Composición Elemental P.pastoris

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
COMPARACIÓN TEÓRICA DE LAS CAPACIDADES METABÓLICAS DE

Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris PARA LA PRODUCCIÓN DE SOD
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA
ORNELLA CECILIA COMINETTI ALLENDE
PROFESOR GUÍA:
JUAN ASENJO DE LEUZE
MIEMBROS DE LA COMISIÓN:
ALEJANDRO MAASS SEPÚLVEDA
BARBARA ANDREWS FARROW
ZIOMARA GERDTZEN HAKIM
SANTIAGO DE CHILE
SEPTIEMBRE 2007
Resumen
La presente memoria tiene como objetivo comparar teóricamente las capacidades me-
tabólicas de dos tipos de levadura: Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, como sistemas de
expresión de la enzima Superóxido Dismutasa humana (hSOD).
Para ello se determinaron las redes metabólicas de ambos organismos produciendo hSOD,
se estudiaron las propiedades topológicas básicas de ambos modelos, se calcularon sus modos ele-
mentales y los rendimientos máximos de hSOD y biomasa versus glucosa, glicerol y metanol entre
los modos elementales, para distintas condiciones.
Entre las propiedades topológicas básicas se compararon los histogramas de conectivi-

dad, los que indicaron que ambas redes presentaban la mayorı́a de los metabolitos asociados a
escasas reacciones (menos de 4) y las diferencias radicaban en el metabolismo de metanol sólo
presente en el modelo de P. pastoris.
Al comparar los modos elementales de ambos modelos se observó que la red de P. pas-
toris presenta un mayor número de modos debido a la presencia del catabolismo de metanol, el
cual no realiza S. cerevisiae. La degradación de glucosa se presenta en el 78 % y 88 % de los mo-
dos elementales para S. cerevisiae y P. pastoris respectivamente, siendo éste el sustrato con mayor
participación en los modos.
Con respecto a los rendimientos relativos máximos de biomasa y hSOD versus glucosa,
glicerol, éstos resultan idénticos para ambos modelos, lo cual indica que los modos en los que se
encuentran aquellos rendimientos máximos se encuentran en ambos modelos, aunque no son nece-
sariamente los mismos modos, y que los modos elementales que incluyen consumo de metanol no
entregan –dada la estequiometrı́a de las reacciones involucradas– mejores rendimientos relativos.
Los resultados sugieren que una fuente de carbono adicional y la mayor cantidad de mo-
dos elementales asociada, que se refleja en mayores posibles combinaciones de vı́as metabólicas
activas da cuenta de la mayor eficiencia mostrada por P. pastoris como productor de proteı́nas re-
combinantes o simplemente, que las vı́as o factores que entregan mayor productividad a P. pastoris
no fueron consideradas.
Se logró realizar el modelo metabólico de mayor extensión conocido hasta la fecha para
Pichia pastoris, abriendo camino para que futuros investigadores realicen mayores análisis y des-
arrollos al modelo.
P. pastoris presenta la ventaja de poseer un promotor (del gen que codifica a la primera
enzima de la vı́a catabólica de metanol) fuertemente regulado, por lo que serı́a de gran interés el
considerar regulación génica al presente modelo y continuar el estudio, para ası́ dilucidar si las
diferencias en eficiencia –como productor de proteı́nas heterólogas– entre P. pastoris frente a S.
cerevisiae, radica en la regulación.
1
Dedicatoria
A mis padres Myriam y Paolo
A mis Nonnos Cecilia y Gerónimo
A mis hermanas Fiorella y Rossana
A toda la familia Cominetti Cotti-Cometti,
en especial a sus nuevos integrantes;
Gustavo
Pascuala
Clarita
.............
2
Agradecimientos
A quienes me han aconsejado y ayudado siempre, en especial durante mi carrera: Gracias

por enseñarme y apoyarme a tomar decisiones, por todo vuestro cariño y por ser mi gran ejemplo.
Papá y Mamá Nonna y Nonno

Roberto y Cecilia Keka y Tone
Sandy y Randy Franca, Rossella y Silvana
A quienes han sido un modelo a seguir en la ingenierı́a y/o academia, por su calidad pro-
fesional y humana.
Papá, Paolo Cominetti Roberto Cominetti

Gerónimo y Silvana Cominetti Prof. Leandro Herrera
A quienes me han brindado grandes oportunidades y han sido un importante apoyo duran-
te mi carrera, en particular en el desarrollo de esta memoria: Muchas Gracias por tanta confianza.
Prof. Bárbara Andrews Prof. Juan Asenjo

Prof. Ziomara Gerdtzen Prof. Alejandro Maass
Pablo Moreno y LBMG Prof. Jaime San Martı́n
A mis hermanas, a mis amigos y a mis compañeros por su amistad, humor y paciencia.
Un agradecimiento especial al Centro de Modelamiento Matemático de la Facultad de

Ciencias Fı́sicas y Matemáticas de la Universidad de Chile por haber financiado esta memoria.
3
Índice general
1. Introducción 9
1.1. Propósito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2. Contenido de la memoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.1. Modelos Estequiométricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3.2. Marco de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3.3. Fenómeno Modelado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3.4. Hipótesis de Trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.4. Objetivo Principal y Actividades Realizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2. Problema y Marco Teórico 18

2.1. Metabolismo de Levaduras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.1. Catabolismo de Azúcar en Levaduras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.2. Diferencias entre Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . 21
2.2. Levadura como sistema de expresión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.1. Levaduras metilotróficas como sistemas de expresión . . . . . . . . . . . . 24
2.3. Superóxido Dismutasa humana (hSOD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4. Redes Metabólicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.4.1. Reconstrucción de Redes Metabólicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.4.2. Representación Matemática Modelos Estequiométricos . . . . . . . . . . . 28
2.5. Análisis de Modelos Estequiométricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.5.1. Modos Elementales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4
2.5.2. Rendimientos Relativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3. Metodologı́a 34
3.1. Modelos Metabólicos Estacionarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.1.1. Desarrollo Modelo Metabólico Pichia pastoris . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.1.2. Análisis Modelos Metabólicos P. pastoris y S. cerevisiae . . . . . . . . . . 35
3.1.3. Modelo Estequiométrico Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . 36
3.2. Análisis Modelos Metabólicos Estacionarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3. Tratamiento Informático del Problema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3.1. Codificación de los Modelos Metabólicos en formato SBML . . . . . . . . 37
3.3.2. Representación Gráfica de Resultados: Lenguage GLE . . . . . . . . . . . 38
3.3.3. Software C ELL N ETA NALYZER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4. Resultados y Discusiones 39
4.1. Modelo Estequiométrico de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.2. Modelo Estequiométrico de P. pastoris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3. Modelo Estequiométrico de P. pastoris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.4. De los Modelos Estequiométricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.4.1. Potenciales Mejoras a los Modelos Estequiométricos . . . . . . . . . . . . 42
4.5. Análisis Modelos Estequiométricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.5.1. Propiedades Topológicas Básicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.5.2. Conectividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.5.3. Modos Elementales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.5.4. Rendimientos Relativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5. Conclusiones 56
5.1. De los Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.1.1. De la Productividad de P. pastoris versus S. cerevisiae . . . . . . . . . . . 57
5.2. Conclusiones Generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.3. Aporte al Campo o a la Disciplina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Apéndice 68
5
A. Modelos Metabólicos 69
A.1. Modelo Estequiométrico de Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . 69
A.1.1. Vı́as Metabólicas del Modelo de Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . 69
A.2. Modelo Estequiométrico de Pichia pastoris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
A.2.1. Vı́as Metabólicas del Modelo de Pichia pastoris . . . . . . . . . . . . . . 76
B. Nomenclatura y Abreviaciones 82
B.1. General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
B.2. Metabolitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
B.3. Flujos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
C. Material Suplementario 87
C.1. Algoritmo Cálculo Modos Elementales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
C.1.1. Descomposición de Distribuciones de Flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
C.1.2. Implementación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
C.2. Archivos de los Modelos Estequiométricos en formato SBML . . . . . . . . . . . 90
C.3. Representación Modelos Metabólicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
C.4. Modos Elementales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Índice Alfabético 92
Glosario 96
6
Índice de figuras
2.1. Ejemplo Simple de Red metabólica, Modos Elementales (EM) y Vı́as Extremas (EP) 32
4.1. Modelo Metabólico del Metabolismo Central de Pichia pastoris. . . . . . . . . . . 43

4.2. Histograma de Conectividad Modelos Estequiométricos S. cerevisiae y P. pastoris. 45
4.3. Modos Elementales con Máximos Rendimientos Y biomasa y Y SOD Modelo S. cere-
glucosa glucosa
visiae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.4. Modos Elementales con Máximos Rendimientos Y biomasa y Y SOD Modelo P. pastoris. 52
metanol metanol
4.5. Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa y Glicerol Modos S. cerevisiae. . . . . 53

4.6. Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa, Glicerol y Metanol Modos P. pastoris. . 54
A.1. Modelo Metabólico del Metabolismo Central de Saccharomyces cerevisiae . . . . 75
7
Índice de tablas
4.1. Referencias utilizadas en la construcción del modelo estequiométrico de S. cerevi-

siae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2. Referencias utilizadas en la construcción del modelo estequiométrico de P. pastoris. 41
4.3. Propiedades Topológicas Básicas de las Redes Metabólicas de S.cerevisiae y P.
pastoris. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.4. Cantidad y Distribución de los Modos Elementales del Modelo de S. cerevisiae. . . 46
4.5. Cantidad y Distribución de los Modos Elementales del Modelo de P. pastoris. . . . 46
4.6. Rendimientos Relativos Máximos de Modos Elementales de S. cerevisiae y P. pas-
toris. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.7. Rendimientos Relativos Máximos de Modos Elementales de S. cerevisiae y P. pas-
toris. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.8. Rendimientos Relativos Experimentales de las levaduras S. cerevisiae y P. pastoris. 48
8
Capı́tulo 1
Introducción
1.1. Propósito
La presente memoria tiene como propósito estudiar, a través de un análisis de vı́as me-
tabólicas de los modelos estequiométricos de Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae, las di-
ferencias teóricas de sus capacidades metabólicas para producir la proteı́na heteróloga Superóxido
Dismutasa humana (hSOD).
1.2. Contenido de la memoria
Esta memoria se desarrolla en los siguientes capı́tulos:
Introducción. Indica el propósito de la presente memoria junto con resumir su contenido. Además
contiene antecedentes de las levaduras Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae, de mo-
delos metabólicos y su análisis, en particular el análisis de modos elementales. Además se
explica el marco de trabajo, el fenómeno a modelar, el objetivo principal y las actividades
realizadas.
Problema y Marco Teórico. Explica el contexto, en relación a la biotecnologı́a y bioinformática

en el que se enmarca el problema planteado. Se divide en los subcapı́tulos siguientes: meta-
bolismo de levaduras, levadura como sistema de expresión, Superóxido Dismutasa humana,
9
redes metabólicas y análisis de modelos estequiométricos.
Metodologı́a. Describe el procedimiento llevado a cabo para cumplir los objetivos planteados en
un comienzo, en particular para desarrollar el modelo metabólico de Pichia pastoris y para
comparar tal modelo con el modelo metabólico de Saccharomyces cerevisiae. Adicional-
mente abarca análisis de modelos metabólicos y tratamiento informático del problema.
Resultados y Discusiones. Muestra el modelo metabólico desarrollado para P. pastoris, las fuen-
tes bibliográficas utilizadas para desarrollar ambos modelos, las diferencias entre las redes
y los resultados obtenidos tras aplicar el método de análisis de modos elementales y ren-
dimientos relativos sobre los dos modelos estequiométricos. Adicionalmente se presentan
discusiones respecto del trabajo realizado y de los resultados obtenidos.
Conclusiones. Indica las conclusiones generales y especı́ficas que se lograron inferir a partir de
los resultados obtenidos, respondiendo a los objetivos planteados en un comienzo. En parti-
cular contiene conclusiones en relación a la productividad de P. pastoris versus S. cerevisiae.
Finalmente se señalan aportes al campo o a la disciplina.
Apéndices. Incluye los modelos estequiométricos en detalle (listas de reacciones), el diagrama del
modelo de S. cerevisiae, y los enlaces a direcciones web en donde se encuentran disponibles
los archivos SBML1 de ambos modelos, los códigos en GLE2 para su representación y los
modos elementales calculados para cada modelo. Para facilitar la comprensión de los mode-
los, se incluye nomenclatura, abreviaciones y explicaciones de los nombres de los flujos.
1.3. Antecedentes
A pesar de que la levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido un sistema de expresión

muy exitoso para sintetizar diversas proteı́nas recombinantes, ésta ha presentado algunas dificul-
tades como lo son: baja productividad, sobre-glicosilación de proteı́nas, pérdidas del plasmidio
1 S YSTEMS B IOLOGY M ARKUP L ANGUAGE [1]
2 G RAPHICS L AYOUT E NGINE P ROFESSIONAL [3]
10
al escalar los cultivos, que las proteı́nas a ser excretadas queden restringidas en el espacio peri-
plasmático, entre otros. Es por esto que han surgido levaduras alternativas como sistemas de expre-
sión, entre las que cabe mencionar Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia
lipolytica, Hansenula polymorpha y Pichia pastoris, la cual se ha destacado por su elevada produc-
tividad al expresar proteı́nas recombinantes3 [75].
P. pastoris presenta numerosas ventajas como sistema de expresión con respecto a S.

cerevisiae. A diferencia de S. cerevisiae, en P. pastoris la expresión de proteı́nas humanas no se
encuentra asociada al crecimiento; puede crecer a altas densidades celulares, aumentando la pro-
ductividad y el rendimiento de la proteı́na heteróloga; tiene un promotor muy eficiente, inducible
por metanol, el que puede ser usado como única fuente de carbono y energı́a. Además, las modi-
ficaciones post-traduccionales —glicosilaciones— en P. pastoris son más parecidas a las células
humanas que las de S. cerevisiae. Otra ventaja corresponde a la facilidad de integración de ADN
heterólogo en el ADN huésped [10] y a que P. pastoris no secreta cantidades considerables de
proteı́nas endógenas (como S. cerevisiae) lo que simplifica la purificación de la proteı́na expresada
[13].
A pesar del gran impacto biotecnológico de Pichia pastoris, la información genética y

metabólica de este organismo es aún escasa. La secuencia de su genoma no se ha publicado4 , y
menos de 100 secuencias completas de genes de Pichia pastoris han sido depositadas en GenBank
al 12 de marzo de 2007 [2].
Es por esto que modelar su metabolismo no es una tarea sencilla, y se debe basar en la
información de enzimas aisladas o de estudios de flujos medidos con técnicas como C13 y experi-
mentos de hibridización cruzada con microarrays de distintos organismos, entre otros. [68].
3 Una lista actualizada de proteı́nas que han logrado ser expresadas en P. pastoris se encuentra en
http://faculty.kgi.edu/cregg/Pichia2004.htm
4 La empresa Integrated Genomics Inc. (IG) ha secuenciado el genoma de Pichia pastoris, pero aún no lo hace
público.
11
Los modelos realizados para P. pastoris hasta la fecha están basados en modelos este-
quiométricos que describen la variación de la biomasa y ciertos sustratos y productos [67, 77, 76].
El primero de estos modelos [67] es muy reducido (por ejemplo, utiliza sólo 8 reacciones para
describir el metabolismo del organismo cuando crece en glicerol), el segundo de éstos [77] no con-
templa el consumo de metanol y el tercero [76], a pesar de incluir el metabolismo del metanol, no
incorpora las reacciones de sı́ntesis de proteı́nas, etanol, carbohidratos, ARN y lı́pidos.
Entre los genes conocidos de P. pastoris, se han identificado secuencias de alta similitud
al compararlos con los correspondientes a S. cerevisiae (puntaje superior a 75 % sobre un largo de
al menos 250 pares de bases). La mayorı́a de los genes secuenciados pertenecen al metabolismo
del carbono y energı́a, o contribuyen a la sı́ntesis de aminoácidos o proteı́nas. Otro grupo de genes
de Pichia pastoris de secuencia conocida pertenece a vı́as especı́ficas de levaduras metilotróficas.
Para tales genes no hay homólogos presentes en el genoma de Saccharomyces cerevisiae [68].
1.3.1. Modelos Estequiométricos
Para analizar, interpretar y predecir el comportamiento celular, se debe obtener informa-

ción de cada reacción en una red bioquı́mica, y en el caso de una red metabólica, se debe conocer
la enzima que la cataliza (de ser catalizada enzimáticamente), la estequiometrı́a de ésta y las cons-
tantes cinéticas. Sin embargo, en ausencia de información cinética, aún es posible determinar las
capacidades teóricas metabólicas de un organismo, y examinar potenciales distribuciones de flujo
bajo el supuesto de estado estacionario [23].
Esta representación in silico del metabolismo se realiza utilizando información de lite-

ratura, genómica y de bases de datos metabólicas, entre otros.
Actualmente existen al menos doce bases de datos metabólicas; BioCasta, BioCyc, Bio-
Silico, BRITE, BSD, KEGG, Kiotho, LIGAND, Metacyc, Metagrowth, PathDB y UM-BBD.
12
Los modelos metabólicos han tenido un rol protagónico en la biologı́a de sistemas (sys-
tems biology);
“estudio de un organismo, visto como una red integrada e interactuante de genes, pro-
teı́nas y reacciones bioquı́micas que dan origen a la vida. En vez de analizar compo-
nentes individuales o aspectos del organismo, tales como ciertas vı́as o componentes
celulares, la biologı́a de sistemas se preocupa de todos los componentes y las interac-
ciones entre ellos, todo como parte de un sistema. Tales interacciones son las respon-
sables, en última instancia de la forma e interacciones del organismo5 . ” [4]
Entre los distintos tipos de modelos metabólicos es posible distinguir modelos basados
en restricciones (CBM, Constrain Based Models) y modelos no basados en restricciones, donde la
principal diferencia radica, tal como es posible inferir de la clasificación, en la presencia/ausencia
de restricciones, en la conectividad (estequiometrı́a de las reacciones), la capacidad (flujos me-
tabólicos máximos), las tasas (de regulación, cinéticas, etc.), otros (presión enzimática, electro-
neutralidad, etc.) [64].
Los modelos estacionarios basados en restricciones, estudiados en la presente memoria,

no incluyen información cinética, que es difı́cil de obtener y que puede variar entre e intra especies.
Para analizar modelos estequiométricos y lograr obtener información adicional del sis-
tema a la obtenida por simple inspección, existen distintas herramientas y métodos que permiten
caracterizar al espacio solución (distribuciones de flujo permitidas dadas las restricciones impues-
tas). Entre los métodos más utilizados es posible mencionar; Análisis de Flujos Metabólico (MFA),
Análisis de Balances de Flujos (FBA) [69], Análisis Regulatorio de Balances de Flujos (rFBA)
[58], Análisis de Planos de Fases de Fenotipos (PhPA) [58], Análisis de Minimización de Ajustes
Metabólicos (MOMA) [58], Análisis de Balances de Energı́a (EBA) [59], Análisis de Robustez
[58], Análisis de Control Metabólico (MCA) [58], Teorı́a Bioquı́mica de Sistemas (BST) [58],
Modelo Cibernético y Análisis de Vı́as Metabólicas (MPA) [9] que incluye al Análisis de Vı́as
5 Tales interacciones permiten identificar propiedades emergentes del sistema.
13
Extremas (EPA) [86] y Análisis de Modos Elementales (EMA) [9], entre otros.
Del listado anterior los dos últimos métodos requieren sólo la estequiometrı́a de la red
metabólica, y permiten determinar propiedades topológicas de la red estequiométrica (conectivi-
dad de metabolitos por ejemplo), identificar potenciales blancos (targets) terapéuticos, estudiar
secuencias huérfanas, etc. La identificación de targets terapéuticos consiste en identificar reaccio-
nes esenciales para forzar o bloquear cierta función metabólica. Por ejemplo, si se ha identificado
que una reacción está presente en todos los modos elementales asociados con tal función, al blo-
quear la reacción, el sistema ya no serı́a capaz de realizar tal función, es decir, tal reacción es un
blanco terapéutico potencial [9].
Cornish-Bowden y Cárdenas en el artı́culo “From genome to cellular phenotype–a role

for metabolic flux analysis? ” del año 2000 compararon los modos elementales de T. palladium con
los modos de E. coli y lograron determinar la existencia de la enzima transaldolasa, a pesar de que
su secuencia no habı́a sido identificada en el genoma. Al identificar enzimas que estaban presentes
en T. palladium y que todos los modos elementales en que participaban requerı́an la presencia de
transaldolasa, se concluyó que tal enzima también debı́a existir en T. palladium, por lo que debı́a
estar codificada entre las secuencias huérfanas a las que previamente no se logró asignar una fun-
ción [14].
Las vı́as extremas corresponden al mı́nimo conjunto de vı́as capaces de describir todas
las distribuciones de flujo posibles en estado estacionario y son linealmente independientes, mien-
tras que los modos elementales representan las sub-redes más pequeñas que le permiten al sistema
metabólico operar en estado estacionario, desde un punto de vista funcional [47].
Los modos elementales son un subconjunto de las vı́as extremas. Para un sistema con
todas sus reacciones irreversibles, ambos conjuntos de vı́as son equivalentes [60].
14
1.3.2. Marco de trabajo
Se escogió utilizar el formato SBML [41] como el formato a utilizar, debido a su estruc-
tura lógica y a la gran difusión y penetración que tiene en los cı́rculos académicos del área. De tal
modo, se facilita compartir, validar y simular los modelos.
En vez de haber programado los métodos de análisis, se optó por utilizar el software
libre C ELL N ETA NALYZER [47] debido a que cuenta con una gran variedad de métodos de análisis
de modelos estequiométricos bien implementados, está basado en M ATLAB, pudiendo modificarse
los códigos fuentes y debido a que posee una gráfica adecuada.
1.3.3. Fenómeno Modelado
El fenómeno modelado corresponde al metabolismo central en estado estacionario de

S.cerevisiae y P. pastoris, incluyendo vı́as de sı́ntesis de aminoácidos, de lı́pidos, de carbohidratos,
de etanol, de ARN, de proteı́nas, y en particular de la proteı́na heteróloga SOD, y las vı́as de con-
sumo de glucosa, glicerol, y metanol, esta última sólo en el caso de P. pastoris, ya que S. cerevisiae
no es capaz de degradarlo.
Los modelos consisten en listas de reacciones bioquı́micas y de transporte presentes en

los sistemas e información relacionada a los metabolitos; compartimentalizaciones al interior de la
célula (mitocondria, peroxisoma y citosol), concentraciones máximas, entre otros.
Se utilizó como base el modelo de Saccharomyces cerevisiae recombinante realizado

por Ramón González [35], modelo que fue revisado y mejorado.
Dado que no se encuentra publicado el genoma de P. pastoris, se realizó su modelo

estequiométrico como sistema de expresión para la proteı́na recombinante Superóxido Dismutasa
humana (hSOD), basándose en el modelo para S. cerevisiae a modo de alcanzar un grado de
15
complejidad similar a este modelo. En el caso de Pichia pastoris se incluyeron adicionalmente las
reacciones que explican el metabolismo del metanol, dado que éste es un organismo metilotrófico.
1.3.4. Hipótesis de Trabajo
A partir de la búsqueda bibliográfica se postuló la siguiente hipótesis:
Pichia pastoris es más eficiente frente a Saccharomyces cerevisiae como sistema de

expresión para la proteı́na SOD y tal eficiencia (medida como rendimiento de producto
versus sustrato) se puede determinar a partir de su red metabólica.
1.4. Objetivo Principal y Actividades Realizadas
El objetivo principal de la presente memoria fue:
1. Realizar un estudio teórico comparativo de las capacidades metabólicas de Pichia pastoris y

Saccharomyces cerevisiae como sistemas de expresión de la enzima Superóxido Dismutasa
humana (hSOD) en base al modelo del metabolismo central de Saccharomyces cerevisiae
produciendo hSOD, realizado por Ramón González en el marco de su tesis para optar al
grado de Doctor en Ciencias de la Ingenierı́a, mención Quı́mica de la Facultad de Ciencias
Fı́sicas y Matemáticas de la Universidad de Chile.
Las actividades realizadas fueron:
1. Se identificaron los elementos que componen la red metabólica de Pichia pastoris produ-
ciendo la enzima Superóxido Dismutasa humana (hSOD) y cómo se interrelacionan.
a) Se realizó una búsqueda bibliográfica acabada del metabolismo, genoma y enzimas de

Pichia pastoris.
16
b) Se codificó el modelo metabólico de Pichia pastoris en formato SBML.
c) Se representó gráficamente el modelo metabólico de Pichia pastoris.
2. Se codificó el modelo metabólico de Saccharomyces cerevisiae en formato SBML.
3. Se representó gráficamente el modelo metabólico de Saccharomyces cerevisiae.
4. Se aplicó el método de Análisis de Vı́as Metabólicas: Análisis de Modos Elementales a

ambos modelos metabólicos.
5. Se compararon los modos elementales previamente obtenidos.
6. Se determinaron los rendimientos máximos de biomasa y SOD con respecto a glucosa, gli-
cerol y metanol de los modos elementales de ambos modelos y se compararon con datos de
rendimientos experimentales reportados en la literatura para ambas levaduras produciendo
SOD.
17
Capı́tulo 2
Problema y Marco Teórico
2.1. Metabolismo de Levaduras
El metabolismo, conjunto de reacciones y procesos fı́sico-quı́micos que ocurren en una

célula, da cuenta tanto de la asimilación bioquı́mica (en vı́as anabólicas) como de la desasimila-
ción (en vı́as catabólicas) de nutrientes. En levadura, ası́ como en otros organismos, estos procesos
están mediados por reacciones enzimáticas. Entre las vı́as anabólicas se encuentran procesos re-
ductivos que llevan a la producción de material celular nuevo, mientras que las vı́as catabólicas
son procesos oxidativos que remueven electrones desde sustratos o intermediarios utilizados para
generar energı́a. En general, estos procesos utilizan NADP o NAD (respectivamente) como cofac-
tores [26, 83].
Aunque todas las levaduras son microorganismos que derivan su energı́a quı́mica en la
forma de ATP, a partir de la ruptura de compuestos orgánicos, existe diversidad metabólica en
cómo estos organismos generan y consumen energı́a desde tales sustratos [26].
Está bien establecido que la mayorı́a de las levaduras emplean azúcares como su princi-
pal fuente de carbono, pero ciertas levaduras pueden utilizar fuentes de carbono no convencionales.
Con respecto al metabolismo de nitrógeno, la mayorı́a de las levaduras son capaces de asimilar
fuentes de nitrógeno simples para biosintetizar aminoácidos y proteı́nas. Aspectos del metabolis-
mo de azufre y fósforo, como también el metabolismo de otros compuestos inorgánicos han sido
18
estudiado en cierto detalle, predominantemente en Saccharomyces cerevisiae [26, 83].
2.1.1. Catabolismo de Azúcar en Levaduras
La principal fuente de producción de energı́a en levadura (en Saccharomyces cerevisiae)

es la glucosa, y la glicólisis es la vı́a general para la conversión de glucosa a piruvato, mientras que
la producción de energı́a en forma de ATP se encuentra acoplada a la generación de intermediarios
y poder reductor en forma de NADH [57].
Se pueden observar dos formas principales para el uso de piruvato en la posterior produc-
ción de energı́a, respiración y fermentación. En la presencia de oxı́geno y la ausencia de represión,
el piruvato ingresa a la matriz mitocondrial donde es descarboxilado oxidativamente hacia Acetil-
CoA por el complejo multienzimático piruvato deshidrogenasa. Esta reacción une la glicólisis con
el ciclo del ácido cı́trico, en el cual AcetilCoA es completamente oxidado para dar dos moléculas
de CO2 y equivalentes reductivos en la forma de NADH y FADH2 . Sin embargo, el ciclo del áci-
do cı́trico es una vı́a ambibólica, dado que combina funciones tanto catabólicas como anabólicas
[26]. Los compuestos necesarios para impulsar el ciclo de ácido cı́trico, como el oxaloacetato y
α-cetoglutarato son recuperados a través de [26, 83];
(i) la fijación de CO2 hasta piruvato por la acción de las enzimas piruvato carboxilasa (depen-
diente de ATP) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa,
(ii) el ciclo del glioxilato (un atajo a través del ciclo del ácido cı́trico), el que es relevante cuando
las levaduras crecen en dos fuentes de carbono, como acetato y etanol.
Durante la fermentación alcohólica de azúcares, las levaduras re-oxidan NADH a NAD

en una reacción de dos pasos desde piruvato, el cual es primero descarboxilado por la enzima pi-
ruvato descarboxilasa seguido por la reducción de acetaldehı́do, catalizado por la enzima alcohol
deshidrogenasa. Al mismo tiempo se genera glicerol desdehidroacetona fosfato [26].
Una forma alternativa de oxidación de glucosa es la vı́a de las pentosas fosfato, que pro-
vee a las células con azúcares pentosas y NADPH citosólico para la biosı́ntesis de ácidos grasos,
19
aminoácidos y alcohol azúcares. El primer paso en esta vı́a es la deshidrogenación de glucosa-6-
fosfato a 6-fosfogluconolactona y la generación de 1 mol de NADPH por glucosa-6-fosfato deshi-
drogenasa. A continuación, el 6-fosfogluconato es descarboxilado por la acción de fosfoglucanato
deshidrogenasa para dar ribulosa-5-fosfato y un segundo mol de NADPH [26].
Los transportadores redox, NAD y FAD, que se reducen durante la ruptura de azúcares a
NADH y FADH2 , respectivamente, son reoxidados en la cadena respiratoria (transporte de electro-
nes) ubicada en la membrana interior de la mitocondria. La energı́a liberada durante la transferencia
de electrones está acoplada al proceso de fosforilación oxidativa (también ubicada en la membrana
mitocondrial interna), que está diseñado para sintetizar ATP desde ADP y fosfato inorgánico [26].
Muchos tipos de levadura pueden crecer en glicerol como única fuente de carbono bajo
condiciones aeróbicas, siendo también una fuente de carbono no fermentable para varias levaduras,
incluyendo Saccharomyces cerevisiae. Para servir como fuente de carbono, tras ser internalizado
el glicerol, debe ser convertido por glicerol quinasa a glicerol-3-fosfato, el que es luego transfor-
mado hacia DAH fosfato (sustrato en gluconeogénesis) por glicerol-3-fosfato deshidrogenasa [26].
El control de la producción de proteı́nas, en levaduras, es dependiente del control del

ciclo celular. Se ha visto que en la fase exponencial la sı́ntesis de proteı́nas se incrementa exponen-
cialmente y una vez que la célula ingresa a la fase estacionaria la sı́ntesis de proteı́nas disminuye
más del 90 % [82, 63].
En el caso de P. pastoris se ha reportado que la adición de metanol al medio de cultivo

de glicerol durante el crecimiento, genera un aumento en la biomasa pero no una mayor actividad
de proteı́nas recombinantes, por lo que se sugirió que no generó un aumentó de producción de
proteı́nas recombinantes [13, 63].
Muchos autores han estudiado cómo afecta la variación en la concentración de metanol

en la expresión de proteı́nas heterólogas [39, 88]. La inducción del promotor AOX está fuertemen-
te influenciada por el sustrato para el crecimiento; en células crecidas en glicerol, xilosa, ribosa o
20
sorbitol la actividad especı́fica de AOX1 es cercana al 60 % de la observada en metanol. Por otro
lado, la glucosa y el etanol son represores efectivos; en cultivos con glicerol la actividad AOX no
se detecta, sin embargo esta fuente de carbono no reprime el sistema. Además se ha demostrado
que los efectos represor e inductor compiten [63].
2.1.2. Diferencias entre Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae
Una de las diferencias principales entre Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae

corresponde al modo de respiración. Mientras que S. cerevisiae es un organismo que realiza respi-
ración aeróbica facultativa, Pichia pastoris realiza respiración anaeróbica. Este segundo organismo
es capaz de metabolizar metanol, formando formaldehı́do a través de la acción de una oxidasa de-
pendiente de O2 , y luego conviertiéndolo en dihidroxiacetona (DAH) por una DAH sintasa. DHA
y gliceraldehı́do-3-fosfato (GAP) pueden utilizarse para sintetizar fructosa-6-fosfato (FRUC 6P)
[26, 75].
P. pastoris tiene un promotor fuertemente inducible por metanol (AOX1) el que permite
tener un control fuerte sobre la degradación de metanol y producción de proteı́nas heterólogas.
Además de esto, P. pastoris realiza glicosilación de manera similar a las células humanas, produ-
ciendo proteı́nas de menor antigenicidad que S. cerevisiae 1 [17].
P. pastoris presenta baja secreción de proteı́nas endógenas, lo cual facilita la purificación

de las proteı́nas heterólogas secretadas. Mientras que en el caso de S. cerevisiae muchas de las
proteı́nas secretadas no se encuentran libres en el medio, sino que en el espacio periplasmático, lo
cual dificulta la purificación y hace diminuir el rendimiento de producto.
P. pastoris puede crecer a densidades celulares mayores que S. cerevisiae (100 g/litro
aproximadamente), lo cual se asocia a una mayor producción de proteı́nas secretadas. Por ejem-
1 En la Sub-Sección 2.2.1 se discutirá en mayor detalle la diferencia en glicosilación de ambas levaduras
21
plo, entre los mayores rendimientos de P. pastoris se encuentra el de la proteı́na heteróloga (S)-
Hidroxinitrilo liasa (Hnl) con un rendimiento de 22 g/litro, mientras que para S. cerevisiae se
encuentra la producción de α-amilasa de bacteria, con un rendimiento de 2.5 g/litro [38, 29].
Fierobe comparó P. pastoris y S. cerevisiae como sistemas de expresión de glucoamila-

sa proveniente de Aspergillus niger, importante almidón-hidrolasa utilizada en la industria. Como
resultado se obtuvo glucoamilasa con mayor termoestabilidad por P. pastoris que la producida por
S. cerevisiae [27].
Por otro lado, se ha demostrado que P. pastoris presenta un mayor rendimiento al produ-
cir proteı́nas heterólogas que S. cerevisiae. Tal es el caso de (S)-Hidroxinitrilo liasa (Hnl) de Hevea
brasiliensis [38], α-amilasa pPAM de ratón [43], insulina [46], monoamida oxidasa A de hı́gado
humano [51], carboxilesterasa de hı́gado de conejo [55], lisozima H5 de huevo de gallina [53],
penicilina G amidasa de Providencia rettgeri [73], nucleoproteı́na del virus de sarampión [74],
dalcoquinasa de Dalbergia cochinchinensis Pierre [79], lactoferrina porcina (rPLF) [84], precur-
sor de insulina de cerdo (PIP) [85] y antı́geno del parásito de la malaria Pfs25 [89], entre muchas
otras.
Sin embargo, en la literatura también se ha reportado la situación opuesta, en que S. ce-

revisiae se presenta como una mejor alternativa que P. pastoris como sistema de expresión. Por
ejemplo, Laffitte expresó el antı́geno bullous pemphigoid 230 (BP230) en ambas levaduras y obtu-
vo como resultado un mayor rendimiento en S. cerevisiae que en P. pastoris [50], lo cual también
ocurrió al expresar caseinomacropéptido humano [44].
Más aún, Parekh señala que la diferencia entre especies de levaduras en cuanto a su
capacidad para secreción de proteı́nas heterólogas podrı́a ser eliminada si se logra que S. cere-
visiae realice un uso eficiente de sus capacidades secretorias disponibles, y que la capacidad de
productividad máxima proteica está determinada por la capacidad del retı́culo endoplasmático de
enrollamiento proteico [61].
22
2.2. Levadura como sistema de expresión
Los sistemas de expresión procariontes son de gran utilidad para producir proteı́nas he-
terólogas (recombinantes) a partir de cDNA de origen eucarionte. Sin embargo, en muchos casos
las proteı́nas eucariontes sintetizadas por bacterias son inestables o carecen de actividad biológi-
ca. Al purificar las proteı́nas recombinantes, éstas se pueden ver contaminadas por compuestos
bacterianos tóxicos o que causen un aumento de temperatura corporal en humanos y animales
(pirogénicos), en el caso de aplicaciones terapéuticas. Con el objetivo de evitar estos problemas,
se han desarrollado sistemas de expresión eucariontes para la producción de proteı́nas de uso te-
rapéutico (humanos o animales), que en general deber ser idénticas a las producidas de forma
nativa, a modo de mantener intactas sus propiedades bioquı́micas, fı́sicas y funcionales. La inca-
pacidad de los organismos procariontes de producir versiones idénticas se debe princialmente a la
ausencia de mecanismos apropiados para realizar modificaciones post-traduccionales [48, 78].
Tales modificaciones pueden ser [24, 34]:
1. Correcta formación de puentes disulfuro, catalizada por la enzima disulfuro isomerasa.
2. Cortes proteolı́ticos de la forma precursora, para lograr una proteı́na funcional.
3. Glicosilación; modificación que le proporciona estabilidad a la proteı́na. Las glicosilacio-

nes protéicas más comunes consisten en la adición de residuos de azúcares especı́ficos a
aminoácidos serina, treonina (glicosilación unida a O ) o a asparagina (unida a N).
4. Adición a aminoácidos; fosforilaciones, acetilaciones, carboxilaciones, entre otras.
La expresión de proteı́nas recombinantes en Saccharomyces cerevisiae ha sido exitosa

en numerosos casos, presentándose ciertas limitaciones en algunos de ellos, debido principalmente
a [22, 21]:
La pérdida del plasmidio.
Sobre-glicosilación de proteı́nas heterólogas.
23
Proteı́nas a ser excretadas se quedaban retenidas en el espacio periplasmático.
Debido a tales limitaciones ha sido necesario estudiar otras especies de levadura como
sistemas de expresión. Entre tales especies es posible mencionar Kluyveromyces lactis, Saccha-
romyces pombe, Yarrowia lipolyctica, Hansenula polymorpha y Pichia pastoris [78].
2.2.1. Levaduras metilotróficas como sistemas de expresión
Al igual que en el caso de Saccharomyces cerevisiae, las levaduras metilotróficas com-

binan las ventajas de muchos microorganismos (es decir, cultivo simple en medios de cultivo de
bajo costo, técnicas genéticas bien establecidas y una amplia experiencia en cultivos industriales
y escalamiento) junto a la habilidad de realizar el procesamiento tı́pico de eucariontes y otras mo-
dificaciones post-transcripcionales, como la glicosilación. Para proteı́nas con fines farmacéuticos
existen muchas otras ventajas; los productos se encuentran libres de exotoxinas y también libres
de ADN viral oncogénico. Gracias a su amplio uso en la industria alimentaria, algunas levaduras
poseen el estatus de GRAS (Generally Regarded As Safe) [11].
La importancia industrial de levaduras metilotróficas ha continuado aumentando debi-

do a caracterı́sticas tecnológicas relevantes. En contraste con S. cerevisiae que pertenece al grupo
de levaduras Crabtree negativas, la producción de etanol ocurre a bajos niveles en condiciones
aeróbicas. Esto permite que estas levaduras crezcan a elevadas densidades celulares en cultivos en
biorreactores y ası́ resultando en elevados rendimientos de productos [78].
Además, las levaduras metilotróficas como Pichia pastoris y Hansenula polymorpha,

tienen la caracterı́stica de presentar una elevada tasa de secreción protéica, mientras que en Sac-
charomyces cerevisiae existe retención de proteı́nas en el espacio periplasmático, incluso para
péptidos de bajo peso molecular [49].
Esta elevada capacidad de secreción de levaduras metilotróficas, en combinación con
24
técnicas de fermentación de alta densidad, ha permitido obtener niveles de varios gramos de pro-
teı́na heteróloga secretada por litro de cultivo [17, 78].
A pesar de que la sobre-manosilación ocurre menos frecuentemente en levaduras meti-

lotróficas que en S. cerevisiae, la mayor diferencia con respecto a la glicosilación es la ausencia
de terminales hı́per-inmunogénicos α-1,3-unidos a manosas en glicanos asociados a terminales N
en proteı́nas producidas por P. pastoris y H. polymorpha. En el caso de expresión de proteı́nas
humanas se ha logrado modificar genéticamente estas cepas para lograr un patrón de glicosilación
similar a las proteı́nas en cuestión, aumentando ostensiblemente el uso de levaduras metilotróficas
como organismos huéspedes [76, 19].
El éxito de las levaduras metilotróficas en la producción de proteı́nas recombinantes

está asociado a sus promotores fuertes y altamente regulados de algunos genes del metabolismo
del metanol. Se destaca el promotor del gen que codifica a la primera enzima de la vı́a de uso de
metanol en P. pastoris, alcohol oxidasa I (AOX1). Los promotores fuertemente regulados equiva-
lentes en otras levaduras metilotróficas, se utilizan muy a menudo en la producción de proteı́nas
recombinantes [75, 81].
2.3. Superóxido Dismutasa humana (hSOD)
Superóxido dismutasa (E.C. 1.15.1.1) humana (hSOD) corresponde a una metaloenzima

que posee cobre y zinc en el sitio activo y su función es “eliminar” o “capturar” radicales de oxı́ge-
no libres [18].
HSOD es útil para prevenir el daño tisular asociado a cambios bruscos de oxigenación
(transplantes, infartos, procedimientos quirúrgicos –by pass–, etc.) y en el tratamiento de la artritis
reumatoidea (la inflamación y destrucción de las articulaciones parecieran estar relacionadas con
los radicales libres del O2 ) [5].
25
Se han realizado diversos estudios teóricos y experimentales del metabolismo de Saccha-
romyces cerevisiae produciendo hSOD, determinándose ciertas capacidades metabólicas y propie-
dades estructurales de su red metabólica [6, 35, 7].
En experimentos de laboratorio se ha logrado sobre-expresar la proteı́na heteróloga SOD

proveniente de S. cerevisiae en P. pastoris, obteniéndose SOD enzimática y biológicamente activa
con alta pureza y elevada actividad especı́fica [87]. Además, se ha logrado expresar SOD manga-
neso humana (hMnSOD) en P. pastoris, en el vector de expresión pPIC9K inducible por metanol,
logrando un rendimiento del 32 % del total de proteı́nas en el sobrenadante [52]. Finalmente, en
el año 2006 se logró por primera vez expresar Superóxido Dismutasa humana extracelular en P.
pastoris [12], lográndose una elevada productividad. Además de ello se observó que las células
transformantes eran resistentes al estrés oxidativo y al shock térmico, pudiendo crecer en ambien-
tes altamente oxidativos y aumentando aún más su capacidad para crecer en elevadas densidades
celulares [12].
2.4. Redes Metabólicas
2.4.1. Reconstrucción de Redes Metabólicas
Se entiende por reconstrucción de redes metabólicas al proceso de ensamblar una lista

de reacciones especı́ficas de un organismo dado. Este proceso actualmente no se encuentra auto-
matizado, es iterativo y se basa en realizar decisiones relacionadas a si existen pruebas para incluir
o eliminar ciertas reacciones metabólicas desde una lista genérica de reacciones [66].
Luego de tener las redes metabólicas reconstruı́das, se procede a su análisis. Aplican-

do métodos matemáticos como análisis convexo y programación lineal, se pueden estudiar sus
propiedades estructurales, como la conectividad, y luego simular el comportamiento celular bajo
distintas condiciones fisiológicas [64]. De tales resultados es posible desarrollar estrategias de in-
genierı́a genética para la construcción de cepas con nuevas propiedades. Además se pueden evaluar
26
ciertas propiedades estructurales de la red para la producción de aminoácidos, entre muchas otras
aplicaciones [15, 56].
Durante el proceso de reconstrucción, se realizan diversas decisiones con respecto a ca-

da reacción, comenzando por ¿se encuentra presente alguna enzima o complejo enzimático que
catalice tal reacción?, ¿cuál es la estequiometrı́a de esa reacción?, ¿existen cofactores asociados
a esa reacción?, si agrego/elimino tal reacción, ¿genero metabolitos que luego no se consumen o
dejo metabolitos sin ser consumidos?, ¿es reversible o irreversible la reacción?, ¿dónde ocurre tal
reacción?. Para el modelamiento, se requerirá información adicional relacionada a la composición
de la biomasa y requerimientos de ATP en distintas condiciones de crecimiento [20].
Para poder responder tales preguntas sobre cada reacción se deberá realizar una amplia
búsqueda bibliográfica, llegando a conocer el actual estado del arte de reacciones metabólicas. Para
ello existen bases de datos de vı́as en lı́nea, libros de bioquı́mica, secuencias genómicas anotadas,
y experimentos metabólicos en revistas y publicaciones cientı́ficas.
El proceso de reconstrucción produce un conjunto de reacciones bioquı́micas que pue-

den ser utilizadas para construir modelos estequiométricos usando balance de metabolitos [23, 16].
Estos modelos se basan en balances de masa de intermediarios metabólicos suponiendo un estado
estacionario. Junto con la información obtenida desde la estequiometrı́a se requiere la localiza-
ción, reversibilidad y conocimiento de composición de biomasa para determinar el “drenaje” de
precursores o bloques de construcción hacia la producción de biomasa. Aunque la composición de
biomasa cambia bajo distintas condiciones fisiológicas, puede suponerse constante, puesto que se
ha observado in-silico que cambios en la composición de biomasa tienen impactos muy leves en
los resultados de simulaciones [80].
27
2.4.2. Representación Matemática Modelos Estequiométricos
El conjunto de reacciones escogidas para representar el metabolismo de un sistema se

puede resumir en una matriz, llamada matriz estequiométrica, donde los componenetes son los
coeficientes estequiométricos de las reacciones.
Por ejemplo, las siguientes reacciones se representarán en una matriz estequiométrica

como se muestra a continuación:
aA + cC −→ eE, (2.1)
bB + e0 E −→ gG + a0 A, (2.2)
(1) (2)
 
A −a a0
 
0 −b
 
B 
 
N = C
 −c 0 .

 

E e −e0 

 
G 0 g
Considerando la estructura anterior, es posible escribir las ecuaciones de balances de

flujos metabólicos como:
m
∑ N ji ·V j = ri , ∀i. (2.3)
j=1
donde:
N: Matriz Estequiométrica (filas ⇔ metabolitos, columnas ⇔ reacciones)

V : Vector de Flujos
28

 ≥ 0, i producto
N ji : Coeficiente estequiométrico del metabolito i en la reacción j. N ji
 ≤ 0, i sustrato
V j : Flujo de la reacción j
ri : Tasa neta de producción del metabolito i
m: Número total de reacciones
Ahora bien, en el caso de los metabolitos internos no acumulables, ri es nulo (condición

de estado estacionario), lo cual se expresa de la siguiente manera:
 
r
N T ·V =  .
0
2.5. Análisis de Modelos Estequiométricos
El análisis de vı́as metabólicas comenzó en los 80’ con el desarrollo de SNA (Stoichio-
metric Network Analysis), realizado por Bruce Clarke. Tal teorı́a fue desarrollada para estudiar la
inestabilidad de redes quı́micas inorgánicas. Tal fue el primer intento de realizar análisis convexo
a redes de reacciones, pero no se extendió a seres vivos [71].
Este estudio fue continuado por algoritmos de inteligencia artificial para buscar a través
de las redes de reacciones siguiendo la teorı́a de grafos. Luego Mavro le agregó restricciones este-
quiométricas. Ambos análisis carecı́an de bases teóricas sólidas, por lo que en el año 1994 Schuster
aplicó Programación lineal al estudio de redes metabólicas determinando grupos de modos ele-
mentales. Esta nueva forma de analizar redes metabólicas fue aplicada por Liao para optimizar el
diseño de cepas bacterianas en la producción de aminoácidos aromáticos [71].
Un ejemplo de análisis de redes de gran tamaño es Feist, Palsson et al. 2007. Este intento
toma el desafı́o de descomposición, pero aún se encuentra en sus primeros pasos. [25].
29
2.5.1. Modos Elementales
Modos Elementales: Definición Biológica/Metabólica
Un modo elemental es un set mı́nimo de enzimas que puede operar en estado estacionario
con todas las reacciones irreversibles procediendo en la dirección apropiada [60].
Para obtener un modo elemental, bloquear alguna enzima de la red metabólica en estudio
y determinar si aún hay flujo a través del sistema. Bloquear una segunda enzima, y repetir
sucesivamente. Un modo elemental se obtiene cuando el bloqueo de una enzima adicional,
aún activa, lleva a la pérdida de cualquier flujo en estado estacionario en el sistema [60].
Modos Elementales: Definición Matemática
Sean las siguientes condiciones:
(C1) Condición de Estado Estacionario ⇐⇒ N ·V = 0 para metabolitos internos.
(C2) Restricción de los Signos ⇐⇒ V ∗ contiene un subvector Virr

∗ que cumple la inequación
∗ ≥ 0, donde los componentes de V ∗ corresponden a las reacciones irreversibles.

Virr irr
Un modo elemental es un vector V ∗ , tal que [60]:
@ vector V ∗∗ (6= al vector nulo) que cumpla las siguientes propiedades:
(i) V ∗∗ cumple las condiciones (C1) y (C2),
(ii) V ∗∗ contiene componentes zero donde V ∗ los contiene y en al menos una posición adicional,
S(V ∗ ) ⊂ S(V ∗∗ ). (2.4)
En definitiva, un modo elemental se puede representar por un vector de flujos que no

puede descomponerse en dos vectores de flujos que tengan un componente cero adicional [54].
30
Determinación de Modos Elementales
Como se ha señalado, un modo elemental corresponde al mı́nimo conjunto de enzimas

que pueden operar en estado estacionario. En redes complejas o de alta densidad, la dificultad
de calcular tales modos radica en que el problema es NP-completo, es decir hay una explosión
combinatorial. A pesar de ello, el análisis de modos elementales ha sido aplicado exitosamente en
genómica funcional, bioingenierı́a y medicina [60].
El algoritmo utilizado por el software escogido2 para calcular los modos elementales
corresponde al que realiza M ETATOOL y que fue desarrollado por Pfeiffer en el año 1999 [62].
Como es difı́cil interpretar un gran número de modos elementales, en general es conve-

niente descomponer tales redes metabólicas en subsistemas más pequeños. Tal subdivisión puede
ser realizada por intuición, de acuerdo a metabolismos particulares (metabolismo de azúcar, de
lı́pidos, del carbono), entre otros [69, 8].
Modos Elementales versus Vı́as Extremas
Una alternativa al Análisis de Modos Elementales corresponde al Análisis de Vı́as Ex-

tremas, que son un conjunto de vectores derivados de la matriz estequiométrica que forman una
base [70], es decir, consisten en los vértices del cono del polihedro convexo que representa a cada
modelo, donde los ejes corresponden a los distintos metabolitos [60].
Las vı́as extremas tienen las siguientes propiedades [60]:
(I) Existe un único conjunto de vı́as extremas para una red dada.
(II) Cada vı́a extrema está compuesta por un número mı́nimo de reacciones que necesita para
existir como una unidad funcional.
2 C ELL N ETA NALYZER
31
(III) Las vı́as extremas son subconjuntos sistemáticamente independientes de los modos elemen-
tales; es decir, ninguna vı́a extrema puede ser representada como una combinación lineal
no-negativa de otras vı́as extremas.
Las propiedades I y II las comparten tanto los modos elementales como las vı́as extre-
mas. En la Figura 2.1 se muestran las vı́as extremas y los modos elementales de un sistema simple.
Se observa que las vı́as extremas son un subconjunto de los modos elementales (tal como lo indica
la propiedad III) [60].
(a) Red Metabólica (b) EM 1 (c) EM 2 (d) EM 3
(e) EM 4 (f) EP 1 (g) EP 2 (h) EP 3
Figura 2.1: Ejemplo Simple de Red metabólica, Modos Elementales (EM) y Vı́as Extremas (EP)
La red está compuesta por tres metabolitos, tres reacciones internas y tres reacciones de intercam-
bio (a), luego se presentan sus cuatro modos elementales EM 1 (b) EM 2 (c) EM 3 (d) y EM 4 (e) y
sus tres vı́as extremas EP 1 (f) EP 2 (g) y EP 3 (h). La diferencia entre los conjuntos de vı́as radica
en el uso del flujo de intercambio reversible para el metabolito A. El modo elemental EM 4 es una
combinación lineal no-negativa de las vı́as extremas EP 1 y EP 2, ya que el flujo de intercambio
reversible para el metabolito A puede cancelarse. [60]
32
2.5.2. Rendimientos Relativos
Como medida de productividad para comparar y validar los modelos estequiométricos

se escogió determinar los rendimientos relativos de los productos biomasa y SOD con respecto a
los sustratos glucosa, glicerol y metanol.
El rendimiento relativo de un producto X sobre un sustrato S corresponde al cuociente

entre la diferencia de biomasa celular y la diferencia de sustrato (en general fuente de carbono)
medido en gramos/gramos o en moles/moles, es decir corresponde a las unidades de biomasa o
producto producidas por unidad de sustrato consumido [75];
∆X Xtiempo final − Xtiempo inicial

YX/S = = . (2.5)
∆S Stiempo inicial − Stiempo final
Los rendimientos relativos varı́an con las distintas fuentes de carbono, con las condicio-
nes de operación, con el tiempo, entre otros [75].
Para convertir los rendimientos relativos medidos en gramos/gramos a mol/mol se utili-

gr gr
zaron los pesos moleculares: PMglucosa = 180 gr-mol , PMglicerol = 92,1 gr-mol y PMmetanol = 32,04
gr
gr-mol , donde;
0 PMS
YX/S = YX/S · . (2.6)
PMX
Se utilizó como aproximación para el peso molecular de las levaduras P. pastoris y S.

gr
cerevisiae 26,62 gr-mol , obtenido a partir de la composición elemental de células de P. pastoris
CH1,89 N0,189 S0,002 O0,626 determinada experimentalmente en Solà 2004 [75].
33
Capı́tulo 3
Metodologı́a
A continuación se detalla la metodologı́a utilizada durante el presente estudio:
3.1. Modelos Metabólicos Estacionarios
3.1.1. Desarrollo Modelo Metabólico Pichia pastoris
El procedimiento utilizado para determinar el conjunto de reacciones presentes en la red

metabólica de Pichia pastoris fue el siguiente:
1. Se realizó una búsqueda bibliográfica acuciosa relativa al metabolismo de levadura y en

particular de Pichia pastoris; enzimas aisladas, enzimas predichas desde su genoma, enzimas
o funciones enzimáticas identificadas a partir de experimentos, etc.
2. Se integró la información metabólica obtenida en una red metabólica que incluyera al menos
las vı́as del metabolismo central del organismo.
3. Se realizaron los supuestos necesarios para completar la red metabólica.
34
3.1.2. Análisis Modelos Metabólicos P. pastoris y S. cerevisiae
Para analizar los modelos metabólicos de Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae

[65] se siguieron los siguientes pasos:
1. Se llevaron las reacciones de los modelos metabólicos al formato SBML.
En esta etapa se tomó como base el SBML del modelo de S. cerevisiae a partir de la
reconstrucción a nivel genómico realizado por Förster, Famili, Fu, Nielsen y Palsson
en el año 2003 [31]. Luego de haber estudiado la reconstrucción y el formato, se proce-
dió a eliminar y agregar reacciones, compartimientos, eventos, condiciones, entre otros
elementos del formato.
2. Se creó un proyecto en C ELL N ETA NALYZER para cada modelo y luego se cargaron los
modelos en SBML en sus proyectos respectivos.
A continuación se indican las dificultades encontradas y los pasos seguidos para superarlas.
En un comienzo no se logró encontrar una solución factible al modelo. Para ello se uti-
lizó la herramienta Basic Topological Properties del Programa C ELL N ETA NALYZER
la cual entrega un reporte en la ventana de M ATLAB indicando la existencia de reaccio-
nes bloqueadas, de metabolitos que se acumulan al interior del sistema o metabolitos
que se utilizan pero no se generan ni ingresan a éste, entre otras propiedades.
Con la información previamente obtenida se identificaron las reacciones problema y se

corrigen, ya sea creando reacciones de transporte de metabolitos o bien transformando
metabolitos de internos a externos, i.e., que su concentración no sea constante.
La etapa en la curación de los modelos que mayor dificultad tenı́a asociada fue la iden-
tificación de errores en reversibilidades de reacciones, lo que puede llevar incluso a la
pérdida de factibilidad del sistema global. Es por esto que se debió revisar en detalle la
reversibilidad de cada reacción en cada modelo.
3. Se ejecutó el método de modos elementales.
35
Al momento de ejecutar el método de cálculo de modos elementales se revisó que no
existiesen reacciones bloqueadas y se ejecutó de modo tal que se respetaran las reversi-
bilidades de las reacciones en el sistema, ya que de no respetarlas el número de modos
elementales aumentarı́a considerablemente y muchos de ellos no serı́an biológicamente
factibles.
4. Se escogieron sustratos y productos finales de interés y se calcularon rendimientos relativos

para los distintos modos elementales y ambos modelos.
Se determinó que biomasa y SOD eran los productos relevantes, y que los sustratos
glucosa, glicerol y metanol serı́an estudiados.
5. Se compararon los resultados obtenidos entre los métodos y las especies.
6. Se analizaron los modelos y resultados y se concluyó al respecto.
7. Se propusieron mejoras al modelo y se sugirieron desafı́os futuros en el tema estudiado.
3.1.3. Modelo Estequiométrico Saccharomyces cerevisiae
Se utilizó el modelo metabólico realizado por Ramón González [36, 35], para S. cere-
visiae expresando Superóxido Dismutasa humana, previa verificación de sus supuestos y algunas
modificaciones que permitieran generalizar el modo tal que tuviera una extensión y complejidad
adecuada para obtener resultados relacionados con las capacidades metabólicas generales de los
organismos en estudio.
Entre las mejoras al modelo se encuentran el haber incluido el metabolito DHAP y más
reacciones que permitieron representar en mayor detalle a la vı́a de degradación de glicerol.
36
3.2. Análisis Modelos Metabólicos Estacionarios
El programa utilizado (C ELL N ETA NALYZER [47]) realiza diversos tipos de análisis de
modelos estequiométricos, entre los que se encuentran Análisis de Modos Elementales, Análisis de
Vı́as Extremas, Análisis de Balances de Flujos, Análisis de Sensibilidad, Análisis de Robustez, etc.
El algoritmo utilizado para calcular Modos Elementales corresponde al desarrollado por

Schuster y Hilgetag en el año 1994, luego por Pfeiffer en el año 1999 y completado por Schuster
en el año 2000. Tal algoritmo también es el utilizado por M ETATOOL [62].1
3.3. Tratamiento Informático del Problema
3.3.1. Codificación de los Modelos Metabólicos en formato SBML
El formato SBML, S YSTEMS B IOLOGY M ARKUP L ANGUAGE, corresponde a un for-

mato de código libre (open source) basado en XML para representar redes de reacciones bioquı́mi-
cas [28].
Fue desarrollado durante el año 2000 por Michael Hucka, Andrew Finney, Herbert Sau-
ro y Hamid Bolouri a petición de Hiroaki Kitano y John C. Doyle con el financiamiento de Japan
Science and Technology Corporation (JST) [40]. Actualmente se encuentra disponible la versión
3 de SBML Nivel 2, la cual se ha obtenido gracias a la colaboración de cientos de personas que
han participado en la revisión y mejora del lenguage [1].
La estructura del lenguage SBML Nivel 2, versión 3, consiste básicamente en una lista
que contiene los siguientes componentes; definición de función, definición de unidad, tipo de com-
partimiento, tipo de especie, compartimiento, especie, parámetro, valor inicial, regla, restricción,
1 Ver Anexos, Capı́tulo C Material Suplementario, Sección C.1 para más detalles.
37
reacción y evento (cambio discontinuo de alguna variable) [1].
Gracias a su versatilidad permite el intercambio de información y modelos entre diver-

sos sistemas de softwares, asegurando que los modelos mantengan su vigencia más allá que los
softwares utilizados en el desarrollo de tales modelos [45, 41].
3.3.2. Representación Gráfica de Resultados: Lenguage GLE
Para representar ambos modelos metabólicos se utilizó el lenguaje gráfico abierto GLE
(G RAPHICS L AYOUT E NGINE) [3], a través del cual es posible producir imágenes de tipo Post-
Script, EPS, PDF, PNG o JPG desde un simple documento de texto.
Se escogió tal lenguaje debido a la alta calidad de las imágenes producidas y a su natural
integración con el procesador de textos LATEX que se utilizó para editar esta memoria.
GLE ha sido desarrollado por los programadores Laurence Abbott, Christoph Brendes,
A. S. Budden, Bryn Jeffries, Vincent LaBella, Jan Struyf y Steve Wilkinson con el patrocinio de
Imagix Corp. [3].
3.3.3. Software C ELL N ETA NALYZER
Se utilizó el software CNA o C ELL N ETA NALYZER (F LUX A NALYZER ) Versión 6.2 para
realizar los análisis de los modelos metabólicos. CNA está programado en M ATLAB bajo el siste-
ma operativo LINUX, con interfaces gráficas para el usuario (GUI).2
Este software fue desarrollado por Steffen Klamt en el grupo de Systems Biology lide-
rado por E. Gilles en Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems [47].
2 Se utilizó el sistema operativo de LINUX Fedora Core 6 en el desarrollo de los modelos estequiométricos y su
análisis posterior.
38
Capı́tulo 4
Resultados y Discusiones
4.1. Modelo Estequiométrico de S. cerevisiae
El modelo estequiométrico (reacciones y esquema) de S. cerevisiae utilizado se basó en

el modelo realizado por Ramón González en el marco de su tesis para optar al grado de Doctor en
Ciencias de la Ingenierı́a, mención Quı́mica de la Facultad de Ciencias Fı́sicas y Matemáticas de
la Universidad de Chile [35]1 .
Una de las modificaciones realizadas a tal modelo corresponde a la incorporación del

metabolito dihidroxiacetona fosfato (DHAP), el cual es un intermediario en la vı́a de asimilación
del glicerol.
La reacción escogida por González para representar el catabolismo de glicerol es la si-

guiente;
GAP + NADH ⇐⇒ GLIC + NAD (4.1)
Se decidió incorporar DHAP a través de las siguientes ecuaciones, para mantener una
mayor similitud con el modelo de Pichia pastoris, y debido a que diversos autores sugieren rele-
vante incluir DHAP dentro de un modelo metabólico de Saccharomyces cerevisiae [42, 21];
1 Las reacciones bioquı́micas y esquema de la red se muestran en el Apéndice, Capı́tulo A, Sección A.1.
39
GAP + DHAP =⇒ FRUC 6P (4.2)
FRUC 6P =⇒ DHAP (4.3)
DHAP ⇐⇒ GAP (4.4)
GLIC + NAD =⇒ DHAP + NADH (4.5)
También se consideró la ecuación alternativa para la reacción ISOCIT – AKG [21, 83];
ISOCIT + NADP =⇒ AKG + NADPH + CO2 (4.6)
Al igual que González, no se consideró el ciclo del glioxilato en presencia de glucosa,

ya que se sabe que este ciclo se encuentra inactivo durante el crecimiento en esa fuente de carbono
[35]. A continuación se muestran las referencias utilizadas por González [35] para construir el
modelo estequiométrico de S. cerevisiae;
Tabla 4.1: Referencias utilizadas en la construcción del modelo estequiométrico de S. cerevisiae.

En negrita se muestran las fuentes bibligráficas nuevas.
Vı́a o Reacciones Referencias

Glicólisis Stryer, 1995; van Gulik y Heijmen, 1995
Ruta de las Pentosas Fosfato Nissen et al., 1997; van Gulik y Heijmen, 1995
Ciclo de los Ácidos Tricarboxı́licos Stryer, 1995; van Gulik y Heijmen, 1995; Walker, 1997 [83]
Reacciones Anapleróticas Stephanopoulos et al., 1998; van Gulik y Heijmen, 1995
Rutas Fermentativas Gancedo y Serrano, 1989; van Gulik y Heijmen, 1995;
Jahic, 2003 [42]
Sı́ntesis de Aminoácidos Stryer, 1995; van Gulik y Heijmen, 1995
Sı́ntesis de Nucleótidos Nissen et al., 1997; Stryer, 1995
Sı́ntesis de Lı́pidos Nissen et al., 1997; Stryer, 1995
Sı́ntesis de Carbohidratos Stryer, 1995; van Gulik y Heijmen, 1995
40
4.2. Modelo Estequiométrico de P. pastoris
Este modelo se construyó tomando como base el modelo de S. cerevisiae desarrollado

por Ramón González [35] y considerando las diferencias en el metabolismo descritas en la litera-
tura. A continuación se presenta una lista de las referencias utilizadas para construir el modelo de
P. pastoris 2 .
Tabla 4.2: Referencias utilizadas en la construcción del modelo estequiométrico de P. pastoris.

La bibliografı́a utilizada por González para las distintas reacciones se encuentran en la Tabla 4.1.
Vı́a o Reacciones Referencias

Glicólisis González, 2001 [35]; Solà 2004 [75]; Walker, 1997 [83]
Ruta de las Pentosas Fosfato González, 2001 [35]; Solà, 2004 [75]; Walker, 1997[83]
Ciclo de los Ácidos Tricarboxı́licos González, 2001 [35]; Solà, 2004 [75]; Walker, 1997 [83]
Reacciones Anapleróticas González, 2001 [35]; Solà 2004 [75];
Rutas Fermentativas González, 2001 [35]; Jahic, 2003; Solà, 2004 [75];
Walker, 1997 [83]
Sı́ntesis de Aminoácidos González, 2001 [35]; Solà, 2004 [75]; Walker, 1997 [83];
Solà y Maaheimo, 2004 [77]
Sı́ntesis de Nucleótidos González, 2001 [35]; Solà, 2004 [75]; Sauer at al., 2004 [68]
Sı́ntesis de Lı́pidos González, 2001 [35]; Solà, 2004 [75]
Sı́ntesis de Carbohidratos González, 2001 [35]; Solà, 2004 [75]
Metabolismo del Metanol Jahic, 2003 [42]; Solà, 2004 [75]; Sauer et al., 2004 [68];
Walker, 1997 [83]; Hartner y Glieder, 2006 [37]
En este modelo no se consideró el ciclo del glioxilato dado que se ha visto en la literatura
la ausencia de las enzimas que realizan tal función y la falta de actividad enzimática necesaria para
acelerar la reacción ISOCIT – MAL [75].
2 Las reacciones del modelo estequiométrico de P. pastoris se muestran en detalle en el Apéndice, Capı́tulo A,
Sección A.2.
41
4.3. Modelo Estequiométrico de P. pastoris
En la Figura 4.1 se muestra un esquema del modelo de Pichia pastoris, donde se distingue
la vı́a del metabolismo del metanol y las similitudes y diferencias con el modelo de S. cerevisiae
(Figura A.1).
4.4. De los Modelos Estequiométricos

Al comparar los modelos estequiométricos de ambas levaduras (Figuras 4.1 y A.1), se
observa que presentan las siguientes diferencias;
1. Reversibilidad de la reacción Succinato – Fumarato en modelo de P. pastoris.
2. Reversibilidad de la reacción Fumarato – Malato en modelo de P. pastoris.
3. Ausencia de reacción anaplerótica PEP – OAC en modelo de P. pastoris.
4. Ausencia de la reacción MAL – PIR en modelo de S. cerevisiae.
5. Presencia de la vı́a de asimilación del metanol únicamente en el modelo de P. pastoris.
4.4.1. Potenciales Mejoras a los Modelos Estequiométricos
Para mejorar la representatividad de los modelos estequiométricos se podrı́an agregar

reacciones de transporte de algunos metabolitos, como oxaloacetato hacia y desde la mitocondria,
extender la red incorporando reacciones no consideradas y considerar a los metabolitos ATP, ADP
NAD, NADP, NADH y NADPH como metabolitos internos.
Para mejorar ambos modelos se podrı́a incorporar regulación génica, lo cual es muy re-
levante dada la existencia del fuerte promotor AOX1 en P. pastoris, ausente en S. cerevisiae.
42
v89
v1
v72-nuRIB5P v80
v18 v74
v70-aaRIB5P v2 v81
v19 v20 v83
vRIB5P
v21 v84 v82

v23
v71-aaRIB5P v85
v79
v3 v4 v87 v86
v22
v88
v31
v70-aaE4P v72-nuG3P
vE4P v5
v73-GAP vG3P v70-aaG3P
v71-aaE4P
v71-aaG3P
v6
vPEP v70-aaPEP
v71-aaPEP
v7
v27 v26 vPIR v70-aaPIR
v73-AcCoA v28 v29

v9 v71-aaPIR
v30 v25
v70-aaAcCoA vAcCoAcit v75
v10 v10
v71-aaAcCoA
v70-aaOAC v O AC
v11
v71-aaOAC v17 v12
v72-nuOAC vAKG v70-aaAKG
v71-aaAKG
v16 v13
v69
v77
v78
v76 v15
v14
43
Figura 4.1: Modelo Metabólico del Metabolismo Central de Pichia pastoris.

4.5. Análisis Modelos Estequiométricos
4.5.1. Propiedades Topológicas Básicas
Tabla 4.3: Propiedades Topológicas Básicas de las Redes Metabólicas de S.cerevisiae y P. pastoris.
Propiedad Modelo S. cerevisiae Modelo P. pastoris

Número de Reacciones 76 84
Número de Metabolitos Internos 60 66
Número de Metabolitos Externos 23 25
Metabolitos de Consumo Glucosa Glucosa
Glicerol Glicerol
Metanol
Reacciones Reversibles 20 22
Rango Matriz Estequiométrica 59 65
Grados de Libertad 18 19
Red comprimida 12 metabolitos 10 metabolitos
30 reacciones 29 reacciones
En la Tabla 4.3 se contrastan las propiedades topológicas de ambos modelos estequiométri-

cos. En ella se pueden apreciar, en relación al número de reacciones, que el modelo de Pichia pas-
toris tiene 8 reacciones extras, las que pertenecen al metabolismo del metanol. A pesar de tener
tales reacciones nuevas y diferir en una reacción anaplerótica, y en reversibilidades de reacciones
del ciclo de los ácidos tricarboxı́licos, se observa que al comprimir la red se logra obtener una
red más reducida que la que se obtiene con el modelo de S. cerevisiae. Es decir, a pesar de tener
más metabolitos y reacciones, éstas reacciones, y aquellas modificadas (quizás las reacciones que
son reversibles sólo en P. pastoris) permiten de alguna manera simplificar la estructura de la red
metabólica.
44
El rango de la matriz estequiométrica, que representa el número mı́nimo de reacciones
necesario para describir cambios en la concentración, también difiere entre ambos modelos. En el
caso de P. pastoris, el rango de su matriz supera en 6 unidades al rango de la matriz estequiométrica
del modelo de S. cerevisiae. Por otro lado, el modelo de P. pastoris tiene un grado de libertad más
que el modelo de S. cerevisiae, es decir, que se requiere una medición de flujo más para definir el
sistema, i.e., para conocer todos los flujos metabólicos en un momento dado.
4.5.2. Conectividad
Figura 4.2: Histograma de Conectividad Modelos Estequiométricos S. cerevisiae y P. pastoris.

(Conectividad: Número de Reacciones en las que un metabolito participa).
En la Figura 4.2 se compara la conectividad de ambos modelos, donde por conectividad

se entiende el número de reacciones en las que un metabolito participa. Se observa que para ambos
modelos la gran mayorı́a de los metabolitos están presentes en menos de 4 reacciones, mientras que
pocos metabolitos (glucosa en particular) tienen una elevada conectividad (i.e., están presentes en
muchas reacciones). En el histograma de conectividad no se consideran algunos de los metabolitos
más conectados por ser metabolitos externos, como lo es el ATP.
45
La diferencia entre las conectividades de ambos modelos se debe a la presencia de las
reacciones del metabolismo del metanol y su interacción con otros metabolitos presentes en ambos
modelos.
4.5.3. Modos Elementales
Tabla 4.4: Cantidad y Distribución de los Modos Elementales del Modelo de S. cerevisiae.
Total Glucosa Glicerol Metanol Etanol SOD Proteı́nas Lı́pidos ARN

429 336 215 — 8 132 132 123 9
100 % 78,3 % 50,1 % — 1,9 % 30,8 % 30,8 % 28,7 % 2,1 %
Tabla 4.5: Cantidad y Distribución de los Modos Elementales del Modelo de P. pastoris.
Total Glucosa Glicerol Metanol Etanol SOD Proteı́nas Lı́pidos ARN

467 413 142 108 8 144 144 131 16
100 % 88,4 % 30,4 % 23,1 % 1,7 % 30,8 % 30,8 % 28,1 % 3,4 %
En las Tablas 4.4 y 4.5 se observa que la glucosa (más precisamente la reacción inicial
de degradación de glucosa) está presente en la gran mayorı́a de los modos elementales (78 % y
88 % para los modelos de S. cerevisiae y P. pastoris respectivamente), lo cual sugiere que ambos
organismos “prefieran” glucosa como fuente de carbono, ya que entre muchas de las distintas mo-
dalidades de crecimiento mı́nimo, el consumo de glucosa está presente. Además, el estar presente
en tantos modos es un signo de robustez de la red, ya que de eliminar un modo al bloquear una
reacción, este sustrato aún podrá ser consumido en alguno de los modos elementales restantes.
46
Los porcentajes de participación de SOD y proteı́nas son idénticos entre sı́ y para ambos
modelos (Figuras 4.4 y 4.5) debido a que requieren la sı́ntesis de casi todos los mismos aminoáci-
dos (SOD está compuesto por todos los aminoácidos proteinogénicos a excepción de metionina y
tirosina), por lo que comparte las vı́as asociadas a la sı́ntesis de aminoácidos.
La diferencia entre los porcentajes de participación de glicerol en los modos de ambas

especies radica en la presencia del sustrato metanol en el modelo de P. pastoris. Con respecto al
etanol se observa el mismo porcentaje de participación en los modos de ambos modelos.
Es importante hacer notar que no todos los modos elementales calculados son factibles,
ya que existen mecanismo de represión y otro tipo de factores no considerados en el modelo, mu-
chos de los cuales no están relacionados con el metabolismo.
Por ejemplo la glucosa y el etanol son represores efectivos del promotor AOX1, impi-
diendo que se metabolice metanol en su presencia. Es por esto, que los modos elementales que
incluyan consumo de metanol y producción de etanol no son factibles. Y los modos elementales
que incluyan consumo de metanol y consumo de glucosa son sólo factibles si la glucosa se está ali-
mentando a medida que se consume sin acumularse en el medio de cultivo. Además, dado que
en P. pastoris la producción de proteı́nas recombinantes está asociada al crecimiento, los modos
elementales en que se produzca SOD y no biomasa, no serı́an viables.
4.5.4. Rendimientos Relativos
En las Tablas 4.6, 4.7 y 4.8 se observa la menor productividad de biomasa y SOD al
crecer en metanol que al crecer en glucosa. A su vez, el glicerol da rendimientos menores que
el metanol, y que los rendimientos máximos Y biomasa , Y biomasa , Y SOD yY SOD coinciden en ambos
glucosa glicerol glucosa glicerol
modelos.
47
Tabla 4.6: Rendimientos Relativos Máximos de Modos Elementales de S. cerevisiae y P. pastoris.
Modelo S. cerevisiae Modelo P. pastoris

P± Y biomasa Y biomasa Y SOD Y SOD Y biomasa Y biomasa Y biomasa Y SOD Y SOD Y SOD
glucosa glicerol glucosa glicerol glucosa glicerol metanol glucosa glicerol metanol
P+ 1,83 0,25 10,99 0,92 1,83 0,25 0,50 10,99 0,92 1,84
P− 2,87 0,61 — — 2,87 0,61 1,23 — — —
P−
P+ 1,57 2,44 — — 1,57 2,44 2,46 — — —
Tabla 4.7: Rendimientos Relativos Máximos de Modos Elementales de S. cerevisiae y P. pastoris.

(Las condiciones representan: B = producción de biomasa, M = consumo de metanol).
Modelo S. cerevisiae Modelo P. pastoris

Condición Y SOD Y SOD Y SOD Y SOD Y SOD
glucosa glicerol glucosa glicerol metanol
B 3,97 0,54 3,97 0,54 1,09

M — — 1,50 0,00 1,84
ByM — — 0,82 0,00 1,09
Tabla 4.8: Rendimientos Relativos Experimentales de las levaduras S. cerevisiae y P. pastoris.
S. cerevisiae [35] P. pastoris [75]

P± Y biomasa Y biomasa Y biomasa Y biomasa Y biomasa
glucosa glicerol glucosa glicerol metanol
P+ 0,75 — 3,59 1,90 0,10

P− 1,12 — — — 0,08
P−
P+ 1,49 — — — 0,80
48
De la Tabla 4.6 se desprende que entre los modos elementales de P. pastoris es posible
obtener el doble de moles de biomasa por mol de metanol que por mol de glicerol.
Los valores expresados en las Tablas 4.6 y 4.7 indican situaciones óptimas (rendimientos
máximos) que son difı́ciles o imposibles de alcanzar y que requieren que toda la célula esté enfo-
cada a producir sólo tal producto. Es decir, en el caso del rendimiento máximo de biomasa versus
glucosa o glicerol, éste se obtiene cuando no se está produciendo SOD, y viceversa. Sin embargo,
de la literatura se sabe la relación entre el crecimiento en biomasa y la producción de proteı́nas
mol
heterólogas, en particular en P. pastoris, por lo que el rendimiento de Y biomasa =10,99 mol es una
glucosa
situación muy lejana a la realidad. Por ello se determinaron los rendimientos relativos máximos de
la célula produciendo tanto SOD como biomasa, mostrados en la Figura 4.7.
Por otro lado, al comparar las Tablas 4.6 y 4.8 se puede observar que la no producción de
SOD por S. cerevisiae bajo las condiciones estudiadas, genera un 49 % de mejora de rendimiento,
y en el caso del modelo, éste indica que al comparar los rendimientos máximos, la no producción
de SOD genera un 57 % de mejora de rendimiento.
En la Tabla 4.7 se observa que la condición de crecimiento (o producción de biomasa)

lleva asociados valores superiores en Y SOD con respecto a las condiciones que consideran consu-
glucosa
mo de metanol. Ello coincide con el hecho que SOD en P. pastoris se exprese de manera asociada
al crecimiento.
El rendimiento Y SOD , por su parte, presenta un máximo en la condición de consumo de

metanol
metanol sin producción de biomasa. Esto coincide con el hecho que la productividad de P. pastoris
al sintetizar proteı́nas heterólogas disminuye notablemente al dejar de producir biomasa.
Se observa además que no existen modos elementales que produzcan SOD a partir de
glicerol cuando está presente metanol (valores nulos para Y SOD bajo condiciones con consumo de
glicerol
metanol) —Ver Tabla 4.7—.
49
De las Tablas 4.6 y 4.8 se observa que el “estrés” que genera la producción de SOD
produce una disminución en los rendimientos relativos, a excepción del rendimiento Y biomasa ex-
metanol
perimental. En el caso del resultado experimental obtenido por Solà en el año 2004, hay un leve
aumento en la productividad biomasa versus metanol al producir SOD en el organismo recombi-
nante. Ello se puede deber a errores en las mediciones, a factores de error asociado a éstos, que
estas mediciones se hayan realizado bajo condiciones ligeramente distintas o a distintos tiempos o
bien que represente en un resultado circunstancial debido a la dinámica celular, ya que en rigor, la
producción de una proteı́na heteróloga genera una disminución de energı́a y metabolitos disponi-
bles para la producción de biomasa.
mol mol
Los rendimientos Y biomasa y Y biomasa experimentales (3,59 mol y 1,90 mol respectivamente)
glucosa glicerol
mol mol
son mayores que los rendimientos máximo teóricos correspondientes (1,83 mol y 0,25 mol respec-
tivamente) para P. pastoris produciendo una proteı́na heteróloga. Esta diferencia podrı́a radicar en
el hecho que los resultados experimentales para P. pastoris corresponden a la producción de la
proteı́na heteróloga lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) y no SOD.3
En relación a los modos elementales que presentan rendimientos máximos biomasa ver-
sus glucosa (Y biomasa ) y SOD versus glucosa Y SOD ), como se puede observar en la Figura 4.3,
glucosa glucosa
ambos modos incluyen el consumo de glicerol. Esto último podrı́a justificarse con el hecho que
el glicerol ingresa directamente a la formación de triosas fosfatos como gliceraldehı́do 3-fosfato
(GAP) y fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP), lo que representa un menor consumo de energı́a
en los pasos de fosforilación de la aldohexosa. Ello ocurre tanto para S. cerevisiae como para P.
pastoris -Figura no mostrada-.
3A la fecha no se han publicado rendimientos correspondientes a P. pastoris produciendo SOD, sino sólo des-
cripciones cualitativas que indican su elevada productividad —a través de la técnica Western Blot— y estudios de
actividad de la enzima.
50
En el caso del modo elemental con máximo rendimiento Y biomasa , éste no incluye la pro-
glucosa
ducción de SOD (ver Figura 4.3(a)), y a su vez, el modo elemental con máximo rendimiento Y SOD
glucosa
no presenta producción de biomasa (Figura 4.3(b)). Ello se debe a que para presentar máximo ren-
dimiento no se deben utilizar moles de sustrato (en este caso glucosa) en producir otro compuesto
o biomasa. En la naturaleza, sin embargo, P. pastoris requiere crecer para poder producir SOD, por
lo que tales modos elementales deben actuar en conjunto para representar el metabolismo de este
organismo en un momento dado.
mol mol
(a) Modo Elemental con Máximo Rendimiento Y biomasa (1, 83 mol ). (b) Modo Elemental con Máximo Rendimiento Y SOD (10, 99 mol ).
glucosa glucosa
Figura 4.3: Modos Elementales con Máximos Rendimientos Y biomasa y Y SOD Modelo S. cerevisiae.
glucosa glucosa
51
v89 v89
v1 v1
v72-nuRIB5P v80 v72-nuRIB5P v80
v18 v74 v18 v74
v70-aaRIB5P v2 v81 v70-aaRIB5P v2 v81
v19 v20 v83 v19 v20 v83
vRIB5P vRIB5P
v21 v84 v82 v21 v84 v82

v23 v23
v71-aaRIB5P v85 v71-aaRIB5P v85
v79 v79
v3 v4 v87 v86 v3 v4 v87 v86
v22 v22
v88 v88
v31 v31
v70-aaE4P v72-nuG3P v70-aaE4P v72-nuG3P
vE4P v5 vE4P v5
v73-GAP vG3P v70-aaG3P v73-GAP vG3P v70-aaG3P
v71-aaE4P v71-aaE4P
v71-aaG3P v71-aaG3P
v6 v6
vPEP v70-aaPEP vPEP v70-aaPEP
v71-aaPEP v71-aaPEP
v7 v7
v27 v26 vPIR v70-aaPIR v27 v26 vPIR v70-aaPIR
v73-AcCoA v28 v29 v73-AcCoA v28 v29

v9 v71-aaPIR v9 v71-aaPIR
v30 v25 v30 v25
v70-aaAcCoA vAcCoAcit v75 v70-aaAcCoA vAcCoAcit v75
v10 v10 v10 v10

v71-aaAcCoA v71-aaAcCoA
v70-aaOAC v O AC v70-aaOAC v O AC
v11 v11
v71-aaOAC v17 v12 v71-aaOAC v17 v12
v72-nuOAC vAKG v70-aaAKG v72-nuOAC vAKG v70-aaAKG
v71-aaAKG v71-aaAKG
v16 v13 v16 v13
v69 v69
v77 v77
v78 v78
v76 v15 v76 v15
v14 v14
mol mol
(a) Modo Elemental con Máximo Rendimiento Y biomasa (1, 23 mol ). (b) Modo Elemental con Máximo Rendimiento Y SOD (1, 84 mol ).
metanol metanol
Figura 4.4: Modos Elementales con Máximos Rendimientos Y biomasa y Y SOD Modelo P. pastoris.
metanol metanol
En la Figura 4.4 se muestran los modos elementales que presentan rendimientos máxi-
mos biomasa versus metanol (Y biomasa ) y SOD versus metanol (Y SOD ). A diferencia de los modos
metanol metanol
mostrados en la Figura 4.3, al comparar las Figuras 4.4(a) con 4.3(a) y 4.4(b) con 4.3(b) se observa
la ausencia de la reacción GLUC 6P – FRUC 6P, lo cual pueda deberse a la presencia de las vı́as
de asimilación del metanol.
52
(a) Y biomasa v/s Modos Elementales Modelo S. cerevisiae. (b) Y SOD v/s Modos Elementales Modelo S. cerevisiae.
glucosa glucosa
(c) Y biomasa v/s Modos Elementales Modelo S. cerevisiae. (d) Y SOD v/s Modos Elementales Modelo S. cerevisiae.
glicerol glicerol
Figura 4.5: Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa y Glicerol Modos S. cerevisiae.
En las Figuras 4.5 y 4.6 se muestran gráficos de biomasa y SOD versus glucosa y gli-
cerol (y metanol en el caso de la Figura 4.6) para los modos elementales (ordenados en manera
creciente) del modelo estequiométrico de S. cerevisiae y P. pastoris respectivamente.
La distribución de los rendimientos Y biomasa , Y biomasa , Y SOD yY SOD es muy similar en

glucosa glicerol glucosa glicerol
ambos modelos. Al comparar las Figuras 4.5(a) con 4.6(a), 4.5(b) con 4.6(b), 4.5(c) con 4.6(c) y
4.5(d) con 4.6(d), se observan patrones muy similares entre los modos elementales de ambas espe-
cies.
53
(a) Y biomasa v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris. (b) Y SOD v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris.
glucosa glucosa
(c) Y biomasa v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris. (d) Y SOD v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris.
glicerol glicerol
(e) Y biomasa v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris. (f) Y SOD v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris.
metanol metanol
54
Figura 4.6: Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa, Glicerol y Metanol Modos P. pastoris.
Esta similitud en los patrones de rendimientos entre ambas especies se debe a que mu-
chos de los modos elementales son idénticos, dado que ambas redes comparten aproximadamente
el 87 % de reacciones (73 de las 84 reacciones del modelo de P. pastoris están presentes en el mo-
delo de S. cerevisiae) y aquellos modos elementales únicos para P. pastoris, e.g., aquellos donde se
consume metanol presentan los mismos rendimientos que otros modos elementales de P. pastoris
y de S. cerevisiae. Esto último se verifica al sobreponer tales gráficos y notar que en los gráficos
asociados a modos elementales de P. pastoris no existen puntos ubicados a “alturas” (rendimientos)
en los que no exista al menos algún modo elemental de S. cerevisiae.
Al comparar las Sub-Figuras 4.5(a) y 4.5(c) se observa que en muchos modos elemen-
tales el rendimiento Y biomasa es mayor que el rendimiento Y biomasa . Esto mismo ocurre en el caso de
glucosa glicerol
SOD (Sub-Figuras 4.5(b) y 4.5(d)) y en el caso de P. pastoris (Sub-Figuras 4.6(a) con 4.6(c) y
4.6(b) con 4.6(d)).
55
Capı́tulo 5
Conclusiones
5.1. De los Resultados
Se logró realizar un modelo metabólico de P. pastoris que incorpora vı́as de asimilación

de la glucosa, glicerol y metanol. El modelo presentado corresponde al modelo metabólico de es-
te organismo más detallado realizado hasta la fecha. El modelo de mayor tamaño conocido para
P. pastoris fue publicado en enero del presente año por Solà [76], pero carece de las ecuaciones
bioquı́micas necesarias para sintetizar proteı́nas, ARN, lı́pidos y etanol, las que se requieren para
realizar estudios de capacidades metabólicas generales. El modelo realizado incorpora además la
sı́ntesis de una proteı́na heteróloga (SOD), lo cual no se habı́a realizado antes para este organismo.
Como los modelos metabólicos son sólo una representación de las capacidades metabóli-
cas reales, y dependen directamente del tamaño de la red y de las condiciones de crecimiento de
los organismos, es recomendable contar con información experimental que valide las capacidades
metabólicas principales indicadas en el modelo y que sugiera reacciones adicionales y relevantes
en éstos. La información experimental encontrada en la literatura permitió observar un cuociente
similar de rendimientos biomasa versus glucosa entre S. cerevisiae recombinante y no recombi-
nante para el modelo teórico y el organismo real.
Al comparar los rendimientos relativos entre ambos organismos se observó que para los
56
sustratos glucosa y glicerol, los modos elementales que arrojaban los rendimientos máximos coin-
cidı́an entre ambos organismos y que para el metanol, entre los modos elementales que lo incluı́an,
el rendimiento relativo máximo era el doble que en el caso del rendimiento de biomasa versus
glicerol.
Debido a lo anterior, se cree que las redes metabólicas contaban con pocas diferencias
para obtener mayores resultados a partir del estudio de sus modos elementales y los rendimientos
relativos asociados.
Ahora bien, en cuanto al metabolismo de metanol, presente en P. pastoris y ausente en

S. cerevisiae, éste está asociado a modos elementales que no presentan mayores rendimientos re-
lativos para hSOD y biomasa, por lo que la eficiencia indicada en la literatura debe estar radicada
en otros factores tales como la regulación génica, y no necesariamente en la estructura de la red
metabólica, o bien son producto de la dinámica y no del estado estacionario.
Serı́a interesante estudiar cuáles modos elementales están activos en determinadas condi-
ciones de cultivo y en distintas etapas de crecimiento. Ello podrı́a realizarse a través de mediciones
de flujos o de estudios de perfiles de expresión génica (“microarrys”) que permitieran filtrar los
modos elementales hasta obtener los más representativos en determinadas condiciones.
5.1.1. De la Productividad de P. pastoris versus S. cerevisiae
El nivel de expresión de proteı́nas recombinantes se ve afectado por una gran variedad

de factores genéticos o ambientales, como el huésped, el promotor, genes foráneos, condiciones
de cultivo (en especial la temperatura), entre muchos otros. El presente estudio sólo abarcó el me-
tabolismo, desde el punto de vista de la estructura de la red estequiométrica. En el caso de casei-
nomacropéptido humano y el antı́geno bullous pemphigoid 230 (BP230) P. pastoris demostró ser
menos productiva que S. cerevisiae, pero son excepciones. La gran mayorı́a de las comparaciones
reportadas indican que P. pastoris presenta mayor productividad al sintetizar proteı́nas heterólogas
que S. cerevisiae. Ello podrı́a deberse a una baja eficiencia intrı́nseca de P. pastoris para producir
57
ciertas proteı́nas recombinantes, que se utilizaron factores de transcripción mejores en algunos ex-
perimentos, o bien que las cepas utilizadas durante los experimentos no fueron óptimas.
Ahora bien, la mayor productividad de P. pastoris al compararla con S. cerevisiae, como

sistemas de expresión de proteı́nas recombinantes, reportada en numerosos casos podrı́a deberse
a muchos factores. Además del metabolismo y su estructura, la mejor productividad podrı́a ser
justificada por diversas razones, entre las que cabe mencionar;
Al ser un organismo preferentemente respiratorio, P. pastoris evita la generación de pro-

ductos no deseados asociados a procesos fermentativos, como el etanol. Esta es una de las
razones por las que puede llegar a crecer a elevadas densidades celulares, lo cual es relevante
al sintetizar proteı́nas cuya expresión va asociada al crecimiento celular, como ocurre en este
organismo.
La vı́a intracelular “respuesta a proteı́nas no plegadas” o UPR (acrónimo de Unfolded Protein

Response), cuya función es eliminar del retı́culo endoplasmático a las proteı́nas mal plega-
das, está regulada de manera distinta en ambos organismos. En P. pastoris se ha observado
que el plegamiento proteico y ensamblaje de heterodı́meros en el retı́culo endoplasmático
son etapas limitantes en la secreción de algunas proteı́nas heterólogas [32]. Los genes rela-
cionados con la respuesta UPR en P. pastoris están regulados diferencialmente a los de S.
cerevisiae [33]. Ello podrı́a influir en el nivel de secreción de las proteı́nas, y con ello en la
productividad como huésped.
5.2. Conclusiones Generales
Se realizó un estudio comparativo de las capacidades metabólicas de Pichia pastoris y

Saccharomyces cerevisiae como sistemas de expresión de la enzima Superóxido Dismutasa huma-
na en base al modelo del metabolismo central de S. cerevisiae realizado por Ramón González.
Se identificaron los elementos de la red estequiométrica de P. pastoris, se completó la red

de S. cerevisiae, se comparó su conectividad, sus propiedades topológicas y se realizó un análisis
58
de modos elementales y un estudio de los rendimientos relativos máximos para los modos elemen-
tales calculados para ambos modelos.
En el caso de P. pastoris, las capacidades metabólicas consideradas son similares a las

de S. cerevisiae, lo cual se observa en los modos elementales, la mayorı́a de los que se pueden ob-
tener en ambos modelos, y en los rendimientos relativos y su distribución en los modos de ambos
modelos.
A través de los modelos se verificó que SOD presenta mayores rendimientos cuando
está asociada al crecimiento en P. pastoris, con glucosa y glicerol como fuente de carbono y que
la producción de SOD genera un estrés metabólico que se traduce en una pérdida de rendimiento
para biomasa versus fuente de carbono.
Los resultados sugieren que una fuente de carbono adicional —metanol— y la mayor
cantidad de modos elementales asociada, que se refleja en mayores posibles combinaciones de
vı́as metabólicas activas da cuenta de la mayor eficiencia mostrada por P. pastoris como productor
de proteı́nas recombinantes o simplemente, que las vı́as o factores que entregan mayor productivi-
dad a P. pastoris no fueron consideradas.
Se logró realizar el modelo metabólico de mayor extensión conocido hasta la fecha para
Pichia pastoris, abriendo camino para que futuros investigadores realicen mayores análisis y des-
arrollos al modelo. Con respecto a la hipótesis de trabajo no fue posible rechazarla ni confirmarla,
por lo que se deberán realizar mayores estudios al respecto. Cabe señalar que el estudio del me-
tabolismo de organismos es una tarea compleja y que requiere tomar en consideración no sólo la
estructura de la red metabólica, sino también la regulación génica, consideraciones termodinámi-
cas, mecanismos de utilización de energı́a, modulación enzimática, entre muchos otros factores.
Se concluye entonces que el trabajo realizado permitió el desarrollo de modelos me-

tabólicos que hicieron posible corroborar resultados empı́ricos y que son la base para continuar
con la búsqueda en el metabolismo de diferencias en la productividad de ambas levaduras.
59
5.3. Aporte al Campo o a la Disciplina
Entre los aportes al campo o disciplina es posible señalar el haber realizado el modelo
estequiométrico de Pichia pastoris de mayor extensión conocido hasta la fecha, y que incluye al
metabolismo central, la sı́ntesis de aminoácidos, el ciclo de los ácidos tricarboxı́licos, la vı́a de las
pentosas fosfatos y el metabolismo del metanol, principalmente.
Este modelo permitió verificar caracterı́sticas metabólicas de este organismo previamen-

te descritas en la literatura.
Además, este corresponde al primer estudio comparativo entre ambas especies a partir
de los modos elementales de sus modelos estequiométricos, entregando mayores antecedentes a la
comparación de ambas especies, en particular en sus capacidades metabólicas.
Como desafı́o futuro se sugiere completar el modelo estequiométrico de P. pastoris hasta

lograr una mejor representación de su metabolismo, agregar restricciones de regulación génica y
de incluir más tipos de levaduras en el estudio.
Una vez hecho público el genoma de P. pastoris será de gran interés obtener un modelo
estacionario a partir de la anotación automática, posterior curación manual y asignación de vı́as
metabólicas con softwares especializados (Pathways por ejemplo). Este modelo podrá ser com-
parado con el modelo presentado en esta memoria y estudiar la validez de las vı́as por medio de
estudios de expresión génica (arrays) y de regulación.
Este último punto es de especial interés debido al fuerte promotor AOX1, el cual se men-
cionó como ventaja al comparar S. cerevisiae de P. pastoris en su función de huéspedes.
60
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68
Apéndice A
Modelos Metabólicos
A.1. Modelo Estequiométrico de Saccharomyces cerevisiae

El Modelo Estequiométrico de Saccharomyces cerevisiae mostrado a continuación fue
desarrollado por el Dr. González y modificado por la autora de la presente memoria [35].
A.1.1. Vı́as Metabólicas del Modelo de Saccharomyces cerevisiae
Glicólisis y Gluconeogénesis
(GLUC::G6P) GLUC + ATP =⇒ GLUC 6P + ADP (A.1)
(G6P::F6P) GLUC 6P ⇐⇒ FRUC 6P (A.2)
(F6P::GAP) FRUC 6P + ATP =⇒ 2GAP + ADP (A.3)
(GAP::F6P) GAP + DHAP =⇒ FRUC 6P (A.4)
(F6P::DHAP) FRUC 6P =⇒ DHAP (A.5)
(DHAP::GAP) DHAP ⇐⇒ GAP (A.6)
(GAP::G3P) GAP + NAD + ADP ⇐⇒ G3P + ATP + NADH (A.7)
(PEP::PYR) PEP + ADP =⇒ PIR + ATP (A.8)
(OxA::PEP) OAC + ATP =⇒ PEP + ADP + CO2 (A.9)
69
Ciclo de Ácidos Tricarboxı́licos
(Pyr::AcCoAmit) PIR + NAD =⇒ AcCoAmit + NADH + CO2 (A.10)
(AcCoAmit::ICit) AcCoAmit + OAC =⇒ ISOCIT + CoA (A.11)
(ICit::alKG) ISOCIT + NAD =⇒ AKG + NADH + CO2 (A.12)
(ICit::alKGb) ISOCIT + NADP =⇒ AKG + NADPH + CO2 (A.13)
(alKG::SuccCoA) AKG + CoA + NAD =⇒ SUCCoA + NADH + CO2 (A.14)
(SuccCoA::Succ) SUCCoA + ADP =⇒ SUC + ATP + CoA (A.15)
(Succ::Fum) SUC + FAD =⇒ FUM + FADH2 (A.16)
(Fum::Mal) FUM + H2 O =⇒ MAL (A.17)
(Mal::OxA) MAL + NAD =⇒ OAC + NADH (A.18)
Vı́a de las Pentosas Fosfato
(G6P::RI5P) GLUC 6P + 2NADP =⇒ RIBU 5P + 2NADPH + CO2 (A.19)
(RI5P::R5P) RIBU 5P ⇐⇒ RIB 5P (A.20)
(RI5P::X5P) RIBU 5P ⇐⇒ XIL 5P (A.21)
(S7P::F6P) SED 7P + GAP ⇐⇒ FRUC 6P + E4P (A.22)
(X5P::F6P) XIL 5P + E4P ⇐⇒ FRUC 6P + GAP (A.23)
Reacciones Anapleróticas
Ciclo del Glioxilato
(ICit::Succ) ISOCIT =⇒ SUC + GLX (A.24)
(AcCoAmit::Mal) AcCoAmit + GLX =⇒ MAL (A.25)
(Mal::Pyr) MAL =⇒ PIR + CO2 + NADPH (A.26)
(Mal::Pyr) MAL =⇒ PIR + CO2 + NADH (A.27)
Carboxilación de piruvato, enzima piruvato quinasa
(Pyr::OxA) PIR + ATP + CO2 =⇒ OAC + ADP (A.28)
70
Sı́ntesis de AcCoA en el citoplasma, enzimas citrato liasa y malato deshidrogenasa
(Cit::AcCoAcit) CIT + CoA + NADH + NADP + ATP =⇒ AcCoAcit + 2NADPH + CO2 (A.29)
Vı́as Fermentativas
(Pyr::Adh) PIR =⇒ ACET + CO2 (A.30)
(Adh::Eth) ACET + NADH ⇐⇒ ETOH + NAD (A.31)
(Adh::Ac) ACET + NAD ⇐⇒ AC + NADH (A.32)
(Ac::AcCoAcit) AC + 2ATP + CoA =⇒ AcCoAcit + 2ADP (A.33)
(DHAP::GAP) GAP ⇐⇒ DHAP (A.34)
(Glyc::DHAP) GLIC + NAD =⇒ DHAP + NADH (A.35)
(A.36)
Fosforilación Oxidativa: P/O=1.09
(Razón P/O: Estequiometrı́a de la fosforilación oxidativa.)
(NADH::POADP) 2NADH + O2 + 2PO ADP =⇒ 2NAD + 2PO ATP (A.37)
(FADH2::POATP) 2FADH2 + O2 + 2PO ADP =⇒ 2FAD + 2PO ATP (A.38)
Transporte Intracelular
(AcCoAmit Synth) AcCoAcit =⇒ AcCoAmit (A.39)
71
Sı́ntesis de Aminoácidos
(Glu synth) AKG + NH4 + NADPH ⇐⇒ GLUT + NADP (A.40)
(Gln Synth) GLUT + NH4 + ATP =⇒ GLUM + ADP (A.41)
(Pro Synth) GLUT + ATP + 2NADPH =⇒ PRO + ADP + 2NADP (A.42)
(CARP Synth) NH4 + ATP + CO2 =⇒ CARP + ADP (A.43)
(Arg Synth) 2GLUT + AcCoAcit + 4ATP+ =⇒ ARG + CoA + AKG + AC + (A.44)
NADPH + CARP + ASP 4ADP + FUM + NADP
(Lys Synth) 2GLUT + AcCoAcit + 3ATP+ =⇒ LIS + CoA + AKG + CO2 + (A.45)
2NADPH + 2NAD 3ADP + 2NADP + 2NADH
(Ser Synth) G3P + GLUT + NAD =⇒ SER + AKG + NADH (A.46)
(Gly Synth) SER + THF ⇐⇒ GLI + METHF (A.47)
(Cys Synth) SER + AcCoAcit + 4NADPH+ =⇒ CIS + AC + CoA + 4NADP + (A.48)
ATP 4ADP
(Asp synth) OAC + GLUT ⇐⇒ ASP + AKG (A.49)
(Asn Synth 1) ASP + NH4 + 2ATP =⇒ ASN + 2ADP (A.50)
(HSer Synth) ASP + ATP + 2NADPH =⇒ HOM + ADP + 2NADP (A.51)
(Thr Synth) HOM + ATP =⇒ THR + ADP (A.52)
(Met Synth) HOM + SUCCoA + CIS+ =⇒ MET + CoA + SUC + PIR + (A.53)
MYTHF + ATP NH4 + ADP + THF
(Ile Synth) THR + PIR + NADPH + GLUT =⇒ ILEU + NH4 + NADP + (A.54)
CO2 + AKG
(Ala Synth) PIR + GLUT ⇐⇒ ALA + AKG (A.55)
(AKI Synth) 2PIR + NADPH =⇒ AKI + NADP + CO2 (A.56)
(Val Synth) AKI + GLUT ⇐⇒ VAL + AKG (A.57)
(Leu Synth) AKI + AcCoAcit + GLUT+ =⇒ LEU + AKG + CoA + (A.58)
NAD + ATP CO2 + NADH + ADP
(Chor Synth) PEP + E4P + NADPH + ATP =⇒ CHO + ADP + NADP (A.59)
72
(Phe Synth) CHO + GLUT =⇒ PHEN + AKG + CO2 (A.60)
(Tyr Synth) CHO + GLUT + NAD =⇒ TIR + AKG + CO2 (A.61)
(Trp Synth) CHO + GLUT + PRPP + SER =⇒ TRIP + CO2 + GAP + GLUT + PIR (A.62)
(PRPP Synth) RIB 5P + 2ATP =⇒ PRPP + 2ADP (A.63)
(His Synth) PRPP + 3ATP + NH4 + GLUM+ =⇒ HIS + 3ADP + 2NADH + (A.64)
NAD + 2NADPH + CO2 NADP + AKG
Sı́ntesis de Nucleótidos
(IMP Synth) PRPP + 2GLUM + GLI + ADP+ =⇒ IMP + 4ADP + 2GLUT + (A.65)
ASP + 2FTHF + CO2 2THF + FUM
(AMP Synth) IMP + ASP + ATP =⇒ AMP + ADP + FUM (A.66)
(GMP Synth) IMP + NAD + 2ATP + GLUM =⇒ GMP + 2ADP + GLUT + NADH (A.67)
(UMP Synth) GLUM + PRPPP + 2ATP + ASP + NAD =⇒ UMP + 2ADP + GLUT + NADH (A.68)
(UTP Synth) UMP + 2ATP ⇐⇒ UTP + 2ADP (A.69)
(CTP Synth) UTP + GLUM + ATP =⇒ CTP + ADP + GLUT (A.70)
(CMP Synth) CTP + 2ADP ⇐⇒ CMP + 2ATP (A.71)
Sı́ntesis de Compuestos de 1-carbono
(FTHF Synth) THF + NADH + ATP + CO2 ⇐⇒ FTHF + NAD + ADP (A.72)
(MYTHF Synth) THF + 3NADH + CO2 ⇐⇒ MYTHF + 3NAD (A.73)
(METHF Synth) THF + 2NADH + CO2 ⇐⇒ METHF + 2NAD (A.74)
Consumo de ATP para Transporte y Mantención
(ADP Synth) ATP =⇒ ADP (A.75)
73
mol ATP
Sı́ntesis de Proteı́nas no Recombinantes: 3.2 mol aminoácido de proteı́na
(PROTSynth) 0,1246ALA + 0,0437ARG + 0,0277ASN + 0,0806ASP + 0,0091CYS +
0,0285GLUM + 0,082GLUT + 0,0787GLY + 0,0179HIS + 0,0524ILEU +
0,0802LEU + 0,0776LYS + 0,0138MET + 0,0364PHEN + 0,0448PRO +
0,0502SER + 0,0518THR + 0,0076TRYP + 0,0277TYR + 0,0719VAL + 3,2ATP =⇒ PROT (A.76)
mol ATP
Sı́ntesis de Proteı́nas Recombinantes (Superóxido Dismutasa humana): 4.3 mol aminoácido de proteı́na
(SODSynth) 0,065ALA + 0,026ARG + 0,046ASN + 0,072ASP + 0,026CYS + 0,02GLUM +
0,065GLUT + 0,163GLY + 0,052HIS + 0,059ILEU + 0,059LEU + 0,072LYS +
0,026PHEN + 0,033PRO + 0,065SER + 0,052THR + 0,0065TRYP + 0,092VAL + 4,3ATP =⇒ SOD (A.77)
mol ATP
Sı́ntesis de ARN: 2.4 mol nucleótido de ARN
(RNASynth) 0,233AMP + 0,233GMP + 0,306UMP + 0,2283CMP + 2,4ATP =⇒ ARN (A.78)
Sı́ntesis de Lı́pidos
(LipSynth) 21,6AcCoAcit + 0,404GAP + 27,2NADPH+
1,02O2 + 1,02NADH + 0,278SER =⇒ LIP + 3,48CO2 (A.79)
mol ATP
Sı́ntesis de Carbohidratos: Poliglucosa (1 mol GLUC 6P de CARB )
(CARBSynth) GLUC 6P + ATP =⇒ CARB (A.80)
74
75
Figura A.1: Modelo Metabólico del Metabolismo Central de Saccharomyces cerevisiae

A.2. Modelo Estequiométrico de Pichia pastoris
El Modelo Estequiométrico de Pichia pastoris mostrado a continuación se basó en el
modelo de S. cerevisiae desarrollado por el Dr. González [35] [37] [76] [42].
A.2.1. Vı́as Metabólicas del Modelo de Pichia pastoris
Glicólisis y Gluconeogénesis
(GLUC::G6P) GLUC + ATP =⇒ GLUC 6P + ADP (A.81)
(G6P::F6P) GLUC 6P ⇐⇒ FRUC 6P (A.82)
(F6P::GAP) FRUC 6P + ATP =⇒ 2GAP + ADP (A.83)
(GAP::F6P) 2GAP =⇒ FRUC 6P (A.84)
(F6P::DHAP) FRUC 6P =⇒ DHAP (A.85)
(DHAP::GAP) DHAP ⇐⇒ GAP (A.86)
(GAP::G3P) GAP + NAD + ADP ⇐⇒ G3P + ATP + NADH (A.87)
(PEP::PYR) PEP + ADP =⇒ PIR + ATP (A.88)
(Mal::Pyr) MAL =⇒ PIR (A.89)
Ciclo de Ácidos Tricarboxı́licos
(Pyr::AcCoAmit) PIR + NAD =⇒ AcCoAmit + NADH + CO2 (A.90)
(AcCoAmit::ICit) AcCoAmit + OAC =⇒ ISOCIT + CoA (A.91)
(ICit::alKG) ISOCIT + NAD =⇒ AKG + NADH + CO2 (A.92)
(ICit::alKGb) ISOCIT + NADP =⇒ AKG + NADPH + CO2 (A.93)
(alKG::SuccCoA) AKG + CoA + NAD =⇒ SUCCoA + NADH + CO2 (A.94)
(SuccCoA::Succ) SUCCoA + ADP =⇒ SUC + ATP + CoA (A.95)
(Succ::Fum) SUC + FAD ⇐⇒ FUM + FADH2 (A.96)
(Fum::Mal) FUM + H2 O ⇐⇒ MAL (A.97)
(Mal::OxA) MAL + NAD =⇒ OAC + NADH (A.98)
76
Vı́a de las Pentosas Fosfato
(G6P::RI5P) GLUC 6P + 2NADP =⇒ RIBU 5P + 2NADPH + CO2 (A.99)
(RI5P::R5P) RIBU 5P ⇐⇒ RIB 5P (A.100)
(RI5P::X5P) RIBU 5P ⇐⇒ XIL 5P (A.101)
(S7P::F6P) SED 7P + GAP ⇐⇒ FRUC 6P + E4P (A.102)
(X5P::F6P) XIL 5P + E4P ⇐⇒ FRUC 6P + GAP (A.103)
Metabolismo de Metanol
(METANOL::FORMper) METANOL + O2 =⇒ FORMper + H2 O2 (A.104)
(FORMper::FORM) FORMper =⇒ FORM (A.105)
1 1
(FORM::FORMOH) FORM + O2 + H2 O =⇒ FORMOH (A.106)
4 2
(FORMOH::CO2) FORMOH + 2NAD =⇒ CO2 + 2NADH (A.107)
(FORMper::DHAper) FORMper + XIL 5P =⇒ DHAper + GAPper (A.108)
(GAPper::GAP) GAPper =⇒ GAP (A.109)
(DHAper::DHA) DHAper =⇒ DHA (A.110)
(DHA::DHAP) DHA + ATP =⇒ DHAP + ADP (A.111)
Reacciones Anapleróticas
Carboxilación de piruvato, enzima piruvato quinasa
(Pyr::OxA) PIR + ATP + CO2 =⇒ OAC + ADP (A.112)
Sı́ntesis de AcCoA en el citoplasma, enzimas citrato liasa y malato deshidrogenasa
(Cit::AcCoAcit) CIT + CoA + NADH + NADP + ATP =⇒ AcCoAcit + 2NADPH + CO2(A.113)
77
Vı́as Fermentativas
(Pyr::Adh) PIR =⇒ ACET + CO2 (A.114)
(Adh::Eth) ACET + NADH ⇐⇒ ETOH + NAD (A.115)
(Adh::Ac) ACET + NAD ⇐⇒ AC + NADH (A.116)
(Ac::AcCoAcit) AC + 2ATP + CoA =⇒ AcCoAcit + 2ADP (A.117)
(DHAP::GAP) GAP ⇐⇒ DHAP (A.118)
(Glyc::DHAP) GLIC + NAD =⇒ DHAP + NADH (A.119)
(A.120)
Fosforilación Oxidativa: P/O=1.09
(Razón P/O: Estequiometrı́a de la fosforilación oxidativa.)
(NADH::POADP) 2NADH + O2 + 2PO ADP =⇒ 2NAD + 2PO ATP (A.121)
(FADH2::POATP) 2FADH2 + O2 + 2PO ADP =⇒ 2FAD + 2PO ATP (A.122)
Sı́ntesis de Aminoácidos
(Glu synth) AKG + NH4 + NADPH ⇐⇒ GLUT + NADP (A.123)
(Gln Synth) GLUT + NH4 + ATP =⇒ GLUM + ADP (A.124)
(Pro Synth) GLUT + ATP + 2NADPH =⇒ PRO + ADP + 2NADP (A.125)
(CARP Synth) NH4 + ATP + CO2 =⇒ CARP + ADP (A.126)
(Arg Synth) 2GLUT + AcCoAcit + 4ATP+ =⇒ ARG + CoA + AKG + AC + (A.127)
NADPH + CARP + ASP 4ADP + FUM + NADP
(Lys Synth) 2GLUT + AcCoAcit + 3ATP+ =⇒ LIS + CoA + AKG + CO2 + (A.128)
2NADPH + 2NAD 3ADP + 2NADP + 2NADH
(Ser Synth) G3P + GLUT + NAD =⇒ SER + AKG + NADH (A.129)
78
(Gly Synth) SER + THF ⇐⇒ GLI + METHF (A.130)
(Cys Synth) SER + AcCoAcit + 4NADPH+ =⇒ CIS + AC + CoA + 4NADP + (A.131)
ATP 4ADP
(Asp synth) OAC + GLUT ⇐⇒ ASP + AKG (A.132)
(Asn Synth 1) ASP + NH4 + 2ATP =⇒ ASN + 2ADP (A.133)
(HSer Synth) ASP + ATP + 2NADPH =⇒ HOM + ADP + 2NADP (A.134)
(Thr Synth) HOM + ATP =⇒ THR + ADP (A.135)
(Met Synth) HOM + SUCCoA + CIS+ =⇒ MET + CoA + SUC + PIR + (A.136)
MYTHF + ATP NH4 + ADP + THF
(Ile Synth) THR + PIR + NADPH + GLUT =⇒ ILEU + NH4 + NADP + (A.137)
CO2 + AKG
(Ala Synth) PIR + GLUT ⇐⇒ ALA + AKG (A.138)
(AKI Synth) 2PIR + NADPH =⇒ AKI + NADP + CO2 (A.139)
(Val Synth) AKI + GLUT ⇐⇒ VAL + AKG (A.140)
(Leu Synth) AKI + AcCoAcit + GLUT+ =⇒ LEU + AKG + CoA + (A.141)
NAD + ATP CO2 + NADH + ADP
(Chor Synth) PEP + E4P + NADPH + ATP =⇒ CHO + ADP + NADP (A.142)
(Phe Synth) CHO + GLUT =⇒ PHEN + AKG + CO2 (A.143)
(Tyr Synth) CHO + GLUT + NAD =⇒ TIR + AKG + CO2 (A.144)
(Trp Synth) CHO + GLUT + PRPP + SER =⇒ TRIP + CO2 + GAP + GLUT + PIR (A.145)
(PRPP Synth) RIB 5P + 2ATP =⇒ PRPP + 2ADP (A.146)
(His Synth) PRPP + 3ATP + NH4 + GLUM+ =⇒ HIS + 3ADP + 2NADH + (A.147)
NAD + 2NADPH + CO2 NADP + AKG
79
Sı́ntesis de Nucleótidos
(IMP Synth) PRPP + 2GLUM + GLI + ADP+ =⇒ IMP + 4ADP + 2GLUT + (A.148)
ASP + 2FTHF + CO2 2THF + FUM
(AMP Synth) IMP + ASP + ATP =⇒ AMP + ADP + FUM (A.149)
(GMP Synth) IMP + NAD + 2ATP + GLUM =⇒ GMP + 2ADP + GLUT + NADH (A.150)
(UMP Synth) GLUM + PRPPP + 2ATP + ASP + NAD =⇒ UMP + 2ADP + GLUT + NADH (A.151)
(UTP Synth) UMP + 2ATP ⇐⇒ UTP + 2ADP (A.152)
(CTP Synth) UTP + GLUM + ATP =⇒ CTP + ADP + GLUT (A.153)
(CMP Synth) CTP + 2ADP ⇐⇒ CMP + 2ATP (A.154)
Sı́ntesis de Compuestos de 1-carbono
(FTHF Synth) THF + NADH + ATP + CO2 ⇐⇒ FTHF + NAD + ADP (A.155)
(MYTHF Synth) THF + 3NADH + CO2 ⇐⇒ MYTHF + 3NAD (A.156)
(METHF Synth) THF + 2NADH + CO2 ⇐⇒ METHF + 2NAD (A.157)
Consumo de ATP para Transporte y Mantención
(ADP Synth) ATP =⇒ ADP (A.158)
mol ATP
Sı́ntesis de Proteı́nas no Recombinantes: 3.2 mol aminoácido de proteı́na
(PROTSynth) 0,1246ALA + 0,0437ARG + 0,0277ASN + 0,0806ASP + 0,0091CYS +
0,0285GLUM + 0,082GLUT + 0,0787GLY + 0,0179HIS + 0,0524ILEU +
0,0802LEU + 0,0776LYS + 0,0138MET + 0,0364PHEN + 0,0448PRO +
0,0502SER + 0,0518THR + 0,0076TRYP + 0,0277TYR + 0,0719VAL + 3,2ATP =⇒ PROT (A.159)
80
mol ATP
Sı́ntesis de Proteı́nas Recombinantes (Superóxido Dismutasa humana): 4.3 mol aminoácido de proteı́na
(SODSynth) 0,065ALA + 0,026ARG + 0,046ASN + 0,072ASP + 0,026CYS + 0,02GLUM +
0,065GLUT + 0,163GLY + 0,052HIS + 0,059ILEU + 0,059LEU + 0,072LYS +
0,026PHEN + 0,033PRO + 0,065SER + 0,052THR + 0,0065TRYP + 0,092VAL + 4,3ATP =⇒ SOD(A.160)
mol ATP
Sı́ntesis de ARN: 2.4 mol nucleótido de ARN
(RNASynth) 0,233AMP + 0,233GMP + 0,306UMP + 0,2283CMP + 2,4ATP =⇒ ARN (A.161)
Sı́ntesis de Lı́pidos
(LipSynth) 21,6AcCoAcit + 0,404GAP + 27,2NADPH+
1,02O2 + 1,02NADH + 0,278SER =⇒ LIP + 3,48CO2 (A.162)
mol ATP
Sı́ntesis de Carbohidratos: Poliglucosa (1 mol GLUC 6P de CARB )
(CARBSynth) GLUC 6P + ATP =⇒ CARB (A.163)
Transporte Intracelular
(AcCoAmit Synth) AcCoAcit =⇒ AcCoAmit (A.164)
81
Apéndice B
Nomenclatura y Abreviaciones
B.1. General
0
YX/S = gramos de producto/litro
gramos de sustrato/litro donde sustrato = {glucosa, glicerol, metanol} y producto = {biomasa, SOD}
moles de producto
YX/S = moles de sustrato
P+ = Organismo produciendo proteı́na heteróloga
P− = Organismo no produciendo proteı́na heteróloga
B.2. Metabolitos
1. aa Aminoácidos 13. ASP Aspartato

2. AC Acetato 14. ATP Adenosina-5’-trifosfato
3. AcCoAcit Acetil coenzima A 15. CARB Carbohidratos
citoplasmática 16. CARP Carbamil fosfato
4. AcCoAmit Acetil coenzima A 17. CHO Corismato
mitocondrial 18. CMP Citidina-5’-monofosfato
5. ACET Acetaldehı́do 19. CO2 Diódido carbono intracelular
6. ADP Adenosina-5’-difosfato 20. COE2 Dióxido carbono extracelular
7. AKG α-cetoglutarato 21. CoA Coenzima A
8. AKI α-cetoisovalerato 22. CTP Citidina-5’-trifosfato
9. ALA Alanina 23. CYS Cisteı́na
10. AMP Adenosina-5’-monofosfato 24. DHA Glicerona
11. ARG Arginina 25. DHAper Glicerona peroxisomal
12. ASN Asparagina 26. DHAP Dihidroxiacetona fosfato
82
27. E4P Eritrosa-4-fosfato
61. NADH Nicotinamida adenin
28. ETOH Etanol
dinucleótido reducida
29. FAD Flavin adenin dinucleótido
62. NADP Nicotinamida adenin
30. FADH2 Flavin adenin dinucleótido
dinucleótido fosfato
reducido
63. NADPH Nicotinamida adenin
31. FORM Formato
dinucleótido fosfato reducida
32. FORMper Formato peroxisomal E
64. NH4 Amonio intracelular
33. FORMOH Hidróxido de formato
65. NH4 Amonio extracelular
34. FTHF Formil-tetrahidrofolato
66. nu Nucleótidos
35. FRUC 6P Fructosa-6-fosfato
67. O2 Oxı́geno intracelular
36. FUM Fumarato E
68. O2 Oxı́geno extracelular
37. G3P 3-Fosfoglicerato
69. OAC Oxaloacetato
38. GAP Gliceraldehı́do-3-fosfato
70. PEP Fosfoenolpiruvato
39. GAPper Gliceraldehı́do-3-fosfato
71. PHEN Fenilalanina
peroxisomal
72. PRO Prolina
40. GLUC 6P Glucosa-6-fosfato
73. PROT Proteı́na no recombinante
41. GLUC Glucosa
74. PRPP 5-fosforibosil-1-pirofosfato
42. GLUM Glutamina
75. PIR Piruvato
43. GLUT Glutamato
76. RIB 5P Ribosa-5-fosfato
44. GLY Glicina
77. RIBU 5P Ribulosa-5-fosfato
45. GLIC Glicerol
78. ARN Ácido ribonucleico
46. GMP Guanosina-5’-monofosfato
79. SOD Proteı́na recombinante
47. HIS Histidina
Superóxido Dismutasa
48. HOM Homoserina
humana
49. ILEU Isoleucina
80. SED 7P Sedoheptulosa-7-fosfato
50. IMP Inosinae-5’-monofosfato
81. SER Serina
51. ISOCIT Isocitrato
82. SUC Succinato
52. LEU Leucina
83. SUCCoA Succinil coenzima A
53. LIPID Lı́pidos
84. THF Tetrahidrofolato
54. LYS Lisina
85. THR Treonina
55. MAL Malato
86. TRYP Triptófano
56. MET Metionina
87. TYR Tirosina
57. METANOL Metanol
88. UMP Uridina-5’-monofosfato
58. METHF Metilen tetrahidrofolato
89. UTP Uridina-5’-trifosfato
59. MYTHF Metil tetrahidrofolato
90. VAL Valina
60. NAD Nicotinamida adenin
91. XIL 5P Xilulosa-5-fosfato
dinucleótido
83
B.3. Flujos
v1 Velocidad de consumo de GLUCOSA para la sı́ntesis de GLUC 6P.

v2 Velocidad de consumo de GLUC 6P para la sı́ntesis de FRUC 6P.
v3 Velocidad de consumo de FRUC 6P para la sı́ntesis de GAP.
v4 Velocidad de consumo de GAP y DHAP para la sı́ntesis de FRUC 6P.
v5 Velocidad de interconversión entre GAP y 3PG.
v6 Velocidad de interconversión entre 3PG y PEP.
v7 Velocidad de consumo de PEP para la sı́ntesis de PIR.
v8 Velocidad de consumo de OAC para la sı́ntesis de PEP.
v9 Velocidad de consumo de PIR para la sı́ntesis de AcCoAmit .
v10 Velocidad de consumo de AcCoAmit y OAC para la sı́ntesis de ISOCIT.
v11 Velocidad de consumo de ICOCIT para la sı́ntesis de AKG y NADH.
v12 Velocidad de consumo de ISOCIT para la sı́ntesis de AKG y NADPH.
v13 Velocidad de consumo de AKG para la sı́ntesis de SUCCoA.
v14 Velocidad de consumo de SUCCoA para la sı́ntesis de SUC.
v15 Velocidad de consumo de SUC para la sı́ntesis de FUM.
v16 Velocidad de consumo de FUM para la sı́ntesis de MAL.
v17 Velocidad de consumo de MAL para la sı́ntesis de OAC.
v18 Velocidad de consumo de GLUC 6P para la sı́ntesis de RIBU 5P.
v19 Velocidad de consumo de RIBU 5P para la sı́ntesis de RIB 5P.
v20 Velocidad de consumo de RIBU 5P para la sı́ntesis de XIL 5P.
v21 Velocidad de consumo de RIB 5P y XIL 5P para la sı́ntesis de SED 7P y GAP.
v22 Velocidad de consumo de GAP y SED 7P para la sı́ntesis de E4P y FRUC 6P.
v23 Velocidad de consumo de GAP y XIL 5P para la sı́ntesis de FRUC 6P y GAP.
v24 Velocidad de consumo de ISOCIT y AcCoAcit para la sı́ntesis de MAL.
v25 Velocidad de consumo de PIR para la sı́ntesis de OAC.
v26 Velocidad de consumo de PIR para la sı́ntesis de ACET.
v27 Velocidad de consumo de ACET para la sı́ntesis de ETOH.
84
v28 Velocidad de consumo de ACET para la sı́ntesis de AC.
v29 Velocidad de consumo de MAL para la sı́ntesis de PIR.
v30 Velocidad de consumo de AC para la sı́ntesis de AcCoAcit .
v31 Velocidad de interconversión entre DHAP y GAP.
v69 Velocidad de consumo de ATP para la sı́ntesis de ADP.
v70 Velocidad de sı́ntesis de PROT.
v71 Velocidad de sı́ntesis de SOD.
v72 Velocidad de sı́ntesis de ARN.
v73 Velocidad de sı́ntesis de LIP.
v74 Velocidad de consumo de GLUC 6P para la sı́ntesis de CARB.
v75 Velocidad de interconversión entre AcCoAmit y AcCoAcit .
v76 Velocidad de transporte de CO2 hacia el exterior (COE2 ).
v77 Velocidad de transporte de O2 desde el exterior (OE2 ).
v78 Velocidad de transporte de NH4 desde el exterior (NHE4 ).
v79 Velocidad de consumo de FRUC 6P para la sı́ntesis de DHAP.
v80 Velocidad de transporte de FORM hacia el exterior del peroxisoma.
v81 Velocidad de consumo de FORM para la sı́ntesis de FORMOH.
v82 Velocidad de consumo de FORMOH para la sı́ntesis de CO2 .
v83 Velocidad de consumo de XIL 5P para la sı́ntesis de DHAper y GAPper .
v84 Velocidad de sı́ntesis de DHAper y GAPper .
v85 Velocidad de transporte de DHA hacia el exterior del peroxisoma.
v86 Velocidad de transporte de GAP hacia el exterior del peroxisoma.
v87 Velocidad de consumo de DHA para la sı́ntesis de DHAP.
v88 Velocidad de consumo de GLIC para la sı́ntesis de DHAP.
v89 Velocidad de consumo de METANOL para la sı́ntesis de FORMper .
v90 Velocidad de consumo de ISOCIT para la sı́ntesis de SUC.
vAcCoAcit Velocidad de consumo de AcCoAcit para la sı́ntesis de aa y LIP.
v70−aaAcCoA Velocidad de consumo de aa obtenidos desde AcCoAcit para la sı́ntesis de PROT.
v71−aaAcCoA Velocidad de consumo de aa obtenidos desde AcCoAcit para la sı́ntesis de SOD.
85
v73−AcCoA Velocidad de consumo de AcCoAcit para la sı́ntesis de LIP.
vE4P Velocidad de consumo de E4P para la sı́ntesis de aa.
v70−aaE4P Velocidad de consumo de aa obtenidos desde E4P para la sı́ntesis de PROT.
v71−aaE4P Velocidad de consumo de aa obtenidos desde E4P para la sı́ntesis de SOD.
vOAC Velocidad de consumo de OAC para la sı́ntesis de aa y nu.
v70−aaOAC Velocidad de consumo de aa obtenidos desde OAC para la sı́ntesis de PROT.
v71−aaOAC Velocidad de consumo de aa obtenidos desde OAC para la sı́ntesis de SOD.
v72−nuOAC Velocidad de consumo de nu obtenidos desde OAC para la sı́ntesis de ARN.
v70−aaRIB5P Velocidad de consumo de aa obtenidos desde RIB 5P para la sı́ntesis de PROT.
v71−aaRIB5P Velocidad de consumo de aa obtenidos desde RIB 5P para la sı́ntesis de SOD.
v72−nuRIB5P Velocidad de consumo de nu obtenidos desde RIB 5P para la sı́ntesis de ARN.
v73−GAP Velocidad de consumo de GAP para la sı́ntesis de LIP.
vG3P Velocidad de consumo de G3P para la sı́ntesis de aa y nu.
v70−aa3PG Velocidad de consumo de aa obtenidos desde 3PG para la sı́ntesis de PROT.
v71−aa3PG Velocidad de consumo de aa obtenidos desde 3PG para la sı́ntesis de SOD.
v72−nu3PG Velocidad de consumo de nu obtenidos desde 3PG para la sı́ntesis de ARN.
vPEP Velocidad de consumo de PEP para la sı́ntesis de aa.
v70−aaPEP Velocidad de consumo de aa obtenidos desde PEP para la sı́ntesis de POT.
v71−aaPEP Velocidad de consumo de aa obtenidos desde PEP para la sı́ntesis de SOD.
vPIR Velocidad de consumo de PIR para la sı́ntesis de aa.
v70−aaPIR Velocidad de consumo de aa obtenidos desde PIR para la sı́ntesis de PROT.
v71−aaPIR Velocidad de consumo de aa obtenidos desde PIR para la sı́ntesis de SOD.
vAKG Velocidad de consumo de AKG para la sı́ntesis de aa.
v70−aaAKG Velocidad de consumo de aa obtenidos desde AKG para la sı́ntesis de PROT.
v71−aaAKG Velocidad de consumo de aa obtenidos desde AKG para la sı́ntesis de SOD.
86
Apéndice C
Material Suplementario
C.1. Algoritmo Cálculo Modos Elementales

A continuación se muestra el algoritmo para el cálculo de modo elementales desarrollado
inicialmente por Schuster y Hilgetag en el año 1994, luego por Pfeiffer en el año 1999 y completado
finalmente por Schuster en el año 2000 [72] [62].
C.1.1. Descomposición de Distribuciones de Flujo
Se considera una red metabólica con m modos elementales y n reacciones. Los modos
elementales se representan por vectores E1 , E2 , ... Em , cada uno de largo n. Ası́, una distribución
de flujos en este sistema se representa por un vector v de largo n. Una descomposición de tal
distribución de flujos en un conjunto de modos elementales se define por un vector w de largo m
tal que:
m
v= ∑ w jE j (C.1)
j=1
Dado que los elementos de E j son adimensionales, aquellos de w tendrán dimensiones

de flujo, llamándolos flujos de modos elementales.
87
Si todas las reacciones que componen un modo elemental dado, E j , son reversibles,
entonces tal modo elemental es reversible, y su flujo w j puede ser positivo o negativo. Si al menos
una reacción de E j es irreversible, el modo elemental es un modo irreversible, y w j será positivo:
w j ≥ 0 si E j es irreversible (C.2)
En general, hay más modos elementales que reacciones en un sistema, y las condiciones
(C.1) y (C.2) no definen una única solución, sino que un espacio convexo continuo de posibles
soluciones.
Ası́, se introduce una tercera condición restringiendo el sistema a una única solución;
m
∑ w2j es mı́nimo (C.3)
j=1
En conjunto, las relaciones (C.1), (C.2) y (C.3) definen un problema de optimización no

lineal.
Los modos elementales son un grupo de factores de escalamiento, y la ecuación no-lineal

(C.3) hace a la solución dependiente de la regla utilizada para el escalamiento de modos elementa-
les.
C.1.2. Implementación
La implementación utilizada para resolver un problema de programación cuadrático se

basa en el algoritmo tradicional de “conjunto activo”, el que usa un proceso iterativo. En cada itera-
ción se escoge un conjunto de restricciones (inecuaciones) y se fijan. Se busca el correcto conjunto
de restricciones activas.
88
Los principales pasos del algoritmo se describen a continuación. Una descripción y de-
mostración matemática detallada del algoritmo de “conjunto activo” se pueden encontrar en [30].
1. El algoritmo se inicializa con una solución factible, es decir, un vector w(0) que cumpla
con las restricciones (C.1) y (C.2) pero no es, en general, la solución óptima. Este paso
es equivalente a un problema de programación lineal, y se resuelve utilizando el método
Simplex. La solución obtenida w(0) se utiliza como el primer punto factible en el paso 2,
junto con un conjunto activo vacı́o.
2. En caso de ocurrir una solución factible donde los valores de v no verifiquen estrictamente
la conservación de flujo.
Esto se puede deber a aproximaciones en los cálculos numéricos de los valores de flujo. Para
balancear las distribuciones de flujo inconsistentes se siguien los siguientes pasos;
a) el espacio nulo de los sistemas se calcula por una diagonalización de la matriz de modos
elementales,
b) el espacio nulo se multiplica por el vector de flujos para verificar la conservación de

flujos,
c) si los flujos no se encuentran estrictamente conservados, se selecciona un subconjunto de

flujos independientes y los flujos restantes se ajustan para re-establecer la conservación
de flujo exacta.
Las operaciones previamente mencionadas permiten reducir la dimensión del problema de

programación. En los pasos siguientes, sólo se mantiene el último subconjunto de restric-
ciones independientes. Este proceso permite que no exista degeneración en el conjunto de
restricciones impuestas, y también lleva a una reducción en el tiempo de cálculo.
3. El problema sujeto a restricciones se resuelve utilizando un cambio de origen a wk y aplican-

do el método de multiplicadores de Lagrange. Una corrección δ(k) se obtiene como resultado.
89
4. Si δ(k) = 0, los multiplicadores de Lagrande se calculan para las restricciones activas. Si
todo ellos son positivos, entonces w(k) es la solución final y el algoritmo finaliza. Si no,
la restricción correspondiente al menor multiplicador de Lagrange se elimina del conjunto
activo, y el algoritmo se repire desde el paso anterior.
5. Si δ(k) es factible, la siguiente iteración comienza con w(k+1) = w(k) + δ(k) y el algoritmo
se repite desde el paso 3. Si no se realiza una búsqueda en la dirección de δ(k) hasta que la
primera restricción inactiva se vuelve activa. Las primeras restricciones inactivas se hacen
activas. Se añade la restricción al conjunto activo, y se repite el algoritmo desde el paso 3.
C.2. Archivos de los Modelos Estequiométricos en formato SBML
Modelo Estequiométrico Pichia pastoris
El archivo del modelo de Pichia pastoris en formato SBML se encuentra disponible en:
http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/pp sbml
Modelo Estequiométrico Saccharomyces cerevisiae
El archivo del modelo de Saccharomyces cerevisiae en formato SBML se encuentra en:
http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/sc sbml
C.3. Representación Modelos Metabólicos
Código GLE Red Metabólica Pichia pastoris
El archivo del código para representar gráficamente el modelo de la red metabólica de

Pichia pastoris se encuentra disponible en:
http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/pp.gle
90
Código GLE Red Metabólica Saccharomyces cerevisiae
El archivo del código para representar gráficamente el modelo de la red metabólica de

Saccharomyces cerevisiae se encuentra disponible en:
http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/sc.gle
C.4. Modos Elementales
Modos Elementales Modelo Estequiométrico S. cerevisiae y P. pastoris
El listado de los modos elementales de los modelos estequiométricos de Saccharomyces

cerevisiae y P. pastoris se encuentra disponible en:
http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/modos elementales.pdf
91
Índice alfabético
Autores Pfeiffer, 37, 87

Abbott, 38 Sauer, 41
Bolouri, 37 Sauro, 37
Brendes, 38 Schuster, 29, 37, 87
Budden, 38 Serrano, 40
Cárdenas, 14 Solà, 41, 56
Clarke, 29 Struyf, 38
Cornish-Bowden, 14 Stryer, 40
Doyle, 37 van Gulik, 40
Förster, 35 Walker, 40, 41
Famili, 35 Wilkinson, 38
Feist, 29
Bases de Datos
Finney, 37
BioCasta, 12
Fu, 35
BioCyc, 12
Gancedo, 40
BioSilico, 12
Gilles, 38
BRITE, 12
Gliede, 41
BSD, 12
González, 15, 16, 36, 40, 41, 69, 76
GenBank, 11
Hartner, 41
KEGG, 12
Heijmen, 40
Kiotho, 12
Hilgetag, 37, 87
LIGAND, 12
Hucka, 37
Metacyc, 12
Jahic, 40, 41
Metagrowth, 12
Jeffries, 38
PathDB, 12
Kitano, 37
UM-BBD, 12
Klamt, 38
biologı́a de sistemas, 13
LaBella, 38
blancos terapeúticos, 14
Mavro, 29
Nielsen, 35 coeficientes estequiométricos, 28
Nissen, 40 conjunto activo, 88
Palsson, 29, 35 Constrain Based Models, 13
92
distribuciones de flujo, 12 XML, 37
GLE, 38
Enzimas
SBML, 15, 17, 35, 37
α-amilasa pPAM, 22
levadura, 19
α-amilasa, 22
alcohol deshidrogenasa, 19 Métodos
alcohol oxidasa, 25 Stoichiometric Network Analysis, 29
carboxilesterasa, 22 Análisis de Balances de Energı́a (EBA), 13
DAH sintasa, 21 Análisis de Balances de Flujos (FBA), 13
dalcoquinasa, 22 Análisis de Control Metabólico (MCA), 13
disulfuro isomerasa, 23 Análisis de Flujos Metabólico (MFA), 13
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, 19 Análisis de Minimización de Ajustes Me-
fosfogluconato deshidrogenasa, 20 tabólicos (MOMA), 13
glicerol quinasa, 20 Análisis de Modos Elementales (EMA), 14
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, 20 Análisis de Planos de Fases de Fenotipos
glucoamilasa, 22 (PhPA), 13
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, 20 Análisis de Robustez, 13
Hidroxinitrilo liasa, 22 Análisis de Vı́as Extremas (EPA), 14
monoamida oxidasa A, 22 Análisis de Vı́as Metabólicas, 17
piruvato carboxilasa, 19 Análisis de Vı́as Metabólicas (MPA), 13
piruvato descarboxilasa, 19 Análisis Regulatorio de Balances de Flujos,
piruvato deshidrogenasa, 19 13
SOD manganeso humana, 26 Modelo Cibernético, 13
Superóxido Dismutasa humana, 15, 16, 25, Teorı́a Bioquı́mica de Sistemas (BST), 13
36 matriz estequiométrica, 28
lipasa de Rhizopus oryzae, 50 membrana interior de la mitocondria, 20
penicilina G amidasa, 22 Metabolitos
espacio solución, 13 α-cetoglutarato, 19
estado estacionario, 12, 29 6-fosfogluconato, 20
estequiometrı́a, 12 6-fosfogluconolactona, 20
acetaldehı́do, 19
flujos metabólicos, 13
acetato, 19
genoma, 34 AcetilCoA, 19
ADP, 20
Hormonas aminoácidos, 20
insulina, 22 ATP, 18–20
Lenguages CO2 , 19
LATEX, 38 DAH fosfato, 20
93
DHA, 21 Pichia pastoris, 11, 15, 17, 20, 22, 24–26,
dihidroxiacetona, 21 34, 35, 42, 44, 49, 51, 53, 55, 57, 58,
etanol, 19 60, 76, 90, 91
FADH2 , 19, 20 Rhizopus oryzae, 50
formaldehı́do, 21 Saccharomyces cerevisiae, 9, 10, 12, 16, 19–
fosfato inorgánico, 20 22, 24–26, 35, 36, 39, 41, 44, 56, 60, 69,
fructosa-6-fosfato , 21 90, 91
GAP, 21 Yarrowia lipolyctica, 24
glicerol, 20
Productos
glicerol desdedihidroacetona fosfato, 19
ácidos grasos, 19
glicerol-3-fosfato, 20
alcohol azúcares, 20
glucosa, 19
ARN, 74, 81
glucosa-6-fosfato, 20
biomasa, 27, 51
NAD, 18
carbohidratos, 74, 81
NADH, 19
etanol, 19
NADP, 18
lı́pidos, 74, 81
NADPH, 19, 20
nucleótidos, 80
oxaloacetato, 19
proteı́nas no recombinantes, 74, 80
piruvato, 19
proteı́nas recombinantes, 74, 81
ribulosa-5-fosfato, 20
Programas
metabolitos internos, 29
C ELL N ETA NALYZER, 15, 31, 35, 37, 38
Modelos
F LUX A NALYZER, 38
Modelo Pichia pastoris, 90
M ATLAB, 15, 35, 38
Modelo Saccharomyces cerevisiae, 90
M ETATOOL, 31, 37
Modelo Estequiométrico de Saccharomyces
Pathways, 60
cerevisiae, 69
promotor AOX1, 60
modelo metabólico, 10
propiedades “emergentes”, 13
Modelo Metabólico Pichia pastoris, 34
proteı́na recombinante, 15
modelos metabólicos, 38
modo elemental, 30 Reacciones Anapleróticas, 77
modos elementales, 88 reacciones bioquı́micas, 37
rendimiento relativo, 57
Organismos
retı́culo endoplasmático, 58
Pichia pastoris, 41
robustez, 46
Escherichia coli, 14
Hansenula polymorpha, 24, 25 secuencias huérfanas, 14
Kluyveromyces lactis, 24 sistemas de expresión, 23
Sustratos
94
azufre y fósforo, 18 Sı́ntesis de Proteı́nas no Recombinantes, 74,
compuestos inorgánicos, 18 80
fuentes de carbono, 18 Sı́ntesis de Proteı́nas Recombinantes, 74, 81
glicerol, 39 Transporte celular, 71
glucosa, 19, 40 Transporte Intracelular, 81
metanol, 42 vı́a ambibólica, 19
vı́a de asimilación de la glucosa, 56
transporte de electrones, 20
vı́a de asimilación del glicerol, 39, 56
UPR respuesta a proteı́nas no plegadas, 58 vı́a de asimilación del metanol, 56
vı́a de las pentosas fosfato, 19, 60, 70, 77
Vı́as vı́as catabólicas, 18
vı́as anabólicas, 18 vı́as extremas, 31
vı́as catabólicas, 18 Vı́as Fermentativas, 71, 78
cadena respiratoria, 20 vector de flujos, 28
Carboxilación de piruvato, 70, 77
Ciclo de los Ácidos Tricarboxı́licos, 60, 70,
76
Ciclo de los Ácidos Tricarboxı́licos , 40, 41
Ciclo del Ácido Cı́trico, 19
Ciclo del Glioxilato, 19, 40, 70
fermentación alcohólica de azúcares, 19
fosforilación oxidativa, 20, 71, 78
glicólisis, 19, 69, 76
Glucólisis, 40, 41
gluconeogénesis, 20, 69, 76
metabolismo del carbono, 12
metabolismo del metanol, 41, 44, 60, 77
Reacciones Anapleróticas, 40, 41, 70
Ruta de las Pentosas Fosfato, 40, 41, 70, 77
Rutas Fermentativas, 40, 41
Sı́ntesis de Aminoácidos, 40, 41, 72, 78
Sı́ntesis de ARN, 74, 81
Sı́ntesis de Carbohidratos, 40, 41, 74, 81
Sı́ntesis de Compuestos de 1-carbono, 73,
80
Sı́ntesis de Lı́pidos, 40, 41, 74, 81
Sı́ntesis de Nucleótidos, 40, 41, 73, 80
95
Glosario
bioinformática aplicación de herrmientas computacionales y

métodos informáticos en el análisis de datos ex-
perimentales y simulación de sistemas biológi-
cos, 9
biotecnologı́a toda aplicación tecnológica que utilice sistemas
biológicos y organismos vivos o sus derivados
para la creación o modificación de productos o
procesos para usos especı́ficos, 9
genoma todo el material genético contenido en las células

de un organismo en particular, 11
metabolismo central conjunto de rutas metabóolicas que proveen pre-

cursores a las otras vı́as; glicólisis, pentosas fos-
fato y Entner Doudoroff, 34
organismo metilotrófico organismos que utilizan metano como fuente de

carbono y energı́a y otros compuestos reducidos
de un átomo de carbono bajo condiciones aeróbi-
cas, 15
96
propiedades emergentes propiedad de nivel superior de un sistema que no
puede deducirse o ser explicado a partir de las
propiedades de entidades inferiores, 13
respiración aeróbica facultativa bajo condiciones anaerobias ocurre fermentación

alcohólica; en presencia de oxı́geno continúa con
el proceso aerobio, es decir, producir energı́a,
CO2 y H2 O, 21
respiración anaeróbica oxidación de moléculas en ausencia de oxı́geno,
21
Superóxido Dismutasa humana enzima humana cuya función principal es elimi-

nar radicales libres, 9
transportadores redox moléculas que pueden actuar como aceptor de

electrones y luego como dador de electrones, 20
vı́a ambibólica vı́a catabólica y anabólica a la vez, 19

vı́as anabólicas vı́as biosintetizadoras y divergentes y necesitan
de energı́a para su metabolismo, 95
vı́as catabólicas vı́as degradativas y convergentes se presentan
con liberación de energı́a y son espontáneas, 95
XML eXtensible Markup Language es un metalen-

guaje extensible de etiquetas desarrollado por el
World Wide Web Consortium, 93
97

Composición Elemental P.pastoris

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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS

COMPARACIÓN TEÓRICA DE LAS CAPACIDADES METABÓLICAS DE

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA

ORNELLA CECILIA COMINETTI ALLENDE

Entre las propiedades topológicas básicas se compararon los histogramas de conectivi-

A mis padres Myriam y Paolo

A mis Nonnos Cecilia y Gerónimo

A mis hermanas Fiorella y Rossana

A toda la familia Cominetti Cotti-Cometti,

en especial a sus nuevos integrantes;

A quienes me han aconsejado y ayudado siempre, en especial durante mi carrera: Gracias

Papá y Mamá Nonna y Nonno

Papá, Paolo Cominetti Roberto Cominetti

Prof. Bárbara Andrews Prof. Juan Asenjo

Un agradecimiento especial al Centro de Modelamiento Matemático de la Facultad de

2. Problema y Marco Teórico 18

4.1. Modelo Metabólico del Metabolismo Central de Pichia pastoris. . . . . . . . . . . 43

4.5. Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa y Glicerol Modos S. cerevisiae. . . . . 53

A.1. Modelo Metabólico del Metabolismo Central de Saccharomyces cerevisiae . . . . 75

4.1. Referencias utilizadas en la construcción del modelo estequiométrico de S. cerevi-

1.2. Contenido de la memoria

Esta memoria se desarrolla en los siguientes capı́tulos:

Problema y Marco Teórico. Explica el contexto, en relación a la biotecnologı́a y bioinformática

A pesar de que la levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido un sistema de expresión

P. pastoris presenta numerosas ventajas como sistema de expresión con respecto a S.

A pesar del gran impacto biotecnológico de Pichia pastoris, la información genética y

1.3.1. Modelos Estequiométricos

Para analizar, interpretar y predecir el comportamiento celular, se debe obtener informa-

Esta representación in silico del metabolismo se realiza utilizando información de lite-

Los modelos estacionarios basados en restricciones, estudiados en la presente memoria,

Cornish-Bowden y Cárdenas en el artı́culo “From genome to cellular phenotype–a role

1.3.3. Fenómeno Modelado

El fenómeno modelado corresponde al metabolismo central en estado estacionario de

Los modelos consisten en listas de reacciones bioquı́micas y de transporte presentes en

Se utilizó como base el modelo de Saccharomyces cerevisiae recombinante realizado

Dado que no se encuentra publicado el genoma de P. pastoris, se realizó su modelo

1.3.4. Hipótesis de Trabajo

A partir de la búsqueda bibliográfica se postuló la siguiente hipótesis:

Pichia pastoris es más eficiente frente a Saccharomyces cerevisiae como sistema de

1.4. Objetivo Principal y Actividades Realizadas

El objetivo principal de la presente memoria fue:

1. Realizar un estudio teórico comparativo de las capacidades metabólicas de Pichia pastoris y

Las actividades realizadas fueron:

a) Se realizó una búsqueda bibliográfica acabada del metabolismo, genoma y enzimas de

c) Se representó gráficamente el modelo metabólico de Pichia pastoris.

2. Se codificó el modelo metabólico de Saccharomyces cerevisiae en formato SBML.

3. Se representó gráficamente el modelo metabólico de Saccharomyces cerevisiae.

4. Se aplicó el método de Análisis de Vı́as Metabólicas: Análisis de Modos Elementales a

5. Se compararon los modos elementales previamente obtenidos.

Problema y Marco Teórico

2.1. Metabolismo de Levaduras

El metabolismo, conjunto de reacciones y procesos fı́sico-quı́micos que ocurren en una

2.1.1. Catabolismo de Azúcar en Levaduras

La principal fuente de producción de energı́a en levadura (en Saccharomyces cerevisiae)

Durante la fermentación alcohólica de azúcares, las levaduras re-oxidan NADH a NAD

El control de la producción de proteı́nas, en levaduras, es dependiente del control del

En el caso de P. pastoris se ha reportado que la adición de metanol al medio de cultivo

Muchos autores han estudiado cómo afecta la variación en la concentración de metanol

2.1.2. Diferencias entre Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae

Una de las diferencias principales entre Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae

P. pastoris presenta baja secreción de proteı́nas endógenas, lo cual facilita la purificación