Extracción del ADN

Es esencial en la biología molecular. Contribuye al estudio de polimorfismos,

construcción de bibliotecas genómicas, análisis de PCR, entre otros. El ADN se
encuentra 90% en el núcleo y 10% en otros organelos. Representa el 1% de la
masa total celular y su peso molecular es elevado, lo que lo diferencia de otras
moléculas.
Para extraer el ADN se debe:

Eliminar Verificar la
Romper la Concentrar el
proteínas y pureza del
célula ADN
ARN ADN

Los métodos deben garantizar :

Se debe obtener
No dañar la DNA integro de
Ser igual de
naturaleza Debe ser rápido alto peso
eficiences con
química y física y simple molecular con
todos los DNA.
de la molécula. pocas cadenas
monocatenarias

Protocolo de Aislamiento Manual de ADN genómico a partir de sangre total

Ruptura de Eritrocitos
En un microtubo colocar 0.5
mL de una muestra de
sangre en EDTA.
Congelar a -80 grados C por
20 minutos.
Sacar del congelador y
añadir 1 mL de agua
destilada sin descongelar la
muestra de sangre.
Poner en el agitador orbital
por 5 minutos.
Comprobar que exista lisis
completa de los eritrocitos,
(en el caso de que no se
complete la lisis, repetir el
paso 4 hasta que se observe
una solución más clara)
Centrifugar a 10.000 rpm
por 10 minutos a 4º C.
Lavado
Descartar con pipeta el
sobrenadante con cuidado
de no alterar el pellet.
Resuspender el pellet en 0.5
mL de suero fisiológico,
mezclar por inversión.
Centrifugar a 10.000 rpm
por 10 minutos a 4 C.
Descartar con pipeta el
sobrenadante con cuidado
de no alterar el pellet.
Lísis de linfocitos
Resuspender el pellet en 60
uL de suero fisiológico,
añadir 360 uL de A-Fasano
y 4 uL de proteinasas K (20
mg/ml).
NaCl -> mantiene la fuerza
iónica-estructura - ADN - A-
Fasano> NaCl, EDTA, Tris,
SDS > detergente (inhibidor
de DNAsas,
lisis celular y
concentración de proteínas.
Proteinasa K> Remociónde
proteínas
(digestión
enzimatica previa)