KEGIATAN BELAJAR 3

VALIDASI METODE ANALISIS KIMIA

Capaian Pembelajaran
Merancang Validasi Metoda Uji Dalam Analisis Kimia

Sub Capaian Pembelajaran

1. membedakan verifikasi metode dan validasi metode
2. merancang parameter yang digunakan dalam melakukan validasi metode analisis

Pokok-pokok materi
1. Pengertian Validasi Metode
2. Parameter validasi metode analisis

URAIAN MATERI
Dalam rangka penjaminan sistem mutu laboratorium pengujian, alat-alat ukur harus memiliki
jadwal kalibrasi sesuai dengan kesepakatan yang telah ditetapkan. Selain jadwal kalibrasi
laboratorium pengujian harus memiliki metode-metode pengujian yang digunakan tervalidasi
dan dilaporkan pada suatu dokumen khusus. Pada kegiatan belajar 3 ini akan diuraikan apakah
itu validasi metode analisis, kapan perlu dilakukan validasi metode, dan parameter-parameter
yang digunakan pada pekerjaan tersebut.

A. Pengertian Validasi Metode Analisis

Beberapa definisi dari validasi metode analisis adalah sebagai berikut:
Badan POM RI (Anonim, 2006)
”Tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa tiap bahan, proses, prosedur, kegiatan,
sistem, perlengkapan atau mekanisme yang digunakan dalam produksi maupun pengawasan
mutu akan senantiasa mencapai hasil yang diinginkan.” (CPOB: 2006)
AOAC ( Association of Analytical Chemistry)
Validasi metode analisis adalah proses yang menunjukkan atau membuktikan karakteristik
kinerja metode suatu analisis dapat diterima atau tidak.
ISO/IEC 17025 : 2005 klausul 5.4.5.1
Validasi metode analisis sebagai langkah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti
yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus telah dipenuhi.
 Secara garis besar validasi metode analisis adalah proses pembuktian bahwa suatu
pekerjaan atau aktivitas pengukuran atau prosedur analisis kimia memberikan hasil yang
mampu telusur ke sistem satuan internasional. Validasi metode sangat diperlukan karena
beberapa alasan yaitu validasi metode merupakan elemen penting dari kontrol kualitas, validasi
membantu memberikan jaminan bahwa pengukuran akan dapat diandalkan. Dalam beberapa
bidang, validasi metode adalah persyaratan peraturan.
Validasi metode analisis perlu dilakukan ketika:
1. Menggunakan metode yang tidak baku yaitu metode yang diambil dari suatu jurnal yang
belum diakui secara luas, buku ajar, dan dari laporan penelitian.
2. Menggunakan metode yang dikembangkan oleh laboratorium untuk kepentingan sendiri
yag merupakan kegiatan yang terencana serta ditugaskan pada personil yang kompeten
yang dilengkapi dengan sumber daya yang memadai.
3. Menggunakan metode standar tetapi telah mengalami modifikasi sekecil apapun. misalnya
perubahan temperature dan pereaksi.
4. Menggunakan metode rutin yang digunakan di laboratorium berbeda, atau dilakukan oleh
analis atau peralatan yang berbeda.
5. Menggabungkan dua atau lebih metode standar
Setelah Anda memahami pengertian dan kapan perlu dilakukan validasi metode
analisis, ada satu definisi lainnya yang terkadang selalu disandingkan dengan kata valiadasi
metode yaitu verifikasi metode analisis. Istilah verifikasi juga sering digunakan untuk alat-alat
ukur. Verifikasi alat ukur adalah proses pembuktian atau pengumpulan bukti dengan cara
membandingkan ke alat lain yang sejenis bahwa skala ukur atau cara pengukuran atau
persyaratan satuan ukuran telah terpenuhi.
Verifikasi metode uji adalah konfirmasi ulang dengan cara menguji suatu metode
dengan melengkapi bukti-bukti yang obyektif, apakah metode tersebut memenuhi persyaratan
yang ditetapkan dan sesuai dengan tujuan. Verifikasi sebuah metode uji bermaksud untuk
membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan
metode tersebut dengan hasil yang valid. Verifikasi bertujuan untuk membuktikan bahwa
laboratorium memiliki data kinerja. Verifikasi metode analisis dilakukan pada metode yang
sudah standar. Adapun parameter verifikasi metode akan lebih sedikit dibandingkan denga
validasi metode analisis. Apakah itu parameter validasi metode analisis akan diuraikan pada
bahasan selanjutnya.

B. Parameter Validasi Metode Analisis

 Parameter ini berkaitan dengan sejauh mana zat lain mengganggu identifikasi atau
analisis kuantifikasi analit. Selain itu juga merupakan ukuran dari kemampuan metode untuk
mengidentifikasi/mengukur analit. Kehadiran zat lain, baik endogen maupun eksogen, dalam
sampel matriks di bawah kondisi yang dinyatakan metode ini. Kekhususan ditentukan dengan
menambahkan bahan-bahan yang mungkin dihadapi dalam sampel.
Terdapat sepuluh parameter yang harus dikumpulkan untuk melakukan validasi metode
analisis yaitu:
1. linearitas (range atau daerah kerja)
2. batas deteksi (LOD : limit of detection)
3. batas kuantitasi (LOQ : limit of quantification)
4. presisi (ketelitian)
5. akurasi (ketepatan)
6. sensitivitas
7. selektivitas
8. uji ketegaran (robustness)
9. uji ketangguhan (ruggedness)
10. ketidakpastian (uncertainty)
Cara mengukur parameter dalam melakukan validasi metode akan dijelaskan pada bagian
masing-masing. Adapun bagaimana penerapan dari sepuluh parameter tersebut aka dijelaskan
pada kegiatan belajar 4 yaitu bagaimana meracang suatu kegiatan validasi metode analisis
1. Linearitas dan jangkauan kerja
Menunjukkan kemampuan suatu metode analisis memberikan respon yang secara
langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap
konsentrasi analit dalam sampel. linearitas ditentukan dengan cara membuat kurva kalibrasi
dari beberapa set larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya (minimal 5 larutan deret
standar), sehingga akan didapat hubungan antara konsentrasi dan respon pengukuran melalui
persamaan garis pada kurva kalibrasi yang ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasinya seperti
terdapat pada Gambar 3.1.

Kurva Kalibrasi Persamaan Garis r

Gambar 3.1 Hubungan dalam linearitas

Koefisien korelasi (r) inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis.
Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah :
>/= 0,9970 (ICH 1995) ICH : International Conference on Harmonization
>/= 0,9980 (WA Laboratory Operations Manager) WA : West Australian
>/= 0,9980 (AOAC)
Adapun tahapan pekerjaan pada parameter linearitas adalah :
1) Dibuat tujuh deret larutan standar ( misalnya kosentrasi 2,5 : 5,0: 7,5 : 10,0 : 12,5 :15,0 dan
17,5 ppm).
2) dilakukan pengukuran respon untuk masing-masin larutan standar.
3) Dibuat persamaan garisnya dengan metode regresi linear y = bx + a (b kemiringan garis
dan a: intersep)
4) Tentukan nilai koefisien korelasinya yang menunjukkan linearitas kurva kalibrasi.
5) Lakukan pekerjaan sebanyak 3 kali pengulangan.
Kurva kalibrasi untuk menentukan parameter linearitas terdapat pada Gambar 3.2

Gambar 3.2 Persamaan regresi linear y = bx + a

2. Sensitivitas
Sensitivitas masih berkaitan dengan linearitas persamaan regresi linear metode analisis,
maka dari kurva kalibrasi dapat pula langsung menentukan sensitivitas metode. Sensitivitas
metode menunjukkan kemampuan dari suatu alat atau prosedur/metode penentuan untuk
membedakan perbedaan kecil dari konsentrasi analit. Sensitivitas metode ditentukan
berdasarkan nilai kemiringan garis (slope) dari persamaan regresi kurva standar.
Nilai kemiringan garis yang kecil menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi yang
kecil tidak terlalu berpengaruh terhadap sinyal detektor yang dihasilkan, sehingga sensitivitas
menjadi kurang baik. Sebaliknya apabila nilai kemiringan garis besar (tegak) menunjukkan
perubahan konsentrasi yang tidak terlalu kecil akan tetapi dapat berpengaruh besar terhadap
sinyal detektor. Sehingga metode analisis memiliki sensitivitas yang baik.

3. Batas Deteksi, (Limit of Detection,LOD)

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang
masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. LOD juga didefinisikan
sebagai konsentrasi terendah yang dapat dibedakan dari kebisingan latar belakang dengan
tingkat kepercayaan tertentu. Ada beberapa metode untuk menentukan LOD, yang semuanya
tergantung pada analisis spesimen dan pemeriksaan sinyal untuk rasio kebisingan blanko.
Minimum persyaratan untuk sinyal terhadap kebisingan dapat digunakan untuk menentukan
LOD. LOD merupakan parameter yang dapat dipengaruhi oleh perubahan kecil dalam sistem
analisis (misalnya suhu, kemurnian reagen, efek matriks, kondisi berperan). Oleh karena itu,
penting bahwa parameter ini selalu dilakukan oleh laboratorium dalam melakukan validasi
metode.
Pengujian LOD
a. Untuk metode non instrumen, batas deteksi ditetapkan dengan melakukan analisis
sampel yang mengandung analit dalam kadar yang diketahui dan menentukan batas
terendah kadar analit yang dapat dideteksi.
LOD = 3 (SD/b)
SD = simpangan baku blangko,
b = kemiringan garis regresi (Y = bx + a)
b. Untuk metode instrumen, batas deteksi dilakukan dengan mengukur besarnya respon
instrumen dari larutan blanbko dan menghitung simpangan bakunya.

LOD = Nilai rata-rata blanbko sampel + 3 SD

4. Batas Kuantisasi (LOQ)

Batas kuantitasi adalah konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan
akurasi yang bisa diterima.
Pengujian
a. Untuk metode non isntrumental, umumnya ditentukan dengan melakukan analisis
sampel yang mengandung analit dalam jumlah yang diketahui lalu menetapkan kadar
terendah analit yang dapat dideteksi dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima.
 b. Untuk metode instrumental, umumnya dengan mengukur besarnya respon latar
belakang analisis dengan cara menganalisis sejumlah larutan blangko sampel (yang
tidak mengandung analit) sekurang-kurangnya 7 kali pengulangan.

Pengujian LOD dan LOQ dapat pula ditentukan secara bersamaan berdasarkan persamaan
regresi linier yang diperoleh pada uji linearitas.
LOD dan LOQ dihitung dari rerata kemiringan garis dan standar deviasi kurva standar yang
diperoleh.
LOD = 3 (SD/b); dan LOQ= 10 (SD/b)
SD = standar deviasi kurva standar, ( / )
b = kemiringan garis regresi (Y = bx + a)

Pada Tabel 3.1 disajikan hasil pengolahan data penentuan LOD dan LOQ
Tabel 3.1
Contoh Pengolahan Data LOD dan LOQ dari kurva kalibrasi standar

No. x (ppm) y ŷ x2 (yi-ŷ) (yi-ŷ)2

1 2,50 0,0615 0,0616 6,25 -0,0001 0,0000
2 5,00 0,1306 0,1346 25,00 -0,0040 0,0000
3 7,50 0,2113 0,2076 56,25 0,0037 0,0000
4 10,00 0,2789 0,2806 100,00 -0,0017 0,0000
5 12,50 0,3677 0,3536 156,25 0,0141 0,0002
6 15,00 0,4134 0,4266 225,00 -0,0132 0,0002
7 17,50 0,5013 0,4996 306,25 0,0017 0,0000
Σx = 70,00 Σy =1,9647 0,0004
x̅ = 10,00 y̅ = 0,2807 0,0001

( ŷ)
Sy/x = b= 0,0292

,
= = 0,0034

Maka nilai LOD dan LOQ nya adalah:

/
LOD =
 ,
= = 0,3493 ppm
,

/
LOQ =
,
= = 1,11644ppm
,

5. Presisi
Presisi didefinisikan sebagai keterdekatan hasil yang diterima (baik sebagai nilai
teoritis maupun sebagai nilai rujukan yang diterima) dengan nilai yang diperoleh dari hasil
pengukuran.
Presisi dinyatakan dengan 2 cara, yaitu:
Uji Ketahanan (repeatability)
Uji ketertiruan (reproducibility)
Penentuan nilai presisi metode dapat dilakukan melalui cara:
a. Larutan sampel yang telah disiapkan diukur dengan AAS sebanyak 7 kali ulangan.
b. Ketelitian diukur dengan menghitung persentase relatif standar deviasi (%RSD) dengan
terlebih dahulu menentukan standar deviasi berdasarkan data hasil percobaan yang
diperoleh.
( ̅)
s=

% RSD = ̅ x 100%

Pada Tabel 3.2 disajikan contoh perhitungan presisi metode analisis

 Tabel 3.2
Contoh perhitungan presisi metode analisis

No. x − ̅ ( − ̅)
kadar (mg/g)
1 2,0528 -0,0333 0,00110606
2 2,0377 -0,0483 0,00233493
3 2,0610 -0,0250 0,00062705
4 2,0678 0,0270 0,00072885
5 2,1240 -0,0182 0,00033101
6 2.1459 0,0380 0,00144040
Σx =14,6022 14,6022 0,0599 0,00358363
x̅ = 2,0860 0,0101593
s = 0,0411
RSD (%) 1,97

Nilai presisi metode menunjukkan nilai RSD (%) adalah 1,97 untuk memahami
persyaratan nilai RSD silahkan Anda membuka rujukan pada link berikut ini Reference of
Modul PPG Teknik kimia.

6. Akurasi
Akurasi menunjukkan derajat kedekatan hasil dari sederet pengukuran yang diperoleh
dari contoh yang homogen pada kondisi tertentu.
Akurasi ini menandakan suatu metode baik dilakukan untuk analaisis ini, jika akurasinya baik
berarti prosedur ini baik.
Terdapat 3 cara dalam metode ujinya, yaitu:
Uji Pungut Ulang (Recovery Test)
Uji relatif terhadap akurasi metode baku
Uji terhadap standard reference material (SRM)
Penentuan akurasi metode analisis
a. Dilakukan dengan membuat lautan sampel sebanyak 7 buah dan ditambahkan masing-
masing kedalamnya larutan SRM kalsium 15 ppm sebanyak 1 mL.
b. Diukur masing-masing larutan dengan SSA.
c. Dihitung persen perolehan kembali (% recovery) dengan rumus:
 ( )
% perolehan kembali = x 100 …………..(3.1)
∗

Cf = Konsentrasi total sampel yang ditambah analit.

CA = Konsentrasi sampel sebenarnya
C*A = Konsentrasi analit yang ditambahkan

Hasil pengujian akurasi dapat dilihat pada Tabel 3.3

Tabel 3.3
Pengolahan data akurasi metode analisis

Pengulangan ke- Perolehan kembali Perolehan kembali

(µg/mL) (%)
1 1,4623 97,49
2 1,4658 97,72
3 1,4829 98,86
4 1,4987 99,32
5 1,4863 99,09
6 1,4760 98,40
7 1,4760 98,40

7. Selektivitas dan Spesifitas

Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya
mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama walaupun adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat
penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung
bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya,
dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang
ditambahkan. Parameter selektivitas dapat dilakukan untuk tujuan berikut ini:
a. Untuk identifikasi
Metode harus mampu menyeleksi senyawa-senyawa yang ada dalam sampel yang
berkaitan dengan struktur molekulnya. Metode tersebut dapat dibuktikan dengan hasil positif
(atau dibandingkan dengan bahan acuan standar yang diketahui) dari sampel yang
mengandung analit dan digabung dengan hasil negatif dari sampel yang tidak
mengandung analit.
b. Untuk penetapan cemaran
Pengujian metode analisis dilakukan dengan menguji sampel yang ditambahkan
sejumlah tertentu cemaran atau hasil urai dan terlihat dengan nyata cemaran itu dapat
ditetapkan secara akurat dan presisi yang memadai.
Penentuan selektivitas
a. Dilakukan dengan membuat lautan sampel sebanyak 7 buah dan ditambahkan masing-
masing kedalamnya larutan standar Mg 1 ppm sebanyak 50 µL.
b. Diukur masing-masing larutan dengan AAS.
c. Dibandingkan hasil perolehan kadarnya dengan uji- t dengan rumus:

√
t= ̅

keterangan:
t = besaran dalam perhitungan batas kepercayaan dan uji keberartian rataan.
̅ = rerata selisih antar terok
n = jumlah terok
s = simpangan baku dari selisih antar terok
Contoh hasil pengujian selektivitas dapat ditunjukkan pada Tabel 3.4
Tabel 3.4
Data pengolahan selektivitas metode analisis

Pengulangan Kadar sampel Kadar sampel yang selisih ̅

diganggu
1 2,0528 2,2774 -0,2246
2 2,0377 2,2746 -0,2369
3 2,0610 2,2568 -0,1958
4 2,1130 2,2774 -0,1643
5 2,0678 2,2760 -0,2082
6 2,1240 2,2842 -0.1602
7 2,1459 2,3047 -1589
Σx 14,6022 15,9511 -1,3489
x̅ 2,0860 2,2787 -0,1927
s 0,0411 0,0142 0,0322
t = -0,1927 √7/0,0322
t = -15,83
Pada batas kepercayaan 95% pada daerah pengujian berikut
kriteria penerimaan : t hitung 2,45
Daerah kriteria penolakan : t hitung 2,45
t hitung < t tabel, sehingga dinyatakan dipertahankan dan tidak ada perbedaan kadar kalsium
pada sampel yang ditambah Mg dengan yang tidak ditambah Mg. sehingga selektivitas metode
dinyatakan baik.

8. Uji Ketangguhan (Ruggedness)

Uji Ketangguhan (Ruggedness) adalah parameter uji derajat ketertiruan hasil uji yang
diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal seperti
laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, dan hari yang berbeda. Uji
ketangguhan dilakukan untuk mengetahui perubahan reliabilitas metode uji dengan
berjalannya waktu rentannya metode uji terhadap adanya perubahan kondisi pengujian.

Penentuan uji ketangguhan

a. Dilakukan dengan mengukur larutan standar sebanyak 5 buah dengan 3 kali waktu
pengukuran yang berbeda.
b. Diukur masing-masing larutan dengan AAS.
c. Dibandingkan hasil perolehan kadarnya dengan uji- F (Anova).
Uji ketangguhan ini sebagai uji pembanding untuk metode sebelumnya, jika dilakukan uji
ketegaran ini maka tidak perlu dilakukan pembandingan metode.
Hasil uji ketangguhan metode dapat ditunjukkan pada Tabel 3.5
Tabel 3.5
Data pengolahan ketangguhan metode analisis

Konsentrasi Pengulangan
1 2 3
2,50 0,0643 0,0644 0,0606
5,00 0,1250 0,1267 0,1156
7,50 0,1885 0,1927 0,1799
10,00 0,2309 0,2307 0,2185
12,50 0,2979 0,2926 0,2863
Σy 0,9066 0,9071 0,8609 2,6746
y2 0,8219 0,8228 0,7411 2,3859
n=5 N=5 N = 15
Sumber ragam Jumlah kuadrat derajat bebas kuadrat rerata
antar-sampel 2,3859/3-(2,6746)2/15 2 0,3184/2 = 0,1592
(between smple) = 0,3184
dalam-sampel Dari penguranan= 4 2,6746/4 = 0,6687
(within sample) 2,,6746

,
F hitung =
,

Dari tabel F nilai F tabel adalah 6,944 (P=0,05), karena nilai hasil hitungan F(=4,200) lebih
kecil daripada 6,944, maka hipotesis nol diterima rerata sampel tidak berbeda secara
signifikan.

9. Uji Ketangguhan (Robustness)

Untuk memvalidasi ketangguhan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi
yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi.
Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur HPLC
dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak (1%), pH fase
gerak (± 0,2 unit), dan perubahan temperature kolom (± 2 - 3° C).
Robustness adalah ukuran bagi suatu metode analisis dalam mempertahankan unjuk
kerjanya dalam situasi dimana pengaturan kondisi analisis tidak sesempurna seperti yang
ditetapkan dalam metode yang bersangkutan. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis
yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah.

10. Uji Ketidakpastian (Uncertainty)

Sebagaimana telah dituliskan pada dokumen standar “Persyaratan Umum Kompetensi
Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi” ISO/IEC 17025:2005 telah diatur pula
persyaratan tentang ketidakpastian, yaitu dalam klausul 5.4.6. Dalam standar itu diatur bahwa
laboratorium wajib mempunyai dan menerapkan prosedur untuk mengestimasi ketidakpastian
pengukuran.
Estimasi ketidakpastian tersebut harus wajar (reasonable) dan didasarkan pada
pengetahuan atas unjuk kerja metode, dan harus menggunakan data-data yang diperoleh dari
pengalaman sebelumya serta data validasi metode. Istilah ketidakpastian pengukuran yang
digunakan dalam peraturan ini berdasarkan pada kosakata istilah dasar dan umum dalam
metrologi adalah parameter yang terkait dengan hasil pengukuran, yang mencirikan
penyebaran nilai-nilai yang cukup dan dapat dikaitkan dengan pengukuran.

Penentuan Estimasi Ketidakpastian Pengukuran pada pembuatan Larutan Standar Cd 1000

mg/L
• Pembuatan larutan standar Cd 1000 mg/L
• Cara kerja sesuai SNI:
• Logam Cd dibersihan lapisan luar dari oksidanya,
kemudian dilarutkan dengan asam nitrat dan dimasukkan dalam labu ukur 1000 mL,
ditambahkan aquabides sampai batas.

Untuk lebih lengkapnya materi ketidakpastian metode analisis silahkan kunjungi link berikut
ini.Reference of Modul PPG Teknik kimia