Manual de Prácticas de Microbiología Médica

PRÁCTICA N° 26: Aislamiento viral: Cultivos celulares: Inoculación de

animales. Identificación por IFI y PCR.

CÉSAR CABEZAS SÁNCHEZ / MARÍA PAQUITA GARCÍA MENDOZA

CULTIVO CELULAR

OBJETIVO

El Alumno de Medicina conocerá los efectos de la infección viral en los cultivos celulares, en
animales de experimentación ysu utilidad en el diagnóstico de las infecciones virales.

INTRODUCCIÓN

El Aislamiento Viral brinda la posibilidad de caracterización del virus en detalle con las siguientes
desventajas:

- Debe realizarse solo en el período agudo de la enfermedad

- Requiere días o semanas para la obtención del resultado
- Requiere niveles de seguridad 2, 3 ó 4
- Frecuentemente tienen baja sensibilidad lo que depende en gran medida de la condición
de la muestra
- Susceptible de contaminación bacteriana
- Susceptible de sustancias tóxicas que pueden estar presentes en la muestra

Los cultivos de células in vitro consisten en un sistema formado por células provenientes de un
órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química
definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas.

- Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar CULTIVOS
CELULARES.
- La invasión viral se evidencia a través de un cambio celular o efecto citopático (ECP) y mediante
pruebas complementarias
- El medio que las rodea debe suministrar los nutrientes esenciales.
- La temperatura, pH, osmolaridad y humedad deben ser mantenidos dentro de ciertos límites.
- Sustancias tóxicas o inhibitorias no deben estar presentes o permitir que se acumulen.
- La adición de suero al medio basal como fuente de factores de crecimiento macromoleculares
es esencial para el crecimiento de muchos tipos celulares.
- Las células dependientes de anclaje (unión firme) requieren de una superficie para fijarse que
no sea tóxica y biológicamente inerte.

Después de colocar células en un recipiente para cultivo y fijado a la superficie, las células entran
a la fase de regazo (no hay aumento en el nº de células).

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1. Fase logarítmica de crecimiento, con aumento exponencial en el nº de células y actividad

metabólica. La duración de la fase es variable ya que los diferentes tipos de células se dividen
a diferentes índices (tiempo de generación).

2. Fase estacionaria se alcanza una cuando los nutrientes se agotan y los desechos o productos
tóxicos se acumulan. El número de células permanece constante, esto a menudo sucede
cuando se alcanza la confluencia

CULTIVO DE CÉLULAS: TIPOS

1. Cultivo Primario: Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un
tejido original recién extraído

- Tienen varios tipos de células.

- Son células recientemente aisladas a partir de tejidos u órganos
- Suelen tener una duración limitada in vitro, generalmente resisten 5 a 10 subcultivos,
son cultivos celulares finitos
- Ej. células de riñón embrionario humano (REH).

2. Línea Celular: Cuando este cultivo primario es sometido a procesos de transformación que
le confieren capacidad ilimitada de multiplicación.

- Semicontinuas
o Cepas de células diploides derivadas de tejidos normales.
o Constituidas por un tipo de células que retienen su nº cromosómico diploide
original (cariotipo normal).
o Puede cultivarse hasta 50 generaciones.
o Útil en la producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar
materiales tóxicos
o Ej. los fibroblastos de pulmón.

- Continuas
o Cepas de células aneuploides transformadas.
o Se derivan de tejidos normales o de tumores malignos.
o Son células inmortalizadas en el laboratorio (propagación indefinida), resisten (n)
nº de pases y se mantienen in vitro por tiempo prolongado por medio de cultivos
repetidos.
o Generalmente tienen un nº variable de cromosomas y a veces también son
denominadas líneas celulares heteroploides.
o No se usan para vacunas.
o Ej. células Vero (riñón de mono verde africano), LLC-MK2 (riñón mono rhesus) y
BSC-1 (también de tejido normal de riñón de mono), HeLa y HEp-2 derivadas de
células humanas malignas y C6-36 derivadas de (glándulas salivales de Aedes
albopictus).

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3. Tipos de crecimiento celular

Las células se desarrollan sobre una superficie formando monocapa celular o en

suspensión.
- Cultivos en monocapa. - Las células se adhieren a una superficie sólida (vidrio, plástico)
formando una capaa celular que puede ser observada en el microscopio, Para el
mantenimiento de la línea celular se realiza sub.cultivos (pasajes)
- Cultivos en suspensión: Las células proliferan sin adherirse a una superficie. Los
subcultivos se realizan por diluciones de las suspensiones celulares.

Los cultivos de células animales también se pueden clasificar de acuerdo a su capacidad de

adherencia o no a una superficie determinada, pudiendo crecer en forma de monocapa o en
suspensión.

MATERIALES DE LABORATORIO

- 1 frasco con células VERO - 1 medio mantenimiento de cultivo

- 1 frasco con células C6-36
- 1 frasco con células BHK-21
- 1 frasco con células LLMCK2
- 100 mL de tripsina 0.25 %
- 1 lámina porta objeto
- 1 Pipeta pasteur
- 1 Frasco de colorante, cristal vileta o
azul de Tripán
- 1 medio de lavado (PBS)
celular
- 1 medio crecimiento de cultivo celular
- 5 láminas porta objetos para IFI
- 1 camara de newbauer
- 96 Puntas esteriles
- 2 micropipetas de 100 uL
- 2 micropipetas de 100 uL
- 2 micropipetas de 20uL
- Pipetas de trasferencia esteriles

EQUIPOS DE LABORATORIO

- Microscopio invertido - Estufa de 37°C

- Microscopio de Inmunofluorescencia - Refrigeradora.
- Camara de flujo laminar - Congeladora de -80°C
- Baño María - Congeladora de -20°C

PROCEDIMIENTO

 Observación de los frascos con cultivos celulares

 Disgregación de células: por efecto enzimático (tripsina) y por efecto mecánico
 Recuento de celulas para la replicacion
 Inoculacion de muestras en los cultivos celulares
 Inoculacion de muestras en animales de laboratorio.

OBSERVACION DE FRASCOS CON CULTIVO CELULARES.

- Se colocaran en el microscopio frascos conteniendo las monocapas de céluas o suspencion

de celulas.

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DISGREGACION DE CELULAS

EFECTOS ENZIMATICOS:

- Se utilizará la enzima digestive tripsina, para disgregar las células

EFECTOS MECANICOS:

- Se utilizara un dispersor o rascador de células.

- Se realizaran golpes discretos para desprender las celulas de la base del recipiente.

RECUENTO DE CELULAS PARA LA REPLICACIÓN.

- Diluir 1 ml de la suspensión de células con 1 ml de medio de cultivo.

- Transferir con una micropipeta a cada uno de los dos compartimientos de la cámara de
NEUBAUER.
- Realizar el contaje de células de cada uo de los cuatro cuadrantes de la cámara de
Neubauer.
- Calcular el promedio de los cuatro cuadrantes.
- Calcular la concentración de la suspensión celular con la fórmula siguiente.

N° de células X factor de dilución X Factor de conversión para la

Promedio cámara de Neubauer

INOCULACION DE LAS CELULAS.

- Diluir la muestra de suero a una dilución de 1/50 y colocar 200 uL en cada frasco o placa.
- Observar al microscopio la botella de cultivo con el objetivo de ver si el monoestrato
celular es continuo y uniforme.
- Descartar el medio, lavar con PBS.
- Inocular la muestra diluida en las botellas o placas de cultivo con el medio respectivo e
incubar a 37oC o la temperatura que la celula requiera por 30 minutos.
- Eliminar el inoculo y agregar medio de mantenimiento.
- Observar al microscopio invertido diariamente por 15 días, a fin de observar cambios en
la monocapa, es decir el EFECTO CITOPATICO.
- Si observamos efecto citopático se suspenderán las celulas y se colocarán en las láminas
de IFI.

INOCULACION DE ANIMALES DE LABORATORIO.

- Diluir la muestra de suero a una dilución de 1/50.

- Inocular 0.03 ml de la muestra diluida, por via intra cerebral o por via intraperitoneal.
- Observar al microscopio invertido diariamente por 15 días, a fin de observar alteraciones
neurologicas o EFECTO NEUROPATICO, paralisis de los miembros y pstracion de los
animales inoculados.

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FOTOS

CELULAS VERO NORMAL

CÉLULAS C6-36 NOMAL

Sabiendo que los virus son microorganismos complejos que van desarrollando mecanismos para
sobrevivir en la naturaleza y transmitirse de un huésped a otro, e incluso pueden infectar
durante el trabajo al personal de laboratorio; se dan las necesidades de contar con
infraestructura para las diferentes actividades relacionadas al diagnóstico de las infecciones
virales.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué acción tiene la tripsina en las células?

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2. Explique cada uno de los pasos del proceso de repicación viral.

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3. ¿en que consiste el método de Shell Vial?

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4. Explique cada uno de los pasos del proceso de repicación viral.

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BIBLIOGRAFÍA

1. Guia de Prácticas de Microbiologia Médica 2005.

2. INSTITUTO NACIONAL DE SALUD. Manual de procedimientos para el diagnostico de las
Arbovirosis. 1996.