LABORATORIO DE GENÉTICA

PROTOCOLO ENSAYO COMETA ESTANDAR

ELABORÓ: Q.F.I Scarlett Camacho Cantera

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

 AGAROSA REGULAR.
Disolver 0.1 g de agarosa regular en 10 ml de PBS.

 AGAROSA DE BAJO PUNTO DE FUSIÓN

Disolver 0.1 g de agarosa de bajo punto de fusión en 10 ml de PBS.

Nota: Es recomendable preparar estas soluciones en el momento de su uso. Disolver la solución

de agarosa en el microondas, sin dejar que llegue a ebullición, para esto meter la solución en el
microondas por aproximadamente 5 segundos, sacar y agitar, repetir este proceso hasta que
presente una apariencia cristalina. Mantener la solución de agarosa de bajo punto de fusión a
37° C y la regular sobre una parrilla termina, para evitar que solidifique.

 SOLUCIÓN DE LISIS STOCK

Para preparar 1L se requiere:

164.045g de NaCl
41.798 g de EDTA
1.348g de Tris
10g de Lauril Sarcocianato de Sodio.
NaOH Ajustar pH = 10

Para facilitar la disolución de los reactivos y evitar saturaciones, preparar dos soluciones por
separado A y B.

SOLUCIÓN A:
1. Disolver perfectamente (poco a poco) el EDTA en 500 ml de agua desionizada, hasta que
tenga una apariencia cristalina.
2. Adicionar el Tris y esperar a que se disuelva por completo.
3. Ajustar el pH= 10 con NaOH
4. Agregar el NaCl y disolver perfectamente hasta lograr una apariencia cristalina.

Nota: El orden de disolución antes mencionado es de suma importancia ya que permite evitar la
saturación de la solución. Si se adiciona más agua desionizada para facilitar la disolución, registrar
el volumen incorporado, con el fin de no exceder el volumen final (1L)

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SOLUCIÓN B:

Disolver el Lauril Sarcocianato de Sodio en 100 ml de agua desionizada, agitar lentamente para
evitar la formación excesiva de burbujas.

Mezclar las soluciones A Y B, agitando lentamente, dejar reposar hasta que desaparezcan las
burbujas, llevar al volumen final y conservar a temperatura ambiente.

SOLUCIÓN DE LISIS

40 ml de solución de lisis stock

4 ml de DMSO
0.4 ml de Tritón

Nota: Preparar en el momento en que los geles ya estén listos para este proceso, agitar
ligeramente para evitar la formación de burbujas.

 BUFFER DE ELECTROFORESIS (300 mM NaOH / 1 mM EDTA)

Nota: Preparar ambas soluciones por separado y juntarlas hasta el momento de su uso, las dos
soluciones requieren bastante tiempo para prepararse (aproximadamente 5 horas) y para evitar
saturaciones es necesario ser paciente y adicionar una mínima cantidad de soluto y esperar hasta
que esta se disuelva COMPLETAMENTE antes de adicionar más.

Solución NaOH 300 mM NaOH (stock)

Para preparar 1L se requieren 400g de NaOH

En un baño de hielo y con ayuda de un agitador magnético añadir poco a poco el soluto en agua
desionizada , aforar y conservar a temperatura ambiente .

Solución EDTA (stock)

Para preparar 200ml se requieren 14.89 g de EDTA,

Con ayuda de un agitador magnético Disolver poco a poco en agua desionizada y ajustar a pH 10.
conservar a temperatura ambiente

Nota: El ajuste de pH se realiza con HCl o NaOH

Buffer de electroforesis

Para preparar 1L se requiere:

30 ml NaOH 10N (stock)

5 Ml EDTA 200 Mm (stock)

NOTA: La cámara de electroforesis requiere que se preparen 2100 ml de buffer, es recomendable

preparar el buffer con agua fría.

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SOLUCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN (TRIS 0.4M)

Para preparar 1L se requieren 48.5 g de Tris, aforar con agua desionizada y ajustar a pH 7.5 con
HCl concentrado, conservar en refrigeración hasta el momento de su uso.

BROMURO DE ETIDIO

Solución stock:
10 mg Bromuro de Etidio
Disolver en 50 ml de agua destilada
Conservar a temperatura ambiente

Solución de trabajo:
Mezclar 1ml de la solución stock con 9 ml de agua

Nota: La solución debe almacenarse en un frasco color ambar o protegerse de la luz.

OBTENCIÓN DE CÉLULAS INDIVIDUALES

Extraer el hígado y cerebro de ratón, lavar los órganos 2 o 3 veces con PBS frio y destinar un
fragmento de cada órgano de aproximadamente 4 mm para el desarrollo de la técnica.

Adicionar 250 µL de PBS al fragmento del órgano y con ayuda del embolo de una jeringa golpear
suavemente 25 veces.

Tomar 50 µL de la suspensión previamente formada y colocarlos en un tubo eppendorf, mantener

las células en refrigeración, o en una superficie con hielo, cuidando que no se congelen.

TECNICA

1.- Preparación de microgeles.

CAPA 1. Poner el porta objetos en una parrilla aproximadamente 10 segundos, retirar y adicionar
110 µL de agarosa regular sobre el esmeril del porta objetos, y colocar rápidamente un cubre
objetos para formar una capa uniforme de agarosa, evitando la formación de burbujas, dejar
solidificar sobre una placa de hielo húmeda aproximadamente 3 minutos.

CAPA 2. Retirar el cubre objetos cuidadosamente para no romper el gel previamente formado,
mezclar rápidamente la suspensión celular recién preparada con 50 µL de agarosa de bajo punto de
fusión, tomar el contenido total con una micropipeta y regresarlo una vez al eppendorf de origen
con el fin de agitar la solución, posteriormente tomar una vez más el contenido total, colocándolo
sobre la primera capa de agarosa, poner un cubre objetos para formar una capa uniforme de
agarosa, evitando la formación de burbujas (Este procedimiento debe realizarse lo más rápido
posible, para evitar que las células se solidifiquen en el tubo eppendorf o en la punta de la micro
pipeta). Posteriormente marcar la laminita con ayuda de un lápiz, para su fácil identificación y dejar
solidificar sobre una placa de hielo húmeda aproximadamente 5 minutos

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CAPA 3. Retirar el cubreobjetos nuevamente cuidando no romper el gel y colocar 110 µL de agarosa
de bajo punto de fusión, poner otra vez el cubre objetos y dejar solidificar sobre una placa de hielo
por un periodo de entre 15 y 20 minutos.

Posteriormente retirar los cubre objetos de todas las laminillas y colocarlas dentro de un coplin
protegido de la luz que contenga la solución de lisis, mantener a 4° C por un periodo entre 2 y 24
horas.
2.- Desnaturalización del ADN

Acomodar las laminillas sobre una cámara de electroforesis horizontal, alinearlas, de manera que
no queden espacios entre ellas y agregar el buffer de electroforesis, cubriendo todas las laminitas,
dejar reposar por 20 minutos.

3.- Electroforesis

Transcurrida la desnaturalización del ADN, iniciar la electroforesis bajo las siguientes condiciones:
20 minutos, 25V y 300 MA.

4.- Neutralización

Después de la electroforesis, sacar las laminitas de la cámara y lavarlas 3 o 4 veces con la solución
de neutralización.

NOTA: Los lavados se realizan con ayuda de una pipeta pasteur, adicionando la solución lentamente
para no dañar los geles.

5.- Deshidratación

Colocar las laminillas en un coplin con una solución 1:1 metanol-agua durante 5 minutos.

6.- Tinción

Agregar 50 µL de la solución de bromuro de etidio y colocar un cubre objetos.

Nota: Analizar los geles en condiciones de obscuridad, utilizando un microscopio de fluorescencia,

y tomar fotos con el software “image pro plus” de 100 células totales por ratón.

Medir las células con ayuda del software antes mencionado y determinar el índice cauda/núcleo.

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 ENSAYO COMETA MODIFICADO CON LA ENZIMA FPG

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Se utilizarán las mismas soluciones que para el ensayo cometa estándar así como las que se
enlistan a continuación.

BUFFER DE LA ENZIMA FPG pH= 8

Para preparar 1L de solución se necesitan:

9.53g de HEPES
7.45g de KCl
0.146g de EDTA
0.2g de Albumina sérica bovina
KOH pH= 8

SOLUCIÓN STOCK DE LA ENZIMA FPG

Tomar 10 µL de la enzima FPG y mezclarlo con 2 ml del buffer de la enzima FPG. Mantener en
refrigeración hasta el momento de su uso.

TECNICA

Seguir los pasos antes mencionados, hasta sacar las laminillas de la solución de lisis, posteriormente
lavar las laminitas 3 veces con el buffer de la enzima FPG.

Nota: Los lavados se realizan llenando 3 coplins con el buffer, sumergiendo las laminitas en cada
coplin durante 5 minutos. El contenido del coplin debe sustituirse en cada lavado.

Colocar 10 µL de la solución stock de la enzima FPG y 40 µL del buffer de la enzima FPG en un tubo
eppendorf, posteriormente tomar el contenido total con una micropipeta y colocarlo sobre la
laminita, poniendo un cubreobjetos. Repetir este paso, para c/u de las laminitas.

Colocar todas las laminitas, sobre una base con una cama de algodón húmeda e incubar a 37° C,
durante 45 minutos. Posteriormente acomodar todas las laminitas en una placa de hielo húmeda,
durante 20 o 30 minutos, con el fin de poder retirar el cubre objetos sin dañar el gel.

Realizar la desnaturalización del ADN y todos los pasos posteriores previamente mencionados.