PRÁCTICA 6

REACCIONES DE CARBOHIDRATOS
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
I. OBJETIVOS:
- Diferenciar experimentalmente monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
- Identificar propiedades de los carbohidratos.
- Familiarizarse con la clasificación de los hidratos de carbono en reductores y no
reductores.
- Estudiar las propiedades del almidón.
- Determinar azucares en soluciones acuosas: valoración colorimétrica de hidratos
de carbono por el método de fenol/ácido sulfúrico.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

2.1.Carbohidratos.
Se denominan carbohidratos o glucósidos a los derivados aldehídicos o cetónicos, de
alcoholes polivalentes o sus productos de condensación.
Se les clasifica como:
Polisacáridos (celulosa, almidón)
Trisacáridos (rafinosa)
Disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacáridos
Los carbohidratos por el calor y la acción de ácidos fuertes se deshidratan, dando en
algunos casos derivados del furfural.
Los monosacáridos por el grupo carbonilíco pueden ser aldosas o cetosas, y por el
número de átomos de carbono, pueden ser hexosas (glucosa, galactona, manosa,
fructosa), pentosas (arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), tetrosas (treosa y eritrosa).
Los ácidos fuertes inorgánicos calientes deshidratan a las hexosas formando
derivados furánicos como el hidroximetil furfural, que puede posteriormente
descomponerse y formar otros compuestos como el ácido levulínico y el ácido
fórmico. Por otra parte, a las pentosas las deshidratan produciendo furfural. Estas
reacciones son la base de las pruebas de Molish, Seliwanoff, Tollens y Bial para
caracterizar a los carbohidratos, ya que el producto deshidratado del carbohidrato se
condensa con el reactivo correspondiente, produciendo compuestos coloridos
característicos
El almidón producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de indicador cualitativo
sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidón, y su hidrólisis catalizada por
ácidos lo convierte en dextrinas, en maltosa y por último en D (+) glucosa. El ensayo
con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrólisis puesto que la coloración va
cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular del compuesto
orgánico.
Los álcalis pueden inducir varias reacciones químicas en los monosacáridos que
dependen de la intensidad del tratamiento y de la concentración del álcali. A bajas
concentraciones (0.5 N) se favorece la isomerización y el equilibrio ceto-enólico
(aldosas cetosas). En condiciones fuertemente alcalinas se generan ácidos sacáricos.
Una reacción característica de los carbohidratos está basada en el poder reductor que
le confiere su grupo aldehído o cetona.
Los carbohidratos son biomoléculas que tienen una gran importancia en la bioquímica.
Existen diferentes métodos analíticos para la determinación de carbohidratos, basados
en la espectrofotometría, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la
refractometría.

2.2. Cuantificación de carbohidratos.

Existe una variedad de métodos colorimétricos los cuales utilizan reactivos distintos
como antrona, fenol, orcinol o resorcinol. El método colorimétrico para la
determinación de la concentración de carbohidratos más ampliamente utilizado es el
desarrollado por DuBois et al. debido a la facilidad del procedimiento, sensibilidad,
rapidez de los resultados y por ser apropiado para cuantificar diferentes azúcares como
monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
La adición de algunos ácidos minerales a las soluciones acuosas de carbohidratos,
como el ácido sulfúrico, el fosfórico y el clorhídrico, provoca la deshidratación de los
carbohidratos con la eliminación de tres moles de agua. Con esta reacción se forman
derivados del furfural, y el 5-hidroximetilfurfural (HMF). En el caso de pentosas, se
produce una deshidratación a furfural y en las hexosas a HMF. La presencia del fenol
y su interacción con el HMF facilita la formación de complejos que permiten la
coloración de la solución y facilitan la cuantificación de carbohidratos por
espectrofotometría.

Variaciones del método fenol- ácido sulfúrico.

Diferentes autores propusieron variaciones para aumentar la sensibilidad y facilitar el
manejo de los reactivos de esta metodología.
Rao y Pattabiraman plantean que, en la reacción de fenol-ácido sulfúrico ocurre una
sulfonación in situ del fenol, el ácido fenolsulfónico formado es capaz de disminuir la
intensidad de color del HMF, el furfural y otras hexosas y pentosas analizadas,
afectando la lectura espectrofotométrica, y sugirieron un cambio en la secuencia de la
adición de los reactivos, donde, el ácido sulfúrico se agrega primero a la solución de
carbohidratos para hidrólizar, seguido por la adición del fenol, que genera la reacción
colorimétrica, conservando la longitud de onda de 490 nm para leer la absorbancia.
Masuko et al., ratificaron que la adición de ácido sulfúrico concentrado a la muestra
seguida por fenol, arroja mejores resultados. A la solución de carbohidratos estos
autores adicionaban el ácido sulfúrico concentrado, seguido inmediatamente por fenol
al 5 %, la mezcla se deja en incubación a 90 °C por 5 min y se somete a enfriamiento
en baño a 25 °C por 5 min.
Albalasmeh, Berhe y Ghezzehei, presentaron un procedimiento alternativo basado en
la capacidad de absorción que posee el HMF en longitudes de onda de luz en el rango
ultravioleta. Ellos suprimen el uso de fenol, reportando una sensibilidad de lectura
mayor a una longitud de 315 nm. Además, se optimizó el tiempo utilizado en la
preparación para la lectura de los ensayos, puesto que no fue necesario esperar los 20
min requeridos para la reacción completa entre el HMF y el fenol, debido a la ausencia
de este reactivo.

Cuantificación de azúcares reductores y totales (método de Lane y Eynon).

Existen diversos métodos de cuantificación de carbohidratos basados en la capacidad
reductora de los azúcares que tienen libre el grupo carbonilo. Estos carbohidratos son
capaces de reducir elementos como el cobre (Cu+2), el hierro (Fe+3) o el yodo. En el
caso específico del cobre, este es reducido desde Cu+2 a Cu+1.
El método de Lane-Eynon se basa en la determinación del volumen de solución que se
requiere para reducir completamente un volumen conocido del reactivo alcalino de
 cobre. El punto final se determina por el uso de un indicador interno, azul de metileno
que es reducido a blanco de metileno por un exceso de azúcar reductor. Se usa para la
determinación de azúcares reductores en mieles y caldos de fermentación.
El método de Eynon-Lane tiene como principal inconveniente el ser un método
volumétrico donde el punto final de la valoración se detecta por cambio de color. Sin
embargo, es exacto.

Metodo de Miller.

Sumner y colaboradores desarrollaron otro método utilizando el ácido 3,5

dinitrosalicílico (DNS) para calcular la concentración de azúcares reductores en
distintos materiales. El procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre
el DNS y los azúcares reductores de la muestra. La principal ventaja radica en su alta
sensibilidad debido a que es un método espectrofotométrico.
El método del DNS no es recomendable para determinar azúcares reductores en
muestras intensamente coloreadas como mieles.
Una modificación es el método Miller, donde el ácido 3,5-dinitrosalicílico es reducido
en presencia de calor, por los azúcares reductores y se desarrolla un cambio de color
parecido al café (con variaciones de amarillo hasta café), que puede determinarse por
lecturas de densidad óptica, leídas por espectrofotometría.

III. MATERIALES Y REACTIVOS.

3.1.Para reacciones de identificación.

Reactivo Molisch Reactivo Fehling
Reactivo Tollens, Reactivo Seliwanoff
Reactivo Barfoed, Sol. glucosa 1%
Sol. fructuosa 1%, Sol. sacarosa 1
Sol. lactosa 1% , Sol. almidón 1%
Sol. sacarosa 5%, Sol. HCl 10%
Sol. NaOH 10%, Tubos de ensayo
Pipetas, Baño de agua hirviente
Pinzas, Baño hirviente
Vaso de precipitados, Luna de reloj.
3.2. Para reacciones de cuantificacion.
-Acido sulfúrico concentrado (H2SO4)
-Fenol en agua al 80% en peso: 3.2 g fenol más 0.8 ml de agua.
-Solución problema, jugos de frutas.
- Solución de Fehling A (34,639 g de CuSO4◦5H2O en 500 ml de agua)
- Solución de Fehling B (173 g de tartrato de sodio y potasio, y NaOH en 500 ml de agua).
- Azul de metileno (1%)
- Solución patrón de glucosa al 1%
-Solución de acetato básico de plomo al 30%
- Oxalato de sodio o potasio en polvo
- Solución de HCl 1:1 9. Solución de NaOH 6 N.

Preparación de la solución clarificada de azúcares:

Pesar una cantidad de muestra tal que, en la solución final clarificada, la concentración
de azúcares reductores sea de 2 a 5 mg/ml (para gastar entre 10 y 25 ml de dicha solución
por cada 10 ml de solución de Fehling).
Homogeneizar la muestra con 50 ml de etanol al 80% (v/v) y traspasar a un matraz aforado
de 250 ml; aforar con etanol (80%), mezclar bien y filtrar.
Tomar una alícuota de 25 ml de la solución filtrada y colocarla en un matraz de 250 ml.
Diluir con 50 ml de agua destilada y añadir unos pocos mililitros de solución de acetato
de plomo (30%), hasta lograr la precipitación completa (en el caso de jugos, pulpas y
mermeladas de frutas es suficiente añadir 1 o 2 gotas de la solución de acetato de plomo
al 30%).
Mezclar bien y filtrar. Agregar al filtrado oxalato en polvo en pequeñas porciones (una
cantidad muy pequeña tomada con la punta de una espátula para evitar profusión de
oxalato) hasta eliminar el exceso de acetato de plomo. Mezclar y filtrar descartando los
primeros mililitros. El filtrado debe quedar perfectamente transparente.

Solución patrón de glucosa.

Para hacer el análisis se debe preparar una solución patrón de glucosa en agua,
disolviendo 0,5 g, de glucosa anhidra en 100 ml de agua destilada.
Preparar 8 soluciones conocidas por dilución.

Preparación del reactivo del ácido 3,5 dinitrosalicílico: en frío y en caliente

Se pesan 5 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico, 150 g de tartrato de Na-K y 8 g de NaOH.
Se disuelve el NaOH en 200 ml de agua y se añade en agitación el tartrato de Na-K
lentamente.
Se completa con agua hasta 400 ml y se comienza a añadir lentamente el ácido 3,5
dinitrosalicílico.
Se deja en agitación toda la noche, se enrasa a 500 ml y se filtra. 7
La preparación del reactivo en caliente es idéntica, pero se hace en agitador magnético
con calentamiento.

IV. PROCEDIMIENTO:
4.1. Reacciones de identificación de carbohidratos
 Reacción de Molisch
Este ensayo permite detectar la presencia de hidratos de carbono en una muestra;
se basa en la acción hidrolizante y deshidratante que ejerce el ácido sulfúrico
sobre estos compuestos. Como se sabe, los ácidos concentrados originan una
deshidratación de los azúcares para rendir furfurales, que son derivados
aldehídicos del furano. Los furfurales se condensan con los fenoles para dar
productos coloreados característicos, empleados frecuentemente en el análisis
colorimétrico.
La prueba de Molish está basada en la formación de furfural o derivados de éste
a partir de los carbohidratos, que se condensan con el alfa-naftol, dando un
producto violeta.
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una solución de glucosa
al1%, 1 ml. de solución de fructuosa o levulosa al 1%, 1 ml. de una solución de
sacarosa al 1%, 1 ml. de una solución de lactosa al 1%, 1 ml. de una solución de
almidón al 1% y en el último 1 ml. de agua (testigo). A cada una agréguele 2
gotas de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes 2
ml. de ácido sulfúrico concentrado.
Observe el color violáceo del anillo formado en la interfase entre los dos
líquidos. Anote aquellas soluciones que den positiva la prueba.
 Reacciones de Fehling
La reacción de Fehling está basada en la acción reductora que tienen los azúcares
sobre los iones cúpricos en medio alcalino.
Carbohidrato + Cu2 + + álcali ---- Carbohidrato oxidado + Cu+
El reactivo de Fehling está constituido por dos soluciones que se mezclan al
momento de usarse (Solución A de sulfato de cobre y solución B de tartrato de
sodio-potasio en medio alcalino).
El poder reductor de los oligo y polisacáridos depende, del número de carbonilos
potencialmente libres que no estén involucrados en enlaces glicosídicos
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solución A de Fehling con
0.5 ml. de la solución B de Fehling, agrégueles 1 ml. de la solución de los
carbohidratos utilizados en el experimento anterior.
Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay cambios de color i/o
formación de precipitados.
 Reacción de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de Tollens
recientemente preparado, añadir a cada uno 2 ml. de las soluciones de
carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay formación de espejo de
plata y cuales carbohidratos dan negativa esta reacción.
Realice una comparación de estos resultados con los de la prueba de Fehling.
 Reacción de Seliwanoff
Es una reacción para diferenciar cetosas de aldosas; aunque ambas dan reacción
positiva, las cetosas la dan rápidamente y las aldosas lentamente. Está basada en
la formación de furfural o un derivado de éste y su posterior condensación con
el resorcinol, dando un color rojo para cetosas y rosa para aldosas
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff, luego añada 3 gotas
de solución de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los tubos
a baño hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color
adquirido.
 Reacción de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Barfoed luego añada 1 ml. de
solución de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a
baño hirviente y observar la formación de un precipitado de color rojo ladrillo,
lo que indicará la presencia de monosacáridos.
Los disacáridos también precipitan óxido cuproso, pero muy lentamente.
 Hidrólisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solución de sacarosa al 5%, llévelos a
baño hirviente y a cada tubo añada volúmenes iguales: de agua para el primer
tubo, ácido clorhídrico al 10% en el segundo tubo, e hidróxido sódico al 10% en
el tercero.
 Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuación la reacción de
una porción de cada mezcla con la solución de Fehling. Observe el resultado,
indique si hubo hidrolisis, y explique.

Reacción con: Sol. Sacarosa Explicación

Agua
HCl
NaOH

 Ensayo del Almidón frente al Iodo

El yodo es atrapado por el almidon y dependiendo de su estructura, da una
coloración característica; si el polisacárido es lineal se obtendrá una coloración
azul, pero si es ramificado, la coloración obtenida va del púrpura al rojo.
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solución de almidón al 1%, añada una
gota de solución de Iodo - lodurada, observe el color de la solución. Luego
caliente la solución coloreada a ebullición y observe el efecto, observe también
qué efecto produce el enfriamiento de la solución.
 Hidrólisis del Almidón
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solución de almidón al 1%, añada
1 ml de ácido clorhídrico concentrado. Hierva la solución y retire muestras de 5
ml. Cada 15 minutos, ensayando su reacción frente al iodo. Anote la variación
en la intensidad del color.
Cuando la solución ya no produzca coloración con el iodo, neutralícela y ensaye
la reacción de una muestra frente al Fehling. Formule estructuralmente los
productos finales de la hidrólisis del almidón (un disacárido y un monosacárido).

4.2.Reacciones de cuantificación de carbohidratos.

Cuantificación de azúcares totales por método Dubois.

Construir una curva de calibración, para la cual se preparan soluciones de 10-70 mg/L
utilizando manosa como estándar.
Como blanco para las lecturas se utiliza agua destilada aplicándole el mismo tratamiento.
Se mezclan 2 ml de muestra con 2 ml de fenol al 5% en tubos y se colocan en una gradilla
sumergida en un baño de agua fría.
A los tubos se les añade 5 mL de H2SO4, se dejan reposar por 15 min y se analizan en un
espectrofotómetro a 490 nm.
Los ensayos se realizan por triplicado para obtener valores promedios.

Cuantificación de azúcares reductores.

Método de Miller.

Se construye una curva de calibración, para lo cual se preparan soluciones de glucosa a

las siguientes concentraciones: 0.5, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.5, 1.7 y 1.9 g/L.
En tubos de vidrio de 10 ml se adicionan 0.5 ml de muestra y 0.5 ml del reactivo de DNS.
Los tubos se colocan en baño de agua a 100 ºC por 5 min.
Se enfrían hasta temperatura ambiente y se le añade 5 ml de agua destilada.
Se agita y se realiza la lectura a 540 nm en espectrofotómetro.

Se agrega 5 ml de agua destilada, se agitan, se dejan en reposo por 15 min, y se determina

su absorbancia a 540 nm.
El mismo tratamiento se realiza para el blanco con agua destilada.
Leyendo la absorbancia de cada una de las muestras en la curva patrón se determina la
concentración de azúcares reductores.

Método de Lane y Eynon

Reactivos y materiales
Oxalato de sodio o de potasio.
Disolución defecante, acuosa saturada de acetato neutro de plomo.
Disolución A: Disolver 34.639 g de sulfato de cobre pentahidratado en 500 ml de agua
destilada y filtrar a través de lana de vidrio o papel.
Disolución B: Disolver 173 g de tartrato doble de sodio y potasio y 50 g de hidróxido de
sodio en agua y diluir a 500 ml, dejar reposar dos días y después filtrar usando asbesto.
Disolución acuosa de azul de metileno al 0.2 %
Disolución de Glucosa al 1 %; P/V

Procedimiento

Titulación de la disolución A + B.

Neutralizar 10 ml de la disolución de azúcar invertido con hidróxido de sodio 1N, en un

matraz volumétrico de 100 ml y completar el volumen con agua.
Transferir la disolución a una bureta, dejar caer la disolución ml a ml a un matraz
Erlenmeyer que contenga una mezcla de 5 ml de la disolución A, 5 ml de la disolución B
y 50 ml de agua en ebullición. Agregar la disolución de azúcar invertido hasta un poco
antes de la total reducción del cobre.
Agregar 1 ml de la disolución de azul de metileno y completar la titulación hasta
decoloración del indicador; La titulación debe efectuarse en 3 minutos. Cuando se emplea
el reactivo de glucosa titular directamente.
El título de la disolución debe ser de 0.0505 a 0.0525 y de acuerdo con el cálculo
siguiente:
Multiplicar los ml de disolución requeridos en la titulación por la concentración de ésta
en g/ml.
El título se expresa indicando que 10 ml de la disolución A + B corresponden a X gramos
de azúcar invertido; este valor se utilizará en el cálculo de las disoluciones problema.

Determinación de los reductores directos

Defecación de la muestra

Pesar la muestra (de 5 a 10 g) y colocarla en un matraz volumétrico de 250 ml., añadir

100 ml de agua, agitar lo suficiente para que todo el material soluble en agua quede
disuelto.
Añadir 2 a 10 ml de la solución saturada de acetato de plomo, agitar y dejar sedimentar.
Añadir poco a poco oxalato de sodio o potasio hasta la total precipitación del acetato de
plomo. Completar el volumen con agua, agitar y filtrar.

Determinación
Transferir el filtrado obtenido de la defecación a una bureta y titular la solución A+ B
nuevamente.

Determinación de reductores totales

Determinación de la muestra

Pesar una cantidad de muestra (de 5 a 10 g) y colocarla en un matraz Erlenmeyer de 250

ml, añadir 100 ml de agua y agitar.
Añadir de 2 a 10 ml de disolución saturada de acetato neutro de plomo, agitar y dejar
sedimentar.
Añadir poco a poco oxalato de sodio o de potasio hasta la total precipitación del acetato
de plomo. Filtrar recibiendo el filtrado en un matraz volumétrico de 250 ml.
Lavar tres veces el matraz Erlenmeyer y el filtro con 20 ml de agua, recibir el agua de
lavado en un matraz volumétrico.

Determinación

Añadir 10 ml de HCl concentrado al matraz volumétrico que contiene el filtrado obtenido

en la defecación. Calentar a 65 °C durante 15 minutos y enfriar.
Neutralizar con hidróxido de sodio 1N y completar el volumen con agua. Transferir a una
bureta y titular con solución A+B.

Cálculos

% de azúcares reductores directos = 25000 • T

V•P
En donde:
T = Título de la disolución A + B en gramos de azúcar invertido.
V = Volumen de la disolución problema, empleado en la titulación de 10 ml de la
disolución A + B en mililitros.
P = Peso de la muestra, en gramos

La disolución al 1 % de azúcares invertido, puede guardarse siete días a la temperatura

de 12 a 15 °C ó 3 días a 20 a 25°C ó 15 minutos a 65°C.