UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

CENTRO UNIVERSITARIO DE LA CIÉNEGA

DIVISIÓN DE DESARROLLO BIOTECNOLÓGICO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA VIDA

Manual de taller para

Validación de procesos y métodos analíticos

(I6172)

Elaboró:  M.  En  C.  Janette  Betzabeth  Villarruel  Muñoz  

Fecha  de  Actualización    Junio  de  2018  
NOMBRE DEL ALUMNO: __________________________________________

CÓDIGO: _______________________________________________________

CICLO ESCOLAR: ________________________________________________

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 Índice

Título del taller Página

Elaboración de un Procedimiento normalizado de ………………………. 4

operación

Elaboración de linealidad del sistema, Exactitud, ………………………. 6

Límite de detección y límite de cuantificación

Elaboración de un protocolo de validación …………………….. 14

3
 Taller 1:
Elaboración de un Procedimiento normalizado de operación
(PNO)

Actividades dentro del taller:

§ Actividad I. Realizar un PNO

4
Actividad I. Realizar un PNO

Instrucciones: Elaborar por equipo (3 personas) un PNO en PDF con Arial 11, interlineado
1.0, 7 cuartillas y debe de contener los elementos del cuadro 1.

Cuadro1. Puntos que debe de llevar el de PNO

Para los procedimientos normalizados de operación se recomienda incorporar los
siguientes elementos:
1. UN ENCABEZADO (figura 1):

Figura 1. El encabezado debe de llevar logotipo de la institución, nombre del documento, centro o institución,
clave del documento, versión, vigencia, próxima revisión, el actual documento sustituye a y paginado.

2. Pie de página (figura 2)

Figura 2. El pie de página debe de llevar fecha de aprobación, firma de quién realizó, puesto, fecha de
autorización, quién autorizó, puesto, y dos revisores .
3. Firmas de consentimiento (primera hoja)
4. Objetivo
5. Alcance
6. Responsabilidades
7. Desarrollo de proceso

5
 8. Referencias bibliográficas
9. Anexo
a. Control de cambios

Taller 2:
Elaboración de linealidad del sistema, Exactitud, Límite de
detección y límite de cuantificación

Actividad dentro del taller:

§ Actividad I: Realizar linealidad del sistema
§ Actividad II: Realizar precisión
§ Actividad II: Realizar límite de detección y cuantificación

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REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO DE IJCF

1. Llenar la bitácora de uso de equipo.

2. Los tubos que contengan sangre total, plasma, suero, capilares y pipetas Pasteur
deberán ser colocados en recipientes herméticos de color rojo especial de residuo
biológico infeccioso.

3. Todo material punzocortante como lancetas, jeringas, navajas de bisturí, agujas,

portaobjetos, cubreobjetos, ser colocados en recipientes rígidos de polipropileno
(contenedor rojo) que tenga la leyenda de peligrosos residuos sólidos biológicos
infecciosos.

4. Todo material que hayan estado en contacto con plasma, sangre total o suero,
algún fluido como esputo, secreciones pulmonares, así como algodones, gasas
papel absorbente, hisopos, palillos, guantes, deberán ser desechados en bolsas
rojas que contiene la leyenda residuos peligrosos sólidos biológico infecciosos.
Nota para los puntos 5, 6 y 7 las bolsas y recipientes herméticos no deberán
rebasar el 80% de su capacidad.

5. Las muestras de orina por no ser consideradas como biológico – infecciosas, serán
desechadas de la siguiente manera:
Orina: se adicionara cloro al 10% por 10 min y verterlo al desagüe. El recipiente
será desechado a la basura común.

6. Las superficies y áreas de trabajo se descontaminaran al inicio y término de las

actividades, cuando exista algún derrame imprevisto, esto se realizara con
hipoclorito de sodio al 10% intercalando de manera semanal con alcohol etílico al
70%.

7. Todos los derrames y accidentes se comunicará al responsable del laboratorio. Se

mantendrán un registro escrito de esos accidentes e incidentes.

8. La preparación de reactivos y medios se realizara en el horario en que se encuentre

presente el personal de laboratorio (9:00-13:00)

9. Al término de las actividades el alumno y profesor deberán entregar los equipos y

materiales utilizados durante la práctica, limpios y en las mismas condiciones como
fueron recibidos.

10. Los reactivos utilizados durante la práctica deberán ser registrados en la bitácora.

11. Queda estrictamente prohibido pipetear con la boca.

7
Actividad I. Realizar una Linealidad del sistema para saber si el quipo de absorción
atómica puede tener una respuesta lineal de Plomo en un rango de 1-10 ppm

Relevancia:

Un método analítico es indispensable para determinaciones cualitativas y cuantitativas

de componentes dentro de un producto. Las empresas requieren de los métodos
analíticos para determinar si el producto o servicio cumple con el atributo de
confiabilidad.
Una validación de métodos analíticos es un sistema involucrado en los procesos de
fabricación en el área de control de calidad de la empresa. La validación hace posible
que las autoridades regulatorias verifiquen que las empresas sustenten sus sistemas de
calidad con actividades documentadas.
La validación de un método analítico es la descripción de las secuencia de actividades,
recursos materiales y parámetros que se deben de cumplir para llevar a cabo el análisis
de un componente específico en una muestra. En la linealidad del sistema se reta el
funcionamiento del equipo, es decir, con la linealidad del sistema debemos observar que
la respuesta del equipo sea directamente proporcional a la concentración.

Instrucciones:
1. Preparar el material necesario para el ensayo asignado
2. Entregar un reporte de resultados con los datos generados en una hoja de
Excel que incluya: Cuadro con resultados (pendiente, ordenada al origen y
desviación estándar de la regresión)
3. Entregar en una cuartilla las observaciones y la conclusión de tu resultado
4. Entregar cuestionario contestado

Material para el ensayo:

Gradilla Reactivos
Matraz volumétrico de 100 ml Ácido nítrico grado reactivo
Matraz volumétrico de 200 ml Cloruro de potasio ACS
1 Pipeta automática Agua bidestilada
1 caja de puntas Estándar de Plomo
Cronómetro Equipo
1 probeta de 100 ml Balanza analítica
3 vasos de precipitado de 100 ml Espectrofotómetro de absorción atómica

PROCEDIMIENTO
Ácido Nítrico al 4 % con 1000 ppm de Potasio (contra ión)
1. Colocar 700 ml de agua bidestilada en un matraz volumétrico de 1000 ml
2. Pesar 1.907 g de Cloruro de potasio grado ACS en balanza analítica y disolver
en el matraz

8
 3. Medir con probeta 57 ml de ácido nítrico concentrado y depositarlos por las
paredes del matraz. Aforar con agua bidestilada

Curva de calibración
Para realizar la curva de calibración se parte de una solución stock que contenga 1000
ppm debe hacer alícuotas (tabla 1)
Curva de calibración
Alícuota Matraz volumétrico Concentración Pb ppm
(mg/l)
0.10 ml 100 ml 1
0.20 ml 100 ml 2
0.40 ml 100 ml 4
0.60 ml 100 ml 6
0.80 ml 100 ml 8
1.00 ml 100 ml 10
Tabla 1 Curva de calibración

Linealidad del sistema

Para evaluar la linealidad del sistema se utilizará una solución stock que contenga 100
ppm

Solución stock de Plomo 100 ppm

Tomar una alícuota de 1 ml de la solución estándar de Plomo de 1000 ppm. Transferir a

un matraz volumétrico de 100 ml. Aforar con solución contra ión.
A partir de la solución stock de 100 ppm preparar por triplicado los 4 niveles de
concentración de acuerdo a la tabla 2, llevar al aforo con solución contra ión.
Linealidad del sistema
Nivel Alícuota Matraz Concentración ppm
del volumétrico
stock
(ml)
25 % 2 200 ml 1
50 % 2 100 ml 2
100 % 2 50 ml 4
150% 6 100 ml 6
200 % 8 100 ml 8
Tabla 2. Linealidad del sistema

Trazar la gráfica en el eje de las (x) la concentración real contra la respuesta analítica
(y), calcular el coeficiente de correlación, pendiente, ordenada al origen e intervalo de
confianza de la pendiente. Reportar el rango como la concentración mínima y máxima
evaluada en los niveles de 25 % y 200 %.

9
Criterio de Aceptación
Linealidad del sistema
r2 ≥ 0.98, reportar pendiente, ordenada al origen y desviación estándar de la regresión.
CUESTIONARIO
1. Explica que esperamos observar en la linealidad del sistema

2. ¿Qué prueba se recomienda realizar antes de la linealidad del sistema?

3. ¿Qué pasa si tu r2 es menor a 0.98?

MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

Es indispensable que los alumnos asistan a la práctica con lentes de seguridad, guantes
de nitrilo, zapato cerrado y bata.
Para conocer las hojas de seguridad ir al anexo

DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS Y FÍSICOS

Los desechos serán depositados en contenedores de polipropileno rotulados con la
etiqueta de seguridad y serán almacenados en el contenedor hasta su disposición
cuando pase el camión de la compañía asignada encargada para su desecho

Bibliografía
• Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos. Guía de Validación de
Métodos Analíticos. Edición 2002
• CENAM-EMA. Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones
analíticas que emplean las técnicas de Espectrofotometría de Absorción Atómica
y de Emisión y Atómica con Plasma Acoplado Inductivamente. Abril 2008.

10
Actividad 2. Realizar precisión del sistema

Relevancia
Exactitud y la precisión son dos características de un sistema de medición aceptable.
Exactitud se refiere a qué tan cerca están del valor real las mediciones en un sistema.
Precisión se refiere a qué tan cerca están las mediciones entre ellas.
Un sistema de medición puede tener cualquier combinación de exactitud y precisión. Por
ejemplo, un sistema de medición que mide las tabletas de un medicamento es preciso
pero no exacto si mide las mismas tabletas de 200 mg como 205.54 mg, 205.43 mg y
205.03 mg. Las mediciones del sistema de medición están cerca unas de otras y, por lo
tanto, son precisas. Pero no están cerca del valor real (200 mg) y, por lo tanto, no son
exactas.

Precisión del sistema

Para evaluar precisión del sistema del sistema se utilizará una solución stock que
contenga 100 ppm

Solución stock de Plomo 100 ppm

Tomar una alícuota de 1 ml de la solución estándar de Plomo de 1000 ppm. Transferir a

un matraz volumétrico de 100 ml. Aforar con solución contra ión.
A partir de la solución stock de 100 ppm preparar por sextuplicado el nivel 100 % de
concentración de acuerdo a la tabla 2, llevar al aforo con solución contra ión.

Criterio de Aceptación
Precisión
CV≤1.5 % entre réplicas
Instrucciones:
1. Realizar el nivel por sextuplicado100 %
2. Entregar un reporte de resultados con los datos generados en una hoja de
Excel que incluya: Cuadro con resultados (%CV)
3. Entregar en una cuartilla las observaciones y la conclusión de tu resultado

MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

Es indispensable que los alumnos asistan a la práctica con lentes de seguridad, guantes
de nitrilo, zapato cerrado y bata.
Para conocer las hojas de seguridad ir al anexo

DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS Y FÍSICOS

Los desechos serán depositados en contenedores de polipropileno rotulados con la
etiqueta de seguridad y serán almacenados en el contenedor hasta su disposición
cuando pase el camión de la compañía asignada encargada para su desecho

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Actividad 3. Encontrar los límites de detección y cuantificación
Relevancia:

El límite de detección es la respuesta que el equipo detecta pero no puede cuantificar.

El límite de cuantificación es la respuesta que el aparato comienza a cuantificar.
Ambos límites se realizan en métodos que utilizan instrumentos para medir larespuesta
analítica y presentan una señal de ruido basal.Determinar la respuesta de blancos
(reactivos. placebos analíticos, etc.) y la respuesta de muestras analíticas (analitos,
placebos adicionados, etc). Determinar la cantidad del analito que genere una respuesta
con respecto al blanco en una proporción de 3 a 1, lo que corresponde a la
concentración asociada al limite de detección:

Límite de detección LD=(3.3xSy/x) /b1

En dónde:
Sy/x: la desviación estándar de la regresión lineal de la práctica 1
b1: pendiente páctica 1

Límite de cuantificación LC=(10xSy/x) /b1

Criterio de Aceptación
LD: El límite de detección debe de ser menor a la concentración del 100 % y la solución
preparada a la concentración con la fórmula LD debe de ser detectada
LQ: El límite de detección debe de ser menor a la concentración del 100 %
Instrucciones:
1. Preparar el material necesario para el ensayo asignado
2. Entregar un reporte de resultados con los datos generados en una hoja de
Excel que incluya: Cuadro con resultados (pendiente, ordenada al origen y
desviación estándar de la regresión)
3. Entregar en una cuartilla las observaciones y la conclusión de tu resultado
Entregar cuestionario contestado

Procedimiento:
De los valores de concentración determinados para LD y LQ preparar una solución de
plomo a la concentración calculada y leer la respuesta por sextuplicado para cada uno
de los límites

MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

Es indispensable que los alumnos asistan a la práctica con lentes de seguridad, guantes
de nitrilo, zapato cerrado y bata.
Para conocer las hojas de seguridad ir al anexo

DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS Y FÍSICOS

Los desechos serán depositados en contenedores de polipropileno rotulados con la
etiqueta de seguridad y serán almacenados en el contenedor hasta su disposición
cuando pase el camión de la compañía asignada encargada para su desecho

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 ANEXO

Hojas de seguridad

1 Ácido nítrico
2 Cloruro de potasio

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 Taller 3:
Elaboración de un protocolo de validación

Actividad dentro del taller:

§ Actividad I. Realizar un protocolo de validación

14
Actividad No. 1. Define con tus palabras los siguientes conceptos:
Analito, estabilidad analítica de la muestra, especificidad, exactitud, precisión, linealidad
del sistema, linealidad del método, recobro, precisión del sistema, precisión intermedia,
límite de detección, límite de cuantificación, robustez,
Actividad No. 2. Elaborar por equipo (5 personas) un protocolo de validación en PDF con
Arial 11, interlineado 1.0, 7 cuartillas y debe de contener los elementos del cuadro 2.

El protocolo debe de estar destinado a cuantificar ppm de Plomo en muestras procedentes

de ambas caras de las manos. Utilizar absorción atómica tomar en cuanta que el 100 %
son 4 ppm. Validación debe de llevar los siguientes elementos:
Para los procedimientos normalizados de operación se recomienda incorporar los
siguientes elementos:
1. UN ENCABEZADO (figura 1):

Figura 3. El encabezado debe de llevar logotipo de la institución, nombre del documento, centro o
institución, clave del documento, versión, vigencia, próxima revisión, el actual documento sustituye a y
paginado.

2. Pie de página (figura 2)

Figura 4. El pie de página debe de llevar fecha de aprobación, firma de quién realizó, puesto, fecha de
autorización, quién autorizó, puesto, y dos revisores .
3. Firmas de consentimiento (primera hoja)
4. Objetivo: Debe de ir relacionado a porqué se quiere realizar la validación
5. Alcance: Debe de responder a la pregunta a quién va dirigido

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6. Responsabilidades: En un cuadro debes de colocar específicamente que
actividades le corresponde a cada uno de las personas que van a estar en
contacto con las personas.
7. Reactivos, equipos, instrumentos. Colocar un cuadro para especificar del
reactivo: fecha de vigencia, marca, fecha de utilización. Equipo: fecha de
verificación, calibración, próximo servicio. Instrumentos: fecha de calibración y
fecha de utilización.
8. Parámetros
• Linealidad del sistema: construir una tabla con 5 niveles de concentración en
dónde 4 ppm sea 100% (cada nivel se realiza por triplicado).
• Linealidad del método: construir una tabla con 5 niveles de concentración en
dónde 4 ppm sea 100% (cada nivel se realiza por triplicado).
• Exactitud y precisión: construir una tabla con el nivel 100 % por sextuplicado.
• Precisión intermedia: puede ser 1 muestra para una persona 3 réplicas tres
días diferentes o dos muestras para 2 analistas (1 c/u), 3 réplicas, dos días
diferentes.
• Límite de detección: puede realizarse en base a la ecuación de la línea recta
de la linealidad del sistema o en base a señal ruido del equipo.
• Límite de cuantificación: puede realizarse en base a la ecuación de la línea
recta de la linealidad del sistema o en base a señal ruido del equipo
• Robustez
9. Referencias bibliográficas

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