UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONIA

FACULTAD: INGENIERIA CIENCIAS Y AMBIENTALES

CARRERA: INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

TRABAJO DE IMVESTIGACION
(CROMATOGRAFIA)

DOCENTE : DR.NERY.F. GRIMALDO CORDOVA

AREA : QUIMICA ANALITICA

ESTUDIANTES :
1. CUJA REATEGUI, LLEYNS
2. CUJA PACUNTA ,NIMAN YURI

CICLO : III

AÑO : 2017-I

YARINA COCHA UNIA-UCAYALI PERU

 DEDICATORIA

La investigación acerca del tema cromatografía, consiste en una investigación

altamente profundizada y detallada con los temas que están relacionadas y a la vez
esta investigación viene incluido con un trabajo experimental realizado, en el
laboratorio de química analítica. La investigación realizada facilita a los estudiantes
entender y aplicar los métodos y las técnicas que se especifican en esta
investigación, es un tema muy amplio y muy aplicativo en industrias alimentarias, y
en control de calidad de los productos o en procesos industriales o a nivel aplicativo
en los procesos analíticos.
La especificación de los temas es dedicado a que los estudiantes tengan un
conocimiento amplio para aquellos enfocados hacia los procesos analíticos, y
también para aquellos estudiantes ingresantes sobre lleven el tema a su capacidad
para que sean aplicados y salir de las falencias que pueda existir en el estudio a
nivel académico en ciencias e ingeniería. El trabajo es realizado en la universidad
intercultural de la amazonia (UNIA), realizado por los estudiantes de tercer ciclo
académico en el curso de química analítica a cargo del Dr. Nery f Grimaldo y
encargado de laboratorio en el trabajo experimental, se basa en la separación de
los componentes de una sustancia o de una mezcla compleja como se especifican
en los siguientes capítulos.
 INTRODUCCION

La mayoría de los métodos de análisis son en los casos más favorables selectivos
pero no específicos .por ello, cuando se trata de muestras complejas la separación
del analito de las posibles interferencias es una etapa esencial .Aun mejor sería la
posibilidad de determinar varios analitos después de una separación previa, uno
de los mejores métodos para conseguir esa separación y posiblemente, el más
utilizado es la cromatografía. Este conjunto de técnicas permite la separación de
componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas .La cromatografía
en sus orígenes era exclusivamente una técnica de separación que se transformó
en técnica de análisis cuando se acoplo con un dispositivo para monitorizar las
especies químicas que se iban separando.
Así, se ha convertido en un método analítico de primer orden para separar,
identificar y cuantificar los compuestos presentes en muestras liquidas o gaseosas
(para muestras solidas se requiere una etapa de disolución o extracción).En
cromatografía, los solutos se separan en base a la distinta velocidad de
desplazamiento cuando son arrastrados por una fase móvil a través de un lecho
cromatógrafo que contiene a una fase estacionaria (solida o liquida). La muestra se
disuelve en la fase móvil y se hace pasar a través de la fase estacionaria (inmiscible
con la móvil) que se mantiene fija en una columna o sobre una superficie plana .Las
dos fases se eligen de tal modo que los componentes de la muestra se distribuyen
de modo distinto entre las dos fases. Aquellos que son fuertemente retenidos por
la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de fase móvil, mientras que
los que se retiene débilmente avanzan con más rapidez
CROMATOGRAFIA
INDICE
I CONCEPTOS BÁSICOS SOBRE CROMATOGRAFÍA ................................................... 7
II DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA CROMATOGRAFÍA ............................................... 7
III CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS ................................... 8
1. CROMATOCRAFIA PLANA .............................................................................................. 8
1.1 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL ................................................................................ 8
1.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA ....................................................................... 9
2. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA .............................................................................. 10
2.1 CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC) .................................................................. 11
2.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES .............................................................................. 13
2.3 CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS ................................................ 15
3. QUE ES EL HPLC .............................................................................................................. 15
3.1 LOS COMPONENTES DE HPLC ............................................................................ 16
A. Bomba ................................................................................................................................ 16
B. Inyector ............................................................................................................................. 17
C. Columna ........................................................................................................................ 17
D. Detector ......................................................................................................................... 17
E. Registración de Datos..................................................................................................... 17
F. Desgasificador ................................................................................................................. 18
G. Horno de columna ....................................................................................................... 18
4. TRABAJO EXPERIMENTAL CROMATOGRAFIA ...................................................................... 19
 TERMINOS EMPLEADOS EN CROMATOGRAFIA

Analito: Es la sustancia que se va a separar durante la cromatografía.

Fase móvil: Es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido
Un gas o un fluido supercrítico
Fase estacionaria: Es la sustancia que está fija en una posición durante la
cromatografía. Un ejemplo es la capa de gel de sílice en la cromatografía en capa
fina.
Cromatografía analítica: Se emplea para determinar la existencia y posiblemente
también la concentración de un analito en una muestra.
Fase enlazada: Es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas
de soporte o a las paredes internas de la columna.
Cromatograma: Es una gráfica de alguna función de la concentración de un soluto
frente al tiempo de elusión o el volumen de elución.
Cromatógrafo: Es el equipo que permite una separación sofisticada. Por ejemplo, un
cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.
Cromatografía: Es el método físico de separación en el cual los componentes que se
van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase
estacionaria) mientras la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida.
Eluyente: Es la fase móvil que atraviesa la columna.
Serie eluotrópica : Es una lista de disolventes clasificados según su poder de dilución.
Fase inmovilizada: Es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre partículas de
soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.
Cromatografía preparativa: se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para
un uso posterior, más que para análisis.
Tiempo de retención: Es el tiempo transcurrido entre la inyección de una muestra y
la aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatografíca
Muestra: Es la materia que va a ser analizada en la cromatografía. Puede consistir
en un simple componente o una mezcla de varios.
Soluto: Es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
Disolvente: Es toda sustancia capaz de solubilizar a otra, y especialmente la fase
móvil líquida en cromatografía de líquidos.
Capacidad de carga: Es la cantidad máxima de muestra que puede ser separada en
una sola carga.
Capacidad de fraccionamiento: Es el número máximo de componentes que pueden
ser separados en una sola operación.
Selectividad: Es la capacidad de poder discriminar y distinguir entre dos
componentes.
 CAPITULO I
CROMATOGRAFIA
I CONCEPTOS BÁSICOS SOBRE CROMATOGRAFÍA

Antes de definir los conceptos básicos para entender los distintos tipos de
separaciones cromatografícas, haré una breve introducción y una explicación
general sobre la cromatografía. Los conceptos que más adelante se explican se
refieren a la cromatografía en columna, sin embargo, es importante señalar que
como los equilibrios en los que se basan los dos tipos de cromatografía son idénticos,
la teoría desarrollada para la cromatografía en columna se adapta también
fácilmente a la cromatografía plana.

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un método muy utilizado en todas las ramas de la ciencia y que

permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos
en mezclas complejas. Ningún otro método de separación es tan potente y de
aplicación tan general como la cromatografía.
II DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA CROMATOGRAFÍA

Es difícil definir rigurosamente el término de cromatografía, ya que se ha aplicado

ese nombre a varios sistemas y técnicas. Sin embargo, todos esos métodos tienen en
común el uso de una fase estacionaria y una fase móvil. En todas las separaciones
cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil, que puede ser un gas,
un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase
estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie
sólida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos
componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se
unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia
de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas
discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen

mutuamente:

 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y puede ser
usados posteriormente (etapa final de muchos síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica).en este
caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.
 III CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

Los métodos cromatógrafos son de dos tipos. En la cromatografía en columna, la fase

estacionaria está contenida en un tubo estrecho y se fuerza el paso de la fase móvil a
través del tubo, ya se a presión o por gravedad. En la cromatografía plana, la fase
estacionaria esta sostenida sobre una placa plana o en los poros de un papel. Aquí,
la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por efecto
de la gravedad. Aquí se considera solamente la cromatografía de columna. Los
métodos cromatógrafos se dividen en tres categorías, según la naturaleza de la fase
móvil:
Líquido, gas y fluidos supercrítico.

1. CROMATOCRAFIA PLANA

Entre los métodos de la cromatografía plana figura la cromatografía de capa fina, la

cromatografía en papel y la electrocromatografia. Cada uno de ellos utiliza una capa
plana y relativamente fina de material que se sostiene por si misma o se aplica como
recubrimiento sobre una superficie de vidrio, plástico o metal. La fase móvil avanza
a través de la fase estacionaria por capacidad, ayudada en ocasiones por la acción
de la gravedad o de un potencial eléctrico. A la cromatografía plana se le denomino
en una época cromatografía bidimensional, aunque esa denominación ha llegado a
significar hoy al acoplamiento de dos técnicas cromatografías con diferentes
mecanismos de separación. Casi toda la cromatografía plana se basa actualmente en
la técnica de capa fina, que es más rápida, tiene mejor resolución y resulta más
sensible que su equivalente en papel. Esta sección está dedicada a los métodos de
capa fina.

1.1 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

La separación por cromatografía en papel se realiza de la misma forma que las de

placas de capa fina. Los papeles se fabrican con celulosa altamente purificada y un
estricto control de la porosidad y el espesor. Esos papeles contienen suficiente agua
adsorbida para que la fase estacionaria sea acuosa. Sin embargo se pueden usar
otros líquidos para desplazar el agua, con lo cual se obtiene una fase estacionaria de
un tipo diferente. Por ejemplo, el papel tratado con aceite de silicona o de parafina
permite efectuar la cromatografía en papel en fase reverse en la que la fase móvil es
un disolvente polar. También se ofrecen comercialmente papeles especiales que
contienen un adsorbente o una resina de intercambio y único, lo cual permite
efectuar la cromatografía en papel de adsorción y de intercambio único.

La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel filtro. La
muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y
evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace
ascender por capilaridad. Luego se coloca la tira de papel verticalmente y con la
muestra de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo.
Después de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al
extremo se retira el papel y se deja secar. Si el disolvente elegido fue adecuado y
las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas.
Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de
revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la
elección del disolvente y la del papel de filtro.
Un ejemplo podría ser que utilices un pedazo de papel y le hagas puntos de colores
con plumones permanentes y le pongas un lápiz del lado donde no están los puntos
de colores (esto te servirá como soporte), después en un vaso pon alcohol y coloca
la tira de papel con el lápiz horizontalmente en la parte de arriba para que el papel
no caiga y tienes que esperar para que el alcohol haga efecto en el papel, lo que
sucederá es que a los puntos de colores se les harán unas pequeñas líneas hacia
arriba.

1.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

La cromatografía en capa fina es una técnica cromatográfica que utiliza una placa
inmersa verticalmente. Esta placa cromatográfica consiste en una fase estacionaria
polar (comúnmente se utiliza sílica gel) adherida a una superficie sólida. La
cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas
relativamente pequeñas. En la biología celular se utiliza frecuentemente para
separar azúcares simples, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, metabolitos, y
ocasionalmente para separar cadenas cortas de polipéptidos y ácidos nucleicos. Al
igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase móvil y
el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o
se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente
proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel
de silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio,
aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible. El tipo
de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de
moléculas que se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores
fluorescentes. La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un
solvente orgánico o una mezcla de ambos.

El procedimiento es sencillo: Se colocan las muestras a un centímetro del borde en

uno de los extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase
(tanque de desarrollo) que ya contiene una pequeña cantidad del solvente, se tapa y
se deja correr por un rato. El solvente subirá por capilaridad e irá arrastrando las
moléculas, las cuales se moverán según la afinidad que muestren por la fase
estacionaria. Si la mezcla de muestras que se está analizando presenta color, se verán
los distintos colores migrando a distintas velocidades. Si son incoloras hay que
someter la placa a algún tratamiento con una sustancia desarrolladora para poder
determinar la presencia de sustancias sobre el silicato.

Cálculo del factor de retención Rf

Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el valor
de Rf (factor de retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la
placa. Cada compuesto tiene un Rf característico que depende del disolvente
empleado y del tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido
del disolvente. De esta manera se puede ayudar a identificar un compuesto en una
mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando
se hacen eluir en la misma placa de CCF).

PREPARACION DE PLACAS DE CAPA FINA

Una placa de capa fina se prepara esparciendo una suspensión acuosa del solido
finamente molido, sobre la superficie limpia de una placa de vidrio o plástico, o de
un portaobjetos de microscopio. Con frecuencia se incorpora un aglomerante a la
suspensión acuosa para reforzar la adhesión de las partículas sólidas al vidrio y de
unas con otras. De deja entonces que la placa repose hasta que la placa se asiente
y adhiera firmemente a la superficie, para ciertos propósitos se puede calentar la
placa en un horno durante varias horas.

2. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Es una técnica de purificación, puesto que permite aislar los compuestos deseados
de una mezcla. La cromatografía en columna es quizás el método más general,
utilizado para la separación, a la vez que para la purificación, de diferentes
compuestos orgánicos que se encuentren en estado sólido o líquido. En este tipo de
cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el
interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso
de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el
eluyente o fase móvil. Seguidamente la mezcla orgánica que nos interesa separar la
depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y así la fase móvil podrá ir
atravesando el sistema.

Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco saldrán de
la columna cromatográfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos
polares, que son por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente,
serán las primeras en salir de la columna. En cambio, las sustancias más polares,
quedan retenidas por más tiempo en el absorbente, y a menudo es necesario el uso
de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad para que sean
arrastradas por estos. El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la
columna, se conoce con el nombre de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo
característico de cada compuesto en una condiciones cromatográficas
determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la presión, el
diámetro que tenga la columna utilizada, etc. El absorbente mayormente utilizado
para las cromatografías en columna, es el gel de sílice. A veces, en sustitución del
gel de sílice, cuando éste es incompatible con la mezcla a cromatografiar, se utilizan
la alúmina o el florisil (silicato magnésico).

La cromatografía en columna puede realizarse por gravedad o a media presión.

Cuando se realiza a media presión, se conecta la cabeza de la columna a un
compresor o a una línea de aire comprimido. La medida de las partículas de gel de
sílice para realizar las cromatografías a media presión debe ser más pequeñas que
en el caso de la cromatografía por gravedad. Si en la cromatografía por gravedad
utilizásemos un gel de sílice con un tamaño de partículas más pequeñas, no se
produciría elución, pues se impediría el flujo del disolvente. Pero en cambio, si
aplicamos presión, entonces debido a la fuerza si se produciría la elución por el
disolvente. A causa de la disminución del tamaño de las partículas del absorbente,
se produce una separación más eficaz. Generalmente la cromatografía a media
presión, produce mejores resultados que la cromatografía por gravedad, y además,
al ser más rápida, es la más utilizada. Cuando vamos a realizar una cromatografía en
columna, lo primero que debemos hacer es elegir un disolvente adaptado para
nuestro caso, para así optimizar la separación de los componentes de la mezcla.
Dicha operación se produce a través de cromatografía analítica en capa fina. La
variante más influyente en la eficacia de la separación de la cromatografía a media
presión usando gel de sílice es el diámetro de la columna, así como la cantidad de
gel utilizado. Para elegir el disolvente, primero se lleva a cabo una cromatografía en
capa fina de la muestra a analizar. El disolvente debe producir una buena separación
de los componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar
a un Rf cercano a 0.3. En el caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un eluyente
menos polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en placa. A veces
se utilizan mezclas de disolventes y se hace una elución en gradiente. Para esto, la
cromatografía se inicia con una mezcla de disolventes de polaridad adecuada para
poder separar el componente que posea mayor Rf, y así, una vez recogido, se
aumentará poco a poco la polaridad para poder ir separando los componentes más
polares. Si cuando se empieza la cromatografía se usa un disolvente excesivamente
polar, los componentes de la mezcla eluirán conjuntamente, lo que llevaría a que la
separación no tenga lugar. Una de las mezclas de disolventes más utilizadas
es hexano/acetato de etilo.

2.1 CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC)

La cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) se ha convertido en una

herramienta analítica indispensable es frecuente el uso de la HPLC en el
procesamiento de las pruebas en HPLC están incluidas las formas de cromatografía
de reparto, adsorción, intercambio iónico, exclusión molecular de afinidad y quiral
.la cromatografía liquida tiene aplicaciones no solo en la medicina forense sino
también en bioquímica farmacéutica y toxicología.
La cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), los químicos la emplean para
separar y determinar especies en diversos materiales orgánicos, inorgánicos y
biológicos. En cromatografía liquida, la fase móvil es un disolvente líquido que
contiene la muestra como mescla de solutos .los tipos de cromatografía liquida de
alta resolución suelen clasificarse según el mecanismo de separación o el tipo de
fase estacionaria estos comprenden:
Cromatografía de reparto o de líquido –liquido, Cromatografía de adsorción o de
líquido –solido
Cromatografía de intercambio de iones o iónica, Cromatografía de exclusión
molecular
Cromatografía de afinidad, Cromatografía quiral

INSTRUMENTACION

Para lograr velocidades de flujo razonables con los empaquetamientos habituales

en cromatografía liquida moderna con un intervalo de tamaño, de 3-10 um, se
requieren presiones de bombeo de varios centenares de atmosferas. Como
consecuencia de esa presión tan alta, el equipo de HPLC tiende a ser mucho más
complejo y costoso que el de otros tipos de cromatografía.
 RECIPIENTES DE FASE MOVIL Y SISTEMAS DE TRATAMIENTO DE DISOLVENTES

Los aparatos de HPLC modernos están equipados con uno más recipientes de vidrio
cada uno de los cuales contiene 500ml o más de un disolvente .frecuentemente
incluye accesorios para eliminar los gases disueltos y partículas en suspensión de
los líquidos. De ello los primeros producen burbujas en la columna y pueden causar
ensanchamiento de la banda además tanto las burbujas como las partículas
interfieren en el rendimiento de muchos detectores .los desgasificadores pueden
consistir en un sistema de bomba de vacío ,uno de destilación ,un dispositivo para
calentamiento y agitación ,un sistema de burbujeo o sparging,en el que los gases
disueltos se extraen de la disolución mediante burbujas finas de un gas inerte que es
insoluble en la fase móvil .

SISTEMAS DE BOMBEO

Existen tres tipos de bombas: las de tipo de jeringa impulsada con tornillo, las
bombas de vaivén u oscilantes y las bombas neumáticas o de presión constante. Las
de tipo de jeringa produce una salida no pulsada cuya velocidad de flujo se controla
fácilmente; pero tiene una bajan capacidad (~250ml) y no resulta apropiado cuando
se requiere cambios en los disolventes. El movimiento de la bomba produce un flujo
pulsado que debe atenuarse después. Entre las ventajas de la bomba oscilante cabe
mencionar un volumen interno pequeño, una presión de salida alta (hasta de 10000
psi) su fácil adaptación a la elución en gradiente y una velocidad de flujo constante,
que es en gran parte independiente de la contrapresión de la columna y la
viscosidad del disolvente. Muchos cromatógrafos comerciales modernos incluyen
una bomba oscilante.
Algunos instrumentos emplean la bomba reumática, cuya forma más sencilla consiste
en un recipiente plegable que contiene un disolvente que puede presurizarse con un
gas comprimido. Las bombas de este tipo son sencillas, no bajo costo y no genera
pulsos, pero tiene una capacidad y una salida de presión limitadas, y su velocidad
de bombeo depende de la viscosidad del disolvente. Además, no son adaptables a
la elusión en gradiente.

SISTEMA DE INYECCION DE MUESTRAS

El sistema de inyección de muestras más usado en la cromatografía liquida se basa

en un bucle, de muestras como el ilustrado. Este tipo de dispositivo es parte integral
de algunos equipos de cromatografía liquida. Frecuentemente se encuentran
disponibles bucles intercambiables de una amplia gama de tamaños que varían de 5
a 500 ul. La reproducibilidad típica de las inyecciones con bucle de muestras es del
orden de décimas de punto porcentual relativa .muchos instrumentos de HPLC,
incluyen un muestreador dotado de un inyector automático que permite la inyección
continua de volúmenes variables.
 2.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES

En esta técnica cromatografica, la muestra se inyecta y volatiliza en la cabeza de una

columna cromatografica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un
gas inerte y a diferencia de la mayoría de las técnicas cromatograficas la fase móvil
no interacciona con las moléculas del analito, su única misión es transportar el analito
a través de la columna.

Existen dos clases de cromatografía de gases:

CROMATOGRAFÍA GAS–SOLIDO: la fase estacionaria es un sólido de gran área

superficial sobre el que se adsorbe el analito. Actualmente solo se aplica a la
separación de especies de bajo peso molecular (CO2, O2, N2 e hidrocarburos).los
compuestos más polares son retenidos en la fase estacionaria de manera
semipermanente.

CROMATOGRAFIA DE GAS-SOLIDO

La cromatografía de gas solido se basa en la adsorción de sustancias gaseosas en

superficies sólidas .los coeficientes de distribución generalmente son mucho
mayores que en la cromatografía de gas líquido .por consiguiente la cromatografía
de gas solido es útil en la separación de especies que no se retienen con columnas
de gas líquido, como los componentes de aire, sulfuro de hidrogeno, bisulfuro de
carbono, óxidos de nitrógeno, monóxido y dióxido de carbono, y gases raros.

La cromatografía de gas solido se realiza con columnas tubulares abiertas y

empaquetadas .En las segundas, se fija una capa fina del adsorbente a la pared
interna del capilar. En ocasiones se las denomina columnas tubulares abiertas de
capa porosa

CROMATOGRAFÍA GAS - LÍQUIDO: La fase estacionaria es un líquido no volátil

inmovilizado sobre la superficie de un soporte sólido inerte. La velocidad de
migración de un analito está determinada por su distribución entre la fase líquida
inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, la volatilidad del analito y su
solubilidad en la fase estacionaria son los factores que regulan su retención.

INSTRUMENTACION EN CROMATOGRAFIA DE GAS-LIQUIDO

SISTEMA DE GAS PORTADOR

El gas de la fase móvil en cromatografía de gases se llama gas portador .el hielo es
el gas usado ,pero también se utiliza el argón ,nitrógeno e hidrogeno .estos gases
están disponibles en tanques presurizados ,se requieren reguladores de presión
,calibradores y medidores de flujo para controlar la velocidad de flujo del gas .la
velocidad de flujo normalmente se controla mediante un regulador de presión de
dos etapas en el canal de gas y algún tipo de regulador de presión o de flujo montado
en el cromatógrafo ,las presiones de entrada suelen ser 10-50 psi(𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑠/𝑝𝑢𝑙𝑔𝑎𝑑𝑎𝑠 2 )
mayores que la presión ambiental , lo que produce velocidades de flujo de 25-
150ml/min en columnas empaquetadas y de 1-25ml/min con columnas capilares
tubulares abiertas . en general se supone que la velocidad de flujo es constante si la
presión de entrada se mantiene constante :mediante un rotometro colocado en la
cabeza de la columna resulta posible establecer las velocidades de flujo pero el
dispositivo no es tan preciso como el medidor de pompas de jabón .
SISTEMA DE INYECCION DE MUESTRAS

Las muestras están formadas por un disolvente, compuestos volátiles (analito) y

compuestos no volátiles (suciedad). El método más común de inyección de muestra
implica el uso de una microjeringa que inyecta la muestra liquida o gaseosa a través
de un septum de goma de silicona en una cámara de vaporización instantánea situada
en la cabeza de la columna. Esta cámara normalmente está a unos 50c° por encima
del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra.

Al inyectar con microjeringa el sistema debe asegurar:

 Que la muestra se vaporice en la cabeza dela columna sin distorsión del gas
portador
 Que la muestra ocupe la mínima longitud posible de la columna

APLICACIONES DE CROMATOGRAFIA DE GAS –LÍQUIDO

La cromatografía de gas líquido es aplicable a especies que posean una apreciable

volatilidad y estabilidad térmica a temperaturas de hasta unos 100C°. La cantidad de
compuestos de interés que poseen esas cualidades es enorme. Por consiguiente, la
cromatografía de gases ha sido ampliamente utilizada en la separación de y
determinación de los componentes en diversos tipos de muestras
Por ejemplo: alcoholes, alcaloides esteroides, alcoholes en la sangre etc.

ANALISIS CUALITATIVO

La cromatografía de gases se usa mucho para establecer la pureza de compuestos

orgánicos .los contaminantes si los hay, se hacen evidentes por la aparición de picos
adicionales, las áreas bajo esos picos son estimaciones aproximadas de la magnitud
de la contaminación .la técnica también reviste utilidad para evaluar la efectividad
de los procedimientos de purificación.
En teoría los tiempos de retención CG deben ser útiles para identificar componentes
en mezclas. Sin embargo en la práctica la aplicabilidad de esos datos está limitada
por el número de variables que deben controlarse para obtener resultados
reproducibles .no obstante ,la cromatografía de gases es una excelente medio para
confirmar la presencia o ausencia de un posible compuesto en una mezcla , si se
dispone de una muestra estándar autentica de dicha sustancia .al agregar el
compuesto conocido no deben aparecer nuevos picos en el cromatograma de la
mezcla y de observarse la intensificación de un pico ya existente . la prueba es
particularmente convincente si resulta posible reproducir dicho efecto en columnas
distintas y con temperaturas diferentes .por otra parte ,un cromatograma
proporciona un solo dato acerca de cada especie de una mezcla (tiempo de
retención)de modo que es limitada la aplicación de la técnica al análisis cuantitativo
de muestras complejas de composición desconocida .esta limitación se ha superado
en gran parte al vincular directamente las columnas cromatograficas con
espectrómetros ultravioleta, infrarrojo y de masas .los instrumentos hifenados
resultantes son muy poderosos para identificar los componentes de mezclas
complejas.
Por ejemplo: del uso de espectrometría de masas acoplada la cromatografía de gases
en la identificación de la sangre.
 2.3 CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS

La cromatografía de fluidos supercríticos es una técnica híbrida entre

la cromatografía de gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas técnicas.
Esta técnica es importante porque permite la separación de mezclas en las que no es
adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a compuestos
no volátiles o térmicamente inestables que no pueden separarse mediante GC, o
aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su detección en la
HPLC.
APLICACIONES
La SFC es una herramienta de gran importancia en la separación y determinación de
compuestos para los que las cromatografías de gases o de líquidos no son
adecuadas:

 Compuestos no volátiles o termolábiles, que descomponen térmicamente antes de

volatilizarse, por lo que la cromatografía de gases no se puede aplicar.
 Compuestos sin grupos funcionales que puedan ser detectados mediante técnicas
espectroscópicas o electroquímicas que se emplean en cromatografía de líquidos.
Los fluidos supercríticos son capaces de disolver moléculas grandes no
volátiles (con masas moleculares varios órdenes de magnitud mayores que las que
se manejan en la cromatografía de gases, aunque no tanto como las que pueden
separarse mediante la cromatografía de exclusión por tamaño) y los solutos disueltos
en ellos se pueden recuperar con facilidad dejando que las disoluciones se
equilibren con la atmósfera a temperaturas relativamente bajas.
La cromatografía de fluidos supercríticos se aplica a un amplio conjunto de
sustancias: productos naturales, fármacos, alimentos, plaguicidas, herbicidas,
tensioactivos, aditivos, polímeros, explosivos… La separación de estos compuestos
se puede llevar a cabo a temperaturas inferiores a 100 ºC, por lo que no llegan a
descomponerse.

La SFC se aplica a una gran variedad de compuestos, entre los que podemos citar
drogas, alimentos, herbicidas, tensioactivos, polímeros y aditivos para éstos,
impelentes, explosivos o combustibles fósiles

3. QUE ES EL HPLC

HPLC significa cromatografía líquida de alto rendimiento. Antes que el HPLC esté
disponible, el análisis de LC era llevado a cabo por el flujo gravitacional del eluyente
(el disolvente utilizado para el análisis de CL), lo que requiere varias horas para que
el análisis sea completado. Incluso las mejoras añadidas más tarde fueron capaces
solo de acortar el tiempo de análisis un poco. Los sistemas CL iniciales se llaman
“cromatografía de baja presión” o “cromatografía en columna”.

Por lo tanto, se solía pensar que HPLC significa cromatografía líquida de alta presión,
sin embargo hoy en día es entendido que las siglas HPLC se refieren a Cromatografía
Líquida de Alto Rendimiento. Otro gran cambio a partir de la fecha de Tswett fue los
métodos de adquisición de datos. En lugar de observar los cambios de las capas con
los ojos, se acopló el sistema detector y la información de datos fueron grabados en
hojas de papel. Si tuviéramos que demostrar el resultado del análisis de Tswett sería
un gráfico (cromatograma), como la figura

APLICACIONES DE HPLC

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos

de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como
condición, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente, al ser la
fase móvil un líquido. Es especialmente adecuada para compuestos poco volátiles,
termolábiles e iónicos. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos,
terpenos, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una gran
variedad de sustancias inorgánicas.

Ejemplos de utilización de HPLC:

 Detección y cuantificación de cafeína y teobromina que son alcaloides muy

importantes en el café, té y el cacao, especialmente por su acción estimulante. El
contenido de estos compuestos se utiliza para evaluar su calidad. (Detección UV
 Determinación de azúcares. La analítica de carbohidratos no resulta fácil pues
presenta acumulación de grupos funcionales iguales, los grupos hidroxilo, y
además posee gran número de esteroisómeros. Tras una dilución los azúcares se
separan cromatográficamente por medio de HPLC en una fase amínica.
(Detección IR)
 Determinación cuantitativa de polisacáridos como el almidón, las dextrinas, los
dextranos, el glucógeno, la inulina, la celulosa, las hemicelulosas, las pectinas,
así como sustancias mucilaginosas de algas marinas y las gomas vegetales. -
Detección de ciclomato en jugos de fruta.
 Separación de ésteres de ácidos grasos por fase inversa y con argentización de
columnas (Silicato de Al con Ag). - Separación de Triglicéridos por la longitud de
la cadena y el grado de insaturación por fase inversa y detector de dispersión
luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas.
 Determinación del contenido de Vit A y sus precursores (y β caroteno) en
margarina y aceites de hígado por fase inversa. - Determinación del contenido
en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal.

3.1 LOS COMPONENTES DE HPLC

A. Bomba

En la primera etapa del desarrollo del HPLC, la bomba fue la parte más importante
del sistema. El desarrollo del HPLC se puede decir que fue dado por el desarrollo
del sistema de bombeo. La bomba se colocaba en lo más alto del sistema CL y
generaba un flujo del reservorio del disolvente al sistema. En esta etapa el requisito
más importante del sistema era poder generar una alta presión. Sin embargo, hoy en
día, la generación de alta presión es normal y lo que más preocupa más hoy en día
es proporcionar una presión constante en cualquier condición, para proporcionar un
caudal controlable y reproducible dado que el cambio en la proporción del flujo
puede influir el análisis en gran medida. La mayoría de las bombas utilizadas en los
sistemas LC actuales generan el flujo con un movimiento de vaivén de un pistón de
motor (bombas de pistón). Debido a este movimiento del pistón, se produce
“pulsos”. Ha habido grandes mejoras del sistema para reducir esta pulsación y las
bombas recientes crean un pulso muy inferior a las antiguas bombas. Sin embargo,
los análisis actuales requieren una sensibilidad muy alta para cuantificar una
pequeña cantidad de analitos, e incluso un pequeño cambio en la velocidad del flujo
puede influir en el análisis. Por lo tanto, las bombas necesarias para el análisis de
alta sensibilidad tienen que ser muy precisas.

B. Inyector

Un inyector se coloca al lado de la bomba. El método más simple es utilizar una

jeringa, y la muestra se introduce en el flujo de eluyente. Ya que la precisión de la
medición por CL tiene mucho que ver con la reproducibilidad de la inyección de la
muestra, el diseño de los inyectores es un factor importante. El método de inyección
más utilizado se basa en lazos de muestreo. El uso de muestreador automático (auto-
inyector) del sistema también es ampliamente utilizado ya que permite una serie de
inyecciones repetitivas en un tiempo programado.

C. Columna
La separación se lleva a cabo dentro de la columna, por lo tanto, se puede decir que
la columna es el corazón de un sistema de CL. La teoría de la cromatografía en
columna no ha cambiado desde la época de Tswett, sin embargo ha habido una
continua mejora en el desarrollo de la columna. Las columnas recientes suelen estar
preparados en una carcasa de acero inoxidable, en lugar de columnas de vidrio
utilizadas en el experimento de Tswett. En general, el material de relleno que se
utiliza es de gel de sílice o de polímeros en comparación con el carbonato de calcio
utilizado por Tswett. El eluyente utilizado para la CL varía de ácido a solventes
básicos. La mayoría de la cubierta de la columna es de acero inoxidable y es
tolerante a una gran variedad de disolventes. Sin embargo, para el análisis de
algunos analitos como las biomoléculas y los compuestos iónicos, el contacto con el
metal no es deseable, por lo tanto columnas con cubierta de poliéter éter cetona
(PEEK) se utiliza en su lugar.

D. Detector

La separación de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que un

detector se utiliza para observar la separación obtenida. La composición del
eluyente es consistente cuando no hay analito está presente, en cambio la presencia
del analito cambia la composición del eluyente. Lo que el detector hace es medir
estas diferencias. Esta diferencia se observa como una forma de señal electrónica.
Hay diferentes tipos de detectores disponibles.

E. Registración de Datos

El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de señal electrónica,

y así no es visibles a nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma- papel-registrador
gráfico se utilizaba muy popularmente. Hoy en día, una computadora con un posesor
de base de datos (integrador) es más común. Hay varios tipos de procesadores de
datos, e incluye un sistema simple que consiste en construir la impresora y el
procesador de textos, y un tipo de computadora personal que consta de monitor,
teclado e impresora. También hay programas que están diseñados específicamente
para el sistema LC. Ofrece no sólo la adquisición de datos, pero también cateréticas
como máximo de ajuste, la corrección de línea base, el cálculo automático de la
concentración, la determinación del peso molecular, etc Los componentes
introducidos hasta el momento son los fundamentos del sistema LC. A continuación
se presentan algunos equipos opcionales se utiliza con el sistema básico de LC.

F. Desgasificador
El eluyente utilizado para análisis con LC puede contener gases como oxígeno que
son no visibles a nuestros ojos. Cuando el gas está presente en eluyente, este se
detecta como un ruido y causas una línea base inestable. Generalmente los métodos
que se utilizan incluye el burbujeo (burbujeo de gas inerte), uso de bomba de vacio,
sistema destilación, y / o calentamiento y agitación. Sin embargo, estos métodos no
son convenientes cuando el disolvente se deja por un período de tiempo
determinado (por ejemplo, durante un análisis largo). El desgasificador usa unos
tubos de membrana de polímero especial para eliminar los gases. Los numerosos
pequeños poros en la superficie del tubo de polímero permite que el aire pase a
través mientras que previene cualquier otro líquido pasar a través del poro.
Mediante la colocación de esta tubería bajo el contenedor de baja presión, crea las
diferencias de presión dentro y fuera de la tubería (mayor en el interior del tubo).
Esta diferencia hace que el gas disuelto se mueva a través de los poros y eliminar el
gas. En comparación con el tipo clásico de desgasificación por lotes, el
desgasificador se puede utilizar on-line, es más conveniente y eficiente. Muchos de
los nuevos sistemas HPLC contienen un desgasificador.

G. Horno de columna
La separación con LC es a menudo muy influenciada por la temperatura de la
columna. Con el fin de obtener resultados repetibles, es importante mantener una
temperatura constante. También para algunos análisis, como el azúcar y los ácidos
orgánicos, se puede obtener mejor resolución a temperatura elevada (50 ~ 80 º C).
También es importante mantener una temperatura estable para obtener resultados
repetibles, incluso cuando se analiza a una temperatura de ambiente. Hay
posibilidades de que los diferentes cambios de temperatura haga que los resultados
de la separación sean diferentes. Generalmente las columnas se mantienen dentro
del horno de columna (calentador columna).
 4. TRABAJO EXPERIMENTAL CROMATOGRAFIA
(Cromatografía en papel)
Materiales
 3 placas Petri
 3 vaso precipitado de 250 ml
 Hojas de espinaca
 Una zanahoria
 Una betarraga
 Papel filtro
 Tijera
 Un embudo
 3 matraz de 100 ml
 Alcohol de 96C°
 Cuchillo

OBJETIVOS:
 separar los componentes de zumo de (zanahoria,beterraga,hojas de espinaca)
 determinar las distancias recorridas del compuesto y del disolvente (Rf)

PROCEDIMIENTOS
1. Tener listos los materiales y los reactivos y el zumo que se utilizaran para la
experimentación.

2. Trituración y obtención de zumo de cada producto para la separación

3. Los zumos son separados en placa Petri y se añaden aproximadamente 10 ml

en cada placa
 4. Instalación de papel filtro en forma vertical en cada muestra
5. Observación de los pigmentos separados e identificación de los colores
separados

6. Medición del compuesto recorrida y del disolvente para determinar el (Rf)

a) BETERRAGA

4.3𝑐𝑚 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜
𝑅𝑓 = = 0.67
6.4 𝑐𝑚 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

b) ESPINACA:
𝑐𝑚 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜
𝑅𝑓 = = 0.65
4.6 𝑐𝑚 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
c) ZANAHORIA:
2.5𝑐𝑚 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜
𝑅𝑓 = = 0.59
4.2 𝑐𝑚 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
 CONCLUSION
El experimento realizado tiene una gran importancia ya que nos permite separar los
pigmentos de cada zumo en donde se observan los colores que se separan y así
mismo se determinaron según las velocidades que recorren la sustancia y el
compuesto para hallar Rf los componentes se observan por los colores que resaltan
después de ser secado a una temperatura de calor
 Betarraga en la separación se observan los colores violeta,
amarillo,morado,anaranjado
 Espinaca en la separación se observan los colores verde claro, amarillento verde
caña
 Zanahoria en la separación se observan los colores morado ,amarillento,
anaranjado
De esta manera el trabajo de investigación en experimentación se concluye a
cumplir con los objetivos propuestos.

BIBLIOGRAFÍA.

 https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_de_gases
 https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8247/4/T3gascromat.pdf
 http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html
 https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa
 http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/cromatografa-
de-lquidos-hplc