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CAMPINAS
2015
MARCELLA GONÇALVES MAZUTTI
CAMPINAS
2015
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
MARCELLA GONÇALVES MAZUTTI
MEMBROS:
A minha mãe e minha avó, Roseli e Leda, por serem sempre tão essenciais,
caminhando junto comigo, me apoiando, incentivando e sempre acreditando em
mim. Ao meu namorado, Pedro, por sempre ter estado ao meu lado, por todos os
conselhos, apoio, carinho, compreensão e por ter sido sempre tão importante pra
mim durante essa etapa.
As amigas que ganhei no laboratório, Amanda Donatti, Amanda Canto e Camila,
com as quais partilhei muitas conversas e bons momentos.
A todos os outros amigos e companheiros dos Laboratórios de Genética Molecular,
Citogenética, Zebrafish e Bioinformática, por terem sido sempre tão especiais.
Muito obrigada!
Marcella G. Mazutti
RESUMO
Epilepsy is one of the most common neurological diseases, affecting 1.5 -2.0 %
of the world population. Several types of malformations of cortical development
(MCD), including Focal Cortical Dysplasia (FCD), cause epilepsy and are associated
with the occurrence of refractory seizures. FCD is characterized by cortical
architecture abnormalities observed in other MCDs, such as Tuberous Sclerosis (TS)
and Hemimegalencephaly (HME). FCD, TS and HME also show aberrant expression
of genes belonging to mTOR signaling pathway. Potential involvement of Tau
pathway has also been reported in patients with FCD, due to the presence of tau
aggregates, which are also identified in Alzheimer's disease. Therefore, the similarity
in histological features and molecular pathways suggests that pathogenic
mechanisms could be common to these three disorders. Furthermore, somatic
mosaic mutations have been identified in patients with TS and HME. In addition to
sequence variants , genomic structural variations called Copy Number Variations
(CNV) have also been reported as a source of DNA variation which could be
associated to disease. These variations are associated with many neurological
disorders ranging from psychiatric disorders to malformations of the cerebral cortex,
such as DCF. Some studies have identified structural variations in patients with DCF
and HME.. Therefore, the main objective of this project is to investigate whether
somatic mosaic mutations in genes belonging to the mTOR and Tau pathways, as
well as, structural variations (CNVs) located in these and other genes could be
involved in the molecular mechanisms leading to FCD. Deep Sequencing by
NGS was performed in genomic DNA of both, FCD resected brain tissue and
peripheral blood of patients in order to assess whether the somatic mutations are
restricted to the central nervous system. CytoScan HD Kit (Affymetrix) was used for
the identification of CNVs and Chromosome Analysis Suite (Affymetrix) was used for
data analyzes. DNA sequencing was performed in four patients with FCD in both,
samples resected brain tissue and peripheral blood. We identified a total of 758
variants in genes belonging to the mTOR pathway, 30 of these variants were found in
a mosaic state - 13 were exclusively present in brain tissue and 17 were present only
in blood DNA. In genes belonging to Tau pathway, we identified a total of 38
variants,seven of them were in a mosaic state - four were only present in brain tissue
and three were present only in the blood DNA. In addition, we investigated the
presence of CNVs in six patients in both, FCD resected brain tissue and peripheral
blood. We identified a total of 131 CNVs and 13 CNVs have not yet been described
in the Database of Genomic Variants (DGV). Therefore, we conclude that sequence
variants in a mosaic state, as well as putative CNVs are indeed present in tissue
resected from patients with FCD. Although additional studies are needed in order to
unequivocally determine that these DNA variations are indeed causative of the
molecular abnormalities which ultimately lead to FCD, the present work have
contributed significantly by adding additional evidence supporting the involvement of
mTOR and Tau pathways in the mechanisms leading to FCD.
LISTA DE ABREVIATURAS
Tabela 10. Tabela contendo todos os genes da via Tau nos quais foram identificadas
variantes em mosaicismo, especificando para cada gene qual a região ou
consequência em que a variante se enquadra. (A) sobre as variantes que foram
identificadas apenas no tecido cerebral. (B) sobre as variantes que foram
identificadas apenas no sangue.
Tabela 11. Relação de todos os pacientes que foram utilizados para a análise de
CNVs e para a análise do sequenciamento. Observando que os quatro primeiros
pacientes foram utilizados tanto para a análise de CNVs como do sequenciamento, e
os dois últimos foram adicionados posteriormente, sendo assim utilizados somente
para a análise de CNVs.
Tabela 12. Relação de todos os pacientes que foram analisados para CNVs.
Podemos notar o registro de DNA das amostras de tecido cerebral e de sangue
periférico que se pareiam. Para cada paciente, temos a informação do sexo e do tipo
histopatológico de Displasia Cortical Focal.
Tabela 14. Apresentação dos cálculos das CNVs da tabela 11. As médias e o range
foram calculados a partir do tamanho dos fragmentos (kbp).
Tabela 15. Relação de todas as alterações estruturais (CNVs) identificadas e que
não são descritas no banco de dados DGV, especificando o tipo de alteração, sua
localização, seu tamanho e os genes abrangidos. As cores iguais simbolizam
amostras de tecido e sangue dos mesmos pacientes. As setas indicam as alterações
que aparecem na forma de mosaicismo, somente no tecido cerebral.
Tabela 16. Relação de todas as alterações que foram analisadas em 104 indivíduos
controles da população brasileira, especificando os detalhes da alteração e o código
do paciente.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. DNAs de sangue (A) e DNAs de tecido (B) testados em gel de agarose 1%
para verificar a integridade dos mesmos.
Figura 3. Gráfico obtido como resultado do bioanalyser. Essa técnica nos permite
analisar o tamanho dos fragmentos obtidos pela biblioteca já finalizada. No eixo X
podemos observar a quantidade de pares de base (pb) e no eixo Y, a quantidade de
moléculas que obtivemos. Neste caso, temos como tamanho médio, 351pb.
Figura 5. Cascata da via Tau retirada do KEGG: Kioto Encyclopedia of Genes and
Genomes. Dentre todos os genes dessa via, os genes em amarelo foram aqueles
escolhidos para serem analisados, em decorrência de estes serem os genes
relacionados com a doença de Alzheimer, a qual compartilha com as DCFs a
presença dos agregados de Tau.
Figura 10. Comparação das proteínas geradas a partir da sequência do gene ULK2
normal e do ULK2 com a variante identificada (deleção de um nucleotídeo T). Pela
comparação das figuras, podemos observar o stop códon gerado como
consequência da variante, originando uma proteína truncada.
Figura 11. Análise de predição pelo programa Human Splicing Finder, comparando
a sequência de referência com a sequência mutada do gene EIF4E, na qual
podemos observar a mudança do nucleotídeo que dá início à região codificante
como consequência da alteração do sítio de splicing.
Figura 12. Regiões do gene EIF4E consideradas como sendo potenciais sítios de
splicing, pelo programa Humam Splicing Finder. A região na qual se encontra a
variante identificada está destacada em vermelho.
Figura 13. Comparação das proteínas geradas a partir da sequência do gene EIF4E
normal e do EIF4E com a variante identificada (deleção de um nucleotídeo T). Pela
comparação das figuras, podemos observar o stop códon gerado como
consequência da variante, originando uma proteína truncada.
Figura 15. Resumo de todas as variantes identificadas no paciente 44/11 – P13, nos
genes: ULK2, EIF4E e ULK1.
Figura 16. Visualização dos produtos de PCR em gel de agarose 2%. Amostras
aleatórias. Nas laterais podemos ver o marcador de peso molecular de 100pb.
1. INTRODUÇÃO. ..................................................................................... 19
Moleculares .. 23
2. OBJETIVOS .......................................................................................... 27
3.4 Bioinformática................................................................................ 38
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 83
6. CONCLUSÃO .............................................................................................. 92
ANEXOS .......................................................................................................... 99
19
1. INTRODUÇÃO
2. OBJETIVOS
3. MATERIAIS E MÉTODOS
630G por 10 minutos. A parte inferior do tubo foi descartada e acrescentou-se 1.5mL
de fenol e 1.5mL de solução de clorofórmio álcool isoamílico, seguidos de
homogenização e centrifugação a 630G por 10 minutos, sendo a parte inferior do
tubo descartada. Este processo foi repetido com 3mL de solução de clorofórmio
álcool isoamílico. O DNA genômico foi então precipitado com 6mL de etanol
absoluto. Em seguida o DNA foi transferido para tubos cônicos de 1.5mL e diluídos
em aproximadamente 200µL de TE 1x.
foram submetidas à primeira hibridação) e transferidas para uma nova placa. Foram
adicionados 250ul de SMB (esferas magnéticas com estreptavidina) a cada amostra
e após isto a reação será incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. Após o
período de incubação as amostras foram colocadas na placa magnética por dois
minutos até que o liquido se tornasse claro. Todo sobrenadante foi descartado e as
amostras foram removidas da placa magnética. Foi então realizada a primeira
purificação adicionando-se 200ul de WS1 (solução de lavagem I) a cada amostra,
transferindo as mesmas para a placa magnética por dois minutos até que o líquido
se tornasse claro, em seguida o sobrenadante foi descartado e as amostras
removidas da placa magnética. A segunda purificação se iniciou com adição de
200ul de WS2 (solução de lavagem II) a cada amostra, transferindo as mesmas para
a placa magnética por dois minutos até que o líquido se tornasse claro, em seguida
o sobrenadante foi descartado e as amostras removidas da placa magnética. Foram
adicionados mais 200ul de WS2 a cada amostra, em seguida todo o volume de
reação foi transferido para uma nova placa que foi incubada em um termociclador a
42°C por 30 minutos. As amostras foram removidas imediatamente do termociclador
e colocadas na placa magnética por dois minutos até que o líquido se tornasse claro,
o sobrenadante foi removido e descartado. Foram adicionados novamente 200ul de
WS2, foram repetidas as incubações no temociclador e purificação em placa
magnética. A terceira purificação se iniciou com a adição de 200ul de WS3 (solução
de lavagem III) a cada amostra, transferindo as mesmas para a placa magnética por
dois minutos até que o líquido se tornasse claro, em seguida o sobrenadante foi
descartado. Todas as etapas da terceira purificação foram repetidas mais uma vez.
A eluição teve inicio com o pré-mix de eluição, onde foram adicionados 28.5ul de
ET1 (Tampão de Eluição I) e 1.5ul de HP3 (2N de NaOH) por amostra. Um total de
23ul do pré-mix de eluição foi adicionado a cada amostra que foi incubada por cinco
minutos a temperatura ambiente, sendo transferida para placa magnética por dois
minutos. Foram pipetados 21ul do sobrenadante de cada amostra para uma nova
placa, em seguida foram adicionados quatro microlitros de ET2 (Tampão de Eluição
2) para neutralizar o processo de eluição.
35
3.4 Bioinformática
SIFT: http://sift.bii.a-star.edu.sg/
Polyphen: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
http://www.umd.be/HSF3/HSF.html
composta por 1µL de enzima NspI, 2µL de tampão da enzima, 0,2µL de tampão BSA
e 11,55µL de água. As reações foram transferidas para um termociclador
(Mastercicler Gradiente Eppendorf®) onde permaneceram incubadas a 37°C por 120
minutos, seguida por nova incubação a 65°C por 20 minutos.
3.6.5 Purificação
3.6.6 Quantificação
3.6.7 Fragmentação
cada amostra, 14µL de tampão TdT 5x, 2µL de DNA Labeling Reagent 30mM e
3.5µL de enzima TdT. A reação foi incubada a 37°C por quatro horas e a 95°C por
15 minutos em um termociclador (Mastercicler Gradiente Eppendorf®).
3.6.9 Hibridação
Ao DNA marcado foram adicionados: 165µL de Hyb Buffer Part I, 15µL de Hyb Buffer
Part II, 7µL de Hyb Buffer Part III, 1µL de Hyb Buffer Part IV e 2µL de Oligo Control
Reagent 0100. Em seguida, os fragmentos de DNA foram desnaturados em um
termociclador (Mastercicler Gradiente Eppendorf®) a 95°C por 10 minutos e
posteriormente mantidos a 49°C. Foram aplicados 200 µL de cada amostra em cada
chip. Os chips foram incubados em um forno de hibridação por 16 horas a
temperatura de 50°C e rotação de 60rpm (Genechip® Hibridization Oven 645,
Affymetrix®).
3.6.10 Lavagem
Após a hibridação, os chips passaram pela estação de lavagem (GeneChip
Fluidics Station 450, Affymetrix®) que realiza automaticamente um processo de
injeção de soluções para a lavagem dos chips.
3.6.11 Escaneamento
Os chips foram escaneados pelo GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix®)
do nosso próprio laboratório.
3.6.12 Análises
A análise dos resultados das alterações estruturais foi realizada pelo software
Chromosome Analysis Suite (Affymetrix®).
Para a análise dos CNVs com possível potencial patogênico foram consultados
bancos de dados disponíveis na internet: DGV, ISCA e DECIPHER.
43
4. RESULTADOS
Tabela 2. Parâmetros de qualidade dos DNAs de tecido cerebral e sangue antes de iniciar o preparo das bibliotecas.
As mesmas cores dos números de registro de DNA indicam que são o mesmo paciente, pareado tecido
– sangue.
A B
Figura 1. DNAs de sangue (A) e DNAs de tecido (B) testados em gel de agarose 1% para verificar a
integridade dos mesmos.
Após verificar que todos os DNAs estavam com uma boa qualidade,
começamos o protocolo da preparação de bibliotecas com o Nextera® Expanded Kit
(Illumina®). No decorrer do protocolo, existem pontos de checagem para verificar se
até aquele ponto os procedimentos ficaram de acordo com o esperado. Após a etapa
do primeiro Clean up da PCR, nós analisamos um dos pontos de checagem por
bioanalyser, o qual analisa o tamanho dos fragmentos que foram amplificados e que
precisam estar com tamanho molecular entre 150pb-1kb. Podemos observar
46
Figura 2. Gráficos obtidos como resultado do bioanalyser. No eixo X podemos observar a quantidade
de pares de base (pb) e no eixo Y, a quantidade de moléculas que obtivemos.
47
Para finalizar, fazemos outro bioanalyser, o qual vai nos dizer novamente qual
o tamanho médio da biblioteca (Figura3). Além disso, precisamos obter uma
medição precisa da concentração da biblioteca, a qual foi realizada pela técnica de
Real Time. Esses dois parâmetros – tamanho médio e concentração – são
necessários para calcularmos a quantidade da biblioteca em nM, que por sua vez
será convertida para pM, sendo que 1nM é igual a 1000pM. Deixamos as amostras a
2nM e as levamos ao Lactad, onde por sua vez, foram colocados 16pM em cada
lane.
Figura 3. Gráfico obtido como resultado do bioanalyser. Essa técnica nos permite analisar o
tamanho dos fragmentos obtidos pela biblioteca já finalizada. No eixo X podemos observar a
quantidade de pares de base (pb) e no eixo Y, a quantidade de moléculas que obtivemos. Neste
caso, temos como tamanho médio, 351pb.
48
28,6x 111,6x
Tabela 4. Relação das médias dos valores de cobertura de todos os genes analisados, das vias
mTOR e Tau, incluindo regiões de íntron e exon e das médias dos valores de cobertura de todas as
variantes identificadas somente nos exons.
Figura 4. Cascata da via mTOR retirada do KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.
Todos esses genes foram escolhidos para serem analisados após o sequenciamento. Os genes em
amarelo são aqueles nos quais já foram identificadas mutações em mosaicismo na HME e os genes
em vermelho são aqueles nos quais já foram identificadas mutações na ET.
51
Figura 5. Cascata da via Tau retirada do KEGG: Kioto Encyclopedia of Genes and Genomes. Dentre todos os
genes dessa via, os genes em amarelo foram aqueles escolhidos para serem analisados, em decorrência de
estes serem os genes relacionados com a doença de Alzheimer, a qual compartilha com as DCFs a presença
dos agregados de Tau.
52
Seguindo essa análise, após aplicar os dois primeiros filtros (por genes e
cobertura acima de 70X), nós identificamos um total de 758 variantes na via mTOR e
38 na via Tau. Posteriormente, ao aplicar os outros dois filtros, pudemos identificar
as variantes que se encontravam na forma de mosaicismo. Na via mTOR, do total de
758 variantes, 30 apareceram na forma de mosaicismo, ou seja, se encontravam
presentes no tecido cerebral e ausentes no sangue ou vice-versa. Destas 30, 13
variantes apareceram apenas no tecido cerebral, estando ausentes no sangue
(Tabela 5) e 17 apareceram somente no sangue, estando ausentes no tecido
cerebral (Tabela 6 e Figura 6). Dentre as 30 variantes identificadas na forma de
mosaicismo, 18 são variantes ainda não descritas no banco de dados do Ensembl*.
* www.ensembl.org
53
44 - P13
16 2603088 CT C downstream_gene_variant PDPK1
8 38060117 A G non_coding_transcript EIF4EBP1
541 - P19
10 87965536 CT C 3_prime_UTR_variant PTEN
17 19841552 TA T splice_region_variant ULK2
17 19849711 T A intron_variant ULK2
5 38966791 A T intron_variant RICTOR
742 - P20
1 243504623 TA T,AA intron_variant AKT3
541 -
P19 16 2603088 CT C downstream_gene_variant PDPK1
RP11-
17 59936156 GA G upstream_gene_variant 178C3.1
19 53875323 CAT C downstream_gene_variant MYADM
4 98881149 GA G splice_region_variant EIF4E
4 98929328 G A upstream_gene_variant EIF4E
742 -
P20 12 102398799 CT C downstream_gene_variant IGF1
19 53875849 CA C upstream_gene_variant PRKCG
8 38060102 C T non_coding_transcript EIF4EBP1
Tabela 6. Tabela detalhada de todas as 17 variantes que apareceram na forma de mosaicismo na via
mTOR – presentes apenas no sangue, estando ausentes no tecido cerebral.
55
44 –
P13 - - - - - -
541 -
P19 - - - - - -
742 -
P20 17 46029955 CT C downstream_gene_variant KANSL1
2 118847727 T G upstream_gene_variant EN1
2 118847741 T G upstream_gene_variant EN1
Tabela 7. Tabela detalhada de todas as quatro variantes que apareceram na forma de mosaicismo
na via Tau – presentes apenas no tecido cerebral, estando ausentes no sangue
44 - P13 - - - - - -
541 -
P19 21 25880942 A C 3_prime_UTR_variant APP
2 118847725 T TG upstream_gene_variant EN1
742 -
P20 17 46030147 G GT non_coding_transcript KANSL1
Todos os genes envolvidos nas variantes em mosaicismo das vias mTOR e Tau,
junto com a consequência ou região em que cada variante se encontra, seguem
abaixo, nas Tabelas 9 e 10.
(A)
Presentes apenas no tecido
cerebral
(B)
Presentes apenas no
sangue
Tabela 9. Tabela contendo todos os genes da via mTOR nos quais foram identificadas
variantes em mosaicismo, especificando para cada gene qual a região ou consequência em que
a variante se enquadra. (A) sobre as variantes que foram identificadas apenas no tecido
cerebral. (B) sobre as variantes que foram identificadas apenas no sangue.
58
(A)
Presentes apenas no tecido cerebral
(B)
Presentes apenas no sangue
Tabela 10. Tabela contendo todos os genes da via Tau nos quais foram identificadas
variantes em mosaicismo, especificando para cada gene qual a região ou consequência em que a
variante se enquadra. (A) sobre as variantes que foram identificadas apenas no tecido cerebral. (B)
sobre as variantes que foram identificadas apenas no sangue.
Tanto na via mTOR como na via Tau, podemos observar que nenhuma das
variantes identificadas se encontra em região codificante. Entretanto, duas variantes
identificadas na via mTOR se encontram em região de splicing, uma no gene ULK2
e outra no gene EIF4E. A partir desse momento, o foco do trabalho concentrou-se
nessas duas variantes da via mTOR, com a finalidade de investigar se iria ocorrer
uma modificação do sítio de splicing, como consequência dessas variantes, e se
essa modificação poderia ocasionar efeitos deletérios.
A variante no gene ULK2, que se trata da deleção de um nucleotídeo (T), foi
identificada em um paciente, 541 – P19, apenas no tecido cerebral. A cobertura
dessa variante possui um valor elevado, o que aumenta significantemente a
confiabilidade da ausência de erros – a cobertura do tecido cerebral com o valor de
256x e a cobertura do sangue com o valor de 188x. Entretanto, em outro paciente,
44 – P13, essa mesma variante aparece apenas no sangue, se encontrando ausente
no tecido cerebral. Neste caso, os valores de cobertura também são elevados – do
59
Figura 8. Análise de predição pelo programa Human Splicing Finder, comparando a sequência
de referência com a sequência mutada do gene ULK2, na qual podemos observar a mudança do
nucleotídeo que dá início à região codificante como consequência da alteração do sítio de
splicing.
Esse programa também oferece uma ferramenta que nos mostra todas as
regiões do gene as quais são consideradas como potenciais sítios de splicing, sendo
que a região em que identificamos a variante está entre elas (Figura 9).
Figura 9. Regiões do gene ULK2 consideradas como sendo potenciais sítios de splicing, pelo
programa Humam Splicing Finder. A região na qual se encontra a variante identificada está
destacada em vermelho.
61
ULK2 normal
ULK2 mutado
Figura 10. Comparação das proteínas geradas a partir da sequência do gene ULK2 normal e do
ULK2 com a variante identificada (deleção de um nucleotídeo T). Pela comparação das figuras,
podemos observar o stop códon gerado como consequência da variante, originando uma proteína
truncada.
62
Figura 11. Análise de predição pelo programa Human Splicing Finder, comparando a sequência de
referência com a sequência mutada do gene EIF4E, na qual podemos observar a mudança do
nucleotídeo que dá início à região codificante como consequência da alteração do sítio de splicing.
63
Figura 12. Regiões do gene EIF4E consideradas como sendo potenciais sítios de splicing, pelo
programa Humam Splicing Finder. A região na qual se encontra a variante identificada está
destacada em vermelho.
EIF4E normal
EIF4E mutado
Figura 13. Comparação das proteínas geradas a partir da sequência do gene EIF4E normal e do
EIF4E com a variante identificada (deleção de um nucleotídeo T). Pela comparação das figuras,
podemos observar o stop códon gerado como consequência da variante, originando uma proteína
truncada.
ULK2 EIF4E
- Identificada em 10 de 24 - Identificada em 7 de 24
controles (amostras de sangue); controles (amostras de sangue);
TSC1
Presente no tecido
cerebral e no sangue
- Missense ;
-A T ;
Figura 14. Resumo de todas as variantes identificadas no paciente 541/12 – P19, nos genes: ULK2, EIF4E, TSC1.
68
ULK2 EIF4E
- Identificada em 10 de 24 - Identificada em 7 de
controles (amostras de sangue); 24 controles;
ULK1
Presente no tecido e no
sangue
- Sinônima ;
- G A;
Figura 15. Resumo de todas as variantes identificadas no paciente 44/11 – P13, nos genes: ULK2, EIF4E e ULK1.
69
CNVs Sequenciamento
Tabela 11. Relação de todos os pacientes que foram utilizados para a análise de CNVs e para a análise do
sequenciamento. Observando que os quatro primeiros pacientes foram utilizados tanto para a análise de CNVs
como do sequenciamento, e os dois últimos foram adicionados posteriormente, sendo assim utilizados somente
para a análise de CNVs.
Tabela 12. Relação de todos os pacientes que foram analisados para CNVs. Podemos notar o registro de DNA
das amostras de tecido cerebral e de sangue periférico que se pareiam. Para cada paciente, temos a informação
do sexo e do tipo histopatológico de Displasia Cortical Focal.
70
Figura 16. Visualização dos produtos de PCR em gel de agarose 2%. Amostras aleatórias. Nas laterais
podemos ver o marcador de peso molecular de 100pb.
Figura 17. Visualização dos produtos da fragmentação em gel de agarose 2%. Amostras
aleatórias. Nas laterais, o marcador de peso molecular 50bp. A última canaleta corresponde ao
controle positivo.
Tabela 14. Apresentação dos cálculos das CNVs da tabela 11. As médias e o range foram
calculados a partir do tamanho dos fragmentos (kbp).
Todas as 13 CNVs que ainda não foram descritas no DGV, tanto de tecido
como de sangue, seguem abaixo. Das 13 CNVs não descritas, seis aparecem na
forma de mosaicismo, ou seja, aparecem somente no tecido cerebral (Tabela 15).
76
Tabela 15. Relação de todas as alterações estruturais (CNVs) identificadas e que não são
descritas no banco de dados DGV, especificando o tipo de alteração, sua localização, seu
tamanho e os genes abrangidos. As cores iguais simbolizam amostras de tecido e sangue dos
mesmos pacientes. As setas indicam as alterações que aparecem na forma de mosaicismo,
somente no tecido cerebral.
Também podemos notar que nessa mesma região, existem outras CNVs de ganho e
de perda já descritas no DGV, porém nenhuma delas abrangendo todos os genes
dessa alteração que encontramos. (Figura 18). Abaixo segue uma curta descrição
dos pacientes com esta deleção.
P13: Trata-se de um paciente do sexo masculino portador de Displasia Cortical
Focal do tipo IIA.
P16: Trata-se de um paciente do sexo masculino portador de Displasia Cortical
Focal do tipo IIB.
P19: Trata-se de um paciente do sexo feminino portador de Displasia Cortical
Focal do tipo IIA.
Figura 18. Análise de alta resolução da alteração estrutural no cromossomo 1 do indivíduo P16.
Essa mesma alteração também aparece nos indivíduos P13 e P19. Notar na parte superior da
figura a barra em vermelho que representa a variação no número de cópias do indivíduo, vermelho
representando alteração de perda e azul de ganho. Logo abaixo podemos observar barras em
vermelho e azul que são as variações já descritas em bancos de dados e não associadas a
quadros patológicos. Também na parte inferior, encontramos os genes englobados pela variação:
C1orf63, RHD, TMEM50A, RHCE, TMEM57.
78
Figura 19. Alteração estrutural encontrada no banco de dados ISCA que se sobrepõe a alteração
estrutural de uma deleção de 187kbp identificada neste trabalho.
79
4.2.2 Paciente P3
Figura 20. Análise de alta resolução da alteração estrutural no cromossomo 20 do indivíduo P3.
Notar na parte superior da figura a barra em vermelho que representa a variação no número de
cópias do indivíduo, vermelho representando alteração de perda e azul de ganho. Logo abaixo
podemos observar que não existem variações que já são descritas em bancos de dados e não
associadas a quadros patológicos. Também na parte inferior, encontramos os genes englobados
pela variação: BMP7, MIR4325, SPO11, RAE1
80
Figura 21. Análise de alta resolução da alteração estrutural no cromossomo 19 do indivíduo P3.
Notar na parte superior da figura a barra em azul que representa a variação no número de cópias
do indivíduo, azul representando alteração de ganho e vermelho de perda. Logo abaixo podemos
observar que não existem variações que já são descritas em bancos de dados e não associadas a
quadros patológicos. Também na parte inferior, encontramos os genes englobados pela variação:
CRTC1, COMP, UPF1.
Para essas alterações, também investigamos cada um dos genes que elas
abrangem. No caso da deleção de 100kpb no cromossomo 20, dentre todos os
genes envolvidos, consideramos o BMP7 como o mais relevante. Este gene está
relacionado com processos de proliferação e diferenciação celular, além de ser
atuante durante a morfogênese neuronal. No caso da duplicação de 140 kbp no
cromossomo 19, dentre todos os genes os quais essa alteração abrange,
consideramos o CRTC1 como sendo o mais relevante. Este gene está envolvido em
mecanismos de plasticidade sinaptica, desempenhando um papel na consolidação
da memória e na manutenção de neurônios.
Após essa análise acerca dos genes, também investigamos nos bancos de
dados ISCA e Decipher se existia neles alguma alteração já descrita se sobrepondo
às alterações que nós identificamos. Para a deleção de 100 kbp no cromossomo 20,
não obtivemos nenhum resultado, em ambos os bancos de dados. Para a duplicação
de 140 kbp no cromossomo 19 obtivemos um resultado apenas no Decipher. A
81
Figura 22. Nesta figura podemos observar, na barra em azul, a alteração estrutural descrita no
Decipher , uma duplicação de 188,06 kbp com um fenótipo que inclui crises generalizadas e a qual
se sobrepõe a alteração estrutural identificada neste trabalho, que se trata de uma duplicação de
140 kbp. Mais a cima podemos observar todos os cinco genes que essa alteração descrita
abrange, sendo três deles em comum com a alteração que nós identificamos: CRTC1, COMP e
UPF1.
Análise em Indivíduos
Paciente CNV - Tipo CNV - Tamanho Genes
Controles
Tabela 16. Relação de todas as alterações que foram analisadas em 104 indivíduos controles da
população brasileira, especificando os detalhes da alteração e o código do paciente.
83
5. DISCUSSÃO
6. CONCLUSÃO
A variante no gene ULK1 se trata de uma variante sinônima ainda não descrita.
Pelas análises in silico observamos que a região dessa variante não é um sítio de
ancoragem para micro RNA.
Essas duas variantes não foram identificadas em nenhum dos 24 indivíduos
controles analisados.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Anexo 1. Relação de todos os genes analisados da via mTOR, detalhando o nome completo de cada gene e sua respectiva
localização.
PIK3CD phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit delta [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
MTOR mechanistic target of rapamycin (serine/threonine kinase) [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
RPS6KA1 ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
RRAGC Ras-related GTP binding C [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
PIK3R3 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (gamma) [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
PRKAA2 protein kinase, AMP-activated, alpha 2 catalytic subunit [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
AKT3 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3 [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
IRS1 insulin receptor substrate 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 2
CAB39 calcium binding protein 39 [Homo sapiens (human)] Chromosome 2
EIF4E2 eukaryotic translation initiation factor 4E family member 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 2
PIK3CB phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit beta [Homo sapiens (human)] Chromosome 3
PIK3CA phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit alpha [Homo sapiens (human)] Chromosome 3
EIF4E eukaryotic translation initiation factor 4E [Homo sapiens (human)] Chromosome 4
RICTOR RPTOR independent companion of MTOR, complex 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 5
PRKAA1 protein kinase, AMP-activated, alpha 1 catalytic subunit [Homo sapiens (human)] Chromosome 5
PIK3R1 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1 (alpha) [Homo sapiens (human)] Chromosome 5
EIF4E1B eukaryotic translation initiation factor 4E family member 1B [Homo sapiens (human)] Chromosome 5
TNF tumor necrosis factor [Homo sapiens (human)] Chromosome 6
VEGFA vascular endothelial growth factor A [Homo sapiens (human)] Chromosome 6
RRAGD Ras-related GTP binding D [Homo sapiens (human)] Chromosome 6
RPS6KA2 ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 6
PIK3CG phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit gamma [Homo sapiens (human)] Chromosome 7
BRAF v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B [Homo sapiens (human)] Chromosome 7
RHEB Ras homolog enriched in brain [Homo sapiens (human)] Chromosome 7
EIF4EBP1 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 8
IKBKB inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase beta [Homo sapiens (human)] Chromosome 8
RRAGA Ras-related GTP binding A [Homo sapiens (human)] Chromosome 9
RPS6 ribosomal protein S6 [Homo sapiens (human)] Chromosome 9
TSC1 tuberous sclerosis 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 9
DDIT4 DNA-damage-inducible transcript 4 [Homo sapiens (human)] Chromosome 10
PTEN phosphatase and tensin homolog [Homo sapiens (human)] Chromosome 10
INS insulin [Homo sapiens (human)] Chromosome 11
RPS6KB2 ribosomal protein S6 kinase, 70kDa, polypeptide 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 11
EIF4B eukaryotic translation initiation factor 4B [Homo sapiens (human)] Chromosome 12
IGF1 insulin-like growth factor 1 (somatomedin C) [Homo sapiens (human)] Chromosome 12
ULK1 unc-51 like autophagy activating kinase 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 12
CAB39L calcium binding protein 39-like [Homo sapiens (human)] Chromosome 13
HIF1A hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor) [Homo sapiens (human)] Chromosome 14
AKT1 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 14
ULK3 unc-51 like kinase 3 [Homo sapiens (human)] Chromosome 15
TSC2 tuberous sclerosis 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
MLST8 MTOR associated protein, LST8 homolog (S. cerevisiae) [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
PDPK1 3-phosphoinositide dependent protein kinase 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
PRKCB protein kinase C, beta [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
MAPK3 mitogen-activated protein kinase 3 [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
PIK3R5 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 5 [Homo sapiens (human)] Chromosome 17
ULK2 unc-51 like autophagy activating kinase 2 [Homo sapiens(human)] Chromosome 17
RPS6KB1 ribosomal protein S6 kinase, 70kDa, polypeptide 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 17
STRADA STE20-related kinase adaptor alpha [Homo sapiens (human)]
100 Chromosome 17
PRKCA protein kinase C, alpha [Homo sapiens (human)] Chromosome 17
RPTOR regulatory associated protein of MTOR, complex 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 17
99
100
Anexo 2. Relação de todos os genes analisados da via Tau, detalhando o nome completo de cada gene e sua respectiva
localização.