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com/doc/11642417/Cromatografia-Fundamentos-y-Aplicaciones

CROMATOGRAFÍA

En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil, que
puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través
de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una
superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra
se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos
componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta
movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que
pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

Factor de retención o factor de capacidad

Es un parámetro que describe la velocidad de migración de los solutos (analitos) en la

columna. Para una especie A, el factor de capacidad k’A se define como

donde K A es el coeficiente de distribución de la especie A, VS es el volumen de la fase

estacionaria y VM es el volumen de la fase móvil. Cuando el factor de capacidad para una
especie es mucho menor que la unidad, la elución tiene lugar tan rápidamente que es difícil
determinar con exactitud los tiempos de retención, estos son demasiado cortos. En cambio
cuando el factor de retención es del orden de 20 o 30 otal vez mayor, los tiempos de
retención son excesivamente largos.

Factor de selectivitad:

El factor de selectividad α de una columna para dos especies A y B se define como:

donde KB es el coeficiente de distribución para la especie más fuertemente retenida B, y KA

es el coeficiente de distribución para la menos retenida, o que eluye con más rapidez, la
especie A. Según esta definición α siempre es mayor que la unidad, porque B es el
compuesto más retenido (de > tR ). Donde k’B y k’A son los factores de capacidad de B y de
A, respectivamente.

Resolución cromatográfica:

La resolución cromatográfica RS de una columna es una medida cuantitativa de su

capacidad para separar dos analitos. La resolución de una columna se define como

donde WA y WB son la anchura de los picos A y B.A partir de la Figura 1-2 se deduce que si
R> 1,5 la separación de los componentes es completa, no será así si R<1,5. Por lo que para
una fase estacionaria dada, la resolución puede mejorarse alargando la columna,
aumentando así el número de platos. Aunque una consecuencia negativa del aumento de
platos es el incremento del tiempo requerido para la separación.
Eficiencia en cromatografía:

La eficiencia se define en base a dos términos, que son medidas cuantitativas de la eficiencia
de una columna: 1º la altura del plato H y 2º el número de platos N. Los dos están
relacionados por la ecuación:

Donde L es la longitud (normalmente en centímetros) del relleno de 1a columna. De la

ecuación anterior se deduce que la altura del plato H es:
La eficacia de la columna cromatográfica aumenta cuanto mayor es el número de platos, y
cuanto menor es la altura de plato. Existen diferencias en las eficacias por diferencias en el
tipo de columna y/o el tipo de fases móvil y estacionaria. Las eficacias en términos de
número de platos varían de cientos a miles, y las alturas de plato de unas pocas décimas a
milésima de centímetro o menos. Existe otra ecuación para calcular el número de platos N:

En este caso N se puede calcular a partir de dos medidas de tiempo, tR y W (anchura del pico); para
calcular H, se hade conocer también la longitud del relleno de la columna L.

Tipos de separación cromatográfica

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero de

ellos se basa en la forma en que las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto,
diferenciándose así la cromatografía en columna de la cromatografía en plano o plana. En
la cromatografía en columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la
cual hace se pasar la fase móvil por presión o gravedad. En la cromatografía en plano o
plana, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en
este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por
efecto de la gravedad.
Otra clasificación más fundamental de los métodos cromatográficos se basa en el tipo de
fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los
solutos entre las fases. Existen tres clases generales de cromatografía:
cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos
supercríticos. Como su nombre indica las fases móviles en las tres técnicas son,
respectivamente, líquidos, gases y fluidos supercríticos. Hay que mencionar que solamente
la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse a cabo en columnas o sobre superficies
planas; por otra parte, tanto la cromatografía de gases como la de fluidos supercríticos
están restringidas a los procedimientos en columna, de tal modo que las paredes de la
columna contienen la fase móvil.

Cromatografía plana

Los métodos de cromatografía plana incluyen la cromatografía en capa fina (TLC) y la

cromatografía en papel (PC). En todos los casos se emplea una capa plana y relativamente
delgada de un material que a su vez es el soporte, o bien que recubre una superficie de
vidrio, plástico o metálica. La fase móvil se mueve a través de la estacionaria por capilaridad,
a veces ayudada por gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad,
la cromatografía en plano se centra en la técnica dela capa fina, que es más rápida, tiene
mejor resolución, y es más sensible que su alternativa en papel. Por ello nos centraremos
en los métodos de capa fina. Las separaciones en capa fina se realizan en placas de vidrio o
plástico que se recubren con una capa delgada y adherente de partículas finamente dividas;
esta es la capa estacionaria. Las partículas son semejantes a las descritas en cromatografía
en columna de adsorción, de reparto en fase normal y en fase inversa, y las fases móviles
también son similares las utilizadas en cromatografía de líquidos de alta eficacia en
columna. Las placas de capa fina se obtienen de forma comercial. Los tamaños son varios
5X20, 10X20, y20X20. Estas placas comerciales se presentan en dos formatos. El
convencional, donde las placas tienen un espesor de 200 a 250 µm un tamaño de partícula
de 20 µm o más. Presentan por lo común unos 2000 platos teóricos en 12 cm. y con un
tiempo de desarrollo de 25 min. El segundo tipo de placas comerciales es el de alta eficacia,
que tienen películas de unos 100 µm de espesor, y un diámetro de partícula de 5 µm o
menos. El número de platos teóricos es mayor unos 4000 en 3cm y con 10 min. de
desarrollo. Las placas de alta eficacia (HPTLC) permiten mejores separaciones y en menos
tiempo, pero tienen la desventaja detener una menor capacidad de carga. La aplicación de
la muestra es el aspecto más crítico de la cromatografía en capa fina. Por lo general, se
aplica una disolución de la muestra del 0,001 al 0,1 %, como una mancha, a 1 o 2 cm. del
extremo dela placa. Pero para una separación de mayor eficacia, la mancha debería tener
un diámetro mínimo-aproximadamente 5nm para una aplicación cualitativa y menor para
el análisis cuantitativo, y en el caso de las disoluciones diluidas se realiza tres o cuatro
aplicaciones superpuestas secando la zona entre aplicación. La aplicación puede ser manual
o por aplicadores mecánicos. Si es manual es por contacto entre la placa y un capilar que
contiene la muestra, o utilizando una jeringa hipodérmica. En el caso de que sea mecánico,
se mejorara la precisión y exactitud de la aplicación. El desarrollo (Figura 3-1) de la placa es
un proceso análogo a la elución en la cromatografía de líquidos, en el que la muestra es
transportada por la fase móvil a través de la fase estacionaria. La forma más común de
desarrollar la placa consiste en depositar una gota de la muestra cerca de unos de los
extremos de la placa, y marcar su posición con un lápiz. Tras la evaporación del disolvente
en el que estaba disuelta la muestra, se coloca la placa en un recipiente cerrado y saturado
con los vapores del disolvente con el que se efectuara el desarrollo. Uno de los extremos de
la placa se introduce en el eluyente procurando evitar el contacto directo de este con la
muestra. El eluyente asciende por la placa gracias el efecto de capilaridad ejercido entre las
finas partículas. A medida que el eluyente se desplaza pasa por el punto de aplicación de la
muestra, la disuelve y la arrastra por la placa distribuyéndose entre el disolvente que se
desplaza y la fase estacionaria. Después que el disolvente ha pasado a través de la mitad o
las dos terceras partes de la longitud de la placa, se retira esta del recipiente y se seca. Las
posiciones dela muestra se pueden determinar por distintos procedimientos. Dos de ellos
se usan con la mayoría de las mezclas de sustancias orgánicas. Consisten en nebulizar sobre
la placa una disolución de yodo o de ácido sulfúrico, ya que ambos reaccionan con los
compuestos orgánicos para dar productos oscuros. También se utilizan reactivos específicos
(como la ninhidrina) para localizar las especies separadas. Otro método de detección se
basa en incorporar un material fluorescente a la fase estacionaria. Una vez ha finalizado el
desarrollo, se examina la placa bajo luz ultravioleta. Los componentes de la muestra
amortiguan la fluorescencia del material de tal forma que, toda la placa exhibe
fluorescencia menos los lugares donde están los componentes de la muestra, no
fluorescentes.

Existen distintos tipos de análisis cualitativos para identificar los distintos componentes de
la muestra tras realizar la cromatografía en capa fina:
Uso de patrones:
Consiste en aplicar a la placa la muestra desconocida y disoluciones de
muestras purificadas, de las especies que probablemente pueden estar presentes en la
muestra desconocida. La coincidencia entre los valores RF de alguna de las manchas de la
muestra desconocidas el de alguno de los estándares proporciona evidencias para la
identificación de uno de los componentes de la muestra. RF es un nuevo parámetro
denominado factor de retardo (ó RELACIÓN DE FRENTES), siendo el factor de retardo en la
Figura 3-1 para el soluto de la muestra 2. Este método necesita una confirmación mediante
la repetición del ensayo con diferentes fases móviles y estacionarias y con distintos
reactivos de revelado.

Métodos de elución:
Se raspa la zona de la placa que contiene el analito con una espátula o una navaja, y se
recoge el sólido sobre un papel satinado. Se trasfiere a un tubo de ensayo u otro recipiente,
donde el analito se disuelve con un disolvente adecuado y se separa de la fase estacionaria
por centrifugación o filtración. La identificación se realiza por técnicas como la
espectrometría de masas, la resonancia magnética nuclear o la espectroscopia de absorción
en infrarrojo.
Cromatografía en plano bidimensional
: En este caso la muestra se coloca en una de las esquinas de una placa cuadrada y se realiza
el desarrollo en dirección ascendente con el disolvente A. A continuación se elimina este
disolvente por evaporación, y se gira la placa 90 grados, realizando ahora el desarrollo
ascendente con el disolvente B. Tras la eliminación del disolvente, se determina la posición
de los componentes con un reactivo de revelado, tipo ninhidrina, y las manchas originadas
se identifican comparando sus posiciones con las de los estándares, (Figura 3-2).
En cuanto al análisis cuantitativo, éste se puede hacer comparando el área de la mancha
del estándar con la del analito, se puede hacer una estimación semi cuantitativa de la
cantidad del componente presente. Los mejores resultados se obtienen si se raspa la
mancha de la placa, se extrae el analito delsólido que forma la fase estacionaria, y se
determina el analito por métodos físico o químicos. Otro procedimiento consiste en usar
un densitómetro de barrido que puede medir la radiación emitida de la mancha por
fluorescencia o reflexión.

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cromatografia.pdf

Tipos de cromatografía
La cromatografía puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, mismo que
es gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. Así la cromatografía puede ser de
(1) adsorción, (2) partición, (3) intercambio iónico, (4) exclusión, y (5) afinidad (ver figura 4).
Tipos de cromatografía utilizados en la separación de lípidos

1. Cromatografía de adsorción
La fase estacionaria es un sólido en el que los componentes de la muestra son
adsorbidos. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía líquido-sólido) o un gas
(cromatografía gas-sólido); los componentes se distribuyen entre dos fases a través de
la combinación de los procesos de adsorción y desorción. La cromatografía de capa fina
(TLC) es un ejemplo especial de cromatografía por adsorción en la cual la fase
estacionaria es un plano, en la forma de un soporte sólido en un plato inerte.

2. Cromatografía de partición
La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en un
sólido inerte. Otra vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición
líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía
en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una
capa de agua adsorbida en una hoja de papel.
Estas son clasificaciones arbitrarias de la técnicas cromatográficas, y algunos tipos de
cromatografía se les considera juntas como una técnica separada, como la
cromatografía de gases para la cromatografía gas-sólido y gas-líquido. En cualquier
 caso, los equilibrios sucesivos son los que determinan cuanto tiempo el analito
permanecerá unido o se moverá con el eluyente (fase móvil). La cromatografía de gases
es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos
térmicamente estables y volátiles. La disponibilidad de detectores versátiles y
específicos, y la posibilidad de acoplar el cromatógrafo de gases a un espectro de masas
o a un espectrofotómetro de infrarrojo, amplían aún más la utilidad de la cromatografía
de gases. Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados
para: 1) proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase móvil), 2)
permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye, 3)
contener la longitud apropiada de fase estacionaria, 4) mantener la columna a la
temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura), 5) detectar los
componentes de la muestra conforme eluyen de la columna, y 6) proveer una señal
legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente. Sólo aprox. 20%
de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografía de gases, ya
sea porque son insuficientemente volátiles y no pasan a través de la columna, o porque
son térmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separación.

3. Cromatografía de exclusión por tamaño

En la cromatografía de exclusión puede separarse moléculas solvatadas de acuerdo a
su tamaño y habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase estacionaria). La
separación en cromatografía de partición y en cromatografía de intercambio iónico se
logra de diferentes interacciones de solutos con la fase móvil y la fase estacionaria. En
contraste, la separación en cromatografía de exclusión por tamaño se lleva a cabo por
diferencias en tamaño molecular y la habilidad de diferentes moléculas para penetrar
los poros de la fase estacionaria a diferentes tamaños o magnitudes. La cromatografía
de exclusión por tamaño se usa extensivamente para las separaciones preparativas de
macromoléculas de origen biológico, así como para la purificación de polímeros
orgánicos sintéticos.