a relative error of
2.8%. Measurements of Cu(II) ion in two seawater samples obtained by the proposed
method were also compared which those obtained by differential pulse anodic stripping
voltammetry (DPASV) (Application Bulletin No.231/2e; B12916, Metrohm). The relative
error for seawater samples (1 and 2) were 1 and 1.5 %, respectively. In both studies,
significant differences at 95% confidence limit were not found.

466
 English summary

Table E.4. Recovery of copper ions from binary mixtures with inorganic salts present in
seawater [Grasshoff et al., 1983] (20 g Cu(II); Vsample=500 mL)
Concentration of
% Cu
Inorganic salt inorganic salt
Recovery
(g/L)
NaCl 23.939 99.3
MgCl2·6H2O 10.825 96.7
Na2SO4 3.994 99.6
CaCl2·H2O 1.704 100.1
KCl 0.677 98.5
NaHCO3 0.196 99.4
KBr 0.098 100.8
H3BO3 0.027 102.7
SrCl2·6H2O 0.024 99.3
NaF 0.003 100.8

Table E.5. Recovery of copper ions from binary mixtures with trace metals present in
seawater [Grasshoff et al., 1983] (20 g Cu(II); Vsample=500 mL)
Concentration
Metal ion of metal ion % Cu Recovery
(g/L)
Al(III) 2.70 99.2
Fe(III) 5.58 101.1
Mn(II) 5.49 99.8
Ni(II) 5.87 99.3
V(V) 5.09 100.5
Zn(II) 6.54 99.2
Pb(II) 6.22 99.6
Bi(III) 0.63 99.2
Cd(II) 0.34 101.2
Co(II) 0.18 99.7
Tl(I) 0.61 99.4

467
English summary

Table E.6. Determination of Cu(II) ions in certified reference water (TM-DWS-2, lake
water) and real seawater (from southwest coast of Spain) by the proposed solid-phase
extraction method (n=2)
Cu(II) concentration Cu(II) found by the Relativo error
Sample
(g/L) proponed method (g/L) (%)
TM-DWS-2 168 ± 7.1 a 172.7 ± 2.3 2.8

Seawater 1 13.83 ± 0.51 b 13.97 ± 0.28 1.0

Seawater 2 26.11 ± 0.63 b 26.49 ± 0.12 1.5

a
Certified value
b
Determination by ASV, n=4

A comparison study with other SPE methods published by different authors in terms of
detection limit, reusability and range of linearity [Dindar et al., 2010; Moghimi, 2007a;
Moghimi, 2007b; Dalma et al., 2003; Shamsipur et al., 2000] was carried out. It can be
concluded that the method proposed in this work presents not only a great sensitivity with
low detection limit and a significant reusability, but it is also acceptable for seawater
samples analysis.

As a result, an accurate, reproducible and inexpensive method for preconcentration

and determination of trace amount of copper ion in natural waters has been developed.

468
 English summary

Lead electrochemical speciation analysis in

seawater by using AGNES and SSCP techniques

Lead is a ubiquitous environmental and industrial pollutant that accumulates in the

human body over a lifetime. The most important non-occupational sources of Pb are food,
water, air, smoking habits and alcohol consumption. Many industrial processes, such as
mining, household renovation, battery and automobile manufacturing, and also the
production of plastics, ceramics, paints and pigments, may involve human exposure to Pb
[Kasuba et al., 2010].

Its toxic effects have been known for centuries. It is known that exposure to this heavy
metal adversely affects human health by producing toxicity in several organs and systems
including the cardiovascular, renal, immune and reproductive ones, as well as on bones and
teeth [García-Lestón et al, 2012a; García-Lestón et al, 2012b; Mansouri and Cauli, 2009].

In natural waters, lead is found at trace levels. Freshwaters contain 0.13-60 g/L of
lead. Coastal, bays and estuary waters contain lead concentration from about 0.038-7.44
g/L and open seawater contains 0.000041-9.0 g/L [Crompton, 2007].

It is well-established that the total concentration of an element is a poor indicator

of its reactivity, bioavailability or toxicity [Tessier and Turner, 1995]. Therefore, there
is a great interest on the development of new analytical methods to study the
speciation of heavy metals in environmental samples. Metal speciation greatly
determines the behaviour and toxicity of metals in the environment. Speciation refers
469
English summary

to the occurrence of a metal in a variety of chemical forms, which include free metal
ions, metal complexes dissolved in solution and sorbed on solid surfaces, and metal
species that have been coprecipitated in major metal solids or that occur in their own
solids [Fairbrother et al., 2007].

Stripping voltammetry (SV) techniques have been widely employed to study metal
speciation in natural waters [Mota et al., 2012]. However, adsorption of organic
species on the electrode surface appears as one of the most serious problems to
obtain reliable measurements of trace metal speciation [Town and van Leeuwen,
2002; van Leeuwen and Town, 2002a]. Recently, the important features of stripping
chronopotentiometry (SCP) [Town and van Leeuwen, 2001], especially when operated
in scanned deposition potential (SSCP) mode have been demonstrated [van Leeuwen
and Town, 2003a]. SSCP technique is particularly suited for trace metal complexation
studies due to its sensitivity and ability to provide information about dynamic nature of
complexes and heterogeneity of ligands. Moreover, it is a technique that is relatively
insensitive to organic adsorption interferences [Town and van Leeuwen, 2002; van
Leeuwen and Town, 2002a]. Data interpretation of SSCP curves is straightforward for
homogeneous metal-ligand systems. Although such curves are basically different from
conventional voltammograms (they are distinctly steeper and do not conform to a
linear log vs E plot), the shift in half-wave deposition potential in the presence of
complexing agents, as well as the effect of reduced diffusion coefficients for the metal
complex species, can be interpreted easily, analogous to the DeFord-Hume expression
for a voltammetric wave [van Leeuwen and Town, 2002b; Town and van Leeuwen,
2003]. The change in slope of the SSCP wave is an unambiguous indicator of the
degree of heterogeneity of the metal complexes present. SSCP allows this effect to be
distinguished from that of possible irreversibility in the electrochemical reaction [van
Leeuwen and Town, 2003b].

On the other hand, the knowledge of the free metal ions in natural waters is
essential to predict the biouptake of trace elements by organisms. Ion selective
electrodes (ISE) has been widely used to obtain the free metal concentration, but they
are not sensible and selective enough to measure the metal ions which are usually
found at very low concentrations in natural waters [Crompton, 2007]. A new stripping
technique for the determination of free metal ion concentration (Absence of gradients
and Nernstian equilibrium stripping – AGNES) has been recently proposed [Galceran et
al., 2004]. In this technique the amalgamation of the metal in the mercury electrode
during the deposition step is allowed to proceed until reaching Nernstian equilibrium
and the stripping step is applied when a special situation has been achieved: there is

470
 English summary

no concentration gradient of any species. The response function to be measured after

a prescribed potential program is not a potential, but the current. The concentration of
amalgamated metal and the measured faradaic stripping current are proportional to
the free metal ion concentration in the bulk, with the advantage of having lower
detection limit when compared to commercial ISEs.

The aim of this work is to compare the results of SSCP and AGNES techniques and
verify their suitability in the analysis of lead in seawater samples, tackling the
difficulties of low metal concentrations and a complex matrix. The simultaneous use of
these techniques in the same electrochemical cell was proposed. It is advantageous for
the speciation study in case heterogeneous complexes are present. In order to validate
the AGNES measurements, free metal concentrations were compared with the
theoretical values predicted by the equilibrium speciation code MINTEQ [Herndon and
Flowery Branch, 1999; Gustafsson, 2010].

3.1. Theoretical fundaments

Consider the scheme of a metal ion M which can associate reversibly with a ligand L to
form an electroinactive complex ML, and to be reduced to the metal atom M0, at an
electrode:

ka
M+L ML (E.1)
kd
ne-
M0

where ka and kb are the association and dissociation rate constants, respectively, and are
related with the stability constant K of the complex:

c ML ka
K  (E.2)
cL cM kd

Under conditions of ligand excess, cL,t  cL and K’ can be defined as::

c ML
K'  Kc L,T  (E.3)
cM

where c ML , c M and c L are the concentration of ML, M and L, respectively, and c L,T is the
total concentration of ligand [Pinheiro and van Leeuwen, 2004].

471
English summary

- Scanned stripping chronopotentiometry (SSCP)

Stripping chronopotentiometry, SCP, is a two-step technique: the deposition step is
identical to that for SV, but quantification of the accumulated metal is achieved by
application of a constant oxidising current, Is, and the analytical signal is the time taken for
reoxidation (the transition time, ). At low applied oxidising currents, reoxidation occurs
slowly (thus, the analytical signal is relatively large) and practically all of the accumulated
metal is fully depleted from the electrode (Is constant) [Town and van Leeuwen, 2001];
this mode determines a regime corresponding to depletive SCP or diffusion-limited
conditions. Under these conditions, SCP is a straightforward application of Faraday’s law
and yields a direct quantitative relationship between the analytical signal and the species
concentrations in the sample [van Leeuwen and Town, 2002c]. For larger stripping
currents, conditions approach those of semi-infinite linear diffusion (Is1/2 constant),
stripping is incomplete and the post-peak baseline is influenced by the ongoing faradaic
process that follows incomplete depletion of the mercury drop.

SSCP curves are constructed from a series of measurements made over a range of
deposition potentials, Ed. The thermodynamic complex stability constant can be calculated
from the shift in the half-wave deposition potential, Ed,1/2, irrespective of the degree of
lability of the system [Pinheiro and van Leeuwen, 2004]:

E d,1 / 2  
RT
Ln1  K '  LnM*  L / M*  (E.4)
nF
* *
where  M L and  M are the limiting wave heights in the presence and absence of ligands,
respectively. R is the gas constant (8.31 J/mol K), F is the Faraday constant (96485 C/mol),
n is the number of electrons involved in the faradaic process (2), and T is the temperature
(296.15 K).

Using the mass balance for the metal, the free metal ion concentration is given by:

c M, T
cM  (E.5)
1  K'

where c M, T is the total metal concentration of metal.

The plots of  vs. Ed are very rich in speciation information since they can cover a relevant
part of stability distribution spectrum, and the corresponding parts of the rate constants
distributions.

For the complete depletion mode of SSCP a known rigorous theoretical equation is available
for the full wave in the kinetic current regime [van Leeuwen and Town, 2004]. The
characteristic parameters of the SSCP waves (the limiting wave height *, and the half-
472
 English summary

wave deposition potential Ed,1/2) provide an indicator of changes in lability of metal complex
systems [Pinheiro and van Leeuwen, 2004]. Its features also allow to identify the presence
of heterogeneous ligands [Buffle, y col., 1987; Town, 2008]. In fact, humic or fulvic
substances presence causes a decrease in the height of the SSCP curves and spread out
along the Ed axis compared to homogeneous systems [Van Leeuwen y Town, 2003a]. In
samples where heterogeneous complexes are presence, equation (E.4) will not be suitable
because in these cases the experimental curves get flattened and the theoretical SSCP
curves cannot be adjusted to the experimental data.

- Absence of gradients and Nernstian equilibrium stripping (AGNES)

AGNES consists of two conceptual stages [Galceran et al., 2004]:

1. First stage: it is a deposition or preconcentration stage where the aim is to reach a

special situation of no concentration gradient at either side of the electrode surface, while
keeping a constant ratio (determined by the applied potential, E1) of the electroactive
couple concentrations due to the Nernstian equilibrium:
*
cM o  nF 
Y  exp   (E1  E 0 ' )  (E.6)
*
cM  RT 

where Y is the concentration gain (or preconcentration factor), c M * refers to the metal
o
0
concentration inside the mercury electrode, and E ' stands for the formal standard potential
of the redox couple of the metal. The duration of this step is t1 and can be reduced when
the stage is split into two sub-stages (Figure E.8) [Companys et al., 2005]:

(a) A potential step corresponding to a large concentration gain Y1,a (under diffusion
limited conditions) during a time t1,a so that most of the required number of moles
needed inside the electrode are supplied from the medium.

(b) A potential step at the desired concentration gain Y (which can also be denoted as
Y1,b) so that the profiles become sufficiently homogeneous after a time t1,b. Then, a
time tw without stirring is applied in order to be on the safe side and avoid possible
stirring effects on the measurement along the second stage.

If the potential step corresponding to Y1,a is applied during a very large time, an excess of
metal enters the mercury electrode and there will be an overshoot of metal concentration
inside the amalgam. To avoid this overshoot of the final current, a sufficiently long second
potential step is necessary at the desired gain Y1,b. It was demonstrated [Companys et al.,
2005] that when working with a constant concentration of free ligand, the ratio t1,b = 3t1,a
could be used to compensate for any possible overshoot and reach AGNES conditions.

473
English summary

E
Measurement
+

E2

Stirring Unstirred

E1,b

E1,a

-
t1,a t1,b tw t

t1 t2

Figure E.8. Schematic potential and stirring program for AGNES with the strategy of
splitting the first stage [Companys y col., 2005]

Previous the AGNES procedure, a differential pulse polarography (DPP) experiment was
carried out daily in order to obtain Epeak and avoid the small drifts in the reference
electrode. By combining Eq. (6) with the well-known expression for the DPP peak for the
planar electrode [Bard y Faulkner, 2001] we obtain that the preconcentration factor Y can
be determined from this Epeak value:

DM  nF  E DPP 
Y exp    E 1  E peak    (E.7)
D M0  RT  2  

where DM and D M 0 are the diffusion coefficients for the free metal ion and the reduced metal
inside the amalgam (DPb = 9.85·10-10 m2/s y DPb0 = 1.25·10-9 m2/s), and E DPP is a
characteristic parameter of the DPP experiment.

*
2. Second stage: A stripping stage in order to measure the final concentration c M o. A

sufficiently less negative potential E2 is applied under diffusion-limited conditions, so that

the response function (the measure current I at a certain time t2) is proportional to the free
ion concentration:

474
 English summary

*
I faradaic  hc M (E.8)

As the measured current I contains components other than the Faradaic one, there is a
need to subtract a blank from the total current. The blank used in this work is called shifted
blank [Galceran et al., 2007], where the same potential program is applied as in the main
measurement, but with the potentials shifted a fixed Eshift towards less negative potentials,
so that the Y value and thus the Faradaic current are negligible. The subtraction of this
blank will allow to eliminate the contributions to the current other than the Faradaic one.

3.2. Material and Methodology

All reagents and solvents were of the highest purity available (pro analysis or Suprapur
grade) and all aqueous solutions were prepared using Milli-Q deionised water (Millipore,
USA).

NaNO3 was used as the inert supporting electrolyte and prepared from solid (Merck,
pro analysis). The synthetic seawater samples were prepared as described before [45] by
dissolving inorganic salts in Milli-Q water [Grasshoff et al., 1983]. Seawater samples were
collected from the beach located in Faro, southern Portugal, and placed in 2 L PVC bottles.
The pH was 8.6 and the total organic carbon (TOC) was 2.01 mg/L. Previous studies
showed that Pb(II) concentration in these seawater samples was about 10-9 mol/L [Santos-
Echeandía y col., 2012].

Prior to analysis, the content of Pb(II) traces in NaNO3 and the inorganic salts used to
prepare the synthetic seawater samples was evaluated by using Square Wave Anodic
Stripping Voltammetry (SW-ASV). It was found that the Pb(II) concentration in the salts
was less than 5.04·10-9 y 6.70·10-9 mol/L, respectively.

SSCP and AGNES experiments were performed using Eco Chemie Autolab PGSTAT12
potentiost attached to Metrohm 663VA stand and to a computer using the GPES 4.9 (Eco
Chemie) software package. The working electrode was a Metrohm hanging mercury drop
electrode. The auxiliary electrode was a glassy carbon electrode and the reference
electrode was Ag | AgCl | KCl (3 mol/L) encased in 0.55 mol/L NaNO3.

Each AGNES and SSCP experiment was subsequently carried out in the same
electrochemical cell during the same day. Both included calibration plots using NaNO3 at a
given concentration of total lead (1.4·10-6 mol/L) and at ionic strength similar to that for
seawater (0.55 mol/L). Calibrations were performed at low pH (<4) so the total metal
concentration was equal to the free metal concentration. Then the cell was properly
cleaned and seawater was placed in it. Since the amount of lead in the seawater samples
was not high enough to study the speciation (~ 10-9 mol/L) an aliquot of lead solution was

475
English summary

added in order to make the concentration of total lead 6·10-7 mol/L. The pH values (2.7; 5;
6; 7 and 8.6) were adjusted using HNO3 solutions or the buffers MES (2-
morpholinoethanesulfonic acid) 0.2 mol/L at pH 6 or MOPS (3-morpholinopropanesulfonic
acid) 0.2 mol/L at pH 7.

- AGNES procedure

After the solutions were purged with oxygen-free nitrogen, a DPP experiment was
performed with the largest mercury drop (area 0.52 mm2) so that the planar electrode
expression (7) could be applied, and Epeak was obtained. The modulation amplitude (EDPP)
was 0.04995 V. This way the E1-value (Eq. (E.7)) (corresponding to a desired Y) was
calculated and applied in AGNES experiments (in which the drop size was 0.25 mm2). The
potential program consists in splitting the first stage into two potential steps [Companys et
al., 2005]:

1. First stage:

(a) E1,a under reduction diffusion limited conditions, corresponding to Y1,a = 1·108
during t1,a = 35 s for calibration and samples at pH < 7 or t1,a = 70 s for samples at pH
> 7. These time values were chosen since they provided a response current in the
mean measurement higher enough than the current in the shifted blank Isb (at least
Ifaradaic > 3Isb).

(b) E1,b corresponding to the desired concentration gain: Y1,b = 50 and t1,b = 105 s for
calibration and samples at pH < 7 or Y1,b = 100 and t1,b = 210 s for samples at pH > 7.
The waiting time (without stirring) was tw = 50 s.

2. Second stage:

E2 corresponding to Y2 = 1·10-8 under re-oxidation diffusion limited conditions for 50 s, with

the response current being read at t2 = 0.16 s.

The shifted blank was made using AGNES 1P with Y1 = 0.01 and Y2 = 2·10-12, being
negligible gains compared to the Y values of the main measurement.

The program MINTEQ was used to obtain the free metal concentration during the
calibration in order to calculate the h value.

- SSCP procedure

Stripping chronopotentiometry measurements were carried out in the same sample

where AGNES was applied. During the deposition step, the potential was held at Ed for a
deposition time of 45 s, followed by the application of the oxidising strip current Is of
476
 English summary

2.5·10-9 A. The Is value corresponds to conditions that approached complete depletion (I
constant) [Town and van Leeuwen, 2001]. The SSCP waves were constructed from a series
of individual SCP measurements, by plotting the peak area (dt/dE) as a function of the
deposition potential Ed.

3.3. Results and discussion

3.3.1 AGNES
- Epeak and h evaluation
Epeak value was evaluated by applying a DPP to a NaNO3 solution of 0.55 mol/L ionic
strength and pH 3.44, with an added concentration of Pb(II) of 6·10-7 mol/L. Epeak values
were slightly different for each experiment. Thus, Epeak value ranged from -0.4161 to
-0.4390 V. After the DPP was carried out, the h parameter was calculated by AGNES
implementation in the calibration solution (NaNO3 0.55 mol/L) at a concentration range of
Pb(II) between 3·10-9 and 1.4·10-6 mol/L. The h parameter was found from the slope of the
linear regression of Ifaradaic versus the free [Pb(II)] data predicted by the equilibrium
speciation code MINTEQ from the total concentration of Pb(II) in each addition. This
parameter ranged from 0.340 to 0.389 A (mol/L)-1.

The h values were no affected by pH changes. Thus, the difference between the pH
value of the calibration solution and that of the sample was consider immaterial, since h
was found to be the same for a large set of pH values [Galceran et al., 2007].

- Limit of Detection and Quantification

Prior to AGNES application, the limit of detection (LOD) of this technique was studied
using synthetic seawater without any added Pb(II). The LOD (n=7) was obtained from
LOD=KSb for a numerical factor K=3 according to the desired confidence level (95%),
being Sb the standard deviation of the blanks concentrations. LOD was found to be
6.34·10-9 mol/L and 3.06·10-9 mol/L for Y=50 and Y=100, respectively. The limit of
quantification, calculated as LOQ = KSb for a numerical factor K=10, was 2.11·10-8 mol/L
and 1.02·10-8 mol/L for Y=50 and Y=100, respectively.

- Applicability of AGNES in synthetic seawater for the determination of free Pb(II)

concentration
The procedure was performed in synthetic seawater at different pH values by
comparing the obtained results with the theoretical ones predicted by MINTEQ.
477
English summary

The total concentration of the synthetic sample was 6·10-7 mol/L in Pb(II) and its pH
was modified in range between 2.7 and 8.6.

Table E.7 shows the values of free metal concentration and the conditional stability
constant K’ obtained at pH 2.7; 5; 6; 7 and 8.6 provided by AGNES and MINTEQ. It can be
seen on the table that the higher the pH of the sample the lower the free Pb(II)
concentration obtained by AGNES. Thus, the bulk conditional stability constant clearly
increases when increasing pH. The free metal concentrations experimentally obtained with
AGNES and those obtained with MINTEQ were comparable, although there are some slight
differences, which could probably be due to the constants used (the constants in the
databases are usually obtained at higher concentrations of both metal and ligand).
Considering the difficulties in theoretically determination of the free metal concentration
[Turner, 1995] the experimental results can be accepted as satisfactory. This makes AGNES
a useful technique to get the free bulk metal concentration.

Table E.7. Mean values of free Pb(II) concentration and conditional stability constant
obtained in synthetic seawater using AGNES. Comparison with MINTEQ calculations (total
Pb = 6.0·10 -7 (n=3))
Sample AGNES (synthetic seawater) MINTEQ

pH Cfree Pb(II) (mol/L) K´ Cfree Pb(II) (mol/L) K´

-8 -10 -8
2.7 5.6·10 ± 9.4·10 9.66 ± 0.12 6.0·10 9.00

5 5.5·10-8 ± 8.0·10-10 9.68 ± 0.16 5.9 ·10-8 9.17

6 5.5·10-8 ± 9.7·10-10 9.90 ± 0.39 5.8·10-8 9.34

7 4.4·10-8 ± 1.4·10-9 12.90 ± 0.18 5.5·10-8 9.91

8.6 1.6·10-8 ± 1.5·10-9 37.80 ± 0.23 1.8·10-8 32.33

- Applicability of AGNES in real seawater for the determination of free Pb(II) concentration

AGNES was also applied to real seawater from Faro Beach. As the concentration in
Pb(II) was very low and the aim of this study was to investigate the speciation of this metal
in a saline matrix, the sample was spiked with a certain amount of Pb(II) solution in order
to make the concentration 6.0·10-7 mol/L. The results are gathered in Table E.8. The bulk
conditional stability constant for lead obtained by AGNES clearly increases when increasing
pH. It was also found that the real seawater behaves the same way as the synthetic water:
the free metal concentrations obtained from AGNES and MINTEQ were in a very good

478
 English summary

agreement. For pH 2.7; 5; 6 and 7, the K´ values are similar to those found in synthetic
water. For pH 8.6, K’ is greater in seawater than in synthetic water due to the lower free
metal concentration found in seawater as a consequence of organic complexation.

Table E.8. Mean values of free Pb(II) concentration and conditional stability constant
obtained in real seawater using AGNES. Comparison with MINTEQ calculations (total Pb =
6.0·10 -7 (n=3))
Sample AGNES (real seawater) MINTEQ

pH Cfree Pb(II) (mol/L) K´ Cfree Pb(II) (mol/L) K´

2.7 5.5·10-8 ± 3.5·10-9 9.97 ± 0.40 6.0·10-8 9.00

5 5.4·10-8 ± 1.2·10-9 10.06 ± 0.23 5.2·10-8 10.54

6 4.7·10-8 ± 1.4·10-9 11.66 ± 0.27 4.8·10-8 11.50

7 3.1·10-8 ± 1.6·10-9 18.29 ± 0.96 3.6·10-8 15.67

8.6 1.06·10-8 ± 9.2·10-10 55.01 ± 4.7 1.1·10-8 53.55

3.3.2 SCP and SSCP

- Reproducibility in SCP and SSCP
The reproducibility of the analytical signal in SCP at Ed = -0.5 V and the conditions
mentioned above was investigated. Metal solutions in NaNO3 0.55 mol/L containing 1.4·10-6
mol/L Pb(II) were used, and for 6 replicate experiments the transition time was found to be
10.8 ± 1.0 s, with a R.S.D. of 9%.

The reproducibility of the SSCP curves was also studied at the same conditions. The
waves can be seen in Figure E.9 and the E0, E1/2 and*values are shown in Table E.9.

479
English summary

40
35
30
25
 (s)

20
15
10
5
0
-0.57 -0.55 -0.53 -0.51 -0.49 -0.47 -0.45 -0.43 -0.41
Ed (V)

Figure E.9. Four experimental SSCP waves (transition time against the deposition
potential) measured for 1.4·10 -6 mol/L Pb(II) in NaNO3 0.55 mol/L at conditions mentioned
above (the continuous lines are the fitted SSCP waves)

Table E.9. Reproducibility of SSCP: limiting transition time (*), half-wave deposition
potential (E1/2) and standard redox potential (E0) values at conditions mentioned above

Replicate  (s) E1/2 (V) E0 (V)

1 33.3 -0.50275 -0.468

2 36.3 -0.50475 -0.469

3 34.3 -0.50025 -0.466

4 34.2 -0.50075 -0.466

- Applicability of SSCP in synthetic seawater for the analysis of Pb(II) speciation

After a calibration curve with 0.55 mol/L NaNO3, synthetic seawater with 6.0·10-7 mol/L
in Pb(II) was analysed. Figure E.10 shows the experimental data for five pH values and the
fitted SSCP curves using the homogeneous expressions (Eq. (2) in Ref. [van Leeuwen and
Town, 2003a]). The waves were normalised using the limiting transition time and E0 for
Pb(II) in NaNO3 in the absence of any ligands. It was found that the experimental SSCP
curves are in perfect agreement to those predicted by the theory, thus the homogeneous
480
 English summary

expressions fit very well confirming the relatively low heterogeneity of lead complexes. At
pH 8.6, there is a loss of lability that can be observed as the significant decrease in *
relative to the metal-only case. The SSCP K’-values were calculated (see Table E.10) using
the expression for a homogeneous system (Eq. (E.4)). The K’-values remain constant at pH
2.7; 5 and 6, but when pH increases up to 7 or 8.6 the stability constant gets higher, which
means that the free metal concentration is lower.

- Applicability of SSCP in real seawater for the analysis of Pb(II) speciation

SSCP was applied to real seawater after obtaining a calibration curve with 0.55 mol/L
NaNO3. The total concentration in Pb(II) was 6.0·10-7 mol/L. Figure E.11 shows the
experimental data for five pH values and the fitted SSCP curves. The waves were
normalised using the limiting transition time and E0 for Pb(II) in NaNO3 in the absence of
any ligands. It can be seen that at pH 2.7; 5 and 6, the experimental SSCP curves fit with
the theoretical values. But the slope of the curves at pH 7 and 8.6 get flattened which may
be an indication of the presence of heterogeneous ligands, like natural organic matter in
solution. At pH 8.6 there is a loss of lability. The K’-values at different pH values are shown
in Table E.11. As happened in synthetic seawater, the conditional stability constant K’ for
lead remains constant for the lowest pH values, meanwhile it increases when the pH is 7 or
8.6.

In order to understand the behaviour of real seawater at high pH values, different

concentrations of organic matter (such as fulvic acids) were added to a synthetic seawater
sample with 6·10-7 mol/L in Pb(II) at pH 8.6. Figure E.12 shows the experimental data and
the fitted SSCP curves -normalised as pointed out before- for a synthetic seawater sample
with three different concentrations of fulvic acids (1, 2 and 5 mg/L). When different
amounts of fulvic acids are added to the synthetic sample at pH 8.6, the slopes of the
experimental curves get flattened, as happened with real seawater because of the presence
of heterogeneous ligands. This way it has been shown that a change in the slope of the
SSCP curve is a clear indicator of the presence of heterogeneous ligands in solution.

481
English summary

1.0

0.8

0.6
/*M

0.4

0.2

0.0
-0.15 -0.13 -0.11 -0.09 -0.07 -0.05 -0.03 -0.01 0.01 0.03
0
Ed - E M (V)

Figure E.10. Experimental SSCP data measured for 6·10 -7 mol/L Pb(II) in synthetic
seawater at pH 2.7 ( ), 5( ), 6( ), 7( ) and 8.6( ) (the continuous lines are the fitted
SSCP waves)

Table E.10. Mean values of limiting transition time *, half-wave deposition potential E1/2
and conditional stability constant K’ obtained in synthetic seawater with 6·10 -7 mol/L Pb(II)
using SSCP (n=3)
SSCP in synthetic seawater
pH
* (s) E1/2 (V) K’ a

Calibration 16.48 ± 0.33b -0.48305 ± 0.00246d -

(3.44)
2.7 16.23 ± 1.34c -0.49575 ± 0.00318e 8.14 ± 0.71

5 16.09 ± 0.14c -0.49525 ± 0.00141e 7.88 ± 0.04

6 15.99 ± 0.29c -0.49525 ± 0.00212e 7.96 ± 0.23

7 13.46 ± 1.56c -0.50225 ± 0.00318e 12.66 ± 1.71

8.6 9.14 ± 1.08c -0.51125 ± 0.00141e 38.57 ± 1.66

a
K’ values obtained from the equation (E.4)
b *
M d
value E1/2,M value
c *
M e
L values E1/2,M+L values

482
 English summary

1.0

0.8

0.6
/*M

0.4

0.2

0.0
-0.2 -0.18 -0.16 -0.14 -0.12 -0.1 -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02
0
Ed - EM (V)

Figure E.11. Experimental SSCP data measured for 6·10 -7 mol/L Pb(II) in real seawater at
pH 2.7 ( ), 5( ), 6( ), 7( ) and 8.6( ) (the continuous lines are the fitted SSCP
waves)

Table E.11. Mean values of limiting transition time *, half-wave deposition potential E1/2
and conditional stability constant K’ obtained in real seawater with 6·10 -7 mol/L Pb(II)
using SSCP (n=3)

SSCP in real seawater

pH
* (s) E1/2 (V) K´a
Calibration 16.39 ± 0.19b -0.48252 ± 0.01924d -
(pH 3.44)
2.7 13.28 ± 1.17c -0.48208 ± 0.01556e 11.86 ± 0.85

5 15.69 ± 1.83c -0.48525 ± 0.01582e 8.56 ± 0.74

6 15.75 ± 1.83c -0.48525 ± 0.01636e 8.84 ± 0.49

7 12.97 ± 1.54c -0.52975 ± 0.00141e 25.34 ± 2.00

8.6 8.02 ± 1.44c -0.54650 ± 0.00106e 158.42 ± 26.29

a
K’ values obtained from the equation (E.4)
b *
M d
value E1/2,M value
c *
M e
L values E1/2,M+L values
483
English summary

1.0

0.8

0.6
/*M

0.4

0.2

0.0
-0.2 -0.18 -0.16 -0.14 -0.12 -0.1 -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0.02

Ed - E0M (V)

Figure E.12. Experimental SSCP data measured for 6·10 -7 mol/L Pb(II) in synthetic
seawater with different concentrations fulvic acids: 1 ( ), 2 ( ) and 5 mg/L ( ) (the
continuous lines are the fitted SSCP waves)

- Comparison between AGNES and SSCP

AGNES provides the free metal ion concentration directly from Eq. (E.8), while SSCP
provides the value of the stability constant, K’, from the shift in the half-wave deposition
potential (Eq. (E.4)). Therefore, the comparison of the results is not direct, being necessary
to calculate K’ from the free metal concentration using Eq. (E.5) in the case of AGNES, or
the reverse in the case of SSCP. The values computed with the free metal concentration
provided by AGNES are the stability constants corresponding to the bulk concentrations,
meanwhile the ones obtained from SSCP are an average of the stability constants all along
the diffusion layer (which span from the bulk value to the one at the electrode surface,
where -under diffusion limited conditions- K is an average of the free sites [Garcés et al.,
1996]).

The SSCP stability parameter K’-values were similar in both synthetic and real samples
to those calculated from the free metal concentration provided by AGNES at every pH,
except 7 and 8.6 for real seawater. At these pH values, the SSCP stability parameters K’
were much higher than the ones computed from the free metal obtained by AGNES. In

484
 English summary

these conditions the SSCP slope was flattened, thus the K’ value provided were not real and
can not be comparable to those given by AGNES.

In conclusion, it was found that stability constant values obtained by AGNES were in
reasonably agreement with the ones computed by MINTEQ. Furthermore, there is a good
correlation between the results provided by AGNES and SSCP in synthetic and real
seawater at every pH, except at pH 7 and 8.6 for seawater. This fact supports the SSCP
calculation methodology used to calculate the free metal concentration in the case of
absence of heterogeneous ligand in the sample.

SSCP techniques give more information about the system than AGNES. However,
AGNES can be a useful tool in the determination of free metals concentrations, because it
provides robust data independent of any modelling of the system. So the use of both
techniques has been proposed since they supply complementary information.

In these complex systems SSCP is able to diagnose the presence of heterogeneous

ligands while AGNES still measures the free bulk metal concentration allowing the
determination of the apparent stability constant in the bulk.

485
 English summary

Assessment of the metal pollution in

Algeciras Bay

The distribution of metals within the aquatic environments is governed by complex

processes affected by anthropogenic activities or natural processes including riverine or
atmospheric inputs, floor erosion, biological activities, water drainage and discharge of
urban and industrial wastewater [Carman et al., 2007].

The behaviour of metals in water and sediments depends on their chemical form
affecting their mobility, bioavailability and toxicity. Therefore, quantifying metal speciation
in water and sediments provides a good indicator of ecosystem quality [Rauret, 1998].

The aim of this work was to study the distribution of heavy metal in different
compartments of aquatic environment in the Algeciras Bay and to assess bioavailability and
potential impact on aquatic biota. For this purpose, concentrations of heavy metals (As, Ni,
Co and Cr) were measured in tissues (gill, liver and muscle) of four fish species (Solea
Senegalensis (Kaup, 1858), Trigloporus lastoviza (Bonnaterre, 1788), Scorpaena porcus
(Linnaeus, 1758) and Diplodus sargus sargus (Linnaeus, 1758). The first one shows a
benthic behaviour, and the rest of them have demersal behaviour. Furthermore, the study
of heavy metal speciation in water and sediments along the Algeciras Bay were carried out.

Algeciras Bay (Figure E.13) is an important industrial area located on the south-
western Spanish coast (36º11’0’’N; 5º26’45’’W) [Morillo et al., 2007]. The bay has a 10-km
interior and 8-km mouth, covering about 75 km2, with a depth of up to 400 m. Large
amounts of pollutants are discharged into the bay from major population centres such as
487
English summary

the cities of Algeciras, Los Barrios, San Roque, Línea de la Concepción and Gibraltar
receiving heavy urban sewage. The bay also receives the water discharge of Guadarranque
and Palmones rivers. The intense activity from Algeciras harbour, one of the largest
Spanish ports, is another impact factor. There are a significant number of industries around
the coast of Algeciras Bay, including stainless steel manufacturing plant, petrochemical and
petroleum refineries, paper mills, thermal power plants, ironworks, shipyards, piers and
breakwaters [Morillo et al., 2007; Morillo and Usero, 2008; Periáñez, 2012]. The bay’s
water has a high turnover because of its proximity to the Strait of Gibraltar, where the
Mediterranean Sea and the Atlantic Ocean meet with strong currents. These geographical
conditions could disperse the pollutants in the water [Morillo et al., 2007]. Nevertheless,
the anthropogenic effect over the water, sediment and biota quality in this bay is likely to
be a serious problem and must be studied.

Guadarranque
Los Barrios River
Palmones San Roque
River Atlantic
7.1 Ocean

6.1 La Línea de ea
6.2 8.1 S
7.2 la Concepción ean
5.1 an
5.2 9.1 it err
ed
M
4.2 9.2
Algeciras
4.1
10.1
3.1 3.2

Gibraltar
Algeciras

2.1 2.2
Harbour activities
Stainless steel industry
Algeciras Bay
Punta Europa Petrochemical refinery
Paper mills industry
Thermal power plant

1.1

Getares Punta del Carnero

Figure E.13. Map of Algeciras Bay showing the sampling sites and the principal
anthropogenic activities of the area

488
 English summary

4.1. Methodology
A preliminary study was carried out in order to investigate the most polluted area in
Algeciras Bay. For that purpose, sediment samples were collected from 17 sampling sites of
Algeciras Bay in April 2007 (Figure E.13) and the total metal concentration was analysed.
Water, sediments and fish samples for speciation were collected in October 2007, May
2008, November 2008 and May 2009 from site 1.1 (Getares beach, a control site with
scarce urban influence) and the four pollution hotspots at sites 2.1 (Isla Verde, with urban
influence), 6.1 (Palmones, with the Acerinox steel manufacturing plant, urban and river
influences), 7.1 (Guadarranque, with the Cepsa oil refineries, river and urban influences)
and 8.1 (Puente Mayorga, with the Cepsa oil refineries and thermal power plants
influences).

4.1.1. Water collection and analysis

Surface water samples were collected using a peristaltic bomb (Masterflex 07571-05,
poppet head 07518-02, Cole-Parmer Instrument Co., Illinois, USA), rigid Teflon pipes and
flexible Tygon tubing (6406-66). Water samples were picked up into low-density
polyethylene bottles, which were pre-cleaned with 3 mol/L HCl and rinsed with Milli-Q
deionised water (Millipore, USA) six times, and stored in polyethylene bags until required.
For dissolved metals analyses, they were filtered in situ using 0.45 m Whatman
groundwater filter capsule (29705-92, Cole-Parmer Instrument Co. Illinois U.S.A.)
connected on line with the Tygon tubes. In addition, non filtered samples were collected for
total metal analyses. Several water samples were collected in each site in order to study
distribution of heavy metal in water, based on metal (Ni, Co, Cr) fractionation to different
pH and speciation analysis of As.

Samples (500 mL) for total metal and dissolved metal determination were acidified with
2mL/L HNO3 (Suprapur grade), kept to room temperature during 1 week, and afterwards
they were stored at −20 ºC until analysis. In order to evaluate the different dissolved metal
fractions according to fractionation schemes (Figures E.14, E.15 and E.16), a filtered
sample (500 mL) at natural pH for determining labile fractions was stored at -20 ºC
immediately after sampling. Filtered and non-filtered samples (500 mL) used for speciation
analysis of arsenic were acidified with 2mL/L HCl (Suprapur grade) and stored at -20 ºC
until analysis.

489
English summary

Seawater

Filtered 0,45 m

Total Metal Dissolved Metal

HCl/HNO3 HCl HCl/HNO3 HCl

Microwave digestion Microwave digestion Microwave digestion Microwave digestion

As Total Total Dissolved

Dissolved As
Inorganic As Inorganic As

Total Organic As = Dissolved Organic As =

Total As – Total Inorg As Dissolved As – Diss Inorg As

Figure E.14. Scheme of chemical fractionation of As in water samples

Seawater pH 2 Seawater pH 2 Seawater pH natural

Non filtered Filtered Filtered

Acid digestion Acid digestion

HClO4/HNO3 HClO4/HNO3
(120 ºC, 8h) (120 ºC, 8h)

DPAdCSV
with DMG
DPAdCSV DPAdCSV
with DMG with DMG

Total Metal Dissolved

Dissolved Metal
Labile Metal

Particulate Metal = Non labile Metal =

Total Metal – Dissolved Metal Dissolved Metal – Diss Labile Metal

Figure E.15. Scheme of chemical fractionation of Ni and Co in water samples

490
 English summary

Seawater pH 2 Seawater at natural pH

Non filtered Filtered

Acid digestion DPAdCSV DPAdCSV

HClO4/HNO3 Time after DTPA Time after DTPA UV digestion
(120 ºC, 8h) addition: 0 min addition: 30 min H2O2 30%, 2h

DPAdCSV Active Dissolved Cr =

Dissolved DPAdCSV
Time after DTPA Dissolved Cr(VI) +
Cr (VI) Time after DTPA
addition: 0 min Active Dissolved Cr(III)
adition: 0 min

Total Cr
Active Dissolved Cr(III) = Dissolved Cr
Active Diss Cr – Diss Cr(VI)
Particulate Cr =
Total Cr – Total Diss Cr

Non Active Dissolved Cr(III) =

Dissolved Cr – Active Dissolved Cr

Figure E.16. Scheme of chemical fractionation of Cr in water samples

Speciation analyses of arsenic were performed by hydride generated coupled atomic

absorption spectroscopy (HGAAS), with an operational discrimination among particulate
and organic and inorganic dissolved arsenic species [Niedzielski et al., 1999]. For that, two
different acid digestions were accomplished. Inorganic dissolved arsenic species were
analysed after reducing sample solution with HCl (1%, v/v) in a microwave. Total and
dissolved arsenic were analysed by HGAAS using an AAS equipment coupled to a HG
accessory Unicam VP90 (Thermo Elemental, UK), after acid digestion of samples using
HNO3 (0.1%, v/v) and HCl (1%, v/v) heated in a microwave and using non filtered and
filtered water, respectively. Particulate contents were determined by difference between
total and dissolved contents. Organic dissolved contents were determined by difference
between dissolved and inorganic dissolved arsenic species.

Total and dissolved Ni and Co fractions were analysed by differential pulse adsorptive
cathodic stripping voltammetry (DPAdCSV) using a Metrohm 757 VA Computrace Stand
(Metrohm, Switzerland) with a hanging mercury drop electrode (HMDE) as working
electrode, and with the reagent dimethylglyoxime (DMG) at pH 9.5, according to Metrohm
[Application Bulletin, nº 231/2e]. With this aim, a previous acid digestion was performed:
491
English summary

45 mL of sample with 0.2 mL of 65% HNO3 and 0.125 mL of HClO4 (Suprapur grade) were
digested in a Teflon reactor (PTFE, 100mL, BRAND, 1305 38, Weirtheim, Germany) for 8 h
at 120 ºC, cooled and diluted with Milli-Q water up to 50 mL in a volumetric flask. Labile
dissolved fractions (using filtered water at natural pH) of samples were analysed by
DPAdCSV using the same methodology but without any digestion. The contents of
particulate metal and non labile metal were determined by difference between both results,
i.e. total metal fraction minus dissolved metal fraction, and dissolved metal minus dissolved
labile metal.

Total Cr was determined by DPAdCSV using a supporting electrolyte prepared with

diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), acetate buffer and sodium nitrate at pH 6.2 [VA
Application Note nº V-82; Application Bulletin, nº 116/3e]. A previous digestion was carried
out in the same way as in Ni and Co analyses. The analysis with DPAdCSV was done just
after the addition of the electrolyte to the digested sample to avoid inactivation of Cr(III)-
DPTA complex. Dissolved Cr represents dissolved Cr(VI) and dissolved Cr(III). The
dissolved chromium was determined after digestion of the sample with UV and H2O2. The
analysis was done immediately after the addition of the electrolyte to the digested sample
to avoid inactivation of Cr(III)-DPTA complex. Active dissolved chromium is the contribution
of dissolved Cr(VI) and active dissolved Cr(III). The analysis was done immediately after
the addition of the electrolyte to the digested sample to avoid inactivation of Cr(III)-DPTA
complex. Hexavalent chromium, Cr(VI), was determined after keeping the sample mixed
with the electrolyte for 30 minutes. During this waiting time the Cr(III)-DTPA complex
becomes electrochemically inactive. Active dissolved Cr(III) was calculated from the
difference between the active dissolved Cr and dissolved Cr(VI). Non active dissolved
Cr(III) was calculated from the difference between dissolved Cr and active dissolved Cr.
Particulate Cr was obtained from the difference between total Cr and dissolved Cr.

In all cases, blanks were performed using ultrapure water (Milli-Q) as samples
following the same protocol for each phase of speciation scheme. Sample handling and
preparation of solutions were carried out using acid cleaned material, wearing polyethylene
gloves and under laminar flow cabinet.

Temperature, pH, salinity and dissolved oxygen of water were measured in situ with an
electrochemical portable device. Dissolved organic carbon was evaluated in different
samples that those for metal analysis and using TOC analyzer.

The quality of As analysis methods in water was checked by recovery tests using
spiked samples, yielding good accuracy of analysis (98.5 – 102.2%, n=3).

The quality of Ni, Co and Cr analysis was checked by using the estuarine water
reference material Slew-3, obtaining good results (94.5 – 101.5%, n=3).

492
 English summary

4.1.2. Sediments collection and analysis

Sediment samples were collected from the surface sediment (2–20 cm) using an
Eckman-Birdge dredge, immediately placed in polyethylene bags and transported to the
laboratory where they were stored at –20ºC until analysis. Samples were dried at 105 ºC
during 24 h, grinded using an agate mortar, sieved through a stainless steel mesh in order
to obtain fine particle-size fractions and stored in polyethylene bottles until sequential
extraction analysis.

The sequential extractions were performed by means of the 3-step BCR extraction
procedure described by Davidson et al. (1993) [Davidson et al., 1993]. In the first step, 1g
of sediment was mechanically shaken for 16 h (frequency 150/min) with 40 mL 0.11 mol/L
acetic acid and the extract (acid extractable fraction) was separated by centrifugation. The
residue, in the second step, was shaken for 16 h with 40 mL 0.1 mol/L NH2OH·HCl adjusted
to pH 2 with HNO3 and the extract (reducible fraction) was separated by centrifugation. In
the step 3, the residue was twice heated at 85 ºC with 10 mL of 8.8 mol/L hydrogen
peroxide (Suprapur grade), then extracted with 50 mL 1.0 mol/L NH4CH3COO and
separated by centrifugation (oxidisable fraction). The residual fraction was twice heated by
IR lamp with 5 mL HF 48% (Suprapur grade) in a Teflon Petri dish until dryness. This
procedure was repeated twice with 5 mL HNO3 65% (Suprapur grade) and the residue was
lixiviated with 20 mL of 3.86 mol/L HCl by heating and magnetic agitation during 1 h.

Total acid digestions of sediments were performed using the same procedure employed
with the residual fraction. The extracts collected in sequential extraction steps and in the
total acid digestions were made up to 25 mL and 50 mL, respectively. All of them were
stored at 4 ºC in acid washed polyethylene bottle until were analyzed by inductively
coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) with a X7 Series plasma scan sequential
inductively coupled mass spectrometer (Thermo Elemental, UK). In all cases, respective
blank samples were prepared and taken into account.

The quality of total metal analysis was checked by using the estuarine sediment
standard reference material NIST-SRM 1646a, yielded good accuracy of analysis (83.5 –
98.8%, n=5). Standard sediment reference material BCR-701 was used to check the BCR
sequential extraction of Ni and Cr, giving very good recoveries (91.6 – 120.3%, n=4).

4.1.3. Fish collection and analysis

The fish samples were collected at sampling sites and were dissected right there.
Tissue subsamples were taken out quickly from liver, gills and muscle. Fish tissues were
transported to the laboratory into nitrogen liquid and stored at –80 ºC.

Samples were freeze-dried and digested by microwave heating. Gills and muscle
samples (0.1-0.3 g) were digested with 7 mL HNO3 65%, and liver samples (0.1-0.3 g),

493
English summary

containing higher organic matter, were digested with 4 mL of 65% HNO3 (Suprapur grade)
and 2 mL of 30% H2O2 (Suprapur grade). After microwave digestion, samples were diluted
up to 25 mL with Milli-Q deionised water. Metal concentrations of digested tissue samples
were analysed by ICP-MS. Blanks were also performed and measured for all metals
following the same procedure.

The accuracy of the analytical methodology applied was satisfactorily evaluated

through the analysis of two certified reference biological materials of the National Research
Council Canada: NRCC DOLT-3 (dogfish liver) and NRCC DORM-2 (dogfish muscle),
obtaining recoveries of 96.2 – 101.0%, n=9.

4.2. Results and discussion

4.2.1. Previous studies and identification of the hotspots

The distribution patterns of total metal concentrations at the 17 sampling sites are
shown in Figure E.17. Pollution hotspots can be identified, mainly at sampling sites
2.1, 3.2, 6.1, 6.2, 7.1 and 7.2 located around Isla Verde, Palmones and Guadarranque
areas, whereas Getares beach (1.2) retained its pristine state being used as a control
site. Further investigations about metal speciation were carried out in water, fish and
sediments during two seasonal sampling periods (autumn 2007-2008 and spring 2008-
2009) at the identified pollution hotspots and the control site. For these samplings, the
evaluation of the total metal concentrations was also carried out. The sampling sites
for speciation were: P1: Getares beach (site 1.1), P2: Isla Verde (site 2.1), P3: Palmones
(site 6.1), P4: Guadarranque (site 7.1) and P5: Puente Mayorga (site 8.1).

25

20
As (mg/kg)

15

10

0
1.1
2.1
2.2
3.1
3.2
4.1
4.2
5.1
5.2
6.1
6.2
7.1
7.2
8.1
9.1
9.2
10.1

Sampling sites

Figure E.17. Distribution patterns of total metal concentrations (mg/kg)

494
 Cr (mg/kg) Co (mg/kg) Ni (mg/kg)

0
25
50
75
100
125
150

0
5
10
15
20
25

0
50
100
150
200
250
300
1.1 1.1 1.1
2.1 2.1 2.1
2.2 2.2 2.2
3.1 3.1 3.1
3.2 3.2 3.2
4.1 4.1 4.1
4.2 4.2 4.2
5.1 5.1 5.1
5.2 5.2 5.2
6.1 6.1 6.1
Sampling sites

Sampling sites
Sampling sites
6.2 6.2 6.2
7.1 7.1 7.1
7.2 7.2 7.2
8.1 8.1 8.1
9.1 9.1 9.1
9.2 9.2 9.2
10.1 10.1 10.1

Figure E.17 (cont.). Distribution patterns of total metal concentrations (mg/kg)

495
English summary
English summary

4.2.2. Metal concentration in water

(a) Total metal

Physical-chemical parameters and total metal concentrations of water samples

evaluated in all samplings and values of total metal concentrations at each sampling site
are shown in Table E.12 and Figure E.18, respectively. Total metals were ranging over
following intervals: As: 0.5-0.8 g/L, Ni: 0.1-0.6 g/L, Co: 0.02-0.2 g/L y Cr: 0.2-0.6 g/L.
The metals with the highest concentration were Cr and Ni.

Table E.12. Physical-chemical parameters in water

Sampling sites
Sampling Parameter
1 2 3 4 5
October Temperature (ºC) 21.2 22.1 20.1 21.3 21.0
2007 pH 8.34 8.27 8.25 8.24 7.03
Salinity (‰) 35.6 35.5 37.2 35.2 34.4
Dissolved O2 (mg/L) 4.0 4.1 4.0 4.0 4.1
DOC (mg/L) 1.72 1.52 1.39 1.53 6.23
May Temperature (ºC) 18.3 19.7 20.2 20.9 18.9
2008 pH 8.42 8.42 8.56 8.51 8.58
Salinity (‰) 34.8 33.9 32.4 33.8 33.5
Dissolved O2 (mg/L) 6.6 7.0 6.9 6.9 6.9
DOC (mg/L) 0.41 0.59 0.67 0.72 0.56
November Temperature (ºC) 14.9 15.9 15.4 15.3 14.3
2008 pH 7.98 8.03 8.06 8.04 8.07
Salinity (‰) 32.9 32.8 32.2 31.2 32.4
Dissolved O2 (mg/L) 5.7 5.4 4.7 5.3 4.6
DOC (mg/L) 1.74 1.03 0.66 1.67 1.52
May Temperature (ºC) 18.2 18.3 18.2 18.6 18.5
2009 pH 7.11 6.96 7.58 7.37 7.42
Salinity (‰) 30.1 29.3 30.3 29.5 29.7
Dissolved O2 (mg/L) 7.5 7.2 7.9 7.5 7.7
DOC (mg/L) 0.92 2.51 0.41 1.05 1.14

496
 English summary

0.8
0.7
0.6
0.5
As (g/L)

0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

0.6

0.5

0.4
Ni (g/L)

0.3

0.2

0.1

0.0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

Figure E.18. As and Ni total concentration in water samples at the 5 sites of Algeciras Bay

497
English summary

0.8

0.6
Co (g/L)

0.4

0.2

0.0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

0.6

0.5

0.4
Cr (g/L)

0.3

0.2

0.1

0.0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

Figure E.18 (cont.). Co and Cr total concentration in water samples at the 5 sites of
Algeciras Bay

Generally, small differences were observed in As contents. The highest concentration

was found at Puente Mayorga during May in 2008 and 2009.

In the case of Ni, the highest content was obtained at Palmones and Guadarranque
sites during November 2008 and May 2009, probably due to the presence of the Acerinox
stainless steel industry, Cepsa oil refineries and the Palmones and Guadarranque estuaries.
The site of Getares beach, initially selected as the control site, presents high concentration

498
 English summary

of total Ni in the first two samplings, most likely because there was a fuel spill from two
vessels in January 2007 and October 2007. After that, the concentration of Ni at that site
has been decreasing thanks to the high turnover of the waters in that zone and the good
cleaning up that was carried out.

It is noteworthy that the concentrations of Co found in Algeciras Bay were lowest than
those for the rest of metals, but very high values were observed at Guadarranque. It may
be due to a possible punctual spill from the refinery.

The highest values of total Cr in Algeciras Bay were found at Isla Verde and
Guadarranque.

(b) Dissolved and particulate metal distribution

The scheme of metal speciation in water applied in this work allowed to perform a first
fractionation between dissolved and particulate metal, considering the last fraction as less
available. Distributions of dissolved and particulate metals in percentage, obtained in this
study, are shown in Figure E.19. In general, all metals were found mainly as dissolved
metal since the water did not present high contents of suspended solids.

High percentages of dissolved As were obtained during samplings in spring (63.8 -

85.5%), while in autumn the percentages were lower (23.9 - 69.9%). As for Ni, it mostly
appeared in dissolved form (36.5 - 97.9%), except at Getares beach in the second
sampling, where the particulate phase represented 70% of the total content. Regarding Co,
the data showed a greater variability than in the case of Ni, as there were samples with a
high percentage of particulate metal and others with a high percentage of dissolved metal
or even 100%, such as the site Isla Verde during the second and third sampling. In
general, percentages of cobalt in the dissolved phase vary in the range of 9.1 to 100%. As
for the fractionation of Cr, note that it was found dissolved metal levels above 50% in most
of the sampling stations (51.8 - 97.4%), except at Puente Mayorga in first, second and
third sampling, Getares beach and Isla Verde in second sampling and Guadarranque in the
third sampling, in which the particulate fraction was predominant, reaching values up to
80% at Puente Mayorga during the second sampling. This way, metals can be ordered from
highest to lowest percentage in the dissolved fraction and therefore high to low
bioavailability, as follows: Ni> Cr> As> Co.

499
English summary

100%

80%

60%
As

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

100%

80%

60%
Ni

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

% Particulate % Dissolved

Figure E.19. Distribution of dissolved and particulate metal in water samples of Algeciras
Bay

500
 English summary

100%

80%

60%
Co

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

100%

80%

60%
Cr

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

% Particulate % Dissolved

Figure E.19 (cont.). Distribution of dissolved and particulate metal in water samples of
Algeciras Bay

In order to assess the potential hazardous impacts, the heavy metal levels in water
have been compared with reported reference values, background and natural
concentration, and also compared with quality guidelines for protection of aquatic life
proposed by several organizations, guidelines and imperative values of regional
government (Table E.13). It can be seen that As concentrations in water are among the
natural background values, so that despite its high bioavailability, As does not represent
any risk. In relation to the concentration values of Cr and Ni, the total concentrations are
501
English summary

above background values but remain within the range of natural concentrations. All
samples contained lower concentrations than those proposed by EPA criteria of Maximum
Concentration (CMC) and Continuous Concentration (CCC), both established to prevent
from acute and chronic toxicity to aquatic organisms, respectively, and the ones proposed
by the regional government. In the case of Co, Guadarranque site in autumn 2007 and
2008 showed values much higher than the concentrations observed in natural seawater,
although CMC and CCC levels are not available for this metal so the potential effects on
aquatic life cannot be assessed.

In general, it can be concluded that while the bioavailability of the studied metals in
these waters is high, the dissolved metal levels do not suggest a risk to the life of this
ecosystem. The reason is the renewal of these waters due to currents and the tendency of
these metals to be accumulated in the sediments (especially for As, Ni and Cr).

Table E.13. Background levels, natural concentration and guidelines levels of metals
(g/L) in water described in the literature

Background
NOAA-EPA [US Quality of water (BOJA 27
level
Natural EPA 2002] 14/2/1997) c
[Förstner
Metal concentration
and
[Azcue, 1993] Clasification Imperative
Wittman, CMCa CCCb
1983] of waters values

2.1 1.3-2.5 69 36 Limited 50

As
Non limited 25
Limited 50
Ni 0.2 0.02-0.7 74 8.2
Non limited 25
Limited -
Co 0.04 0.02 - -
Non limited -
10300e Limited 20d/6f
Cr 0.08d 0.09 d -0.55d 50f
1100f Non limited 10d/4f
a
CMC: criteria maximum concentration (dissolved metal)
b
CCC: criteria continuous concentration (dissolved metal)
c
IV: imperative values (total metal) proposed by Andalusian Government (Spain)
d
Total Cr
e
Cr(III)
f
Cr(VI)

502
 English summary

(c) Speciation of As

The speciation of As applied in this study distinguishes between inorganic and organic
dissolved and particulate As, being inorganic fraction the most toxic of them. The results
obtained are shown in Figure E.20. Most water samples showed a greater percentage of
dissolved inorganic As, especially at Puente Mayorga in all samplings, Palmones in the third
sampling and Guadarranque in the second and fourth sampling, where approximately
100% of this metal was found in inorganic form. In the case of particulate As, the inorganic
fraction is higher at Palmones during all the samplings and Guadarranque in autumn 2007
and 2008.

100%

80%

60%
As

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

% Organic dissolved % Inorganic Dissolved

100%

80%

60%
As

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

% Organic particulate % Inorganic particulate

Figure E.20. Distribution of inorganic and organic dissolved and particulate As in water
samples of Algeciras Bay
503
English summary

(d) Speciation of Ni and Co

Two metal fractions associated to dissolved metal were obtained following the scheme
of speciation based on metal fractionation to different pH: labile and non labile. It is
important to emphasize that labile fractions are the most available. The results obtained
from metal speciation (Figure E.21) suggested that the Ni labile fraction varied depending
on the sampling. In fact, at Getares beach (sampling 1 and 3), Green Island (sampling 4),
Palmones (sampling 2 and 4) and Guadarranque (sampling 1 and 2) the non labile fraction
was higher. But for all other points, the labile fraction was predominant. Regarding the
speciation of Co, it was observed higher contents of non labile fractions.

100%

80%

60%
Ni

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

100%

80%

60%
Co

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

% Dissolved non labile % Dissolved labile

Figure E.21. Distribution of dissolved labile and non labile Ni and Co in water samples of
Algeciras Bay
504
 English summary

(e) Speciation of Cr

Four metal fractions associated to dissolved metal were obtained following the scheme
of speciation based on metal fractionation to different pH: dissolved Cr(III), dissolved
Cr(VI) (this one being the most toxic of all), active dissolved Cr(III) (higher bioavailability),
non active dissolved Cr(III),. The results obtained from metal speciation can be seen in
Figure E.22. In all samplings, the active dissolved Cr was higher than the non active
fraction. That means that it is very available. Furthermore, it was found that dissolved
Cr(III) concentration was higher than Cr(VI), with the exception of the third sampling.

100%

80%

60%
Cr

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009
Dissolved Cr(III) Dissolved Cr(VI)

100%

80%

60%
Cr

40%

20%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

Active dissolved Cr(III) Non active dissolved Cr(III)

Figure E.22. Distribution of dissolved Cr(III), dissolved Cr(VI), active dissolved Cr(III) and
non active dissolved Cr(III) in water samples of Algeciras Bay
505
English summary

4.2.3. Metal concentration in sediments

(a) Total metal

Total concentration levels of metals in sediments in Algeciras Bay are shown in Figure
E.23. The concentration values are within the following ranges: As: 5.0 to 24.3 mg/kg, Ni:
27.2 to 198.1 mg/kg, Co: 7.1 to 30.1 mg/kg and Cr: 44.7 to 394.7 mg/kg. The average
content is: As: 10.6 mg/kg, Ni: 83.7 mg/kg, Co: 13.8 mg/kg and Cr: 175.4 mg/kg. From
these data, the metals can be sorted from highest to lowest average content in the bay:
[Cr]> [Ni]> [Co]> [As]. It can be seen that values for Ni and Cr concentrations were
higher at Palmones, near Acerinox stainless steels industry, where metals are widely used.
In the case of As, the site with the greater level of concentration is Isla Verde, where there
is a discharge of untreated urban waste water from the city of Algeciras, and at Puente
Mayorga, near the harbour. Co in autumn 2007 and 2008 showed a higher value at
Guadarranque where Cepsa refinery is situated, while in the spring of 2008 and 2009, the
highest values are given at Palmones. Furthermore, it can be seen that the distribution of
metallic content remain constant during all the samplings.

25

20
As (mg/kg)

15

10

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

Figure E.23. As total concentration in sediment samples at the 5 sites of Algeciras Bay

506
 English summary

200

160
Ni (mg/kg)

120

80

40

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

35

30

25
Co (mg/kg)

20

15

10

0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

400
350
300
Cr (mg/kg)

250
200
150
100
50
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

Figure E.23 (cont.). Ni, Co and Cr total concentration in sediment samples at the 5 sites
of Algeciras Bay
507
English summary

The results were compared with guidelines levels of the impact on biological activity by
means of established levels for the protection of aquatic life proposed by the US National
Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA (NS&T: National State and Trend
program)) and Canadian sediment quality guidelines for the protection of aquatic life
proposed by the Canadian Council of Ministers of Environment. These values are included
in Table E.14.

Table E.14. Guidelines levels of metals in marine sediments described in the literature

Canadian SQG
Average values for [Canadian NOAA (NS&T)
continental shale Sediment Quality [Buchman, 2008]
Metal
[Turekian and Guidelines, 2002]
Wedepohl, 1961]

ISQG PEL ERL ERM

As 13 7.24 41.6 8.2 70
Ni 68 15.9 42.8 20.9 51.6
Co 19 - - NTa NTa

Cr 90 52.3 160 81 370

a
ISQG: interim marine sediment quality guidelines
b
PEL: probable effects levels
c
ERL: effects range low
d
ERM: effects range medium

In general, Co values are within the natural background levels, although As, exceeded
ISQG and ERL in most cases while Ni and Cr exceeded these values in all samplings and all
sites. ERM and PEL were extremely surpassed for Ni at Palmones, Guadarranque and
Puente Mayorga in all samplings, and at Isla Verde during autumn 2008. As for Cr, PEL
level was surpassed at Palmones and Guadarranque in all samplings, and at Puente
Mayorga in spring 2008 and 2009. ERM was exceeded at Palmones during spring 2008.

(b) Speciation of metals in sediments

The distribution of metals in sediment (in percentage) following BCR procedure is

shown in Figure E.24. Generally, it can be seen that Ni and Cr are the lowest bioavailable
metals in sediments being mainly associated with the residual phase, which means that
they are tightly associated to the crystal structure of the sediment and it is very difficult to
508
 English summary

mobilize them unless very extreme conditions exist. Comparing these results with those
obtained for the speciation in water it is observed that these two metals are more available
in the water as it occurs mainly in the dissolved fraction. However, in sediments they are
mainly found in the residual phase indicating that the bay is not producing the
remobilization of Ni and Cr from sediments to the water. On the other hand, As and Co are
the more available metals as they can be found in the acid exchangeable, reducible and
oxidisable fractions. According to these findings, the availability of metals in sediment
follows this order: Co> As> Ni> Cr.

100%

75%

50%
As

25%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

100%

75%

50%
Ni

25%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

Residual fraction Oxidisable fraction

Reducible fraction Acid extractable fraction

Figure E.24. As and Ni speciation in sediment samples at the 5 sites of Algeciras Bay

509
English summary

100%

75%

50%
Co

25%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

100%

75%

50%
Cr

25%

0%
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

October 2007 May 2008 November 2008 May 2009

Residual fraction Oxidisable fraction

Reducible fraction Acid extractable fraction

Figure E.24 (cont.). Co and Cr speciation in sediment samples at the 5 sites of Algeciras
Bay

510
 English summary

4.2.4. Metal concentration in fish

The metal concentrations in muscle, gill and liver of 45 Solea senegalensis specimens,
22 Trigloporus lastoviza, 11 Scorpaena porcus and 5 Diplodus sargus sargus were analysed.
Average metal concentrations in different tissues are showed in Table E.15 and Table E.16.
According to experimental data, the metal content in fish can be sorted as: As >> Co > Ni
≥ Cr.

As can be seen, As is accumulated mostly in liver and muscle. As levels in fish are
similar at all sampling sites except at Puente Mayorga, next to the industrial sector, where
it is higher in liver tissues of fish captured during autumn 2007 (367.73 mg/kg) and at
Getares during spring 2008 (225.33 mg/kg). It is also noteworthy the site of Isla Verde in
spring 2008 in liver (168.58 mg/kg) and muscle (165.93 mg/kg). Generally, the content of
As in fish is higher in spring than in autumn.

Ni accumulation in fish occurs mainly in gills and liver. Regarding sampling sites it
should be noted that higher levels of Ni have been found in liver of fish captured in Getares
during spring 2008 (13.85 mg/kg) and in gills of fish caught at Guadarranque during May
2009 (2.66 mg/kg). In general, no seasonal behaviour is observed.

Co is preferably accumulated in liver tissues followed by gills and muscle. The highest
values were found at Guadarranque and Puente Mayorga in liver tissues (11.04 mg/kg at
Guadarranque and 10.29 mg/kg at Puente Mayorga) and gills (6.70 mg/kg at Puente
Mayorga).

Cr levels can be ordered in different tissues from highest to lowest as follows: gills>
muscle> liver, although there are cases in which this order is not observed. All mean values
were between 0.04 and 0.94 mg/kg.

As, Ni, and Cr were found mainly in Solea Senegalensis, while Co was higher in
Trigloporus lastoviza

511
English summary

Table E.15. Average metal concentration and standard deviation at each sampling site
(mg/kg)
Mean value ± s.d.
Sampling site Tissue
As Ni Co Cr
Getares Liver 33.09±45.96 0.62±2.42 0.66±1.18 0.59±2.93
beach Gills 5.66±3.86 0.52±0.47 0.25±0.28 0.74±0.65
Muscle 36.63±21.88 0.17±0.37 0.06±0.11 0.27±0.18
Isla verde Liver 34.73±56.02 0.19±0.12 1.12±1.26 0.09±0.19
Gills 12.73±12.10 0.49±0.41 0.36±0.19 0.54±0.72
Muscle 47.66±52.81 0.10±0.13 0.08±0.08 0.22±0.12
Palmones Liver 21.56±18.54 0.24±0.21 1.88±1.27 0.10±0.18
Gills 14.12±10.72 0.57±0.28 0.52±0.23 0.94±0.74
Muscle 27.75±29.41 0.05±0.10 0.25±0.74 0.14±0.12
Guadarranque Liver 11.80±8.95 0.42±0.44 1.62±3.13 0.04±0.04
Gills 7.30±5.51 0.75±0.71 0.61±0.44 0.64±0.55
Muscle 27.28±16.32 0.14±0.18 0.12±0.06 0.48±0.53
Puente Liver 82.88±131.83 0.27±0.23 1.90±4.04 0.13±0.08
Mayorga Gills 20.10±25.24 0.35±0.25 1.21±2.25 0.56±0.43
Muscle 73.88±49.87 0.14±0.21 0.04±0.04 0.32±0.21

Table E.16. Average metal concentration and standard deviation for each fish species
(mg/kg)
Mean value ± s.d.
Species Tissue
As Ni Co Cr
Solea Liver 46.13±71.39 0.56±2.16 0.39±0.51 0.52±2.62
senegalensis Gills 9.60±13.13 0.60±0.55 0.36±0.96 0.89±0.71
Muscle 53.46±34.16 0.11±0.14 0.03±0.02 0.26±0.18
Scorpaena Liver 8.29±5.48 0.20±0.23 0.99±1.09 0.03±0.03
porcus Gills 4.20±2.14 0.42±0.29 0.38±0.17 0.33±0.26
Muscle 15.34±10.90 0.10±0.14 0.11±0.07 0.29±0.17
Trigloporus Liver 20.81±17.65 0.30±0.31 3.22±2.97 0.06±0.07
lastoviza Gills 14.03±9.46 0.49±0.31 0.69±0.38 0.69±0.65
Muscle 22.10±16.89 0.06±0.11 0.27±0.74 0.28±0.43
Diplodus Liver 16.46±6.21 0.32±0.25 0.82±0.69 0.06±0.04
sargus Gills 8.89±3.70 0.60±0.45 0.58±0.71 0.54±0.19
saurgus Muscle 18.64±12.49 0.65±0.95 0.18±0.31 0.25±0.17

512
 English summary

In conclusion, the metallic contamination (As, Ni, Co and Cr) of water and sediment of
Algeciras Bay was investigated in this study. The metal concentrations in water were found
to be: As > Cr > Ni > Co. In sediments, the metal concentration can be ranged as follows:
Cr > Ni > Co > As. Metal concentrations were compared with quality guidelines values and
they were exceeded frequently for sediments. In addition, speciation analysis of sediment
and water was performed providing information of availability of metal. Ni and Cr were the
most available metals in water, while As and Co were found the most available metals in
sediments. The effect of this pollution was studied by evaluation of metal accumulations in
four species of fish (Solea senegalensis, Scorpaena porcus, Trigloporus lastoviza and
Diplodus sargus sargus). For that, analysis of metal concentrations in gill, liver and muscle
were accomplished. The metal content in fish can be sorted as: As >> Co > Ni ≥ Cr. High
concentrations of As and Co were found mainly in liver. High concentrations of Ni and Cr
were found mainly in gills. The most affected species was found to be Solea
senegalensis due to its benthic character.
Although the waters samples were not highly contaminated, it has been shown that
pollution from industrial activities, sewage from the city of Algeciras and maritime activities
from the Algeciras Port are affecting the sediments and fish of this ecosystem. According to
the pollutions indicators calculated [Díaz-de Alba et al., 2011], there is a moderate pollution
of As, Ni and Cr, that has to be taken into account.

513
 English summary

Conclusions

Taking into account all the results that have been obtained from the research in this
thesis, the main conclusions can be listed as follows:

1. A new methodology for preconcentration of trace Cu(II) by solid phase extraction using
SDB disks, which have been previously modified with the organic ligand Pyridoxal
Salicyloylhydrazone (PSH) has been developed. In order to study the optimal conditions of
this new method a statistical strategy in two steps has been performed: a univariate and a
multivariate optimisation. The new method has a good detection limit and a wide linear
range. This method can selectively separate Cu(II) ions from other metal ions, being
successfully applied to the separation and determination of copper in water samples with
high saline matrix, such as seawater.

2. The applicability of AGNES (absence of gradients and Nernstian equilibrium stripping)

and SSCP (stripping chronopotentiometry at scanned deposition potential) techniques in
synthetic and real seawater has been evaluated in order to analyse the free Pb(II)
concentration and its speciation in real and synthetic seawater samples. It was found that
stability constant values obtained by AGNES were in reasonably agreement with the ones
computed by MINTEQ. Furthermore, there is a good correlation between the results
515
English summary

provided by AGNES and SSCP in synthetic and real seawater at every pH, except at pH 7
and 8.6 for seawater. This fact supports the SSCP calculation methodology used to
calculate the free metal concentration in the case of absence of heterogeneous ligand in
the sample. In these complex systems SSCP is able to diagnose the presence of
heterogeneous ligands while AGNES still measures the free bulk metal concentration
allowing the determination of the apparent stability constant in the bulk. Thus, the
simultaneous use of both methods has great advantages due to the additional information
provided.

3. Finally, the level of contamination produced by some heavy metals has been assessed in
water, sediments and biota from Algeciras Bay. The studies can be summarized as
follows:

- Total levels of metals (As, Cr, Ni and Co, very significant metal in steel and
petrochemical industry) and their distribution in different chemical fractions
(speciation) have been evaluated in water and sediments. The results showed that As
was the metal which presented the highest concentration in water, while Cr was the
greatest in sediments. Regarding speciation, Ni and Cr were the most available metals in
water, while As and Co were found the most available ones in sediments. Metal
concentrations were compared with quality guidelines values and they were frequently
exceeded for sediments.

- Concentration levels of metals in liver, muscle and gills in fish of commercial interest
have been also quantified in order to study the effect of chemical pollution on those
species (Solea senegalensis, Scorpaena porcus, Trigloporus lastoviza and Diplodus
sargus sargus). The metal content in fish can be sorted as: As >> Co > Ni ≥ Cr. High
concentrations of As and Co were found mainly in liver. High concentrations of Ni and
Cr were found mainly in gills. The most affected species was found to be Solea
senegalensis due to its benthic character.
- To assess the state of contamination in Algeciras Bay, pollutions indicators were
calculated. As a result, Guadarranque and Palmones were the sites with highest metal
contamination, not only in water but also in sediment and fish. According to sediment
pollution indicators, the bay is generally moderately contaminated with As, Ni and Cr, which
has to be taken into account.

516
 English summary

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522
 
 
 
 
 
 
 
 

Artículos derivados de la Tesis

 Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Hazardous Materials

journal homepage: www.elsevier.com/locate/jhazmat

Assessment of the metal pollution, potential toxicity and speciation of sediment

from Algeciras Bay (South of Spain) using chemometric tools
M. Díaz-de Alba, M.D. Galindo-Riaño ∗ , M.J. Casanueva-Marenco, M. García-Vargas, C.M. Kosore
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Sciences, University of Cádiz, Campus Río S. Pedro, 11510 Puerto Real, Cádiz, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: A study to determine total and mobile heavy metals concentrations in sediments from Algeciras
Received 1 December 2010 Bay was performed and pollution hotspots were identified. The effects on aquatic organisms were
Received in revised form 7 March 2011 established using sediment quality guidelines (SQGs). Ni and Cr exceeded the effect range medium
Accepted 8 March 2011
and low levels, respectively, around industrial area. Potential toxicity of metals was determined by
Available online 15 March 2011
diethylenetriaminepenta-acetic acid (DTPA) extractions and low alert levels of Co, Cu, Zn, Cd, Ni and
Pb were exceeded at most sampling sites. Three pollution indicators were used showing significant val-
Keywords:
ues for As, Ni, Cr, Pb and Cd. Sediment speciation using the sequential extraction BCR procedure was
Available metal
Sediment
carried out, being Cd, Zn, Pb and As the most available metals. Principal component, cluster and ANOVA
Total metal analyses were performed in order to assess the sources of metals and the influence of seasonality and
Speciation anthropogenic activities on the sediment quality. Two principal component analysis (PCA) factors were
Anthropogenic pollution obtained identifying the sampling sites affected by anthropogenic activities; Ni–Cr and Zn–Cu–V clusters
were also obtained associated with stainless steel and petrochemical industrial activities. ANOVA showed
the outstanding sites because of total metal concentration and significant differences among sampling
sites by the acid extractable and reducible fractions for all metals except for Ba and V.
© 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction origin, biological and physico-chemical availabilities, mobilization

The distribution of metals within the aquatic environments is
governed by complex processes affected by anthropogenic activi-
ties or natural processes including riverine or atmospheric inputs,
floor erosion, biological activities, water drainage and discharge of
urban and industrial wastewater [1]. Sediments accumulate higher
levels of hazardous trace elements than water, causing serious
problems due to their toxicity and bioaccumulation [2,3].
1.1. Mobile metal and speciation of sediment
and transport of trace metals. The procedure simulates the mobi-
lization and retention of these species in the natural environment
by changes such as pH, redox potential and organic matter degrada-
tion [6,7]. A three-stage sequential extraction procedure proposed
by the European Community Bureau of Reference (BCR) was deve-
loped in order to standardize the various schemes described in the
literature [8,9]. This method provides the acid extractable (water
soluble, exchangeable and bound to carbonates metal), reducible
(bound to Fe and Mn oxides), oxidizable (bound to sulfides and
organic matter) and residual (inert) fractions of metal in the sedi-
ment.

The behavior of metals in sediments depends on their chemical

form affecting their mobility, bioavailability and toxicity. There-
fore, quantifying metal speciation in sediments provides a good
indicator of ecosystem quality [4].
Soluble, exchangeable and weak chelated metal species cons-
titute the most mobile fraction and are usually assessed by
complexing agents [5]. Sequential extraction procedures are
accomplished to evaluate all metal fractions in sediments; although
time-consuming, they provide detailed information concerning the
∗ Corresponding author. Tel.: +34 956016362; fax: +34 956016460.
E-mail address: dolores.galindo@uca.es (M.D. Galindo-Riaño).
1.2. Assessment of sediment quality: sediment quality guidelines
(SQGs)
Numerous sediment quality guidelines are used to protect
aquatic biota from the harmful and toxic effects related with
sediment-bound contaminants; they are useful assessment tool
of the potential pollution [10–12]. These guidelines evaluate the
degree to which the sediment-associated chemical status might
adversely affect aquatic organisms and are designed for the inter-
pretation of sediment quality. They are also used to rank and
prioritize contaminated areas for further investigation [13–16].
Some of the SQGs are given in Table 1.

0304-3894/$ – see front matter © 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.jhazmat.2011.03.020
178 M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187

Table 1 Contamination factor is an effective tool for monitoring pol-

Sediment quality guidelines (SQGs) (mg kg−1 ).
lution over a period of time and evaluating the pollution of the
Metal Effect range Effect range Low alert level High alert level environment single substances [17,21]. It is calculated using the
low (ERL)a [14] medium (LAL)a [15] (HAL)a [16] following ratio:
(ERM)a [14]
Measured concentration of the metal
As 8.2 70 0.5 70 CF = (2)
Ba NA NA 50 1000 Background level of the metal
Cd 1.2 9.6 0.04 9.6 The geoaccumulation index is based on the geochemical data
Co NA NA 0.5 120
Cr 81 370 4 370
that makes possible to map the areas according to their pollution
Cu 34 270 2 270 degree. Igeo values are calculated using the following equation:
Fe NA NA NA NA  Cn

Mn NA NA NA NA Igeo = log2 (3)
Ni 21 52 3 50 1.5 · Bn
Pb 47 220 2 218
where Cn is the measured concentration of the element and Bn is
V NA NA 5 350
Zn 150 410 5 410 the geochemical background concentration for the average con-
a
tinental shale. The 1.5 factor includes possible variations of the
NA: not available.
background values due to lithogenic effects [18,20–22]. Criteria for
these pollution indicators are given in Table 3.
Table 2
Metal concentrations in average continental shale (mg kg−1 ).
2. Materials and methods
Metal Average continental shale

As 13 2.1. Study area

Ba 580
Cd 0.3 Algeciras Bay (Fig. 1) is an important industrial area located on
Co 19 the south-western Spanish coast (36◦ 11 0 N; 5◦ 26 45 W) [2,23].
Cr 90
Cu 45
The bay has a 10-km interior and 8-km mouth, covering about
Fe 47000 75 km2 , with a depth of up to 400 m. Large amounts of pollutants
Mn 850 are discharged into the bay from major population centres such
Ni 68 as the cities of Algeciras, Los Barrios, San Roque, Línea de la Con-
Pb 20
cepcion and Gibraltar receiving heavy urban sewage. The bay also
V 130
Zn 95 receives the water discharge of Guadarranque and Palmones rivers.
The intense activity from Algeciras harbour, one of the largest Span-
ish ports, is another impact factor. There are a significant number
of industries around the coast of Algeciras Bay, including stainless
1.3. Assessment of sediment quality: pollution indicators
steel manufacturing plant, petrochemical and petroleum refine-
ries, paper mills, thermal power plants, ironworks, shipyards, piers
The anthropogenic metal contribution in sediments can be
and breakwaters [23]. The bay’s water has a high turnover because
estimated from the enrichment relative to unpolluted reference
of its proximity to the Strait of Gibraltar, where the Mediterranean
materials or widely accepted background (pre-industrial) levels,
Sea and the Atlantic Ocean meet with strong currents. These geo-
such as the average values for continental shale (Table 2) or crust
graphical conditions could disperse the pollutants in the water [2].
abundances [17–19]. Different pollution indicators can be used
Nevertheless, the anthropogenic effect over the sediment quality
such as enrichment factor (EF), contamination factor (CF) and
in this bay is likely to be a serious problem and must be studied.
geoaccumulation index (Igeo ), providing a relative ranking of sam-
pling sites.
2.2. Sampling and sample pretreatment
The enrichment factor estimates the anthropogenic impact on
sediments by using the following equation:
Surface sediment samples for the preliminary study were col-
Mx · Feb lected from 17 sampling sites of Algeciras Bay in April 2007 (Fig. 1).
EF = (1) Sediments for speciation were collected in autumn 2007–2008 and
Mb · Fex
spring 2008–2009 from site 1.2 (Getares beach, a control site with
where Mx , Mb , Fex and Feb are the concentrations of metal (M) and scarce urban influence) and the four pollution hotspots at sites 2.1
Fe in the sample and in the background reference, respectively. (Isla Verde, with urban influence), 6.1 (Palmones, with the Aceri-
Iron or aluminum is used as a normalization element to reduce nox steel manufacturing plant, urban and river influences), 7.1
the variations produced by heterogeneous sediments; the refe- (Guadarranque, with river, urban and industrial influences) and
rence element must have minimum variability of occurrence or 8.1 (Puente Mayorga, with the Cepsa oil refineries and thermal
large concentrations in the studied environment [18,20]. power plants influences) using Ekman–Birdge grab. The samples

Table 3
Criteria of pollution indicators in sediment based on the EF, CF and Igeo values.

EF Pollution status CF Pollution status Igeo Pollution status

>1 ≥6 Very high >5 Extreme

With anthropogenic sources 3≤CF < 6 Considerable 4–5 Strong to extremely strong
1≤CF < 3 Moderate 3–4 Strong

<1 <1 Low 3–3 Moderate to strong

1–2 Moderate
Without anthropogenic sources
0–1 Unpolluted to moderate
<0 Unpolluted
 M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187 179

Fig. 1. Map of Algeciras Bay showing the sampling sites and the principal anthropogenic activities of the area.

Table 4
The BCR sequential extraction scheme used for operational speciation of metals.

Step Sediment fraction Extractant Conditionsb

F1 Water soluble, exchangeable or bound to carbonates 40 mL of 0.11 M CH3 COOH Shake 16 h at RT

F2 Reducible 40 mL of 0.5 M NH2 OH·HCl (pH 1.5) Shake 16 h at RT
10 mL of 8.8 M H2 O2 (twice) Shake 1 h at RT and 1 h at 85 ◦ C
F3 Oxidizable
50 mL of 1 M NH4 OAc (pH 2) 16 h at RT
5 mL 48% HF (twice) Heat until dryness
F4 Residuala 5 mL 65% HNO3 (twice) Heat until dryness
20 mL 3.86 M HCl Heat and stir 1 h
a
Digestion of the residual material has been included.
b
RT: room temperature.

were oven-dried at 40 ◦ C, grinded and sieved in order to obtain fine yielded good accuracy of analysis (80-106%, n = 5). Standard
particle-size fractions (<0.063 mm) . sediment reference material BCR-701 was used to check the BCR
sequential extraction, giving very good recoveries (Table 5). No
2.3. Analytical methods reference material was available for DTPA extraction; however,
good recoveries ranging from 85% to 105% were obtained from a
Organic matter content (%OM) was estimated by measuring the spiked sample, indicating the accuracy of method for the mobile
loss of weight on ignition at 550 ◦ C. Sediment speciation analyses metal analysis.
for the 5 selected sites were performed using BCR sequential extrac- All reagents were of Suprapur and Pro analyze quality from
tion procedure [9] according to previously reported [24], using Merck (Germany) or Panreac (Spain). Ultrapure water from
conditions given in Table 4 as a brief summary. Total acid digestions
of sediments from all sediments were performed using the same
procedure employed with the residual fraction. The extraction Table 5
of diethylenetriaminepenta-acetic acid (DTPA)-extractable metals Recoveries of Standard Sediment Reference Material BCR-701 by applying BCR
sequential extraction method (n = 4).
from all sediments was performed using 0.005 M DTPA + 0.01 M
CaCl2 + 0.1 M triethanolamine (TEA) [25]. Determination of total Metal Recovery (%)
metal, DTPA-extractable and BCR fractions were performed using Fraction 1 Fraction 2 Fraction 3
X-Series ICP-MS. Solaar-M Series atomic absorption spectrometer
Cd 101 ± 2 96 ± 6 109 ± 10
(FAAS) was used only for analysis of total and DTPA-extractable Fe Cr 120 ± 8 96 ± 8 88 ± 5
and Mn (Thermo Elemental, UK). In all cases, blank samples were Cu 127 ± 5 72 ± 4 119 ± 10
analyzed and taken into account. Ni 104 ± 1 93 ± 9 90 ± 9
The quality of total metal analysis was checked by using the Pb 90 ± 8 99 ± 6 111 ± 8
Zn 93 ± 2 94 ± 7 95 ± 7
estuarine sediment standard reference material NIST-SRM 1646a,
180 M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187

a Millipore Milli-Q50 system was used. Samples and solu-
tions handling were performed under a class 100 laminar
flow hood cabinet Crusair 9005-FL (Cruma, Spain). Metal stan-
dard working solutions were prepared from 1000 mg L−1 Merck
stock solutions. All laboratory glassware was cleaned using a
HNO3 (20%) bath overnight followed by rinsing with ultrapure
water.
Data statistical treatments were performed using STATISTICA 7
software package (2004, Statsoft Inc., USA).
with SQGs (ERM: effect range medium; ERL: effect range low; HAL:
high alert level; LAL: low alert level). The organic matter values
ranged from 7% to 15%, with a mean value of 10%, obtaining the
highest percentages in sediment from the sites 5.1; 5.2; 6.1; 7.1
and 7.2. The common values for coastal sediment are from 0.32%
to 1.76%. Therefore, the studied sediments showed a high organic
matter content that could decrease the metal availability by com-
plexing. The ranges and average metal concentrations are included
in Table 6 giving the following rank:

[Fe] > [Mn] > [Ba] > [Cr] > [Zn] > [V] > [Ni] > [Pb] > [Cu]
3. Results and discussions ≈ [Co] ≈ [As] > [Cd]

3.1. Total metals and sediment quality

Pollution hotspots can be identified, principally in sampling sites
The distribution patterns of total metal concentrations and %OM 2.1, 3.2, 6.1, 6.2, 7.1 and 7.2 located around Isla Verde, Palmones
in sediments from Algeciras Bay are given in Fig. 2 and compared and Guadarranque areas, whereas Getares beach (1.2) retained its

Fig. 2. Distribution patterns of total metal concentrations (mg kg−1 ), %OM and sediment quality guidelines.
 M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187 181

Fig. 2. (Continued).

pristine state being used as a control site. Ni and Cr extremely sur-
passed the ERM and ERL, respectively, at sampling sites 6.1 and 6.2,
located around Acerinox stainless steel industry and the Palmones
estuary, implying that biota might be regularly and occasionally
exposed to toxic effects. The highest values observed for As at Isla
Verde could have resulted from the maritime activities at the Alge-
ciras harbour. The highest values for Ba and Mn may have been
due to atmospheric deposition from the industrialized regions and
sewage overflow urban-based industrial processes [26].
Further investigations about metal speciation were carried out
during two seasonal sampling periods (autumn 2007–2008 and
spring 2008–2009) at the identified pollution hotspots and the con-
trol site. For these samplings, the evaluation of the total metal
concentrations was also carried out (Table 7) producing similar
values than those obtained in April 2007.
Fig. 3 shows the pollution indicators for each metal based on
the average shale content (Table 2) and using iron content to nor-
malize the data. EF values were principally higher than 1 except for
Ba, Fe, Co, Cu, Zn and V, meaning the anthropogenic influence on
sediments. The highest values were found for Cr, Ni and Cd at sam-
pling sites 6.1 and 6.2, indicating significant industrial influences
for Cr and Ni and pollution from the oil based power generation,
ship wastes and anticorrosive paints applied on ships for Cd; and
for Pb and As at sites 2.1 and 2.2 with port activities. Mn had high
EF values at 1.2 and 10.1 sites related to atmospheric deposition.
The CF values allowed to define the sediments from sites 5, 6
and 7 for Cr, Ni and Cd, from sites 2 and 3 for As and from almost
all sites for Pb as moderately polluted (1 ≤ CF < 3). The rest of met-
als remained within the low contamination level of the sediment
(CF < 1).
182 M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187

EF EF
5 5

As
4 4

Cr Cd
3 3
Pb
Ni

2 2

1 1

0 0
1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.2 5.1 5.2 6.1 6.2 7.1 7.2 8.1 9.1 9.2 10.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.2 5.1 5.2 6.1 6.2 7.1 7.2 8.1 9.1 9.2 10.1

V Cr Co Ni Cu Zn As Cd Ba Pb Fe Mn

CF CF
4 4

3 3

Cr Cd
Pb
2 2 As
Ni

1 1

0 0
1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.2 5.1 5.2 6.1 6.2 7.1 7.2 8.1 9.1 9.2 10.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.2 5.1 5.2 6.1 6.2 7.1 7.2 8.1 9.1 9.2 10.1

V Cr Co Ni Cu Zn As Cd Ba Pb Fe Mn

I geo I geo
2 2

Cr
1 1
Cd
As Pb
Ni
0 0

-1 -1

-2 -2

-3 -3

-4 -4
1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.2 5.1 5.2 6.1 6.2 7.1 7.2 8.1 9.1 9.2 10.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.2 5.1 5.2 6.1 6.2 7.1 7.2 8.1 9.1 9.2 10.1

V Cr Co Ni Cu Zn As Cd Ba Pb Fe Mn

Fig. 3. Enrichment factor (EF), contamination factor (CF) and geoaccumulation index (Igeo ) in sediments from sampling sites of Algeciras Bay collected in April 2007.

The results of Igeo were more restrictive, characterizing the se-
diments as unpolluted except for Cr (sites 6.1, 6.2, 7.1), Ni (sites 6.1,
6.2), As (site 2.1), Cd (site 6.2) and Pb (sites 6.2 and 7.2) which were
“unpolluted to moderately polluted”, with index values ranging
from 0 to 1.
These pollution indicators indicated that Algeciras Bay sedi-
ments are still in their pristine state with respect to metal pollution
except for As, Ni, Cr, Pb and Cd. The strong currents that predomi-
nate in the area, together with its deep waters, mean that pollutants
are dispersed in a large body of water and their effects are consi-
derably diminished, even with great anthropogenic activity in this
area. It is noteworthy that despite this, there is moderate pollution
of these five toxic metals.
3.2. Potential toxicity of metals in sediment
Table 8 shows the results of 0.005 M DTPA + 0.01 M CaCl2 + 0.1 M
TEA extraction to evaluate the mobile metal concentration at each
sampling site. Significant values were obtained for Cd, Co, Cu, Ni,
Pb and Zn following this ranking: Cu > Cd ≈ Pb > Zn > Co > Ni. The
mobile metal fractions in site 6.1 were: Cu = 71%, Cd = 66%, Pb = 64%,
Zn = 55%, Co = 15% and Ni = 6%, showing their high potential toxicity.
V, Cr, As, Fe, Mn and Ba yielded insignificant percentage (<3%). The
use of complexing ligands DTPA and TEA and the ion Ca2+ allows
the fast exchange with bivalent cations, especially for Cd2+ and
Zn2+ when they are mobile [27] and for Cu2+ even when complexed
by organic matter with high stability constant of organic-Cu com-
 M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187 183

Table 6

1.3

1.6
1.8
0.9
0.4

0.9
0.4
3.9
0.6
0.1

0.7
1.2

1.1

1.8
3.0
0.8
2.0

0.2

4.3
0.9
Average total metal concentrations in sediments from 17 sites of Algeciras Bay
collected in April 2007.

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
27.5
49.9
103.2
68.8
34.7

31.9
38.8
69.8
42.3
33.2

22.9
53.4
75.8
74.3
48.1

22.3
31.9
71.1
50.0
60.8
Metal Concentrations (mg kg−1 )

Zn
Min Max Mean Stand. Dev.

17.7
14.8
22.4

12.8

16.5
As 8 23 11 5

1.8

3.4
0.5

1.0

0.9

0.3
0.7

0.5
7.3
2.0

0.1
0.6

6.4
8.5
0.0
Ba 93 263 196 50

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
Cd 0.1 0.7 0.3 0.1

44.9
112.4
145.
87.3
89.6

51.0
63.8
117.3
47.6
42.1

22.6
82.7
116.0
88.7
94.5

26.2
30.1
77.8
74.5
100.3
Co 5 22 11 4

V
Cr 30 251 112 63
Cu 5 25 17 7

0.04
Fe 18285 42756 28129 7216

1.1
3.6
2.2

5.9

4.6

1.8
0.1

2.0
5.6
0.7
0.1

0.1

1.9

3.7
0.9

0.3
1.0

0.1

0.4
Mn 235 967 534 231

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
Ni 19 144 65 36

12.4
22.2
30.4
24.4
19.3

0.4 12.2
0.4 16.1
19.1 19.2
0.1 11.4
2.8 11.2

9.7
23.4
23.0
24.2
18.9

0.5 7.7
0.1 11.1
0.9 14.9
2.0 25.1
11.6 26.5
Pb 12 39 24 7

Pb
V 36 94 66 18

0.8

7.9
3.7
1.3
1.0

0.3
1.1
2.9
3.4
7.5
Zn 33 117 73 26

Nia

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
896.7 ± 63.327.2
437.0 ± 11.656.6
314.2 ± 9.2157.8
224.4 ± 6.5104.4
285.2 ± 10.067.9

11.227.3
1.5 40.1
198.1
1.3 41.1
2.5 45.8

21.3 8.2
7.9 47.2
6.9119.2
36.896.1
6.3 68.0

15.210.4
2.2 13.7
15.337.7
1.0125.3
3.1106.2
24.3
±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
682.3
365.0
330.8
227.6
250.4

369.1
308.8
355.4
303.5
276.3

312.3
294.6
317.0
277.7
282.9
Mn
pounds [28,29]. This Cu mobility found at site 6.1 may be related
to the discharge of organic matter entering the bay from Palmones

1195.6

3224.9

1344.3

1684.9
River [23].

697.1

717.2
450.6

291.4
489.8

217.7
149.1

811.1
189.9

272.8

131.3

348.7
809.1
84.7

76.2

66.0
In order to predict the potential bioavailability (toxicity) of

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
studied metals, the means of mobile metals extracted in DTPA

17663.4
21668.7
32081.1
22677.6
18919.3

17579.0
17023.1
28854.5
20269.7
17111.6

22089.8
22492.1
37107.9
31765.2
29515.2

15256.2
14578.1
36721.3
18661.3
25457.8
were compared with LAL SQGs. LAL refers to concentration
range limits normally found in uncontaminated sediments. The
results revealed that LAL values for Co, Cu, Zn, Cd, Ni and Pb Fe
were exceeded at most sampling sites, principally at sampling
0.03

0.02
1.1
0.3

0.8
0.2
0.8

0.1
0.2
1.0
0.6

0.1

3.2
0.5
0.1
1.0

0.4
0.1
1.0
0.6
site 6.1.
±
±
±
±
±

±
±

±
±
±
±

±
±
±

±
±
±
±
±
6.5
12.58
24.2
15.5
10.9

4.3
8.82
15.8
15.2
10.1

5.6
24.16
29.2
23.2
19.7

8.4
12.14
27.8
15.7
22.8
Cu

3.3. Sequential extraction of metals

13.2

27.5

13.8

35.1

18.2
1.5

6.1
4.2

1.3
0.7

0.2

0.7

0.1
0.7
1.4

8.4

2.4
8.4
8.9
0.1
The distribution of metals in sediment (in percentage) follow-
±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
45.5
106.4
286.8
156.1
102.4

44.7
85.5
394.7
169.8
176.5

31.8
124.2
314.7
214.3
132.8

39.6
60.5
170.3
348.7
219.7
ing BCR procedure is shown in Fig. 4. It was observed that Cd was
Cra

the most mobile metal mainly extractable by weak acids (0–64%).

Total metal concentrations (Mean values ± SD; mg kg−1 ; n = 4) in sediments for five selected sites.

The results were also in agreement with the fact that Cd has been
0.99

reported as being among the easily removed and most labile metal
0.1
0.5

0.9
0.6

0.3
0.2
0.8
0.4
0.2

0.1
0.2
0.5

0.5

0.1
0.2
0.2
0.4
1.3
0.0
[30,31]. Mn was also found to be highly extractable by weak acids
±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
9.1
14.3
20.15
30.1
9.8

8.1
8.7
18.5
11.2
9.0

3.6
11.0
17.2
24.9
11.8

4.0
5.0
12.5
14.1
13.6
(4-51%). The high percentage of Mn in the acid–soluble and car-
Co

bonates fraction was probably due to its known close association

with carbonates [2,32]. Mn was also recorded to have the high-
0.003

0.004

0.002
0.000

est percentage (8–67%) in the reducible fraction probably due to

0.01
0.01

0.04

0.06
0.08

0.02
0.01
0.00

0.00
0.1
0.2

0.1

0.1
0.0

0.0
0.0

the presence Mn oxides in this fraction. The results also showed

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
that Pb had a higher proportion in the reducible fraction (0.4–53%), ±
0.003
0.1
0.2
0.067
0.0

0.02
0.0
0.2
0.13
0.09

0.072
0.26
0.3
0.20
0.13

0.07
0.3
0.256
0.26
0.28

followed by Cd (7–51%), As (3–43%) and Zn (4–41%). The results The underlined concentration highly exceeded the HAL values.
Cd

for Pb were in agreement with reported findings for regions influ-

enced by industrial effluents, like coastal sediments in Spain [33]
32.5

34.4

18.6
10.4
10.8

24.0

10.2

20.8
32.5
0.01
1.9

2.7

6.2
6.6

3.2

7.3

5.3
3.0

1.0

7.0

or marine sediments in Singapore [34], where Fe and Mn oxides

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

were found to be important carriers of the metal in the sediments.

136.3
204.9
259.7
222.6
170.3

332.5
221.6
226.2
241.87
189.1

186.4
192.5
288.9
271.1
269.3

176.1
200.6
259.6
355.1
353.6

It was observed that Zn, Pb, Cd, Cu and As recorded the highest
Ba

contents (3–65%; 2–61%; 3–50%; 0–29% and 2–23% respectively)

in the oxidizable fraction. The results for Pb, Cd and Cu may be
0.01

due to their strong complexation with sediments being released

2.3

1.6

2.5
0.9
0.2
0.1
0.1

0.5
0.8
0.3
0.5
0.3

0.2

0.4

0.2

0.1

0.3
0.4
0.0

after degradation of organic matter or oxidation from sulfides to

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±

±
±
±
±
±
12.8
24.3
7.7
7.9
12.62

11.7
15.8
5.0
3.5
5.7

4.5
10.7
4.3
6.0
7.5

4.4
6.87
5.5
11.5
16.1

sulfates. The observed behavior was probably due to the affinity

As

of metals for the organic matter present in water, given the high
anthropogenic loadings in the study region. Higher metal contents
Site

1.2
2.1
6.1
7.1
8.1

1.2
2.1
6.1
7.1
8.1

1.2
2.1
6.1
7.1
8.1

1.2
2.1
6.1
7.1
8.1

were found in the residual fraction for Fe (77–98%), Cr (83–97%),

V (78–94%), Ba (69–91%) and Ni (67–96%). Other metals (Pb, Cu,
Ba, As, Co and Zn) also showed significant contents. These fractions
May 2008

May 2009
Nov 2008
Oct 2007

were less bioavailable because metals in the residual fraction are

Table 7

Date

strongly bound to silicates. Low contents of residual fraction were

a

obtained for Mn (9–52%) and Cd (17–75%) being more available.

184 M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187

Fig. 4. Distribution of heavy metals in sediment from Algeciras Bay obtained by sequential chemical extraction (BCR procedure). Sampling sites: 1.2 (Getares beach); 2.1
(Isla Verde); 6.1 (Palmones); 7.1 (Guadarranque); 8.1 (Puente Mayorga).

3.4. Potential sources of metals Euclidean distances are shown in Figs. 7 and 8. Two groups of metals
formed clusters: Ni–Cr and Zn–Cu–V clusters with the most signi-
Metal concentration and organic matter values in sediment from ficant short linkage distance. The next joining included Fe–(Ni–Cr)
the 17 sampling sites were further investigated by applying princi- and Pb–(Zn–Cu–V). These groups can be associated with stainless
pal component analysis (PCA) with Varimax rotation to obtain an steel and petrochemical industrial activities, respectively. As and
overview of their behaviors and possible metal sources. Data were Mn showed the furthest cluster. Fig. 8 includes the sites clusters
auto-scaled (standardized) in order to be treated with equal impor- with short distances for 5.1–5.2, 4.1–3.1 and 9.1–9.2. The next clus-
tance. Two-factor principal components for the loads (chemical ters were formed among these groups and 7.2, 4.2 and 8.1 sites;
variables) were extracted for the 13 variables in sediments repre-
sented by 17 cases corresponding to eigenvalues >1 and cumulative
variance of 79.2%. Factor 1 accounted for 65.7% of the total variance 0.8
explained and factor 2 explained 13.5%. The factor loadings plot
(Fig. 5) was split into two groups: Group I containing Ba, Cd, Cr, Co, 0.6 Cr Ni
Cu, Fe, Ni, %OM, Pb, V and Zn, while Group II contained As and Mn. Fe
0.4
These groupings indicated showed similarities in behavior among Cd Ba
Zn
Factor 2: 13.5%

these metals and organic matter, influencing the distribution of 0.2 %OM Cu
metals in sediments [35]. Co
V
The scores (sampling sites) plots of the PCA of the sediment sam- 0.0
Pb
ples (Fig. 6) were used to identify the potential sources of pollution,
considering that each factor (with its chemical variable associated) -0.2
could be related with different sites. The principal group in the plot
-0.4
included the sampling sites from the inner of the bay with greatest
influence of the anthropogenic activities; sites 1.2 and 10.1 from the -0.6
outer of the bay with a low influence of PC1; sites 2.1 and 2.2 related Mn
to As and Mn; and sites 9.1 and 9.2 with the opposite behavior. The -0.8
As
site 7.1 close to Guadarranque Estuary presented the highest contri-
-1.0
bution of PC1 and the site 3.2 with Algeciras Port influence showed -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
the influence of PC2. Factor 1: 65.7%
Hierarchical cluster analysis (CA) was applied on standard-
ized data sets sorted by metals and sampling sites to understand Fig. 5. Loadings of variables on the plane defined by the principal components of
the similarities among them. The dendograms with single linkage PCA analysis for total metal concentrations and %OM in sediments from Algeciras
Bay.
Table 8
Concentrations (Mean values ± SD; mg kg−1 ; n = 4) of metal extracts in 0.005 M DTPA + 0.01 M CaCl2 + 0.1 M TEA from 17 sites.

Site As Ba Cda Coa Cr Cua Fe Mn Nia Pba V Zna

1.2 0.07 ± 0.01 0.21 ± 0.01 0.005 ± 0.002 0.135 ± 0.004 0.02 ± 0.00 0.34 ± 0.00 80.8 ± 0.0 19.7 ± 0.2 0.15 ± 0.02 2.75 ± 0.07 0.13 ± 0.01 2.2 ± 0.1
2.1 0.09 ± 0.02 0.27 ± 0.01 0.012 ± 0.002 0.28 ± 0.01 0.019 ± 0.001 1.6 ± 0.1 98.3 ± 0.0 29.2 ± 0.1 0.28 ± 0.02 4.5 ± 0.2 0.18 ± 0.01 3.0 ± 0.2
2.2 0.09 ± 0.01 0.18 ± 0.02 0.016 ± 0.002 0.20 ± 0.02 0.04 ± 0.00 1.23 ± 0.03 82.2 ± 0.2 25.9 ± 0.2 0.35 ± 0.02 4.3 ± 0.2 0.18 ± 0.01 2.2 ± 0.1
3.1 0.08 ± 0.01 0.15 ± 0.01 0.019 ± 0.002 0.37 ± 0.02 0.02 ± 0.00 3.1 ± 0.1 167.3 ± 0.0 6.2 ± 0.2 0.51 ± 0.03 5.5 ± 0.1 0.25 ± 0.01 6.7 ± 0.2
3.2 0.12 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.019 ± 0.001 0.46 ± 0.02 0.03 ± 0.00 3.3 ± 0.1 149.07 ± 0.03 17.9 ± 0.1 0.58 ± 0.02 6.8 ± 0.2 0.28 ± 0.01 6.5 ± 0.3
4.1 0.08 ± 0.01 0.14 ± 0.01 0.063 ± 0.002 0.45 ± 0.01 0.014 ± 0.003 3.7 ± 0.1 176.5 ± 0.0 5.8 ± 0.1 0.59 ± 0.01 7.2 ± 0.1 0.2 ± 0.0 12.5 ± 0.3
4.2 0.10 ± 0.01 0.18 ± 0.01 0.084 ± 0.002 0.55 ± 0.01 0.033 ± 0.003 4.8 ± 0.2 169.7 ± 0.4 6.3 ± 0.1 0.96 ± 0.02 11.8 ± 0.2 0.47 ± 0.01 18.7 ± 0.6
5.1 0.04 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.068 ± 0.001 0.83 ± 0.02 0.02 ± 0.00 6.0 ± 0.1 248.1 ± 0.7 15.58 ± 0.01 1.53 ± 0.01 6.3 ± 0.1 0.13 ± 0.01 16.8 ± 0.3
5.2 0.06 ± 0.01 0.15 ± 0.01 0.081 ± 0.002 0.90 ± 0.01 0.028 ± 0.001 6.9 ± 0.2 210.9 ± 3.2 16.9 ± 0.2 1.91 ± 0.03 8.6 ± 0.3 0.25 ± 0.01 19.0 ± 0.6
6.1 0.08 ± 0.02 0.28 ± 0.02 0.26 ± 0.01 2.38 ± 0.06 0.06 ± 0.01 17.1 ± 0.4 238.3 ± 0.0 22.8 ± 0.2 7.9 ± 0.1 15.1 ± 0.2 0.2 ± 0.0 54.4 ± 0.9
6.2 0.06 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.096 ± 0.006 0.63 ± 0.02 0.03 ± 0.00 4.6 ± 0.1 182.0 ± 0.8 6.9 ± 0.2 1.54 ± 0.04 10.1 ± 0.2 0.26 ± 0.01 24.7 ± 0.6

M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187

7.1 0.04 ± 0.01 0.14 ± 0.01 0.062 ± 0.002 1.59 ± 0.05 0.016 ± 0.001 0.1 ± 0.1 157.9 ± 0.0 6.4 ± 0.2 0.73 ± 0.03 5.0 ± 0.1 0.16 ± 0.01 8.8 ± 0.1
7.2 0.09 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.031 ± 0.004 0.65 ± 0.03 0.026 ± 0.001 5.0 ± 0.2 154.9 ± 0.3 6.9 ± 0.2 0.74 ± 0.03 11.2 ± 0.1 0.34 ± 0.01 9.5 ± 0.4
8.1 0.06 ± 0.01 0.18 ± 0.01 0.014 ± 0.001 0.165 ± 0.002 0.025 ± 0.003 1.65 ± 0.04 118.8 ± 0.0 7.0 ± 0.2 0.28 ± 0.00 4.8 ± 0.1 0.21 ± 0.01 3.03 ± 0.03
9.1 0.03 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.018 ± 0.004 0.11 ± 0.01 0.002 ± 0.002 1.01 ± 0.03 83.19 ± 0.02 3.9 ± 0.3 0.35 ± 0.01 1.39 ± 0.02 0.1 ± 0.0 1.84 ± 0.03
9.2 0.04 ± 0.01 0.27 ± 0.02 0.018 ± 0.001 0.12 ± 0.01 0.07 ± 0.00 1.5 ± 0.1 79.3 ± 0.1 6.7 ± 0.1 0.42 ± 0.03 2.04 ± 0.03 0.19 ± 0.02 2.4 ± 0.1
10.1 0.08 ± 0.01 0.28 ± 0.01 0.005 ± 0.001 0.12 ± 0.01 0.021 ± 0.004 0.30 ± 0.01 59.2 ± 0.1 14.1 ± 0.1 0.06 ± 0.00 3.18 ± 0.05 0.18 ± 0.01 2.2 ± 0.1
a
The underlined concentration highly exceeded the LAL values.
for total metal concentrations and %OM in sediments.
Fig. 8. Dendogram showing clustering of the studied sampling sites in Algeciras Bay

%OM in sediments from Algeciras Bay.

Fig. 7. Dendogram of hierarchical cluster analysis for total metal concentrations and

Bay.
of PCA analysis for total metal concentrations and %OM in sediments from Algeciras
Fig. 6. Scores of sampling sites on the plane defined by the principal components
Linkage Distance Linkage Distance Factor 2: 13.5%
0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5
0

-2.0
3.2 6.2 6.1 7.1 9.2 9.1 7.2 5.2 5.1 4.2 8.1 4.1 3.1 2.2 2.1 10.1 1.2

Mn

9.2
1.2
-1.5
As

9.1
10.1
Co Cd %OM Ba Fe

-1.0
-0.5
Factor 1: 65.7%

8.1
2.2

4.1
2.1

3.1
0.0
Ni

4.2
0.5

7.2
Cr

5.1
Pb

5.2

6.1
1.0

3.2
Zn

6.2
1.5
Cu

7.1
V

2.0

185
186 M. Díaz-de Alba et al. / Journal of Hazardous Materials 190 (2011) 177–187

Table 9 Table 10
ANOVA test results for the significant values (p < 0.05) of total metals among sam- Kruskal–Wallis ANOVA for the fractions of speciation scheme using sampling point
pling sites for five selected points used for speciation studies. as independent variable.

Variable Square sum Mean square F p Metal p-Valuea , b

Co 510 128 5.44 0.0064 Exchangeable Reducible Oxidizable Residual

Cr 159351 39838 10.07 0.0004 fraction fraction fraction fraction
Cu 669 167 6.01 0.0043
Fe 6 × 108 1 × 108 7.29 0.0018 As 0.0277 0.0039 0.1056 0.0063
Mn 8 × 10−6 2 × 10−6 6.06 0.0041 Ba 0.1307 0.0607 0.0051 0.2323
Ni 29892 7473 5.31 0.0072 Cd 0.0050 0.0388 0.2674 0.8190
V 12382 3096 4.78 0.0109 Co 0.0019 0.0059 0.0334 0.0044
Zn 6476 1619 10.60 0.0003 Cr 0.1120 0.0123 0.1857 0.0566
Cu 0.0226 0.0144 0.0522 0.0553
Fe 0.0020 0.0033 0.0064 0.0024
Mn 0.0134 0.0140 0.0429 0.1401
between 2.1–2.2 (Isla Verde) and 1.2–10.1 (the most external sites). Ni 0.0089 0.0146 0.0188 0.0078
Pb 0.0053 0.0070 0.0238 0.0745
Sites 6.1, 6.2 and 7.1 were distinguished from the rest with high
V 0.0932 0.0094 0.2079 0.0037
influence of industrial pollution. Site 3.2 was clearly not grouped Zn 0.0034 0.0126 0.0136 0.0404
probably due to its position near the Algeciras Port with a high As a
The underlined p values showed no significant differences.
content. b
Significant differences with p < 0.05; n = 20.
Significant differences among metal concentrations obtained
from the control site and the pollution hotspots were investigated
by applying ANOVA and Tukey tests, studying sampling sites (sites the residual fraction and Ba and Mn in the oxidizable fractions also
1.2, 2.1, 6.1, 7.1 and 8.1), sampling campaigns (1st, 2nd, 3rd and presented significant differences among sampling sites. From this
4th), seasons (autumn-spring) and years (2007, 2008 and 2009). statistical analysis can be concluded that depending on the influ-
The concentrations of As and Mn were not normally distributed ence of pollution hotspot the availability of the metals studied may
(showed by Shapiro–Wilk test) and (log As) and (1/Mn) conver- be different. The significant differences found among metals for
sions were made to transform the data into a normal distribution. more available fractions mean that the pollution reaching the Alge-
According to one-way ANOVA test Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, V and Zn ciras Bay is potentially toxic. Although they may transfer to the less
showed significant differences (p < 0.05) in concentrations among available fraction after geochemical distribution, all metals do not,
sampling sites (Table 9). Cd showed significant differences among as for As, Cd, Pb and Zn above mentioned in the speciation study.
sampling campaigns (p = 0.023) and years (p = 0.039). Significant
seasonal differences were not observed for any metal. The post hoc 4. Conclusions
Tukey test (or multiple comparison test) was applied to determine
the found significant differences among groups. Co, Cr, Cu, Fe, Ni, The metallic contamination in sediments from Algeciras Bay was
V and Zn showed significant differences between the sampling site investigated in this study. Fe, Mn, Ba and Cr showed the highest
1.2 (Getares beach) and 6.1 (Palmones) and Cr, Ni and Zn did it contents. Quality guidelines values for metal concentrations were
between 2.1 (Isla Verde) and 6.1 (Palmones). It is outstanding that exceeded for Ni and Cr. Potential toxicity of metals was studied and
Fe concentrations of site 6.1 showed differences with all sampling low alert levels of Co, Cu, Zn, Cd, Ni and Pb were exceeded at most
sites. Co, Cr and Zn also showed significant differences between 1.2 sampling sites, mainly at Palmones. In addition, speciation analysis
and 7.1 (Guadarranque). These metals presented higher concentra- of sediment was performed providing information of availability
tions at Palmones and Guadarranque sites than at Getares beach, of metal. Cd, Zn, Pb and As were found as the most available met-
probably due to their proximity to the steel manufacturing plant, als. EF, CF and Igeo showed that Algeciras Bay is still in its pristine
thermal power plants and the petroleum refinery. It is notewor- state regarding metal pollution except for As, Ni, Cr, Pb and Cd.
thy that Co at Guadarranque recorded lowest contents in the resi- Principal component, cluster and ANOVA analyses were applied to
dual fraction and demonstrated to be mainly extractable by weak assess the sources of metals and to study the influence of season-
acids, being quite bioavailable metal. The rest of the above metals ality and anthropogenic activities on the quality of the sediments.
at Palmones and Guadarranque were found mainly in the residual The effectiveness of these analyses for environmental studies was
fraction, concluding that they were not bioavailable at those areas. demonstrated; important and reliable information was obtained
Regarding Mn, it was found that the sampling site 1.2 was signif- describing the quality of sediments from Algeciras Bay. It has been
icantly different from the sites 7.1 and 8.1 (Puente Mayorga). At shown that pollution from industrial activities, sewage from the
Getares beach, higher concentrations of this metal were observed, city of Algeciras and maritime activities from the Algeciras Port are
maybe because of atmospheric deposition from the industrialized affecting this ecosystem.
regions. Mn presented a high percentage in the acid extractable
and reducible fraction at Getares beach, meaning its availability Acknowledgements
to aquatic organisms although is low toxic. Significant differences
were found for Cd between the first sampling and the last one (Octo- The research was supported by Andalusia Government (Project
ber 2007 and May 2009), as well as between the years 2007 and PAI-EXCEL-06-FQM-02075) and the grants: Formación Profesorado
2009, recording the highest contents in May 2009. Universitario (MEC) for M. Díaz, Erasmus Mundus External Win-
Non-parametric analyses (Kruskal–Wallis ANOVA) (data set dow Cooperation for C. Mitto and Formación Personal Investigador
could not be normalized) were applied to speciation data (in per- (UCA) for M.J. Casanueva.
centage) in order to understand the significant differences among
sampling sites for each fraction of speciation scheme (Table 10). It References
was found that all metals in the acid extractable and reducible frac-
tions showed significant differences among sampling sites except [1] C.M. Carman, X.D. Li, G. Zhang, O.W.H. Wai, Y.S. Li, Trace metal distribution in
for Ba and V in the first fraction and Ba in both ones. However sediments of the Pearl River Estuary and the surrounding coastal area, South
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 Talanta 100 (2012) 432–438

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Talanta
journal homepage: www.elsevier.com/locate/talanta

Solid phase extraction of copper traces using poly(styrene-divinylbenzene)

membrane disks modified with pyridoxal salicyloylhydrazone in
water samples
M. Dı́az-de Alba, M.D. Galindo-Riaño n, M. Garcı́a-Vargas
Faculty of Sciences, Department of Analytical Chemistry, University of Cádiz, Campus Rı́o S. Pedro, 11510 Puerto Real, Cádiz, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: A simple technique for the isolation, concentration and matrix simplification of Cu(II) ion in natural
Received 2 May 2012 waters is proposed. This method has been developed using poly(styrene-divinylbenzene) membrane
Received in revised form disks modified with the synthesized ligand pyridoxal salicyloylhydrazone (PSH). The retained ions on
8 August 2012
the disks were eluted with 10 mL 1 mol L  1 HNO3 and measured by flame atomic absorption
Accepted 9 August 2012
Available online 18 August 2012
spectrometry at 324.8 nm. The influence of pH, amount of ligand, type and amount of eluent for the
stripping of copper ion from the membrane over extraction efficiency were evaluated. Extraction
Keywords: efficiencies 4 99% were obtained by elution of the disks with minimal amount of solvent with a
Copper preconcentration factor up to 100. The precision of the method for 10 replicate measurements of
Water analysis
aqueous solutions containing 40 mg L  1 Cu(II) was 1.5% at significance level of 95%. The breakthrough
Solid phase extraction
volume for 5 mg of Cu(II) was found to be 1000 mL and the detection limit of the method was 4 ng L  1
Poly(styrene-divinylbenzene) membrane
disks of metal ion. The present method was successfully applied to the extraction and determination of
Pyridoxal salicyloylhydrazone copper in lake and sea waters.
& 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction by EPA method 220.1 (Methods for the Chemical Analysis of

The separation and isolation of low levels of copper from natural
waters and its determination has special importance. Copper is a
ubiquitous trace metal and occurs in soil, water, air and in the
biosphere. Natural waters (pristine streams, rivers and lakes) contain
0.5–200 mg L  1 total dissolved copper. Coastal, bays and estuary
waters contain copper concentration from about 0.0069–20.0 mg L  1
and ocean water contains 0.0063–2.8 mg L  1 [1]. Copper is an
essential and necessary micronutrient for many biological systems
at very low levels. However, it becomes toxic at high levels due to its
association with cell membranes, preventing the transport across the
wall cell. Spectrophotometric methods and flame atomic absorption
spectrometry (FAAS) [2–4] are very available techniques in many
laboratories so they are frequently used for determination of heavy
metals, such as copper. FAAS is usually less subjected to interferences
than electrothermal atomic absorption (ETAAS) or inductively-
coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) (difficulties in the
determination are caused by matrix interferences, principally high
salt content). However, its sensibility can be insufficient with some
environmental samples containing subtraces amounts of copper
(detection limit of 0.02 mg L  1 copper in water without interferences
n
Corresponding author. Tel.: þ34 956 016362; fax: þ34 956 016460.
E-mail address: dolores.galindo@uca.es (M.D. Galindo-Riaño).
Water and Wastes (EPA/600/4–79/020)). Consequently, a separation,
preconcentration and matrix simplification step prior to copper
determination by FAAS is normally necessary.
Many preconcentration techniques have been widely used for
copper analysis in environmental samples, liquid–liquid extrac-
tion, coprecipitation, ion-pair extraction and liquid membrane
technology [5–8]. These classical methods of extraction are labor
intensive and time-consuming. Furthermore, the majority of
these techniques consume relatively large volumes of high-
purity solvents with expensive disposal requirements, and the
subsequent removal of solvents causes many environmental
problems.
The solid phase extraction method (SPE) can solve these
disadvantages. SPE is a rapid and simple technique for the
isolation, preconcentration and matrix simplification of selected
analytes in samples with unfavorable properties for direct analy-
sis to achieve increased sensitivity in the analytical process. It is
an attractive alternative for the classical solvent–solvent extrac-
tion methods, due to its low costs, shorter processing times,
simpler processing procedures and low consumption of and
exposure to solvent and it has received much attention in recent
years for the analysis of trace metals in environmental samples. In
SPE the water sample passes through the solid phase, which
consists of particulate sorbent packed into columns of short
length (usually called ‘‘cartridges’’) or immobilized in the form

0039-9140/$ - see front matter & 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2012.08.014
 M. Dı́az-de Alba et al. / Talanta 100 (2012) 432–438
of a thin disk. During the process, the analytes are retained onto
the solid phase and eluted from the sorbent with a suitable
solvent.
Recently, the SPE disks and cartridges have been successfully
used for the separation and determination of metal ions in some
types of natural waters. Carbon nanotubes cartridges have been
used in order to preconcentrate copper from water samples prior
to its analysis by FAAS [9]. Likewise Al, Cd, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Sn, V
and Zn in seawater have been analyzed by preconcentrating in
cartridges and ICP-optical emission spectrometry determination
[10]. By contrast, SPE disks have been frequently used to pre-
concentrate so many metallic ions in water samples, like nickel,
iron and copper before their determination by FAAS [11–13] or
silver and nickel in natural waters prior to their analysis by
diffuse reflectance spectroscopy [14,15]. Both formats (cartridges
and disks) use the same sorbent technology, but disks offer many
advantages that favor their use for some applications: disks work
better for large sample volumes containing suspended particles
because of their larger cross-sectional area that provides shorter
sample processing times; the use of smaller particles and the
grater mechanical stability of disks minimize channeling that
can occur in cartridges due to their lower packing density. In
summary, the thin bed mass of the disk provides these perfor-
mance gains: minimization of solvents and sample volumes, high
throughput, small elution volumes, ability to eliminate the
evaporation step, sample processing at maximal flow rates with-
out channeling and consistent recoveries.
There are many kinds of sorbent for disks: octadecylsiloxane
(C18) and octylsiloxane-bonded silica (C8) (for extraction of
non-polar and moderately polar compounds), poly(styrene-
divinylbenzene) (SDB) (for compounds poorly extracted by
octadecylsiloxane-bonded silica sorbents and soluble in water),
activated carbon (less frequently used), mixed mode, sulphonic
acid and quaternary amine ion exchangers (for the selective
isolation of ionic and easily ionisable compounds),y [16]. For
metal ions in water samples, octadecylsiloxane-bonded silica and
poly(styrene-divinylbenzene) disks are commonly used (e.g., SDB
disks have been used to the trace analysis of silver, nickel, copper,
iron and chromium [14,15,17] and C18 disks have been utilized
for the analysis of nickel, iron, copper, silver and cadmium
[11–13,18,19]). SDB disks have the important advantage of being
stable in the whole range of pH. The selectivity of the disks can be
improved by immobilization of suitable reagents onto the solid
sorbent.
The aim of this work was the use of pyridoxal salicyloylhy-
drazone (PSH) reagent as a selective modifying agent of the SDB
membrane disk for the highly selective extraction, preconcentra-
tion and determination of very low trace amounts of copper ion in
water samples with different saline matrix by FAAS. Heterocyclic
hydrazones, including PSH, are an important group of ligands
which have attracted attention on medicinal chemists due to their
remarkable antiviral and antimalarial effects, iron scavenging and
antitubercular activities. These biological activities are based on
their ability to form stable chelates with the transition metal ions
[20] which can be retained on disks.
2. Experimental
2.1. Reagents and solutions
All reagents and solvents were of the highest purity available
(pro analysis or Suprapur grade) and all aqueous solutions were
prepared using Milli-Q deionised water (Millipore, USA).
Standard solutions of copper were prepared by dilution of
1000 mg L  1 AS (atomic spectroscopy) standard solution from
433
Merck (Darmstadt, Germany) in 0.05 mol L  1 HNO3. The synth-
esis of PSH has been described previously [21] using salicyloyhy-
drazide and pyridoxal hydrochloride (Sigma-Aldrich, Steinheim,
Germany). Crystals obtained were filtered off and washed with a
large volume of ethanol. Subsequently, they were re-crystallized
from 1:1 ethanol/water and dried at 110 1C with a yield of 80%.
The reagent obtained was yellow (C15H15N3O4, formula weight,
301; m.p., 247 1C; CAS No.: 82970-90-9).
The pH values of sample solutions (range 3.5–5.5) were
adjusted using acetate buffer (4 mol L  1) prepared with acetic
acid and sodium hydroxide of Suprapur grade (Merck, Darmstadt,
Germany). After adjustment of pH, the final concentration of
buffer in sample solutions was 0.4 mol L  1.
The proposed method was applied to coastal water samples
from southwest coast of Spain (Huelva Estuary). They were
filtered in situ using 0.45 mm Calyx Capsule MSI filter (3/800 barb,
1/PK, polypropylene; Osmonics, USA) connected on line with the
Tygon tubes. 500-mL portions of samples were acidified with
2 mL L  1 HNO3 of Suprapur grade (Merck Darmstadt, Germany),
kept to room temperature during one week, and after stored at
 18 1C until analysis. Before analysis, organic matter of samples
was destroyed by adding of 0.02 mol L  1 Suprapur hydrogen
peroxide (Merck, Darmstadt, Germany) and UV digestion for three
hours employing a 500 W high pressure mercury vapour lamp.
2.2. Apparatus
Metal ion measurements were performed by atomic absorp-
tion spectroscopy (AAS) using a Solaar-M Series spectrometer
(Unicam, UK), with a hollow cathode lamp at a wavelength of
324.8 nm using an adjusted air–acetylene flame and a deuterium
background corrector. A model 2001 pH-meter equipped with
52-02 combined glass-Ag/AgCl electrode (Crison, Spain) was used
for pH measurements. Extractions were carried out on a standard
Millipore 47-mm filtration apparatus connected to a D95 model
DINKO vacuum pump.
2.3. Sample extraction
Extractions were performed with 47 mm diameter  0.5 mm
thickness 3M-EmporeTM SDB-XC membrane disks containing
poly(styrene-divinylbenzene) (16-mm particles, 80-Å pure size).
The typical composition of the disks is 90% w/w poly(styrene-
divinylbenzene) and 10% w/w PTFE fibers and their surface area is
450 m2 g  1. The structure of SDB-XC provides unique selectivity,
especially in the retention of moderately polar analytes and
displaying aromatic interactions allowing the retention of PSH.
Before sample extraction, a preconditioning step, cleaning and
conditioning of disks were carried out in order to ensure an
optimal extraction of copper ion. Thus, after installing the
membrane disk in the filtration apparatus, it was rinsed with
5 mL methanol with the aim of preconditioning the disk and
making the pass of following solvents easier. Cleaning step
consisted in washing the membrane disk with 10 mL of a
1 mol L  1 HNO3, 10 mL methanol and 10 mL acetonitrile by
applying a slight vacuum to remove all metallic and organic
contaminants that could come from manufacturing process and
the environment. After all the solvents had passed through the
disk, it was dried by passing air for a few minutes. Conditioning
step began by introducing 2.5 mg of PSH dissolved in 2.5 mL of
methanol to the reservoir of the apparatus. This solution was
drawn slowly through the disk without vacuum so that the whole
disk surface was soaked. When the ligand had completely
penetrated inside the membrane and methanol had been evapo-
rated at room temperature, the disk was washed with 25 mL of
water under vacuum and dried by passing air through it. By this
434 M. Dı́az-de Alba et al. / Talanta 100 (2012) 432–438

way, the membrane disk was modified by PSH and ready for
sample extraction.
The general procedure for the extraction of Cu(II) ions from
aqueous samples was as follows: the modified membrane disk
was washed with 25 mL of water in order to prewet its surface
before the extraction of Cu(II) ions. Then, 500 mL of the sample
solution containing 20 mg of Cu(II) adjusted to a pH 4.5 was
passed through the disk under vacuum to maintain a flow rate of
10 mL min  1. The surface of the disk must be wet during all
extraction process. After the extraction, bulk water was removed
from the disk and the apparatus by sucking air through the disk
under full vacuum for about 3 min. With this procedure, copper
ions are quantitatively adsorbed on the modified disk. After the
extraction, the adsorbed copper was stripped from the modified
membrane disk using 10 mL of 1 mol L  1 HNO3 at a flow rate of
5 mL min  1. The copper concentration was determined at
324.8 nm by FAAS.
In order to re-use the disk, a last cleaning step was carried out.
Thus, the membrane disk was rinsed with 10 mL of 1 mol L  1
HNO3, 10 mL of methanol and 10 mL of water by appling vacuum
until the disk was completely dried before storing.
fractional factorial design 33 1 [26] was applied to optimise the
extraction conditions using this multivariate method.
3.1. Preliminary studies
3.1.1. Choice of eluent
In order to choose the most effective eluent the retained
copper ions were stripped with varying concentrations of differ-
ent acids. The recovery for samples containing 20 mg of Cu(II) in a
500 mL solution at pH 4.5 using 5 mg of PSH are summarized in
Table 1. The quantitative elution of copper from the modified
membrane disk could be accomplished by using 5–10 mL of
0.5 mol L  1 HCl, or 10 mL of 1 mol L  1 HCl. Also, 10 mL of
1–2 mol L  1 HNO3 were adequate. Acetic acid could not produce
a quantitative stripping of these metallic ions, even at high
concentrations. Subsequent quantitative elutions of the complex
were carried out with 5–10 mL of 1 mol L  1 HNO3 rather than HCl
because nitrate ion is reported to be a more acceptable matrix for
FAAS and ETAAS measurements than chloride [27].

3.1.2. Effect of pH on the adsorption of Cu(II)

The effect of pH of test solutions on the copper recovery using a
3. Results and discussion modified disk with 5 mg of PSH was studied as follows: 500 mL
solutions containing 20 mg Cu(II) were adjusted in the pH range
PSH is a multidentate ligand with the chromogenic group 3.5–5.5 by using 4 mol L  1 acetic acid/sodium acetate buffers. The
(OH)C–C–CO–NH–N–C–C(OH) (Fig. 1) with a low solubility in resulting solutions were passed through the modified membranes
water (0.6 g L  1 [22]). The ligand has an acid-base behaviour with and then stripped with 10 mL of 1 mol L  1 HNO3. The obtained
two ionisation constants of pK1 ¼4.0 and pK2 ¼ 7.9, caused by results are shown in Fig. 2. Maximum retention of metal was
protonation of the pyridine nitrogen atom and deprotonation of achieved at the pH range of 4.5–5. The progressive decrease of
the hydroxyl group, respectively. It can be bonded to different copper recovery at pHo4.5 is probably due to weak complex
transition metals, like Al(III), Cu(II), Ni(II), Ti(IV) and Zr(IV), formation of copper with immobilized PSH on solid phase particles
producing very stable complexes [21,23,24]. This reagent has
been used in the spectrophotometric determination of several Table 1
metals as nickel, zinc, iron or zirconium and in the stripping Copper ions recovery from the modified membrane disks using different stripping
voltammetric determination of nickel [25], but nothing has been acid solutions (samples contained 20 mg Cu2 þ ions in 500 mL water at pH 4.5).
previously reported about the use as a potential modifier of
Stripping acid solution % Recovery for each acid concentrationa
membrane disks. In this study, PSH has been proposed for copper
determination because of its good binding capacity to this ion. 0.5 mol L  1 1 mol L  1 2 mol L  1
The continuous variation (Job’s method) and the mole ratio
methods were applied in order to establish the stoichiometry of 10 mL HNO3 93.2 101.0 102.1
5 mL HNO3 91.7 95.7 93.7
the Cu(II)-PSH complex. Methanol solutions of copper chelate
10 mL HCl 100.7 101.4 96.4
buffered at pH 4.5 were prepared and their absorbances were 5 mL HCl 100.3 96.8 95.7
measured at 420 nm with visible spectrophotometer. The copper/ 10 mL CH3COOH 7.1 28.0 83.4
PSH ratio was found to be 2:3.
a
Some preliminary experiments were performed in order to R.S.D. r 1.2% for three replicate experiments.

investigate the quantitative retention of Cu(II) ions by poly

(styrene-divinylbenzene) membrane disks in the absence and
presence of PSH. It was found that, while the membrane disk 100
itself did not show any tendency for the retention of Cu(II) ions
95
( o1%), the membrane disk modified by PSH was capable to
quantitatively retain Cu(II) ions in the sample solution. 90
% Recovery

The efficiency of this proposed method was first determined

with a set of preliminary experiments in order to acquire informa- 85
tion about chemical and instrumental variables using the univariate 80
model. The variables studied were the type and concentration of
eluent, pH of the sample, flow rate and amount of PSH. Afterwards, a 75

70
N O OH
OH 65
N 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
H 3C N pH
H
OH Fig. 2. Effect of aqueous phase pH on extraction of copper ion (conditions: Cu(II)
amount¼ 20 mg; sample volume ¼500 mL; eluent ¼10 mL of 1 mol L  1 HNO3;
Fig. 1. Structure of pyridoxal salicyloylhydrazone. immobilised PSH amount ¼5 mg; n¼ 3).
 M. Dı́az-de Alba et al. / Talanta 100 (2012) 432–438 435

and the possible Cu ions precipitation at basic pH values [28]. Table 2

Therefore, a pH 4.5 was chosen for the following determinations. Factor levels and selected values for the fractional factorial design 33  1 (samples
containing 20 mg Cu2 þ ions in 500 mL; 2.5 mg of immobilised PSH on the disk).

3.1.3. Effect of flow rates Variable Low level Medium level High level
The influence of flow rates of the sample and stripping ( 1) (0) (þ1)
solutions on the preconcentration method was investigated. It
Volume of HNO3 (mL) 5 10 15
was found that adsorption of the metal ion was quantitative and
pH of the sample 3.5 4.5 5.5
reproducible in the range 10–20 mL min  1. Thus, the flow rate of Concentration of HNO3 0.5 1 1.5
sample selected for all studies was 10 mL min  1. On the other (mol L  1)
hand, quantitative stripping of copper ions from the disk was
achieved in a flow rate range of 1–10 mL min  1 using 10 mL of
1 mol L  1 HNO3. At higher values of flow rate, greater volumes of
nitric acid are necessary to reach a quantitative stripping. Because Table 3
of it, the flow rate during the stripping was maintained at Variable levels and results of the experimental design 33  1 (random order for
5 mL min  1 throughout the experiments. experiments).

Experiment Volume of pH HNO3 concentration % Cu

3.1.4. Effect of PSH amount HNO3 (mL) (mol L  1) recovery
In order to investigate the amount of PSH on the quantitative
recovery of Cu(II) by the membrane disk, the solid-phase extraction 2 5 4.5 1.5 77.6
was conducted by varying the amount of ligand from 0 to 7.5 mg 5 10 4.5 1 99.4
3 5 5.5 1 70.3
using 1 mg mL  1 PSH solutions in methanol (Fig. 3). The extraction
8 15 4.5 0.5 86.5
of copper ions was quantitative above 2.5 mg of ligand. Hence, for 4 10 3.5 1.5 64.2
subsequent studies 2.5 mg PSH sorbed on SDB disk was used. 7 15 3.5 1 72.8
6 10 5.5 0.5 67.6
9 15 5.5 1.5 73.1
3.2. Experimental design: Multivariate optimisation
1 5 3.5 0.5 76.2
10 10 4.5 1 99.2
To select the optimum conditions for pH, volume and concen- 11 10 4.5 1 99.5
tration of the eluent, a reduced factorial design was employed
(fractional factorial design 33  1). With this type of design the
factors can be efficiently evaluated using a small fraction of
the experiments of the full factorial design [26]. A total of ten Pareto chart of Standardized Effects
Variable: Cu Recovery (%)
experiments were carried out including three repetitions of the
central point. The variables were studied at three levels, high,
pH (Q) 3.90
medium and low, denoted by ( þ1), (0), (  1), respectively. The
different variables and levels evaluated and the Pareto chart are
[HNO3] (Q) 1.72
shown in Table 2 and Fig. 4, respectively. The results of each
experiment can be found in Table 3.
[HNO3] (L) -0.84
According to the Pareto chart, it can be concluded that the pH
showed a significant quadratic positive effect at confidence level of
V HNO3 (Q)
95% being 4.5 the optimum value. Three-dimensional (3D) plots for 0.55
the measured responses were formed based on the model poly-
nomial functions to assess the change of the response surface. The V HNO3 (L) 0.45
relationship between the response (Cu ions recovery) and the
independent variables (pH, volume and concentration of HNO3) pH (L) -0.12
can be also understood by these plots. In Fig. 5 it can be seen that
the higher recovery is obtained when pH 4.5 and 10–15 mL of HNO3 p=0.05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Fig. 4. Pareto chart for fractional factorial design 33  1.

100

75 are used. In Fig. 6 the best response is achieved when pH 4.5 and
1 mol L  1 HNO3 are used. Fig. 7 shows the maximum recovery for
% Recovery

1 mol L  1 HNO3 and 10–15 mL of HNO3. Thus, the optimum

50 conditions were: pH 4.5 and 10–15 mL of 1 mol L  1 HNO3. 10 mL
were selected to diminish the elution volume.
25

4. Analytical performance
0
0 2 4 6 8
4.1. Reusability and maximum capacity of the disk
Amount of PSH (mg)

Fig. 3. Effect of immobilised PSH amount on extraction of copper ion (conditions:

The reusability and stability of the modified disk was tested by
Cu(II) amount ¼20 mg; sample volume ¼ 500 mL; pH¼ 4.5; eluent¼ 10 mL of monitoring recovery of copper ions for several cycles. It was
1 mol L  1 HNO3; n ¼3). found that the use of the same disk modified with 2.5 mg of PSH
436 M. Dı́az-de Alba et al. / Talanta 100 (2012) 432–438

100 105

Recovery of Cu (%)
Recovery of Cu (%)

90 100
80 95
70 90
60 85
50 80
40 75
1 70
1
1 1
0 0
0

[H
pH

0
O3

N
3
N NO

O3
VH V H

]
-1
-1
Fig. 5. Response surface plots (3D) showing the effect of pH and volume of HNO3.
Fig. 7. Response surface plots (3D) showing the effect of concentration and
volume of HNO3.

coefficient and equation of the linear regression (n¼10) were

R2 ¼0.9982 and Absorbance (l ¼ 324.8 nm)¼0.0038þ0.0047 [Cu(II)]
(mg L  1), respectively.
100
Recovery of Cu (%)

90 4.2. Break-through volume

80 The break-through volume was checked by dissolving 5 mg of

70 copper in different volumes (50, 100, 250, 500, 750, 1000 mL) of
aqueous phase. The recovery of copper was tested following the
60 proposed procedure. It was observed that the sorption of copper
50 was quantitative for the studied range, being the breakthrough
volume of 1000 mL. Thus, a preconcentration factor of 100 using
40 10 mL of eluent was easily achievable being comparable with
1 other SPE methods.

1
4.3. Reproducibility and limit of detection
0
[H

0
N

The reproducibility of the proposed method for the extraction

O3

pH and determination of copper was investigated and the recovery

]

average of metal ion obtained from ten replicate experiments

-1
Fig. 6. Response surface plots (3D) showing the effect of pH and concentration of
HNO3.
resulted in no change in the recovery of 40 mg L  1 Cu(II) ion for at
least 20 times with a RSD of 1.24% (n ¼20). This indicates that the
modified disk has a good reusability for continuously usage.
The maximum capacity of the membrane disk was determined
by passing 500 mL of an aqueous solution containing 350 mg
copper at pH 4.5 through the disk, followed by determination of
the retained metal ions by FAAS. The maximum capacity was found
to be 65.672.1 mg of copper ion on the disk modified with 2.5 mg of
PSH. The linear dynamic range of the proposed method for Cu(II)
ions was found in a concentration range of 1–60 mg L  1, being very
appropriate for copper analysis in water samples. The correlation
using different disks was found to be 99.072.1% for 40 mg L  1
Cu(II) in the sample. The precision of the method calculated by
using the student’s t test for these ten replicates was 1.5% at
confidence level of 95%.
The detection limit (DL) of the method, calculated as three
times the standard deviation of blank samples (n ¼5), was
4 ng L  1 Cu(II) and the quantification limit (QL), calculated as
10 times the standard deviation, was 14 ng L  1 Cu(II) [29].
4.4. Effect of diverse ions on sorption of copper
In order to investigate the selective separation and determina-
tion of copper from samples containing diverse ions, aqueous
solutions (500 mL) containing 20 mg Cu(II) and different inorganic
salts present in seawater (synthetic seawater composition) were
 M. Dı́az-de Alba et al. / Talanta 100 (2012) 432–438 437

taken and the proposed procedure was followed. Furthermore, this kind of samples [30]. The results summarized in Tables 4 and
the influence of other trace metals present in seawater was 5 showed that 20 mg of Cu(II) ions in the binary mixtures are
evaluated using higher concentrations as the usually found in retained quantitatively by the PSH-modified membrane disk,
indicating the applicability of this method to complex samples.

Table 4
Recovery of copper ions from binary mixtures with inorganic salts presented in
seawater [30] (20 mg Cu(II); Vsample ¼ 500 mL).
5. Analytical applications

Inorganic salt Concentration (g L  1) % Cu(II) recovery 5.1. Method validation and analysis of seawater

NaCl 23.94 99.3

The accuracy of the method was evaluated by the determina-
MgCl2  6H2O 10.83 96.7
Na2SO4 3.99 99.6 tion of Cu(II) in a certified reference lake water TM-DWS-2. The
CaCl2  4H2O 2.12 100.1 method was also applied successfully to the analysis of dissolved
KCl 0.677 98.5 Cu(II) in two real seawater samples collected from the southwest
NaHCO3 0.196 99.4
coast of Spain (Huelva Estuary). Samples were filtered and UV
KBr 0.098 100.8
H3BO3 0.027 102.7
digested in order to remove suspended and organic matter. The
SrCl2  6H2O 0.024 99.3 results (Table 6) showed a very good agreement between the
NaF 0.003 100.8 experimental and certified values for reference water with a
relative error of 2.8%. Measurements of Cu(II) ion in two seawater
samples obtained by the proposed method were also compared
Table 5 which those obtained by differential pulse anodic stripping
Recovery of copper ions from binary mixtures with trace metals presented in voltammetry (DPASV) (Application Bulletin No. 231/2e; B12916,
seawater [30] (20 mg Cu(II); Vsample ¼ 500 mL).
Metrohm) [31]. The relative error for seawater samples (1 and 2)
Metal ion Concentration Cu:Metal % Cu(II) were 1 and 1.5%, respectively. In both studies, significant differ-
(mg L  1) Concentration recovery ences at 95% confidence limit were not found.
ratio (mg L  1:mg L  1)

Al(III) 2.70 14.8 99.2

5.2. Comparison with other SPE methods for copper analysis
Fe(III) 5.58 7.2 101.5
Mn(II) 5.49 7.3 99.8 in seawater
Ni(II) 5.87 6.8 99.3
V(V) 5.09 7.9 100.5 Table 7 shows a comparison of SPE methods for copper
Zn(II) 6.54 6.1 99.2 analysis in seawater in terms of detection limit, reusability and
Pb(II) 6.22 6.4 99.6
range of linearity. As can be seen, the method presented in this
Bi(III) 0.63 63.5 99.2
Cd(II) 0.34 117.6 101.2 paper shows a very high sensibility, a significant reusability and a
Co(II) 0.18 222.2 99.7 good range of applicability, being suitable for low levels of copper
Tl(I) 0.61 65.6 99.4 in water samples such as seawater.

Table 6
Determination of Cu(II) ions in certified reference water (TM-DWS-2, lake water) 6. Conclusions
and real seawater (from southwest coast of Spain) by the proposed solid-phase
extraction method (n¼2). An accurate, reproducible and inexpensive method for
preconcentration and determination of trace amount of copper
Sample Cu(II) concentration Cu(II) found by the Relative
(mg L  1) proposed method (mg L  1) error (%) ion was developed. A preconcentration factor of 100 could be
achieved by this method which allows determining the copper
TM-DWS-2 168 77.1 a 172.7 72.3 2.8 content in highly diluted samples by conventional flame atomic
Seawater 1 13.83 70.51 b 13.97 70.28 1.0 absorption spectrometry. The method can selectively separate
Seawater 2 26.11 70.63 b 26.49 70.12 1.5
Cu(II) ion from other metal ions, being successfully applied to the
a
Certified value. separation and determination of copper in water samples with
b
Determination by ASV [31]; n ¼4. high saline matrix, such as seawater.

Table 7
Summary of SPE methods for copper analysis in seawater and other samples using membrane disks and AAS determination.

Solid Immobilized reagent DL Reusability Range Application Ref.

support (mg L  1) (no. cycles) (mg L  1)

C-18 silica 5-tert-butyl-2-hydroxy-benzaldehyde oxime (L1) 0.29 – 2.5–2847.2 Tap water, spring water and sea [32]
3,5-di-tert-butyl-2-hydroxy-benzaldehyde oxime (L2) 0.25 2.5–3825 water
C-18 silica N,N0 -disalicylideneethylenediamine 0.005 14 – Tap water, snow water, rain [33]
water, sea water
C-18 silica 1,5-diphenylcarbazide 0.005 15 – Tap water, snow water, rain [34]
water, sea water
C-18 silica 3-{2-[2-(2-hydroxyimino-1-methyl-propylideneamino)- 0.17 – – Tap, snow, river, rain, spring, [35]
ethylamino]-ethyl-imino}-butan-2-one oxime mineral and seawater
C-18 silica (2,20-[1,2-ethanediyl bis(nitriloethylidyne)] bis(1-naphthalene) 0.004 – – Tap, snow, rain, seawater [36]
SDB Pyridoxal salicyloylhydrazone (PSH) 0.004 20 1–60 Lake and seawater This work
438 M. Dı́az-de Alba et al. / Talanta 100 (2012) 432–438
Acknowledgment
This work has been supported by the grant ‘‘Formación de
Profesorado Universitario’’, from the Ministerio de Ciencia e
Innovación for M. Dı́az-de Alba.
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