UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ORQUÍDEAS E BROMÉLIAS

NATIVAS DA AMAZÔNIA.

MANAUS
2018
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ORQUÍDEAS E BROMÉLIAS
NATIVAS DA AMAZÔNIA.

Prosposta projeto para iniciação

científica, apresentado a
Universidade Federal do Amazonas,
como parte das exigências para a
aprovação no Programa Institucional
de Bolsas de Iniciação Cientifica.
Tendo como Orientadora Profª
Dra.Eva Maria Alves Cavalcanti
Atroch.

MANAUS
2018
SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ................................................................................................... 3
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ORQUÍDEAS E BROMÉLIAS NATIVAS DA
AMAZÔNIA......................................................................................................... 4
OBJETIVOS ....................................................................................................... 6
METODOLOGIA................................................................................................. 7
MEIOS DE CULTURA ........................................................................................ 9
ALGUMAS ESPÉCIES DE ORQUÍDEAS E BROMÉLIAS ............................... 11
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 13
INTRODUÇÃO

As famílias Orchidaceae e Bromeliaceae reúnem espécies com

reconhecido valor comercial, devido as características ornamentais que
apresentam. Também elevada importância ecológica, por suas variadas
interações com plantas e animais nos ambientes em que ocorrem, além de
serem alvo de exploração predatória e sofrerem sérios prejuízos em suas
populações, como resultado de desmatamentos e fragmentação de florestas,
situação que as tornam indicadoras de impactos ambientais, juntamente com
outras epífitas. Assim propõe-se neste trabalho estabelecer e multiplicar in vitro
espécies das famílias Orchidaceae e Bromeliaceae, ocorrentes em locais de
campina/campinarana em áreas do Campus da UFAM e da Fazenda
Experimental/UFAM, eventualmente na Reserva de Campina do INPA, com o
intuito de formar coleção dessas espécies in vitro, aclimatiza-las e,
futuramente, realocar indivíduos nas regiões de coleta.

3
 PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ORQUÍDEAS E BROMÉLIAS NATIVAS DA
AMAZÔNIA.

As famílias Orchidaceae e Bromeliaceae reúnem espécies com

reconhecido valor comercial, devido as características ornamentais que
apresentam. Também elevada importância ecológica, por suas variadas
interações com plantas e animais nos ambientes em que ocorrem, além de
serem alvo de exploração predatória e sofrerem sérios prejuízos as suas
populações como resultado de desmatamentos e fragmentação de florestas,
situação que as tornam indicadoras de impactos ambientais, juntamente com
outras epifitas(Kersten, 2010).
Outro aspecto importante é o tamanho reduzido das sementes de
plantas epifitas, em geral, e especialmente em Orchidaceae, que pode dificultar
o recrutamento de plantas que ocorre de maneira irregular (Kersten, 2010).
Em trabalho com Cattleya eldorado na Reserva de Campina do INPA,
Storti (2007) relata uma baixa produção de frutos, e considera que a espécie
corre perigo de extinção no local. Vale ressaltar uma importante característica
da biologia de Orchidaceae, que é a simbiose necessária com fungos do
gênero Rhizoctonia para o estabelecimento e desenvolvimento inicial das
plantas em ambiente natural (BRAGA, 1977).
Orchidaceae Juss. constitui a maior família das monocotiledôneas, em
numero de espécies, que contam com aproximadamente 24.500 distribuídas
em 800 gêneros. A família apresenta plantas com características herbáceas,
perenes, terrícolas ou mais frequentemente epífitas. São de distribuição
cosmopolita e ocorrem principalmente e com grande diversidade em florestas
tropicais da Ásia e das Américas (RODRIGUES, 2011).
A família Bromeliaceae Juss. apresenta 3010 espécies que estão
distribuídas em 56 gêneros. Esta dividida em três sub familias: Pitcairnioideae,
Tillandsioideae e Bromelioideae. A família se caracteriza como um dos
principais componentes da flora e da fisionomia dos ecossistemas
brasileiros.Encontra-se distribuída em habitats terrestres, rupícolas e epifíticos.
As plantas são geralmente herbáceas com grande

4
diversidade de porte na família, desde plantas pequenas e
delicadas (Tillandsia recurvatta) ate plantas de grande porte (Puya raimondii)
(MOREIRA, et al., 2006).
Morel (1960) foi o primeiro a micropropagar orquideas in vitro, para
aplicação comercial, a partir de ápices caulinares e regeneração de
protocormos (Carvalho et al, 2006). Assim as orquídeas foram as primeiras
plantas de importância econômica micropropagadas. sendo esta a principal
forma de propagação comercial dessas plantas até hoje. Também para
Bromeliaceae a micropropagacao tem sido largamente empregada, para
garantir o sucesso da multiplicação em escala, embora possam ser propagadas
por sementes ou brotações caulinares, como na propagação do abacaxi e
muitas espécies ornamentais da família (DAL VESCO et al., 2011).
A propagação in vitro depende de um grande número de fatores que
influenciam a regeneração das plantas. Em geral, organizam-se as etapas da
propagação em três estágios: (I) seleção dos explantes, desinfestação e cultura
em meio nutritivo sob condições assépticas; (II) multiplicação dos propágulos
mediante sucessivas subculturas em meio adequado para multiplicação; (III)
transferência das partes aéreas produzidas para meio de enraizamento e
posterior transplantio para substrato ou solo (TORRES et al., 1998).
A assepsia se apresenta como primeiro gargalo da propagação in vitro,
sendo que o tipo e as características do material utilizado para dar início ao
cultivo influenciam bastante nos procedimentos de assepsia. No caso de
sementes, por exemplo, a natureza dos tecidos de revestimento e a ausência
de injúrias, facilitam a desinfestação e a menor incidência de oxidação.
Situação semelhante ocorre, em geral, na inoculação de sementes de
orquídeas onde a assepsia é realizada na superfície do fruto, e as sementes
são acessadas em ambiente asséptico. Contudo a assepsia poderá ser
complexa em gemas, segmentos nodais, folhas e outros órgãos que sejam
provenientes de plantas em ambiente não controlado (viveiro ou campo),
especialmente quando as superfícies do explante apresentam rugosidades,
pelos ou alguma estrutura que dificulte o acesso das substâncias
descontaminantes (TORRES et al., 1998).
A multiplicação das plântulas estabelecidas in vitro é
frequentementerealizada com a utilização de duas classes de reguladores:

5
auxinas e citocininas. De maneira que, o balanço entre as duas
classes pode dirigir os processos de desenvolvimento no sentido de formação
de calos, de raízes ou de gemas caulinares (SKOOG e MILLER, 1957).
Outro gargalo importante do processo ocorre durante a aclimatização
das plantas, quando a transferência da condição in vitro para viveiro ou estufa,
pode resultar em estresse principalmente por transpiração. Entretanto,
indivíduos de Orchidaceae e Bromeliaceae foram aclimatizadas em nosso
viveiro de plantas sem dificuldades (dados não publicados).
Assim propõe-se neste trabalho estabelecer e multiplicar in vitro
espécies das famílias Orchidaceae e Bromeliaceae, ocorrentes em locais de
campina/campinarana em áreas do Campus da Ufam e da Fazenda
Experimental/Ufam, com o intuito de formar coleção dessas especies,
aclimatiza-las e, futuramente, realocar indivíduos nas regiões de coleta.

OBJETIVOS
1. Objetivo geral

Propagar e multiplicar plantas in vitro de espécies de orquídeas e bromélias

nativas.

1.2. Objetivos específicos

 Listagem das espécies coletadas com documentação fotográfica e
anotações de campo, das ações de coleta;
 Elaboração de um mapa preliminar dos locais de coleta, buscando-se
contribuição de um geografo;
 Obter a germinação in vitro de espécies das duas famílias estudadas;
 Verificar a eficiência do uso de reguladores de crescimento, para
estimular brotações nas plântulas obtidas;
 Avaliar a taxa de multiplicação in vitro;
 Avaliar o crescimento in vitro por meio de medidas biométricas do
comprimento da parte aérea, numero de folhas e de raízes nas plântulas
obtidas das duas famílias;
 Regenerar indivíduos para aclimatização no viveiro, e futura alocação de
plantas em forofitos adequados nas matas de origem.

6
METODOLOGIA

1. Serão realizadas excursões ao campo, para reconhecimento das

áreas de estudos e levantamento preliminar das observações de orquídeas e
bromélias, com registro fotográfico, anotações gerais de campo e localização
no GPS. Também medidas de umidade e temperatura do ambiente.

2. Coletas de material biológico:

Serão realizadas caminhadas aleatórias, principalmente em áreas de
campinas ou campinaranas no fragmento florestal da Ufam e na área da
Fazenda Experimental, eventualmente na Reserva de Campina do INPA, para
localização de indivíduos em condições de coleta de frutos, nas duas famílias.
Cuidando para atender os requisitos de coletas botânicas (localização no GPS,
marcação de forofitos, características da vegetação e solo, data, coletor, etc).

3. Catalogação, identificação e definição das espécies:

Para herborização de espécies de orquídeas e bromélias de pequeno
porte, os indivíduos serão coletados inteiros, enquanto das bromélias de
grande porte serão coletadas inflorescências e algumas folhas. Sempre com
registro fotográfico. O material será prensado e levado para secagem em
estufa a 60ºC para posterior confecção de exsicatas. As identificações serão
realizadas in situ, quando houver a presença de taxonomista e com o auxilio do
Guia da Flora da Reserva Ducke (Ribeiro et al., 1999). O material testemunho
será encaminhado ao herbário da Ufam para confirmação da identificação. As
espécies utilizadas neste trabalho serão definidas segundo a disponibilidade de
frutos e sementes, em quantidades suficientes para obtenção de um mínimo de
100 plântulas in vitro.

4. Obtenção de plantas
Germinação in vitro

Orquídeas: a semeadura será feita após assepsia dos frutos com agua
sanitária 20% (v/v) por 30 minutos, seguindo-se de tríplice lavagem com agua
destilada autoclavada. Os frutos serão abertos em câmara de fluxo laminar e
as sementes distribuídas em frascos contendo 10 mL de meio de MS (1962)

7
com a metade da concentração usual dos macronutrientes,
mantendo-se a concentração de micronutrientes. Na sequencia será
adicionada de 30 g/L de sacarose e 7 g/L de ágar, seno o pH ajustado para
5,8. Após a inoculação das sementes, os frascos serão alocados em sala de
crescimento, em prateleiras iluminadas com lâmpadas fluorescentes brancas-
fria, de aproximadamente 30 µmol m-2 s-1de radiação fotossinteticamente ativa
(RAF), fotoperíodo de 16/8 horas, e temperatura de 27±2º C.
Bromélias: as sementes serão removidas de frutos maduros e
submetidas à assepsia em agua sanitária 30%(v/v) por 30 minutos, em seguida
uma tríplice lavagem com agua destilada autoclavada. As condições de
semeadura e cultivo serão semelhantes às acima descritas.
a) Potencial germinativo
Será determinado pela porcentagem de plântulas formadas em cada
frasco, no período de 30-60 dias após a inoculação.
b) Desenvolvimento dos experimentos para multiplicação de orquídeas e
bromélias:
Após a obtenção de plântulas que apresentem 2-3 pares de folhas,
serão realizadas transferências para frascos com o mesmo meio descrito para
germinação, acrescidos dos reguladores de crescimento acido indolil acético
(AIA) e benzilaminopurina (BAP), em mg/L, nos seguintes tratamentos: (n=10)
T1: controle (sem regulador de crescimento);

T2: 0,0 AIA + 0,5 BAP

T3: 0,0 AIA + 1,0 BAP

T4: 0,1 AIA + 0,5 BAP

T5: 0,5 AIA + 1,0 BAP

Será utilizado o delineamento inteiramente casualizado com dez

repetições por tratamento, constituindo-se cada repetição de um frasco com
uma planta. Será avaliada a porcentagem de surgimento de raízes, brotações e
a média do ganho foliar (teste de Tukey a 5% de probabilidade), após 90 dias
de inoculação.

8
 5. Aclimatização em viveiro
Obtendo-se plantas com 3-5 cm de comprimento ao final da fase de
multiplicação, estas serão aclimatizadas em viveiro para formação de coleção,
e futura transferência para forofitos adequados nas matas.

MEIOS DE CULTURA

Os fatores que mais freqüentemente determinam o sucesso da

micropropagação de espécies vegetais são a fonte do explante e o meio
nutritivo onde são cultivados (PASQUAL; HOFFMANN; RAMOS, 2001).
Diversos meios de cultivo podem ser empregados para propagação in
vitro de orquídeas. O meio de cultura padrão utilizado, é o MS (MURASHIGE;
SKOOG, 1962), composto de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, Fe-
EDTA, sacarose e ágar, acrescido de carvão ativado. Embora seja o meio mais
utilizadopela maioria dos produtores, apresenta um custo significativamente
alto que incide no aumento do custo de produção (SU; SCHNITZER; FARIA,
2012).
O meio nutritivo esta composto por elementos essenciais e por
componentes opcionais.
Os nutrientes essenciais são: sais inorgânicas, os carbohidratos, as
vitaminas e pelas fito-hormonas ou reguladores de crescimento (Tabela I).
Outros componentes, incluindo as fontes de azoto orgânico, ácidos orgânicos e
substâncias complexas, podem ser importantes em determinadas culturas, mas
são opcionais.
Uma grande variedade de meios de cultura tem sido testados. Um meio
de cultura é identificado pela composição em sais minerais. As
vitaminas, hormonas e outros suplementos orgânicos variam amplamente com
respeito a sua composição e concentração.
A escolha do meio de cultura depende da espécie em questão e do
propósito da cultura (cultura de meristemas, organogénese, embriogénese
somática, etc.). O meio de Murashige e Skoog, 1962 (MS) é um meio
universalmente usado especialmente para morfogénese (Tabela I), cultura de
meristemas e regeneração de plantas. Este meio caracteriza-se pela sua
elevada concentração em sais minerais. O meio de Gamborg (B5) contém

9
quantidades mais baixas de sais minerais, o que parece ser
preferido pelas células de determinadas espécies (Tabela I).
Tabela I. Concentração molar dos nutrientes inorgânicos dos meios de
Murashige e Skoog (1962) e Gamborg.
Macronutrientes (mM) MS B5
N (NO3) 40 25
N (NH4) 20 2.0
K 20 25
Mg 1.5 1.0
P 1.25 1.1
Ca 3 1.0
S 1.5 1.0

Micronutrientes (uM)
Na - 61.1
Cl 6.0 2.0
I 5.0 4.5
B 100 50
Mn 30 7.0
Zn 1.1 1.0
Mo 0.1 0.15
Cu 0.1 0.1
Co
Fe

A técnica do cultivo in vitro de plantas ornamentais é reconhecida por ser

útil para a produção em larga escala de indivíduos com elevada qualidade e
uniformidade. A elaboração de protocolos de propagação possibilita o cultivo
de espécies vulneráveis para comercialização ou para repovoamento (Amo et
al., 2009). A escolha do meio adequado ao cultivo de determinada espécie é
importante, pois, através dele, tecidos e órgãos são supridos com
macronutrientes, micronutrientes e outros produtos orgânicos (Knudson, 1946;
Vacin Went, 1949; Murashige & Skoog, 1962; Campos, 2002) necessários à
germinação e ao desenvolvimento in vitro.

10
 ALGUMAS ESPÉCIES DE ORQUÍDEAS E BROMÉLIAS

ORQUÍDEAS:

Cattleya Jenmanii
Fonte: https://tiposdeorquideas.com/orquideas-da-amazonia/

Acacallis
Fonte: https://tiposdeorquideas.com/orquideas-da-amazonia/

Coryanthes
Fonte: https://tiposdeorquideas.com/orquideas-da-amazonia/

11
 BROMÉLIAS:

Ananas lucidus
Fonte: http://www.ceapdesign.com.br/familias_botanicas/bromeliaceae.

Neoregelia compacta
Fonte: http://www.ceapdesign.com.br/familias_botanicas/bromeliaceae.html

CONCLUSÃO

O projeto visa multiplicar espécies nativas de orquídeas e bromélias, que

possam contribuir com a recomposição de indivíduos dessas famílias no
campus da Ufam e da Fazenda Experimental, e constituir uma coleção in vitro
dessas plantas para subsidio em aulas e projetos de biotecnologia vegetal.

12
REFERÊNCIAS

BRAGA, P. I. Aspectos biológicos das Orchidaceae de uma campina da

Amazônia Central. Acta Amazonica, Manaus, v. 7, n.2 (suplemento), jun de
1977. 89p.

CARVALHO, J. M. F. C.; SILVA, M. M. A.; MEDEIROS, M. J. L. Fatores

inerentes à micropropagação. Campina Grande: Embrapa, 2006. p. 11-25.
(Documentos, 148).

DAL VESCO, L. L.; STEFENON, V. M.; WELTER, L. J.; SCHERER, R. F.;

GUERRA, M. P. Induction and scale-up of Bilbergiazebrinanodule cluster
cultures: implications for mass propagation improvement and conservation.
Scientia Horticulturae, v. 128, p. 515-522, 2011.

KERSTEN, R. de A. Epífitas vasculares – histórico, participação taxonômica e

aspectos relevantes, com ênfase na Mata Atlântica.Hoehnea, v. 37, n. 1, p. 9-
38. 2010.

MOREIRA, B. A.; LAPA WANDERLEY, M. das G.; CRUZ-BARROS, M. A. V.

da. Bromélias: importância ecológica e diversidade. Taxonomia e morfologia.
Curso de capacitação de monitores e educadores – Instituto de Botânica – IBt.
São Paulo. 2006. 12p.

MURASHIGUE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen,
v.15, p. 473-497, 1962.

RIBEIRO, J. E. L. DA S.; HOPKINS, M. J. G.; VICENTINI, A.; SOTHERS, C. A.;

et al. Flora da Reserva Ducke: Guia de identificação das plantas vasculares de
uma floresta de terra-firme na Amazônia Central. Manaus: INPA, 1999. 816p.

RODRIGUES, V. I. Orchidaceae Juss. Aspectos morfológicos e taxonômicos.

2011.Disponivel
emhttp://www.biodiversidade.pgibt.ibot.sp.gov.br/Web/pdf/Orchidaceae_Juss_A
spectos_Morfologicose_Taxonomicos_Vinicius_Trettel_Rodrigues.pdf Acesso
em 27/4/2018.

Meiosdecultura. Disponivel em
http://home.uevora.pt/~zavattieri/meios_de_cultura.htm Acesso em 19/5/2018
http://www.scielo.br/pdf/cr/v46n3/1678-4596-cr-46-03-00499.pdf Acesso em
19/5/2018.

SKOOG, F.; MILLER, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation

in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. For Exp. Biol., v 11, p 118-131,
1957.

13
STORTI, E. F. Dinâmica populacional e biologia reprodutiva de
Cattleya eldorado Linden (Orchidaceae). Tese de doutorado, UFAM/INPA,
Manaus, 2007. 131 p.

TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação

genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI: Embrapa-CNPH, 1998. v.1, 509p.

14