Sandra Sabrina Villacorta Leal

Estudio de la fisiología neuronal mediante la técnica de Patch Clamp.

El cerebro humano está formado por millones de neuronas, esta técnica permite estudiar las
características electrofisiológicas de estas neuronas.
Algo importante para las neuronas es el líquido cefalorraquídeo, el cual trasporta los nutrientes y el
oxígeno fundamental para la supervivencia neuronal, para esta técnica se prepara un líquido de
composición semejante que se llama líquido cefalorraquídeo artificial, del cual se comprueba su
osmolaridad y su pH, las cuales deben ser de 300 y 7,4 respectivamente. El líquido se pone a burbujear
continuamente con una mezcla de gases, de la cual la composición es 95% oxígeno y 5% dióxido de
carbono.
Después se extrae el cerebro del animal después se coloca y pega en la cámara de corte de vibratomo
y se rellena con líquido cefalorraquídeo artificial a una temperatura de entre 1 y 4 grados centígrados,
el tejido se corta en partes transversales de 300 micrómetros de grosor. Las partes que contengan la
estructura cerebral de interés se pasan a una cámara de incubación donde se mantiene durante 30
minutos a una temperatura de 33 grados centígrados, después se dejan a temperatura ambiente y la
actividad neuronal puede empezar a ser registrada.
Para esta prueba se requieren de microelectrodos, los cuales se preparan a partir de tubos de vidrio
de policilicato de 1, 1.5 milímetros de diámetro con capilar interno que se estira al calor mediante un
estirador de pipeta, estos microelectrodos se rellenan con un líquido semejante al intracelular, estos
tienen la punta abierta en aproximadamente 2 micrómetros, la parte del cerebro seleccionada pasa de
la capara de mantenimiento a la cámara de registro, esta cámara esta perfundida continuamente con
líquido cefalorraquídeo artificial a un flujo constante de 2 mL por minuto generado por una bomba de
corriente continua. Se coloca una maya mediante presión en la cámara de registro para evitar que el
corte cerebral se mueva. La parte de interés se localiza con un aumento bajo y se coloca en el centro
de la imagen y se sube el aumento (40X). se coloca la micropipeta en el preamplificador y con ayuda
del micromanipulador se sitúa el electrodo justo debajo del objetivo, una vez que aparece en la pantalla
se mide su resistencia son válidos para el registro neuronal las que presenten una resistencia eléctrica
de entre 3 y 6 megaoms. Se aplica un flujo de corriente positiva al electrodo con ayuda de una jeringa,
esto ayuda a acceder y visualizar mejor la neurona seleccionada, hay que bajar simultáneamente el
objetivo y el electrodo y cuidadosamente se acerca a la neurona hasta visualizar una maraca
blanquecina en su membrana.
La configuración del cell-atached consiste en la formación del giga-cello, en esta configuración la
membrana de la neurona queda completamente adherida a la punta de la pipeta de manera que la
resistencia de la pipeta sube hasta valores cercanos o mayores a 1 gigaoms, para conseguir esto, una
vez marcada la célula se quita la presión positiva, lo que hará un efecto succionador, si necesario se
realiza una mayor presión negativa con la ayuda de la jeringa. La visualización del cello será diferente
si se está fijando la corriente o fijando el voltaje. Si se fija en la corriente se observará una subida en
voltaje, pero si se fija en el voltaje. La configuración de célula completa se realiza aplicando succión
para romper parte de la membrana produciendo un acceso al espacio intracelular lo que supone la
continuidad eléctrica entre el interior de la célula y el electrodo. Para la técnica perforación patch la
pipeta no entra en contacto directo con el citoplasma, el contacto eléctrico se establece por la
formación de poros en la porción de membrana donde se formó el cello dichos poros se forman gracias
a la inducción de un antibiótico en la solución de la pipeta. Técnica inside-out patch: Después de la
formación del cello la micropipeta se retira rápidamente de la célula así parte de la membrana queda
unida a la micropipeta exponiendo la superficie intracelular de la membrana al medio externo. Técnica
outside-out patch: Después el electrodo es lentamente retirado de la célula permitiendo la formación
de una ampolla en la membrana de la célula; estas dos configuraciones de utilizan para investigar los
canales iónicos. Configuración 3: técnica de fijación de corriente. Se realiza una pequeña succión para
conseguir que el sello se rompa y el interior de la pipeta entre en contacto con el citoplasma, si la
membrana se ha abierto correctamente se observa una caída en voltaje de aproximadamente de 60
milivolts, esta corresponde al potencial de membrana en reposo. Técnica de fijación de voltaje. Se
observa un cambio y se ve la corriente que se requiere para fijar el potencial de membrana en un valor
predeterminado.
Del video: estudio de la fisiología neuronal mediante la técnica patch-clamp, en youtube.

Ecuaciones de Nerst

Eion K-= (25) Ln (3/140)= -96.58

EionNa+= (25) Ln (140/7)= 74.89

EionCl-= (25) Ln (7/140)= -74.89

EionCa+= (25) Ln (1.5/0.0001)= 240.39