Kromatografi Lapis Tipis

Ditulis oleh Jim Clark pada 06-10-2007

Bagian ini merupakan pengantar ke topik kromatografi lapis tipis. Meskipun anda adalah
seorang pemula yang mungkin lebih mengenal kromatografi kertas, penjelasan　tentang
kromatografi lapis tipis sama mudahnya dengan kromatografi kertas.

Pelaksanaan kromatografi lapis tipis

Latar Belakang

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-

komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini.

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-
padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam
dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-
komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Kita akan membahasnya lebih
lanjut.

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.

Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis
seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra
violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai.

Kromatogram

Kita akan mulai membahas hal yang sederhana untuk mencoba melihat bagaimana
pewarna tertentu dalam kenyataannya merupakan sebuah campuran sederhana dari
beberapa pewarna.
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada
garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan
menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas
kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas
kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi
jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda

dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak
sebagai perbedaan bercak warna.

Gambar menunjukkan lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari lempengan.

Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan
pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu
dari pelarut dan fase diam.

Perhitungan nilai Rf

Jika anda ingin mengetahui bagaimana jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari
campuran, anda dapat berhenti pada bahasan sebelumnya. Namun, sering kali
pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa
yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan
jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas
kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses
penguapan.

Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Rf=jarak yang ditempuh oleh komponen

jarak yang ditempuh oleh pelarut

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal,
sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah
menjadi:

Jika anda dapat mengulang percobaan ini pada kondisi yang tepat sama, nilai Rf yang
akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf untuk warna
merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan
sebagainya), nilai tersebut akan berubah. Anda harus tetap mengingat teknik ini jika anda
ingin mengidentifikasi pewarna yang tertentu. Mari kita lihat bagaimana menggunakan
kromatografi lapis tipis untuk menganalisis pada bagian selanjutnya.
Bagaimana halnya jika substansi yang ingin anda analisis tidak berwarna?

Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak　berwarna.

Menggunakan pendarflour

Mungkin anda masih ingat apa yang telah saya sebutkan bahwa fase diam pada sebuah
lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya,
supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti
jika anda menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun
bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika
anda menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang
berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, anda harus menandai posisi-posisi dari
bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu.
Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.

Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak

dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang
berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran
asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin

bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat
atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada
wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai bercak-bercak kecoklatan.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada
wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai bercak-bercak kecoklatan.

Penggunaan kromatografi lapis tipis untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa

Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin menemukan asam amino-
asam amino tertentu yang terkandung didalam campuran tersebut. Untuk sederhananya,
mari kira berasumsi bahwa anda mengetahui bahwa campuran hanya mungkin
mengandung lima asam amino.

Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak
kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping
tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam
pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah
M dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5.

Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir　mencapai bagian

atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan
apa yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.
Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan
bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui
melalui posisi dan warnanya.

Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino 1, 4 dan 5.

Bagaimana jika campuran mengandung lebih banyak asam amino daripada asam amino
yang digunakan sebagai perbandingan? Ini memungkinkan adanya bercak-bercak dari
campuran yang tidak sesuai dengan asam amino yang dijadikan perbandingan itu. Anda
sebaiknya mengulangi eksperimen menggunakan asam amino lain sebagai perbandingan.

Bagaimana kromatografi lapis tipis berkerja?

Fase diam-jel silika

Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh
atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika,
atom silikon berlekatan pada gugus -OH.

Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini
menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya
van der Waals dan atraksi dipol-dipol..
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang
jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.

Apa yang memisahkan senyawa-senyawa dalam kromatogram?

Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-
senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan
cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan
pelarut.

Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan,

tergantung pada:

• Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana
besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
• Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Hal ini
tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.

Anggaplah bercak awal mengandung dua senyawa, yang satu dapat membentuk ikatan
hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil　bagian interaksi van der Waals
yang lemah.

Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat
dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari
senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu
substansi pada permukaan.

Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara
yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.

Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu
terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu
proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa
semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.

Dalam contoh yang sudah kita bahas, senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen
akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van der Waals,
dan karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan.

Bagaimana jika komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk ikatan-ikatan

hidrogen?

Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut
dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara
senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang
penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan
keluar dari permukaan silika.

Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik

ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu
dengan baik-termasuk　memungkinkan perubahan pH pelarut.

Ini merupakan tingkatan uji coba ? jika satu pelarut atau campuran pelarut tidak berkerja
dengan baik, anda mencoba pelarut lainnya. (Berikan tingkatan dimana anda dapat
berkerja, seseorang telah berkerja keras untuk anda dan anda hanya menggunakan
campuran pelarut yang telah anda berikan dan segala sesuatunya akan berkerja dengan
sempurna!)