Protocolo aislamiento de microorganismos celulolíticos

Proyecto cepario : colección de microorganismos de interés agro empresarial

Objetivo : aislar e identificar microorganismos celuloliticos

Laboratorio de biotecnología - sena agro empresarial y minero

Introducción

Microorganismos celuloliticos

La celulosa es un polisacárido cuya fórmula es (C6H10O5)n. Es el principal componente de la

membrana celular de la mayor parte de las plantas. Está constituida por moléculas de D-
glucosa y es polímero más abundante en la biosfera, uno de los componentes más abundantes
de la biomasa vegetal y por lo cual se encuentra en gran medida en el suelo, es degradada por
una serie de microorganismos mediante la acción de varias enzimas no asociadas en complejos
como las celobiohidrolasas y las endoglucanasa que se encargan de su degradación, como en
los hongos filamentosos y en algunos actinomicetos o formando un complejo denominado
"celulosoma", como en los clostridios y en bacterias del rumen (Murashima et al., 2002; Lynd
et al., 2002)

Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen hongos y bacterias aerobios y

anaerobios mesofilicos y termofilicos que ocupan una variedad de hábitats. Entrelos hongos
celuloliticos se destacan Thrichoderma reesei; Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani,
Penicillium funiculosum, Thrichoderma koningii, Sporotrix sp, Alternativa sp , Geotrichum
spRhizoctonia sp, Trametes sp, Mucor sp, Cladosporium sp, Buñgaria sp, Chaetomium sp.
Helotium sp, Aspergillus sp. Las bacterias celuloliticas mas abundantes y conocidas son las
aerobias entre las cualesse puede citar: Cellulomonas sp, Microbi spora bispora,
Thermomonospora sp., Cytophaga sp, Cory nebacterium sp, Vibrio sp, Bacillus sp, Pseudomona
sp, Thermobifida sp. Ademas se encuentran algunosanaerobios como Acetivibrio cellulolyticus,
Butirivibrio sp, Bactroides cellulolyticus, Bacteroides succnogenes, Clostridium cellulovorans,
Clostridium thermocellum, Ruminococcus albus, Rumionococcusflavefaciens. Entre los
actinomicetes se destacan. Sterptpmyces drozdowiczii, Streptomyces cellulolyticus,
Thermomonospora curvata, thermomonospora chromogena, thermomonospora alba y
Thermomobifidafusca.

El pH optimo para la actividad de las celulasas producidas por bacterias abarca un amplio
rango, el cual incluye condiciones alcalinas y acidas. Por otro lado, las celulasasproducidas por
hongos requieren generalmente un pH acido.
Fundamento

La lignina conforma la pared celular de las plantas, es un polímero constituido por celulosa y
hemicelulosa (Ortiz, 2009). Los microorganismos lignolíticos catabolizan la celulosa y la
hemicelulosa. La mayoría de estos son hongos de la pudrición blanca y algunas bacterias
(Dávila & Vázquez-Duhalt, Enzimas lignocelulolíticas fúngicas para fines ambientales, 2006).

La celulosa es un polímero de origen vegetal constituido por 15.000 moléculas de D-glucosa.

Forma una estructura rígida de cadenas paralelas unidas por puentes de hidrógeno (Cuamatzi,
2004). Los microorganismos celulolíticos son mesofílicos, termofílicos, aerobios y anaerobios
de los géneros Bacillus sp., Clostridium sp., Streptomyces y hongos como Sclero tium sp.,
Aspergillus sp., Achlya sp., Rhizopus sp. y Penicillum sp. (Gaitán & Pérez, 2007).

Los microorganismos capaces de degradar celulosa secretan un sistema complejo de enzimas

extracelulares, celulasas y xilanasas, que actúan en forma conjunta en la degradación de
celulosa y hemicelulosa (los dos componentes principales de la madera).

Las fibras de celulosa son degradadas esencialmente por dos tipos de sistemas enzimáticos
llamados agregativos y no agregativos, como se muestra en la siguiente figura:

Los microorganismos celulolíticos (que degradan celulosa) desempeñan un papel importante

en la biosfera reciclando este polímero. Existe una diversidad de estos microorganismos,
bacterias y hongos aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos (ver Cuaderno Nº 57), que
producen las enzimas celulasas. Algunos de ellos son:
GRUPO ESPECIES
Hongos aerobicos Trchodermaviride,trichodermareesei,penicillum
pinophilum,fusarium solani,talaromyces emersom y
trichoderma koningii.
Hongos aerobicos Sporotrichum thermophile, thermoascus aurantiacus, y
termofilos humicola insolens.
Hongos anaerobicos Neocallimastix frontalis, piromonas cammunis, sphoeramonas
Mesofilicos cammunis
Bacterias aerobicas Cellulomonas sp, celluibrio sp, microbispora bispora y
mesofilicas y thermomonospora sp.
termofilas
Bacterias anaeróbicas Acetivibrio celbriolyticos,bacteroides succinogenes
mesofilicas y rminococcus albus, ruminococcus flavefaciens y clostridium
termófilas thermocellum.

Dentro del grupo de hongos aeróbicos, el hongo filamentoso Trichoderma reesei es uno de los
más estudiados y se caracteriza por su efectividad en la degradación de la celulosa nativa y
cristalina mediante su complejo celulolítico que presenta las tres actividades necesarias para la
hidrólisis de la celulosa (endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa). Otra ventaja que
presenta el uso de este microorganismo, es su estabilidad en reactores agitados bajo
condiciones de pH ácido y a 50 ºC durante 48 hs.

Entre los microorganismos, los termófilos son de interés por su capacidad para producir
enzimas celulolíticas termoestables, las cuales son en general estables bajo condiciones
severas, incluso en niveles de pH altamente ácidos o alcalinos así como temperaturas de hasta
90 °C.

Las enzimas celulolíticas producidas por las bacterias del género Bacillus presentan
básicamente actividad endo-β-1,4-glucanasa y exo-β-1,4-glucanasa; pero tienen una
característica particular, en especial las enzimas de Bacillus subtillis y es la resistencia a ser
inhibida por la propia glucosa o celobiosa que producen.

En la actualidad existen disponibles numerosos preparados enzimáticos comerciales que

contienen principalmente actividad celulolítica (endo-β-1,4-glucanasa, exo-β-1,4-glucanasa, β-
1,4-glucosidasa). Estos preparados enzimáticos son obtenidos de microorganismos de origen
fúngico y bacteriano, que principalmente provienen de los microorganismos Trichoderma sp.,
Aspergillus níger y Bacillus subtillis.

Aislamiento

Se pesaran 10g de las muestras de residuos vegetales o de las muestreos de suelo tomados
para luego ser llevados a 90 ml de agua peptonada a 0.1% (p/v). Posteriormente se realizaran
diluciones seriadas a en agua peptonada a 0.1% (p/v) a partir de las diluciones
preparadas se realiza siembra en superficie en agar carboximetilcelulosa (cmc) al 1% (p/v).

Las cajas se incubaran a 35ºc por 48 horas

Transcurrido el tiempo de incubación se adiciona rojo congo al 1 % (p/v) como revelador a las
colonias presentes en los medios, luego de 15 minutos se retira el exceso y se adiciona NaCI
0.1 M, dejando reposar por 15 minutos, para luego hacer el recuento de las colonias que
presentaron halos de hidrolisis (teathery Wood, 1982).

Materiales y equipos

 Espátula o cucharilla
 Carboximetilcelulosa 10g
 Extracto de levadura 2.5g
 Peptona universal 2.5g
 Sulfato de amonio 0.5g
 Cloruro de calcio 0.5g
 Fosfato monobásico de potasio 0.1 g
 Fosfato dibasico de potasio 0.1 g
 Agar – agar 15 g
 Agua destilada 1000.0ml
 Rojo congo al 1 % (p/v)
 NaCI 0.1 M
 Balanza analítica
 Plancha de calentamiento y agitación
 Cámara de flujo laminar
 Autoclave
 Potenciómetro

Agar CMC

Composición

Carboximetilcelulosa 10g

Extracto de levadura 2.5g

Peptona universal 2.5g

Sulfato de amonio 0.5g

Cloruro de calcio 0.5g

Fosfato monobásico de potasio 0.1 g

Fosfato dibasico de potasio 0.1 g

Agar – agar 15 g
Cálculos

Carboximetilcelulosa

10 g 1000ml
X= 2.4g de
X 240ml carboximetilcelulosa

X= 10 g x 240ml = 2.4 g

1000 ml

Extracto de levadura

2.5g 1000ml
X=0.6g de extracto de
X 240ml
levadura
X= 2.5 g x 240ml = 0.6g

1000 ml

Peptona universal

2.5 g 1000ml

X 240ml X= 0.6g de peptona

universal
X= 2.5 g x240ml = 0.6g

1000 ml

Sulfato de amonio

0.5 g 1000ml

X 240ml X=0.12g de sulfato de

amonio
X= 0.5 g x 240ml = 0.12g

1000 ml

Cloruro de calcio

0.5 g 1000ml
X=0.2g de cloruro de
X 240ml calcio
X= 0.5 g x 240ml = 0.2 g
 1000 ml

Fosfato monobásico de potasio

o.1g 1000ml

X 240ml X=0.024g de fosfato

monobásico de potasio
X= 0.1g x 240ml = 0.024g

1000 ml

Fosfato dibasico de potasio

0.1 g 1000ml
X=0.024g de fosfato
X 240ml dibasico de potasio
X= 0.1 g x 240ml = 0.024g

1000 ml

Agar – agar

15g 1000ml

X 240ml X= 2.88g de agar

X= 15 g x ? = 2.88g

1000 ml

Rojo congo

1% p/v 1000ml

X 50 ml X=0.5g de rojo congo

X= 1% p/v x 50 ml = 0.5 g

1000 ml

Calculos para preparar cloruro de sodio ( NaCI) AL 0.1 M

Utilizaremos un volumen de 30 ml
1L 1000ml

X 30 ML

X= 30ML x 1L = 0.03L X= 0.03 L

1000 ml

M= n mol = n moles = M . L sln

Lsln n moles = w (peso en gramos ) = w= n mol . pm

Pm

n mol = 0.1 moles/L x 0,03 L = 0,003 n mol

N mol = 0,003

n moles = w ( peso en gramos) = w= n mol . pm

pm

pm NaCI = 58,44 g/mol

w= 0,003 mol x 58,44g/mol = 0,17 g

W= 0,17 g

Procedimiento

Se disuelven cada componente en agua destilada, una vez disueltos todos los componentes se
ajusta el Ph ( 7.1 – 7.2 ), luego se somete a temperatura promedio al punto de ebullición, el
medio tomara un color cristalino esto nos indica que debemos retirar el medio de la plancha
de calentamiento, por siguiente se lleva al autoclave para su debida esterilización por
consiguiente estando el medio esterilizado se reparte en cajas Petri. Después de tener las
cajas cajas con el medio Se inocula en las placas mediante el método por estrías o
agotamiento, esto en condiciones asépticas.

Transcurrido el tiempo de incubación( 36ºc por 48 h ) se adiciona rojo congo al 1 % (p/v) como
revelador a las colonias presentes en los medios ( se le adiciona rojo congo por gotas a las
colonias), luego de 15 minutos de haber adicionado rojo congo como revelador se adiciona
NaCI 0.1 M, dejando reaccionar por 15 minutos mas , para luego hacer el recuento de las
colonias que presentaron halos de hidrolisis.
Bibliografía

Celulosas y Celulasas. ArgenBio (2007)

http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=102

Aislamiento y evaluación de microorganismos celuloliticos a partir de residuos vegetales y

en compost generados en un cultivo de crisantemo. Diana Gaitan, Liliana perez. (enero 2007)
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis274.pdf