1. ¿Que es la agarosa?

La agarosa un polímero natural, polisacárido formado por galactosas alfa y beta

que se extrae de las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. Es soluble en
agua a temperaturas superiores a los 65ºC, dependiendo del grado de
sustituciones hidroxietílicas de sus cadenas laterales. Presenta una histéresis
(diferencia entre temperaturas de fusión y gelificación) importante, que la hace
idónea para técnicas de separación tales como electroforesis, cromatografía y
otras. En concreto gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 - 45°C y funde a
temperaturas entre 80 - 95°C, aunque estas temperaturas pueden ser alteradas en
productos para usos específicos. La agarosa es un producto natural y no tóxico, por
lo que puede ser manejado libremente y de forma cómoda en el trabajo. Además
de su uso en geles, es fácilmente derivatizable, por lo que es sencillo fijar a su
estructura proteínas tales como enzimas, antígenos o anticuerpos. En la
electroforesis, forma la matriz del gel y provoca el retardo dependiente del tamaño
que marca la separación. Su uso más extendido es para construir geles que
permitan separar moléculas de ADN.

2. ¿Qué ventajas tienen los geles de poliacrilamida respecto a los de

agarosa?
La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar y
purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolución.
Por su parte, la electroforesis en geles de poliacrilamida, aunque tiene una mayor
limitación en cuanto al tamaño de los fragmentos que podemos separar (5-600
pb), posee un poder de resolución mucho mayor, permitiendo la separación de
moléculas que difieren en un sólo par de bases. Los geles de poliacrilamida se
corren de forma vertical y tienen la desventaja de ser más complicados en su
elaboración y manipulación. Los geles de agarosa tienen un poder de resolución
mucho menor que los de poliacrilamida, porque no permiten separar moléculas de
ADN que difieren en tamaño menos de unas 50 pb. Además, tiene la ventaja de
que, variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera
controlada el tamaño del poro. La poliacrilamida es más efectiva que los geles de
agarosa cuando se desean separar fragmentos pequeños de ADN entre 5 a 500
pares de bases (bp).

3. ¿Para qué propósito se utiliza una electroforesis en gel de poliacrilamida?

Los geles de poliacrilamida y agarosa son utilizados para la separación de
fragmentos de ácidos nucleicos cuando una corriente eléctrica se aplica sobre el
gel. El ADN tiene una carga negativa a pH7, y migra hacia el ánodo (polo
positivo). La poliacrilamida es más efectiva que los geles de agarosa cuando se
desean separar fragmentos pequeños de ADN entre 5 a 500 pares de bases (bp).
Estos geles incluso pueden separar fragmentos que difieren en sólo una base, pero
estos son más complicados de hacer y se corren en camaras especiales y debido a
los bajos costos de secuenciación han quedado obsoletos. Por otra parte, los geles
de agarosa se utilizan comúnmente para separar fragmentos desde 200 bp hasta
más de 1 Mb que es igual a 10,000 Kb o un millón de bp. En la electroforesis,
forma la matriz del gel y provoca el retardo dependiente del tamaño que marca la
separación.
 4. Diferencia entre usar TAE Y TBE.
Hay dos soluciones tampón muy usadas para separación de fragmentos de ADN
mediante electroforesis, son el buffer TBE y buffer TAE, que sólo se diferencian en
un compuesto, ácido bórico y ácido acético respectivamente.
TAE buffer tiene baja fuerza iónica y baja capacidad tamponante lo que hace
necesario la recirculación del buffer cuando los tiempos de electroforesis son
largos. TBE buffer tiene alta fuerza iónica y alta capacidad tamponante lo que
permite trabajar sin recirculación en electroforesis largas. Se recomienda para
separación de fragmentos pequeños y con pequeñas diferencias de tamaños entre
ellos.

Diferencias entre el buffer TBE y TAE:

– Migración: El TAE es mejor para el análisis electroforético de fragmentos
grandes de ADN (900 – 2000bp) ya que corren más rápido y tiene mayor capacidad
de discriminación en un gel de agarosa a 0.8%. Mientras que en TBE para
fragmentos pequeños de ADN (100 – 500bp) corren más rápido y tiene mayor
capacidad de discriminación en gel de agarosa al 2%.
– Capacidad tamponante: el TBE es más estable y tiene una capacidad tampón
más alta que el TAE.
– Reciclaje: el TAE no aguanta más de 3 corridas de electroforesis seguidas sin
alterar sus propiedades, mientras que el TBE dura 3 o 4 días independientemente
de las corridas de electroforesis realizadas.
– Recuperación del ADN: el TBE tiene una interacción pegajosa con la agarosa,
lo que provoca una recuperación baja del ADN.

5. ¿Para qué sirve el buffer de carga?

Los buffers de carga facilitan la visualización y sedimentación del producto de PCR
o de ácidos nucleicos en los pozos. La muestra + tampón de carga se deopsita al
fondo del pocillo y no difunde por el tampón que llena la cubeta y cubre el gel. De
ese modo no se pierde y se mantiene concentrada
En electroforesis de DNA:
 Glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación a los pocillos.
 Azul de bromofenol (u otro colorante como el xileno-cianol) como marcador del
frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual
durante la carga de muestra en los pocillos.
 Tampón para estabilizar el pH y, por tanto, la carga de las moléculas.
El buffer de carga debe tener una alta densidad que permita que la muestra se
introduzca en el pocillo del gel, además de colorantes que nos indiquen cuando
debe detenerse la electroforesis.
Buffer de carga: Proporciona densidad a la muestra, permitiendo que caiga al
fondo del pozo. A su vez, este posee un agente que permite visualizar el frente de
corrida. (Azul de Bromofenol). Se usa aproximadamente en una proporción 10% del
volumen de muestra a cargar.
6. Utilidad del marcador de peso molecular.

Los marcadores de peso molecular están diseñados para visualizar la migración del
DNA en geles de agarosa y poliacrilamida. Su mezcla de compuestos como el
glicerol ayudan a precipitar la muestra y EDTA para inhibir la actividad de
nucleasa.

También se puede utilizar durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),

en la que se amplifican pequeñas cantidades de ADN o ARN para producir grandes
cantidades de producto. un marcador de peso molecular es una molécula utilizada
para proporcionar una estimación del tamaño de las moléculas se someten a
electroforesis en gel. Esta es una técnica en la que el ADN, ARN, o proteínas se
separan por tamaño usando una corriente eléctrica en un gel.

7.Fundamento de la tinción de bromuro de etidio y GelRed.

Solución de bromuro de etidio El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante

(se intercala entre las bases nitrogenadas) que se usa como colorante fluorescente
para la visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida. El
BrEt absorbe luz ultravioleta de λ ≈ 300 nm, y emite una luz anaranjada de 590
nm, mediante la cual podemos observar la posición y cantidad relativa del ADN en
el gel tras la electroforesis. La solución stock de BrEt se prepara a una
concentración de 10 mg/ml en agua, y se conserva a temperatura ambiente o a
4°C en un tubo envuelto en papel de aluminio. Existen dos formas diferentes de
realizar el teñido del ADN:

1. Preparar el gel con BrEt incorporado.

2. Teñir el gel una vez finalizada la electroforesis con una solución de BrEt. En
ambos casos, la concentración final del BrEt en el gel o en la solución de teñido
debe ser de 0.5 µg/ml.

Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al

DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometría
plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con el interior
hidrófobo de la doble hélice. En menor medida, interacciona también con DNA
monocatenario.

Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un

entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta de
onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-
anaranjado. En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su
posición en el gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de
bromuro de etidio, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se
prepara el gel.

Precaución: el etidio es cancerígeno, debido a su capacidad para intercalarse y así

dificultar la replicación y transcripción correctas. Debe manejarse con precaución,
especialmente el polvo sólido y las disoluciones concentradas.
Referencias.

 http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/reactivos/reactivos.htm

 Current Protocols in Molecular Biology,(2003). Supplement 40, Frederick M. Ausubel

 Alberto Checa Rojas. (2017). Método: Gel de electroforesis Agarosa. 2018, Marzo
10, Conogasi.org Sitio web: http://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-
electroforesis-agarosa/

 http://www.medioscultivo.com/agarosa/

 Sheer DG, Yamane DK, Hawke DH, Pau-Miau Yuan. The use of micro preparative
electrophoresis of protein/peptide isolations for primary structure determinations.
Peptide Research. 1990; 3 (2)