UNIDAD 3.

- FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

INTRODUCCIÓN.-

La producción de bebidas alcohólicas ha sido una actividad ligada a la mayoría de

las culturas durante miles de años.
Existen evidencias arqueológicas de más de 7000 años de antigüedad que en
forma empírica los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de
diversos sustratos.
Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados
como los jugos de frutas, ya que éstos sólamente requieren poner en contacto el jugo con
la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta.
Desde épocas remotas diferentes civilizaciones aprendieron a fermentar diversos
sustratos a fin de producir sus bebidas alcohólicas autóctonas ,pero fue hasta el siglo XV
cuando empieza a popularizarse el arte de la destilación y de esta forma aparecen las
bebidas con mayor contenido alcohólico.
Las bebidas alcohólicas son compañeras constantes de el hombre en su historia,
pero bien es cierto que su exceso es capaz de reducir nuestras sensibilidades y también
es verdad que tiene la virtud de animar el espíritu y de establecer atmósferas propicias
para la convivencia y conversación, esto cuando se consume con la justa medida y con la
prudencia que caracteriza a quienes saben disfrutar de las cosas de la vida.
Debido a al gran importancia de estos productos la investigación científica y
tecnológica generan industrias las cuales son de mayor importancia económica en el
mundo.

BEBIDAS ALCOHOLICAS.

Son soluciones acuosas que contienen además de agua alcohol sustancias

orgánicas que ejercen influencia sobre los aromas y el sabor según “ Francisco Rico
Benitez.”
Son bebidas obtenidas a partir de cualquier jugo vegetal que no sea de uva y que
tienen propiedades organolépticas nuevas y atractivas para una prueba estadística
significativa de consumidores según Colin y Emilion.
De acuerdo a su contenido alcohólico las bebidas alcohólicas se clasifican en:

Fermentados.............................( 2-18% alcohol/volumen)

Destilados................................ ( 30-60% alcohol/volumen)
Generosas................................ (15-20% alcohol/volumen)
Licores..................................... (15-90% alcohol/volumen)

Ejemplo de un proceso para una bebida alcohólica jugo vegetal 80 y 230 g/l de
azúcares fermentables pH:
 3.6 y 4.3 antes de sulfatarlo.
 Clarificación Microfiltración.

1
  Inóculo cultivo puro.
 Fermentación 20 y 28°C bajo una atmósfera de CO2.

¿ Como se obtiene el alcohol ?

glucosa levadura alcohol + CO2

DESTILACIÓN.

Es la separación de dos o más mezclas de sustancias con puntos de ebullición

muy diferentes de una mezcla a otra (agua, alcohol)

La temperatura de ebullición del alcohol es de 78 oC. A partir de la glucosa,

fructosa o sacarosa a través de las levaduras y temperaturas obtendremos alcohol
(bebida fermentada) (2-18%) porque contiene agua y el agua diluye la concentración de
alcohol y por eso es menos el porcentaje. Y así, aplicamos el proceso de destilación se
separa el agua y obtendremos una bebida destilada de (30-60%) que es alcohol más
puro porque se separa agua.

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA.

Es un proceso bioquímico provocado por la acción de las levaduras y consiste en

la formación de los azúcares en etanol y bióxido de carbono que es un subproducto del
proceso.
Es la formación de etanol producida por la fermentación anaerobia de la glucosa.
La fermentación alcohólica no solo la sufren los azúcares fermentables (glucosa o
fructosa).
La sacarosa o azúcar de caña se desdobla en glucosa y fructosa por acción de la
enzima invertasa y pentasa producida por las levaduras. Además los productos alcohol
(anhídrido carbónico ), se forma también glicerina, ácido sucaníco, ácido subvolátiles,
butiliglicol, alcoholes superiores (esencia de fusel ), acetaldehído, ácido láctico y esteres.
La formación de los carbohidratos o azúcares a etanol mas bióxido de carbono se
realiza en condiciones anaerobiosis mediante la ruta de la glicólisis, que consiste en la
escisición de la glucosa para obtener energía (ATP). La transferencia de un fosforilo de
ATP a la glucosa esta catalizada por hexoquinasa, los siguientes intermediarios de esta
vía metabólica la dihidroxiacetona fosfato, gliceraldehido- 3-fosfato son azucares
fosforilados, de hecho una de las estrategias de la glicólisis es formar intermediarios de 3
carbonos capaces de intransferir subgrupos fosfatos al ADP, y así obtener una síntesis
neta de ATP. Desdoblamiento de la sacarosa a fructosa y glucosa por medio de la
enzima invertasa
Es un proceso que genera ATP en el cual las sustancias orgánicas actúan como
ganadores y aceptores de electrones, la fermentación puede producirse en ausencia de
O. Fue descubierto por Pasteur, que la describió como la vía sansi’air (la vida sin aire).
Enzima : término propuesto en 1878 por Friedrich Wilhem Kuhne para designar a
las sustancias catalíticamente activas, a las que previamente se les había llamado
fermento. Derivado de las palabras griegas en (en) y zumos (levaduras).

2
 ETAPAS Y RECCIONES QUÍMICAS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHOLICA.

GLICÓLISIS.

Derivado del griego glycos = azúcar (dulce), Lysis = disolución que quiere decir
azúcar en disolución.
La glucólisis es la secuencia de reacciones que convierte a la glucosa en piruvato
con la producción convidante de ATP.
La glicólisis es una de las diversas rutas catabólicas , conocidos generalmente
como fermentaciones anaerobias, mediante muchos organismos , obtienen energía
química de varios combustibles orgánicos en ausencia de oxígeno molecular.
Dado en que los organismos vivos sugieren inicialmente en una atmósfera que
careció de oxigeno.
La glicólisis es la secuencia de las reacciones que invierten la fructosa en piruvato
con la producción conocidamente en ATP . En los organismos aeróbicos la glicólisis sirve
de preámbulo al ciclo del ácido cítrico y a la cadena de transporte electrónica , las cuales
recolectan la mayor parte de la energía de la glucosa en condiciones aeróbicas , el
piruvato entra a la mitocondria en donde es completamente oxidasa hasta CO2 y H2 O.
Si el suministro es insuficiente como el músculo en contracción del piruvato se convierten
en lactano. En algunos organismos anaeróbicos como las levaduras del piruvato se
convierten en etanol : La formación del etanol y lactano a partir de glucosa son ejemplo de
fermentación.

3
 RUTA GENERAL DE LA GLICÓLISIS

GLUCOSA
ATP
ADP
GLUCOSA 6 FOSFATO
ATP
ADP
FRUCTOSA 6 FOSFATO

FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO

ESCISIÓN

GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO DIHIDROXICETONA FOSFATO

GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO
H2PO4 H2PO4

H2O 1, 3 BIFOSFOGLICERATO H2O

ADP
ATP
3 FOSFOGLICERATO

2 FOFOGLICERATO n
H2O
FOSFOENOL PIRUVATO
ADP
ATP
PIRUVATO

ACETALDEHÍDO

ETANOL + H2O l

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 RUTA DE LA GLICÓLISIS

CH2OPO-23
H
CH2OH H H
H H H HEXOQUINASA H H
+ ATP OH OH

OH OH OH OH
OH OH

GLUCOSA GLUCOSA 6
FOSFATO

La hexoquinasa entonces es una enzima que transfiere un grupo fosforilo desde el

ATP a un grupo de azucares de 6 carbonos (hexosas) como la glucosa y la manosa. La
hexoquinasa al igual que otras quinasas requieren para su actividad Mg u otro ion
bivalente como el Mn el ion metálico bivalente forma un complejo con el ATP. La etapa
siguiente de la glicólisis es la isomerización de la glucosa 6 fosfato a fructuosa 6 fosfato,
como se ve en la siguiente reacción:

CH2OPO-23 FOSFOGLUCOSA CH2OH

H H H ISOMERASA OPO -23
+ ATP OH
H OH OH
OH OH
OH OH H H

GLUCOSA 6 FOSFATO FRUCTUOSA 6 FOSFATO

El siguiente paso es convertir la glucosa 6 fosfato a fructuosa 6 fosfato que lo

hace la encima fosfato isomerasa es un rompimiento entre el enlace del carbono 1 y 2
haciendo así una isomerización que es como un recorrido de partículas.
OPO-23 CH2OH OPO-23 CH2OPO-2
FOSFOFRUCTOQUINASA
H OH OH OH + ATP H OH OH OH

H H H H

FRUCTUOSA 6 FOSFATO FRUCTUOSA 1, 6 DIFOSFATO + ADP + H

5
 Lo que sucede en esta reacción es que la enzima fosfofructoquinasa hace que
reaccione el ATP para que este sede un grupo fosfato a la posición 1 convirtiéndose el
ATP en ADP pero también en esta reacción se va un H para que la transferencia del
fosfato se ha exacta pasando de fructuosa 6 fosfato a fructuosa 1,6 difosfato.

CH 2OPO3 H H

C=O ALDOLASA H-C-OH C=O

O H- C-H C=O H- C-OH

H-C-OH CH2OPO3 CH2OPO3

H- C-OH

CH2OPO3
FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO DIHIDROXIACETONA GLICERALDEIDO 3 FOSFATO

La andolaza parte a la mitad a la fructuosa 1,6 difosfato formando 2 moléculas

que son la dihidroxiacetona fosfato y el gliceraldehido 3 fosfato y también existe un
reacomodo de moléculas o partículas.

H TRIOFOSFATO H

H-C-OH ISOMERAZA C

C=O H -C-OH

CH2OPO3 CH2OPO3

DIHIDROXIACETONA GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO

En este caso la dihidroxiacetona fosfato se sede de la ruta y la tenemos que volver

a reintegrar a la ruta convirtiéndola en gliceraldehido 3 fosfato con ayuda de la triofosfato
baja 2 H a la posición 2 quitando la doble ligadura que existe en el O pero como en la
posición uno quedan solamente 3 enlaces para que se estabilice se le agrega una doble
ligadura ya que el carbono soporta 4 enlaces.
H O NAD++PI + FOSFATO DESHIDROGENASA O OPO-23

2 C C

H C OH H C OH

CH2OPO3
CH2OPO3
GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO 1,3 DIFOSFATO

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 La isomerización de los azúcares fosforilados de 3 carbonos esta catalizada por la
triofosfato isomerasa.
Esta reacción es muy rápida y reversible. Así pues, se forma dos moléculas de
gliceraldehido 3 fosfato a partir de una molécula de fructosa 1, 6 difosfato por la acción
secuencial de la aldolasa y triofosfato isomerasa.
La reacción inicial de esta secuencia es la conversión de gliceraldehido 3 fosfato.
En 1,3 difosfato, reacción catalizada por el gliceraldehido 3 fosfato de deshidrogenasa.

O= C OPO-23
FOSFOGLICERATO
O =C O

H C OH + ATP QUINASA

C CH2OPO3

CH2OPO3

1, 3 DIFOSFOGLICERATO
3 FOSFOGLICERATO

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FORMACIÓN DEL PIRUVATO Y PRODUCCIÓN DE UN SEGUNDO ATP

La posición del grupo fosforilo se desplaza en la conversión de 3 difosfoglicerato

en 2 fosfoglicerato reacción canalizada por la fosfogliceromutasa.

2 C O FOSFOGLICERATO C - O
QUINASA
H C OH + ADP C - OPO-23

CH2OPO3 CH2OH

3 FOSFOGLICERATO 2 FOSFOGLICERATO

O H
O H PIRUVATO C
C QUINASA
C=O
C-OPO3
H C CH3
H

FOSFOENOL PIRUVICO PIRUVATO

H
O H PIRUVATO C
C CARBOXILASA
C=O
C=O
CH2 CH2

PIRUVATO ACETALDEHIDO

H
ALCOHOL H
C DESHIDROGENASA
H C OH
C=O
CH2 CH3

ACETALDEHIDO ETANOL +CO2

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PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA.

La fermentación alcohólica no sólo la sufren los azúcares fermentables (glucosa y

fructosa). La sacarosa o azúcar de caña se desdobla en glucosa y fructosa; por la acción
de la enzima inversaza producida por las levaduras, además de los productos principales
como alcohol y bióxido de carbono, se forma glicerina, ácido succínico, ácidos volátiles,
butilenglicol , alcoholes superiores(esencia fusen), acetaldehído, ácido láctico y esteres.

1.- ALCOHOL (ETANOL).

Es el producto más importante de la fermentación (etanol) espíritu de vino C2H5

(OH)3 cuya calidad (40-140g/l). Está sometido a grandes fluctuaciones según sea el
contenido de azúcar del jugo de frutas.
Es incoloro, muy fluido de agradable color que arde con llama azulada con
formación de agua y del anhídrido carbónico a 20°C tiene un peso especifico del 0.7894,
hierve a 78.37°C y se congela a –114°C. Se mezcla con el agua en todas las
proporciones desprendiendo calor y provocando una disminución de volumen próximo al
4%. Cuando se encuentra sin diluir el alcohol tiene un penetrante olor a ardiente.

2.- GLICERINA

Es un alcohol trivalente C3H5(OH)3 en estado puro tiene aspecto liquido espeso

incoloro, de sabor dulce y no venenoso. Se mezcla con el agua y el alcohol en todas las
proporciones, reduciendo considerablemente, el punto de congelación del agua. La
glicerina pura tiene a 20°C un peso especifico de 1.2613, la glicerina se diluye en los
productos de fermentación valiosos del vino, ya que este presta cuerpo y consistencia.

3.- ALCOHOLES SUPERIORES

En 1910 fue emitido por f ehrlich que los alcoholes superiores, (alcohol propílico,
isopropilico, amílico, isoamilico e isobutilico), se originan de los aminoácidos
correspondientes (ácido amino butírico, valina leucina, isoleucina) mediante capacitación
de agua y desprendiendo dióxido de carbono y amoniaco. Efectivamente en experiencias
modelo puede comprobarse que agregando aminoácidos al medio que vaya a fermentar
se estimula la formación de alcoholes superiores por levaduras.

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 Azúcar ácido pirúvico

valina productos productor intermedio alcohol

isobutilico
intermedios
cetoivaleriato

productos
intermedios

leucina celoisacaprato productos intermedios alcohol

isoamilico

Esquema simplificado de la formación de los alcoholes superiores (isobutil e

isoamilico) y de los aminoácidos valina y leucina por levaduras. Los alcoholes superiores
solo se encuentran en el vino en escasa cantidad ( 0.1 a 0.3 g/l ).
Ácido succínico ( COOH-CH2-CH2-COOH ) se origina también en la fermentación.
Ya Pasteur había determinado en el vino una cantidad de 0.6 gr. de sete producto para
cada 100gr de azúcar fermentado.
El ácido succínico cristaliza en placas o columnas monoclínicas, se disuelve en
agua y alcohol y tiene sabor limpiante ácido. La pequeña cantidad resulta de la
fermentación (0.6 a 2 gr./l) compensa en parte la disminución de acidez que supone la
merma de “Cartrato Potasio”.

4.- ÁCIDO ACÉTICO

Lo explicaremos con más detalle en la siguiente unidad temática.

5.- SUSTANCIAS AROMÁTICAS

El aroma de un vino obedece a varios cientos de componentes diferentes y está

formado por sustancias de distintas clases (aldehídos, cetonas, alcoholes, esteres, ácido
terpenos). Estas múltiples sustancias olorosas insípidas proporcionan en conjunto la
intención total de dar un vino.
En la constitución de los aromas y sabores peculiares de las uvas (bouquet)
parece participar un número relativamente pequeño de compuestos el bouquet del vino
depende fundamentalmente de números componentes generados en curso de la
fermentación, conocidos con el nombre de “esencia de fusel”.
Estos compuestos fundamentales del extracto de fusel no se originaron en la
fermentación en cantidades constantes. Diversas cepas de levaduras forman distintas
cantidades de estos compuestos.

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 Existen varios sabores: primarios, secundarios, tanto para olores como colores.
Sabores secundarios: son la mezcla de los sabores primarios (1, 2 o más).
Existen 4 sabores primarios: dulce, salado, agrio, amargo.
Sabor dulce: Los compuestos que lo presentan son: los azúcares que son los
carbohidratos: mono y disacárido. Los carbohidratos que son más complejos no presentan
sabor (almidón, celulosa, hemicelulosa).
Compuestos químicos que presentan sabor:

GLICOLIS, GLICEROL, SORVITOL LIGERAMENTE DULCE (SABOR)

CLOROFORMO SABOR DULCE

NITRATO DE ETILO SABOR DULCE

6.- ANHÍDRIDO CARBÓNICO.

Es el gas desprendido de la fermentación (gas carbónico ), es el bióxido de

carbono (cco2) a partir del cual se forma el ácido carbónico. Este último no se presenta
libre si no únicamente en sus sales (carbonatos ).
El anhídrido carbónico es un gas inodoro e incoloro que es 1.52 más pesado que
el aire y no hace combustión (no arde), el anhídrido carbónico no permite la respiración
por lo que ejerce acción asfixiante, de un 3 a 4 % del CO2 en el aire y no hace combustión
(no arde) . El anhídrido carbónico no permite la respiración por lo que ejerce acción
asfixiante. El CO2 en el aire dificulta ya la respiración y desarrolla acción sofocante por
liberarse el la fermentación de grandes cantidades de CO 2 deben instalarse dispositivos
de ventilación que aseguren su eliminación, de aquí que la entrada de las bodegas
durante la etapa de fermentación suponga un evidente peligro de muerte .
En los vinos para embotellar es muy conveniente que exista un cierto contenido
de CO2 , el cual, hace al vino más espumoso.

Clasificación de bebidas alcohólicas de acuerdo con el sustrato del que proceden.

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SUSTRATO NO DESTILADAS DESTILADAS FORTIFICADAS
Brandy, coñac,
Vino, chapage, vinos Jere, oporto, vermut,
Uva armañac, pisco y
espumosos madeira y moscatel
Groppa
Sidra y sidra
Manzana Calvados
espumosa
Pera Perry
Cereza Kirsch
Otros Vinos de frutas
Cereales, cebada cerveza Whisky
Burbon, whisky de
Maíz Tesguino maíz, whisky de
tennese
Varios (incluyendo Vodka, ginebra y
pan.) akvait
Arroz Sake
Sorgo Cerveza africana
Cachazo, pinga,
Caña, melazas o
charanda Ron,
jugos
aguardiente.
Agaves Pulque Tequila, Mezcal.

Fue en la edad media cuando se descubrieron los principios físicos de la

destilación, lo que permitió a los alquimistas la época de destilar por primera vez, es decir,
llevar acabo una separación de los componentes volátiles (alcohólicos) y las no volátiles
(stractiles del vino).
El proceso de destilación del vino lo descubrió un sabio de Salerno (una de las
más antiguas universidades del mundo occidental) llamado Magíster Salernos.
En 1867 algunos escritores deducen que la destilación se usaba para la obtención
de nuevos medicamentos. Siglos después de su descubrimiento el aguardiente constituía,
aún en la mayoría de las culturas, un medicamento.
En el año de 1530 la ciudad de Nüvemberg puso a punto los primeros carros
destinados al transporte de los borrachos. En esta época apareció el término alcohol para
denominar el espíritu que contenía el vino.
Theophrastus, Bombastus Von Hohemhein paracel y médico, obtuvo el término de
alcohol copiando del árabe en este idioma, la palabra alcohol “alko hul” designa algo
esencialmente delicado y puro, “ la más útil de cada cosa “. El nuevo término acabó
sustituyéndolo a todos los utilizados hasta entonces de origen latino como “ agua vitae”
que quiere decir agua de vida o “ agua ordens “ por citar sólo algunos.
Durante el siglo XVI el aguardiente pasó definitivamente de ser una medicina a
convertirse en una bebida habitual.
La producción de aguardiente constituye uno de los hallazgos que mayor
trascendencia ha tenido comparación a la invención de la estructura, el dinero, la pólvora,
la brújula, la imprenta, y ha dado lugar a medicinas y también a exquisitas bebidas bajo el
seductor nombre de agua de vida.

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FERMENTACION ALCOHOLICA
La fermentación es el proceso que convierte el azúcar en alcohol, concretamente en un
alcohol con dos átomos de carbono, el etanol, y dióxido de carbono. Este proceso se lleva a
cabo por los organismos vivos, pero en particular algunos tipos de hongos conocido como
levaduras. En nuestro caso, el componente principal es la Saccharomyces cerevisiae. Estas
levaduras se dedican a la producción de etanol, a cambio de azúcar. Es como si el hombre
desde hace miles de años hubiera “domesticado” a la Saccharomyces cerevisiae, para que
puedan trabajar en la producción de alcohol a cambio de alimentos (azúcar).

El proceso se puede dividir en dos partes. La primera parte, conocida como glucólisis o
glicólisis (del grigego glycos, azucar, y lysis, romper) es común a otras vías metabólicas y
el producto de la cual es el anión piruvato. La segunda parte es la propia fermentación,
donde el piruvato se transforma en alcohol.

Fermentación alcohólica
Una vez formado el piruvato (y con él el final de la glucólisis), puede tomar tres caminos.

Si tenemos suficiente oxígeno, se puede entrar en el metabolismo aeróbico, donde se

convierte en dióxido de carbono y agua. Esto se conoce como respiración celular, y es el
proceso complejo que nuestras células utilizan para proporcionar energía. Se produce en la
matriz de la mitocondria y es conocido como ciclo de Krebs.
Si no tenemos suficiente oxígeno, el ácido pirúvico entra en una vía anaeróbica o vía de
fermentación. En este caso, puede tomar dos caminos:
Fermentación láctica, cuyo producto es ácido láctico. Nuestras células musculares hacen
esta fermentación cuando hacemos un esfuerzo muy intenso, y el resultado son las agujetas
por acumulación de ácido láctico en el músculo
Fermentación alcohólica, donde el piruvato se convierte primero en acetaldehído, para
después degradarse en etanol y dióxido de carbono.
En la fermentación alcohólica, la primera reacción es una descarboxilación del piruvato.
Esto significa que la molécula de piruvato pierde una molecula de dióxido de carbono,
concretamente del carbono del grupo carboxílico, y se convierten en una molécula más
sencilla, el acetaldehído (o etanal). Es una reacción compleja, catalizada por una enzima
llamada piruvato descarboxilasa y necesita de magnesio y de un grupo prostético llamado
tiamina pirofosfato (TPP) como cofactores.

glucólisis 5

Una vez producido el acetaldehído, este se somete a otra reacción, catalizada por una
enzima llamada alcohol deshidrogenasa y utiliza como coenzima el NADH (nicotinamida
adenina dinucleótido) en medio ligeramente ácido. Este es un proceso redox, donde el
NADH se oxida a NAD+ y el acetaldehído se reduce etanol.
El proceso global de la glucólisis más la fermentación alcohólica es el siguiente:
Glucólisis global
Nótese que se producen dos moléculas de ATP por cada glucosa consumida, dos moléculas
de etanol, dos de agua y dos de dióxido de carbono.

13
CARACTERÍSTICAS IDONEAS QUE NECESITAN LOS MICROORGANISMOS
PARA LLEVAR A CABO UNA FERMENTACIÓN.

Ser genéticamente estable en el medio de cultivo.

Poseer células vegetativas, esporas algunas u otras unidades de reproducción.
Tener un crecimiento rápido y vigoroso después de la inoculación (sembrar
microorganismos en el sustrato).
Ser un cultivo puro.
Reproducirse en un tiempo respectivamente corto.
Que no produzcan sustancias tóxicas .
Tiempo de conservación debe de ser considerado (que el microorganismo no se
muera rápido).
El microorganismo debe ser industrialmente rentable .
Que crezca o se desarrolle en condiciones relativamente sencilla.

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

Alicia Gonzalez y Lourdes Valenzuela

Departamento De Genetica Molecular, Instituto De Fisiologia Celular. Universidad

Nacional Autonoma De Mexico. Apartado Postal 70-242. Mexico D.F. C.P. 04510

14
La levadura Saccharomyces cerevisiae: un modelo de estudio desde hace más de cien años

(http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios)

Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de hongos, incluyendo tanto
especies patógenas para plantas y animales, como especies no solamente inocuas sino de
gran utilidad. De hecho, las levaduras constituyen el grupo de microorganismos mas
íntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad. Algunas especies de
levaduras del género Saccharomyces son capaces de llevar a cabo el proceso de
fermentación, propiedad que se ha explotado desde hace muchos años en la producción de
pan y de bebidas alcohólicas, y que a su vez ha inspirado un sinnúmero de obras de arte que
ensalzan al Dios del vino y a aquellos que disfrutan su consumo (Fig. 1). Desde el punto de
vista científico, el estudio de las levaduras como modelo biológico ha contribuido de
manera muy importante a elucidar los procesos básicos de la fisiología celular.

Dentro del género Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura y el

microorganismo eucariote más estudiado (Fig. 2). Este organismo se conoce también como
la levadura de panadería, ya que es necesario agregarla a la masa que se utiliza para
preparar el pan para que este esponje o levante; de hecho el término levadura proviene del
latín levare, que significa levantar.

En 1897, los hermanos Hans y Edward Buchner obtuvieron extractos libres de células
moliendo levadura para pan con granos de arena, a los cuales adicionaron grandes
cantidades de azúcar de caña para evitar su posible contaminación. Para su sorpresa,
encontraron que el azúcar se fermentaba rápidamente: por primera vez se había descubierto
un modelo para el estudio de la fermentación alcohólica en un sistema carente de células.
Este descubrimiento atrajo la atención de los bioquímicos, que decidieron analizar cada uno
de los pasos que conducían a la producción de etanol y bióxido de carbono a partir de la
glucosa. Este trabajo implicó el esfuerzo de muchos científicos y dió como resultado el
descubrimiento y descripción del metabolismo del carbono; algunas de las vías metabólicas
que conocemos actualmente, llevan los nombres de los científicos que participaron en este
trabajo, como Embden y Meyerhof. La vía metabólica que permite la utilización de glucosa
fue la primera ruta metabólica descrita, y la metodología empleada para lograrlo se utilizó
para el estudio posterior de otras vías que constituyen el metabolismo celular.

Así, desde fines del siglo XIX se reconocieron algunas de las ventajas que ofrece el uso de
la levadura de pan, Saccharomyces cerevisiae, como modelo biológico en la investigación:
por un lado, la facilidad con la que se obtienen grandes cantidades de este microorganismo;
y por otro, el hecho de que S. cerevisiae posee un ciclo de vida que al incluir una fase
sexual (Fig. 3), permite abordar estudios con las herramientas que provee la genética
formal.

Otra característica de esta levadura es el tamaño de su genoma, que por ser pequeño facilitó
su secuenciación; y muchas otras virtudes que se han ido haciendo evidentes conforme se
han desarrollado nuevos enfoques y métodos de estudio.

15
El genoma de S. cerevisiae: una aventura fascinante

El genoma nuclear

La levadura S. cerevisiae posee un genoma pequeño, solamente una cuantas veces mayor
que el de Escherichia. coli y 200 veces menor que el de células de mamífero (Fig. 4), esto
simplifica de manera importante el análisis genético y molecular del mismo. Por ejemplo,
una biblioteca genómica de levadura completa puede quedar contenida en unos cuantos
miles de plásmidos o fagos, en tanto que para contener una biblioteca completa de células
de mamífero se requerirían cerca de un millón de partículas. Este hecho propició que se
llevara a cabo una de las aventuras más emocionantes de nuestro tiempo, y el proyecto de
mayor magnitud de la biología molecular moderna: la secuenciación completa de un
genoma eucariote. La secuencia completa de este genoma se dio a conocer el 24 de abril de
1996 y constituyó el resultado de un enorme esfuerzo en el que participaron más de 600
científicos de 96 laboratorios, en un programa mundial encabezado por André Goffeau.
Doce millones de bases fueron secuenciadas en un verdadero esfuerzo internacional, que
involucró laboratorios europeos, americanos, canadienses y japoneses. Aún cuando la
secuencia completa del genoma de la levadura representa solamente una fracción pequeña
de la información que se encuentra actualmente en las bases de datos, ha constituido un
recurso de gran valor para el análisis de la función y arquitectura genómica. Así mismo,
esta experiencia facilitó y propició el desarrollo de proyectos involucrados en la
secuenciación de genomas de una variedad de organismos eucariotes, incluyendo el
proyecto del genoma humano (6).

Una levadura haploide contiene 16 cromosomas variando en tamaño de 200 a 2200 Kb, en
los cuales como resultado del análisis de la secuencia del genoma, se localizaron un total de
6183 marcos de lectura abiertos (ORF, open reading frame) y se predijo que de éstos, 5800
correspondían a genes que codificaban para proteínas (Fig. 5) (6). A diferencia de los
genomas de organismos multicelulares, el genoma de la levadura es muy compacto, dado
que el 72% de la secuencia corresponde a secuencias codificantes. El tamaño promedio de
los genes de levadura es de 1.45 kb, o 483 codones, y solamente el 3.8% de los ORFs
contienen intrones. Aproximadamente el 30% de los genes se han caracterizado
experimentalmente; y del 70% restante, cuya función no se conoce, aproximadamente la
mitad contiene al menos un motivo de algún tipo de proteínas ya caracterizadas, o
corresponden a genes que codifican para proteínas estructuralmente relacionadas con
productos génicos ya caracterizados en levadura o en otros organismos (Fig. 6) (20). El
ARN ribosomal se encuentra codificado por 120 copias repetidas y arregladas en tandem en
el cromosoma, en tanto que existen 262 genes que codifican para ARNs de transferencia,
80 de los cuales poseen intrones. Los cromosomas contienen elementos movibles,
retrotransposones, que varían en número y posición en las diferentes cepas de S. cerevisiae,
aún cuando la mayoría de las cepas de laboratorio poseen aproximadamente 30 elementos
(6).

El genoma no-nuclear

El ADN mitocondrial también puede considerarse parte del genoma de la levadura. Este
ADN codifica para los componentes de la maquinaria traduccional de la mitocondria y

16
aproximadamente el 15 % de las proteínas mitocondriales. Existen mutantes que carecen de
ADN mitocondrial, estas se denominan ro y carecen de los polipéptidos que se sintetizan en
los ribosomas mitocondriales. Estas mutantes son incapaces de llevar a cabo el
metabolismo respiratorio, pero son viables y capaces de fermentar sustratos como la
glucosa (2).

El plásmido circular 2μ, se encuentra presente en la mayoría de las cepas de S. cerevisiae,

hasta la fecha no se ha encontrado una función para este plásmido salvo su propia
replicación, y cepas carentes del mismo no presentan ningún fenotipo (22).

Prácticamente todas las cepas de S. cerevisiae contienen virus de ARN de doble cadena,
que constituyen el 0.1% del total de ácidos nucleicos; de éstos el más estudiado es el M,
que codifica para una toxina.

Los caracteres presentes en el genoma nuclear, segregan de manera Mendeliana, en tanto

que la segregación de los caracteres presentes en el ADN mitocondrial o en algún otro
elemento no-nuclear presentan un patrón de segregación no Mendeliano.

Ciclo de vida: una herramienta excepcional

Uno de los aspectos más relevantes de la biología de S. cerevisiae, es su ciclo de vida.

Ciclo de vida vegetativo

Durante la fase vegetativa, la levadura se divide por gemación. La célula hija inicia su
crecimiento formando una yema en la célula madre, posteriormente ocurre la división
nuclear, la síntesis de la pared y finalmente la separación de las dos células. Este ciclo
puede ocurrir en cultivos de células diploides o haploides, y por tanto se puede
experimentar con cultivos estables haploides o diploides (Fig. 3) (22). Desde el punto de
vista genético, el ciclo de vida vegetativo permite el aislamiento de mutantes recesivas en
un fondo haploide, y el estudio de complementación de fenotipos en cepas diploides. Es
decir, debido a que un organismo haploide solamente posee una dosis de cromosomas, los
efectos de dominancia-recesividad generalmente no obscurecen la expresión genética, y por
tanto el fenotipo es un reflejo directo del genotipo. Por otro lado, si nos interesa estudiar las
relaciones de dominancia y recesividad entre dos alelos, mediante pruebas de
complementación, fácilmente se puede construir la cepa diploide apropiada.

Durante muchos años se consideró que a diferencia de los hongos denominados

filamentosos, S. cerevisiae era incapaz de formar hifas o filamentos y que su crecimiento
vegetativo, a través de la gemación, únicamente resultaba en la formación de células
esféricas denominadas levaduras. Recientemente se encontró un fenómeno que sorprendió a
la comunidad científica dedicada al estudio de esta levadura: Saccharomyces, el organismo
levaduriforme por antonomasia, era capaz de formar hifas! (pseudohifas) (Fig. 7) (9).
Existen hongos como Mucor rouxii, capaces de crecer formando filamentos o formando
células levaduriformes, la posibilidad de cambiar de fase se conoce como dimorfismo y
existen cascadas de señales responsables de cambiar y mantener cada uno de los dos tipos
de crecimiento.

17
Por medio de receptores anclados a la membrana celular, las levaduras pueden responder a
la presencia de moléculas que actúan como señales en una condición fisiológica
determinada, estas señales se transducen por un sistema de señalización en el que participan
cinasas denominadas "proteín-cinasas mitogénicamente activadas" (MAPK) (17). Por
ejemplo, si un cultivo de levaduras se expone a alta o baja osmolaridad, la presencia de una
alta o baja concentración sal en el medio de cultivo constituye una señal, que al
interaccionar con un receptor específico, pasa a través de una serie de moléculas
intermediarias hasta modificar un determinado regulador transcripcional, que ahora es
capaz de activar o reprimir la expresión de un gen o grupos de genes (17). Esto le permite a
la célula transcribir de manera selectiva un grupo de genes específicos, cuya traducción
resultará en la síntesis de los productos que le permitan contender de manera eficiente con
la condición fisiológica en la que se encuentra, y por tanto mantener la viabilidad,
esporular, crecer en forma de filamentos, etc. Así se han descrito en S. cerevisiae distintas
cascadas que responden a estímulos ambientales diferentes y específicos (Fig. 8). Como se
observa en la Fig. 8, la señal específica que desata el funcionamiento de una cascada en
particular no se conoce en todos los casos. El hallazgo del crecimiento pseudohifal de S.
cerevisiae resultó en el estudio de una cascada de señalización cuyo funcionamiento
determina el crecimiento levaduriforme o pseudohifal, y los resultados obtenidos al estudiar
la cascada de S. cerevisiae permitieron una mejor comprensión de los sistemas que operan
en hongos dimórficos.

Ciclo de vida sexual

S. cerevisiae posee dos tipo sexuales: a y α, determinados por un par de alelos heterocigos:
MATa y MATα. Si se cultiva una mezcla de dos cepas haploides en las que una de las dos
cepas sea MATa y la otra MATα, se formarán células diploides MATa/MATα. Esto no
ocurre si las dos cepas cultivadas poseen el mismo tipo sexual; los diploides pueden
mantenerse como tales o pueden esporular si se cultivan en condiciones de limitación de
nutrientes. Durante la esporulación, (Fig. 9) la célula diploide se divide por meiosis (Fig. 9
y 10) dando lugar a cuatro celulas haploides, las cuales quedan contenidas dentro de un
saco denominado asca. Las ascas poseen una pared gruesa que debe ser abierta para que se
liberen los productos haploides, esto puede lograrse utilizando un microscopio y un
micromanipulador (Fig. 11 y 12), que permiten al experimentador recuperar de manera
independiente cada uno de los cuatro productos haploides contenidos en cada una de las
ascas (Fig. 11 y 12). Cada una de las cuatro esporas se coloca sobre una caja de Petri con
medio de cultivo, una vez que que estas crecen y forman una colonia, se pueden transferir a
cajas conteniendo los medios de cultivo pertinenentes que permitan determinar el fenotipo
de cada una de las cuatro esporas (Fig. 11 y 12). Si cruzamos un padre MATa, portador de
todos los genes silvestres necesarios para sintetizar uracilo y que por lo tanto sera URA+, y
un padre MATa portador de una mutación que altere a uno de los genes implicados en la
síntesis de uracilo y que por tanto posea un fenotipo ura-, al analizar el fenotipo de cada una
de las esporas haploides que se encuentran dentro de una asca, necesariamente
recuperaremos dos clonas protótrofas, capaces de sintetizar uracilo y que por lo tanto son
URA+ y dos células auxótrofas, incapaces de sintetizar este compuesto y que por lo tanto
son ura- (Fig. 11). De esta forma se estudia la segregación de los caracteres genéticos de las
cepas padres utilizadas para producir los diploides.

18
Como se muestra en laFigura 10, durante la profase de la meiosis, los cromosómas
homólogos se aparean y es en esta fase que puede ocurrir la recombinación. En el ejemplo
que se muestra en la Figura 10, uno de los padres (P1) es portador de los genes silvestres
CAIE, en tanto que el otro (P2), es portador de los genes mutados caie, el diploide formado
será portador de una dósis de genes silvestres y una dósis de genes mutados CAIE/caie. Si
durante la meiosis no ocurre recombinación, dos de los cuatro productos haploides serán
portadores de la combinación CAIE aportada por el padre P1, en tanto que los otros dos
productos serán portadores de la combinación caie aportada por el padre P2. Si ocurre
recombinación, se generarán dos productos haploides recombinantes; es decir esporas
haploides portadoras de combinaciones nuevas no presentes en los padres: CaIe y cAiE, en
tanto que cada uno de los otros dos productos llevarán en cada caso la combinación CAIE
del padre P1 o la combinación caie del padre P2.

Solamente los hongos Ascomycetos y algunas algas poseen la capacidad de formar ascas, y
por tanto son los únicos organismos en los que se pueden analizar de manera independiente
los productos de una sola meiosis.

Consideremos lo siguiente: cuando se estudia la segregación de dos caracteres en un

diploide, por ejemplo MATa y MATα al encontrar en una muestra al azar el mismo número
de clonas haploides a y α atribuimos este hecho a la segregación de los cromosomas
homologos portadores de a y α, en meiosis individuales; ésta es una inferencia que es difícil
demostrar de manera directa en la mayoría de los organismos eucariotes. Sin embargo,
gracias al análisis de tétradas se demostró de manera directa e inequívoca que la
segregación ocurre. Así mismo, el análisis de tétradas permitió proponer el modelo
heteroduplex del ADN, que explica cómo ocurre el proceso de entrecruzamiento que da
lugar a la obtención de recombinantes durante la meiosis.

En resumen, la disección de tétradas (Fig. 11) provee un método directo de análisis

genético de meiosis individuales, lo que permite estudiar procesos que no son asequibles
utilizando productos meióticos al azar, como la recombinación y la segregación genética
(11).

Aunado al hecho de que S. cerevisiae es un organismo no patógeno, las características

arriba descritas hicieron de esta levadura el modelo biológico favorito de una buena parte
de la comunidad científica del área. Así durante años se obtuvieron mutantes, se
describieron vías metabólicas, se mapearon genes, y se hicieron estudios de microscopía
antes que en ningún otro microorganismo. Sin embargo, con la llegada de la ingeniería
genética y las nuevas técnicas de biología molecular, por un momento pareció que S.
cerevisiae se quedaba atrás, ya que no existía un protocolo que permitiera introducir ADN
exógeno a esta levadura. Sin embargo en 1978 un grupo dirigido por Gerald Fink (12)
publicó en 1980 el primer reporte de un protocolo que permitió introducir ADN en este
organismo y S. cerevisiae entró con paso firme al concierto de la biología molecular.

¡La levadura se transforma!: manipulación del genoma "in vitro".

19
La transformación es un proceso por medio del cual moléculas del ADN desnudo pueden
ser introducidas a una célula. La adquisición de este ADN resulta en un cambio heredable.
Por ejemplo, si nosotros tenemos una célula alterada en un gen que codifica para una de las
enzimas implicadas en la biosíntesis de uracilo, y por tanto es una mutante ura- auxotrofa
para uracilo, si logramos introducir dentro de esta mutante la secuencia silvestre del gen
mutado de manera permanente, la cepa se transformará en URA+ y por tanto será
protótrofa para uracilo.

Para poder transformar a un organismo se requieren protocolos que destruyan la pared

celular y permeabilicen la membrana de tal forma que se puedan introducir fragmentos del
ADN. Así mismo se necesitan vehículos o vectores que se puedan replicar establemente o
recombinarse con el ADN cromosomal dentro del organismo. Finalmente se requieren
marcadores genéticos, es decir, genes que confieran resistencia a antibióticos o que
determinen la síntesis de un aminoácido o nucleótido. Estos marcadores se utilizan para
identificar aquellas células que recibieron ADN exógeno. Por ejemplo, si usamos como
marcador la resistencia a geneticina, en una caja de medio de cultivo conteniendo este
antibiótico solo crecerán aquellas colonias originadas por células que recibieron el gen que
confiere resistencia a geneticina. Así mismo, si nuestro marcador es el gen URA3 que
codifica para una enzima de la biosíntesis de uracilo, y transformamos una mutante ura3-
auxótrofa de uracilo, aquellas células que reciban el gen URA3 generarán colonias capaces
de crecer aún en ausencia de uracilo (Fig. 13). Los genes que se utilizan como marcadores
genéticos deben quedar incluidos dentro de los plásmidos que se utilizarán para transformar
a la levadura. El primer plásmido que se construyó para transformar levadura, se denominó
pYeleu10 y era portador del gen LEU2 de levadura y se utilizo para transformar una
mutante incapaz de sintetizar leucina, leu2- (12). Los primeros marcadores que se utilizaron
para transformar a la levadura fueron LEU2, URA3 e (histidina) HIS3, y se obtuvieron
preparando bibliotecas de S. cerevisiae en vectores propios para E. coli. Estas bibliotecas se
utilizaron para complementar funcionalmente mutantes de E. coli en las diferentes vías
biosintéticas. Por ejemplo, el gen LEU2 de levadura que codifica para la enzima b-
isopropilmalato deshidrogenasa de la biosíntesis de leucina, puede complementar mutantes
leuB de E. coli, deficientes en la misma enzima (Fig. 14). Una vez clonado el gen LEU2 de
levadura, éste pudo ser utilizado para complementar levaduras leu2- que son incapaces de
crecer en medios carentes del aminoácido leucina. Plásmidos portadores del gen LEU2
pudieron ser introducidos en la levadura utilizando protocolos de transformación; así,
cuando las células de levadura leu2- se ponían en contacto con una preparación de ADN de
plásmidos portadores del gen LEU2, solamente aquellas células que adquirían este gen eran
capaces de crecer en ausencia de leucina. Evidentemente, cualquier otro gen o genes
presentes en el plásmido portador de LEU2 eran adquiridos simultáneamente (11).

La construcción de plásmidos apropiados para transformar a S. cerevisiae ha jugado un

papel crucial en el desarrollo de las técnicas de ADN recombinante aplicables a este
organismo. Una de las características más importantes de estos vectores es la capacidad de
replicarse tanto en la levadura como en E. coli, de manera que se puedean propagar en ésta
bacteria y posteriormente puedan ser reintroducidos en la levadura para ser analizados. Por
tanto, estos vectores deben contener orígenes de replicación tanto de E. coli como de
levadura, además de marcadores genéticos que se puedan utilizar para seleccionar las
poblaciones pertinentes, tanto de bacterias como de levaduras. El marcador bacteriano más

20
frecuentemente utilizado para preparar estos vectores es el gen que confiere resistencia a
ampicilina y el origen de replicación es el que se encuentra en los vectores bacterianos
utilizados en la mayoría de los laboratorios que se dedican al estudio de organismos
procariotes. Por lo que respecta a los orígenes de replicación que permiten mantener los
vectores en levadura, se han construido plásmidos portadores de dos diferentes tipos de
orígenes de replicación dependiendo del número de copias del plásmido que se desee
mantener (Fig. 15). Los vectores que carecen de origen de replicación se denominan
integrativos, ya que éstos sólo podrán permanecer en la levadura cuando recombinen, y por
tanto queden permanentemente integrados en algún cromosoma. Aquellos plásmidos
portadores del origen de replicación presente en el plásmido 2μ de levadura mantienen
alrededor de 12 copias, y aquellos portadores de una región de replicación autónoma (ARS)
y de una región centromérica (CEN) se mantendrán sin integrarse y en una sola copia (11).

La construcción de vectores o vehículos apropiados para clonación, aunado al hecho de que

la levadura posee un genoma pequeño, permitió la clonación de genes de levadura por
complementación. Se construyeron bibliotecas genómicas portadoras de fragmentos de
ADN de tamaños que permitían suponer que en la colección de fragmentos estaría
representado el genoma completo de este organismo. Una mutante que tenga un fenotipo
claro, por ejemplo auxotrofía por algún aminoácido y por tanto sea incapaz de crecer en
ausencia del mismo, al transformarse con la biblioteca y sembrarse sobre cajas de agar en
ausencia del amino ácido requerido, resultará en el crecimiento de colonias de aquellas
células que han adquirido una copia silvestre del gen en cuestión. A partir de esta colonia se
puede preparar un cultivo y extraer el ADN plasmídico para realizar la caracterización del
gen clonado. Así se han clonado y estudiado un buen número de genes.

Uno de los métodos más utilizados para caracterizar la función de un gen es la obtención de
mutantes; y en levadura, la obtención de mutantes en las que el gen de nuestro interés ha
sido interrrumpido con una secuencia foránea ha sido de gran utilidad. La interrupción
completa de un gen, permite determinar la función del mismo (11). El procedimiento más
utilizado se basa en el uso de un fragmento lineal de ADN que contiene un marcador
genético, por ejemplo URA3, flanqueado a ambos lados por secuencias del gen que
deseamos interrumpir; estos extremos son altamente recombinogénicos y debido a que en
S. cerevisiae la frecuencia de recombinación homóloga es muy alta, el fragmento lineal de
ADN se inserta en medio de nuestro gen resultando en la interrupción y, por lo tanto, en la
inactivación del mismo (Fig. 16). Este procedimiento se ha utilizado exitósamente para
generar todo tipo de mutantes, con la ventaja de que las mismas tienen exáctamente el
mismo fondo genético que la cepa padre. Cuando se trate de obtener mutantes
interrumpidas en genes cuya anulación pudiera resultar letal, la interrupción génica debe
hacerse en un diploide y por disección de tétradas recuperar las cuatro esporas. Si
efectivamente la interrupción del gen en cuestión resulta letal, dos de las cuatro esporas del
asca no serán viables. Esta constituye una prueba definitiva que demuestra que el gen que
se está estudiando es indispensable.

La primer acetilasa de histonas: nuevas herramientas para el estudio de la expresion

genética

21
Los cromosomas eucariotes están constituidos por fibras de ADN y una variedad de
estudios han demostrado que cada cromosoma está constituido por una sola doble cadena
de ADN (7). Debido a la longitud de los cromosomas, desde hace mucho tiempo se postuló
que debería existir un sistema de empaquetamiento muy eficiente. La mezcla de materiales
de los que se componen los cromosomas se denomina cromatina y está constituida por
ADN y proteínas. Cuando la cromatina se extrae y se trata con concentraciones crecientes
de sal se pueden observar, bajo el microscopio electrónico, diferentes grados de
compactación. A concentraciones bajas de sal se observa una estructura de 10nm de
diámetro que semeja un collar de perlas; dado que el hilo presente entre perla y perla puede
ser digerido con ADNsa, se puede concluir que se trata de ADN. Las perlas del collar se
denominan nucleosomas (Fig. 17), y se ha demostrado que consisten de proteínas llamadas
histonas y de ADN. Las histonas se encuentran constituidas por octámeros conteniendo dos
moléculas de cada una de las siguientes histonas: H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN se
encuentra enrollado alrededor del octámero (Fig. 17). Cuando se utiliza una mayor
concentración de sal para extraer la cromatina, se identifica una estructura llamada
solenoide, que tiene 30 nm de diámetro y cuya conformación se mantiene por medio de la
histona H1 (Fig. 18). A su vez, los solenoides se organizan en asas que se encuentran
ancladas a un andamiaje, por medio de secuencias de ADN denominadas regiones de unión
al andamiaje (Fig. 19) (7). Es evidente, que la organización nucleosomal del ADN
constituye una barrera física que debe ser vulnerada para que el aparato transcripcional
pueda interaccionar con el ADN.

En organismos eucariotes, el proceso de transcripción y su regulación implica la

participación de un gran número de moléculas, que incluyen nucleosomas, polimerasas,
factores generales de transcripción y el aparato regulatorio. Recientemente, se ha
encontrado que los coactivadores y correpresores transcripcionales funcionan modificando
enzimáticamente a las histonas, lo que resulta en un reposicionamiento de los nucleosomas
que determina el acceso de los factores transcripcionales a los promotores. Es decir, el
enrollamiento del ADN alrededor del octámero de histonas es actualmente considerado
como el punto más importante de la regulación transcripcional. Los nucleosomas son
capaces de reprimir la transcripción a través de tres mecanismos específicos: a) bloqueando
los sitios de unión al ADN de los activadores, represores, ARN polimerasa, etc, b) las
cadenas de nucleosomas pueden formar estructuras muy compactas (superestructura),
reprimiendo la transcripción de dominios cromosomales completos, y c) en la
heterocromatina, la interacción de los nucleosomas con otras proteinas cromosomales
puede reprimir la transcripción de manera hereditaria (15).

Al examinar los elementos que constituyen el complejo transcripcional, se hace evidente el

hecho de que la estructura nucleosomal constituye una verdadera barrera que
necesariamente dificulta la interacción con el aparato transcripcional. El complejo de inicio
de la síntesis de ARN en levadura está constituido por la holoenzima (formada por la
enzima ARN polimerasa II asociada al mediador) y por los factores generales TFIIs (TFII-
A, TFII-B, TFII-D, TFII-F, TFII-E y TFII-H). El factor general TFII-D está formado por
las proteínas TAFs y la proteína TBP, siendo ésta última la que reconoce una secuencia
específica denominada caja TATA. El ensamble del complejo de inicio de la transcripción
comienza al unirse TBP a la caja TATA, seguido de los TFIIs y de la holoenzima (13, 18).
La afinidad del complejo arriba descrito por las secuencias promotoras generalmente es

22
pobre, y se requiere de la acción de los activadores transcripcionales para aumentar la
afinidad del complejo por una secuencia específica y por tanto aumentar la transcripción de
un gen o grupo de genes. La existencia de diferentes tipos de activadores se demostró por
medio de la obtención de mutantes y por ensayos de unión a ADN. Así se encontró que hay
activadores específicos para grupos de genes y que éstos solamente son capaces de ejercer
su efecto activador en determinadas condiciones fisiológicas. Por ejemplo, el activador
transcripcional codificado por el gen GLN3, que activa la transcripción de los genes cuyos
productos se encargan del catabolismo de fuentes pobres de nitrógeno, únicamente es
translocado al núcleo en éstas condiciones (1); de tal manera que cuando la levadura se
cultiva en fuentes ricas de nitrógeno, GLN3 no participa en la transcripción ya que no se
encuentra en el núcleo. Las proteínas activadoras son modulares y poseen dos regiones
indispensables para su función: la zona de unión al ADN y la de activación de la
transcripción. En 1992 (8) se reportó por primera vez la existencia de moléculas que se
denominaron coactivadores, que estimulaban la transcripción pero no a través de unirse al
ADN A sino estimulando la acción positiva de los activadores. El primer coactivador que
se describió fue el codificado por el gen GCN5 de S. cerevisiae (8). Poco tiempo después se
encontraron los genes homólogos a GCN5 de una variedad de organismos eucariotes
incluyendo el humano, y se encontró que el producto de este gen se encuentra formando
parte de dos complejos multiproteicos denominados ADA y SAGA (10). ¿De qué manera
estimulan la transcripción estos complejos? Uno de los hallazgos más interesantes en este
campo fue el descubrimiento de que el producto de GCN5 era una acetilasa de histonas,
este hecho confirmó lo que siempre se había supuesto: la estructura de la cromatina tenía un
papel fundamental en la activación transcripcional (23). La acetilación de las histonas
ocurre en las secuencias laterales o colas, que no forman parte del centro del nucleosoma, y
por tanto, la acetilación de éstas contribuye a desestabilizar la interacción entre el ADN y
las histonas, es decir, la superestructura de la cromatina. De manera casi simultánea se
encontraron y describieron genes que codificaban para desacetilasas de histonas y se
propuso que la acetilación de las histonas aliviaba la represión, en tanto que la
desacetilación la restablecía (23). Aún cuando la importancia de la acetilación-
desacetilación es evidente, ésta no es suficiente para activar la transcripción ya que no
compromete la estructura central de los nucleosomas; es decir, la dificultad para que la
polimerasa y los factores transcripcionales se unan a un ADN repleto de nucleosomas debe
aliviarse por mecanismos alternativos. Así se han encontrado complejos multiproteicos
ATP-dependientes que remodelan la estructura de la cromatina, por ejemplo, los miembros
del complejo SWI/SNF modifican la estructura de la parte central de los nucleosomas, en
tanto que los complejos ISWI modifican la localización de los nucleosomas (25) (Fig. 20).
De esta manera, la acetilación y el remodelamiento de la cromatina juegan papeles
diferentes, pero entre ambos determinan cambios de la estructura nucleosomal que son
indispensables para que ocurra la activación transcripcional. Uno de los campos más
apasionantes que se está abordando actualmente en el estudio de la regulación
transcripcional consiste en determinar de qué manera y quién recluta a todos los complejos
que deben llegar al promotor para activar la transcripción (4) (Fig. 21).

La levadura al servicio de la comunidad: sistema de doble híbrido, cromosomas artificiales,

expresión de proteínas heterólogas.

Sistema del doble híbrido.

23
La facilidad con la que se puede estudiar el genoma de la levadura y la cantidad de
manipulaciones genéticas y metodología disponible en este sistema han llevado al
desarrollo de métodos para analizar ADN y proteínas no sólo de la levadura sino de otros
organismos. Un ejemplo de lo antes dicho es el desarrollo del sistema del doble híbrido
(24). El producto codificado por el gen GLN3 es un activador transcripcional que posee dos
dominios funcionales independientes: el domino de unión a ADN y el dominio de
activación. Por lo tanto, si fusionamos una proteina (Gen1p) al dominio de activación y otra
(Gen2p) al dominio de unión a ADN es posible probar si éstas dos proteínas interaccionan
dentro de la célula (Fig. 22). Es decir, si las proteínas Gen1p y Gen2p se asocian dentro de
la levadura, necesariamente se ensamblará el activador GLN3, y por tanto será capaz de
activar la transcripción de los genes cuya expresión dependa del mismo, por ejemplo
GAP1. Esto se facilita aún más ya que es posible utilizar el promotor de GAP1 para
preparar un gen artificial que lleva el promotor de GAP1 y la secuencia codificante del gen
de la b-galactosidasa; así al activarse la transcripción de GAP1, por acción de GLN3 o del
híbrido Gen1p-Gen2p, se producirá la enzima β-galactosidasa cuya actividad puede
determinarse usando un ensayo que resulta en la tinción azul de las células que están
produciendo b-galactosidasa (Fig. 23).

El sistema de dos híbridos ha tenido tres aplicaciones fundamentales: a) probar la

interacción de un par de proteinas, que utilizando otros criterios, se sospecha que
interaccionan, b) definir el dominio o los aminoácidos que juegan un papel importante en la
interacción de dos proteínas, que se sabe que interactúan, y c) tamizar bibliotecas para
detectar proteínas que interaccionen con una proteina dada. El sistema de dos híbridos se ha
utilizado exitosamente para identificar grupos de proteínas que interaccionan en levadura y
en células de mamífero. Algunos ejemplos de proteínas que interaccionan con otras, que se
han descubierto con el sistema de dos híbridos, en células de mamíferos incluyen a Jun y
Fos, la proteín-cinasa Raf, y otras oncoproteínas (24).

Cromosomas artificiales

La caracterización molecular de genomas eucariotes requiere de la posibilidad de clonar

fragmentos muy grandes de ADN, esto no puede llevarse a cabo en los vectores
convencionales porque éstos sólamente admiten fragmentos pequeños de ADN. Por este
motivo, los fragmentos de 200 a 800 Kb, se deben clonar en vectores especiales llamados
Cromosomas Artificiales de Levadura (YACs) (Fig. 15) y fragmentos menores de 100 a
200 Kb se clonan en Cromosomas Bacterianos Artificiales (BACs).

Los YACs se desarrollaron a partir de plásmidos lineares denominados YLp, y contienen:

a) secuencias de ADN que funcionan como telómeros (TEL) "in vivo", orígenes de
replicación (ARSs) y segmentos centroméricos (CEN). Ahora bien, la manipulación de los
YLp se dificulta ya que no poseen orígenes de replicación para E. coli, y por tanto se
desarrollaron los YACs que contienen orígenes de replicación que permiten que éstos de
repliquen en E. coli. El tipo más común de vectores YAC que se pueden propagar en esta
bacteria contienen secuencias teloméricas en orientación invertida, que flanquean un
fragmento de ADN de levadura portador del gen HIS3. Después de su amplificación en E.
coli, y antes de transformar a la levadura, el plásmido se digiere con la enzima de

24
restricción que permite la escisión de HIS3 y genera una forma lineal "in vitro", ésta forma
se puede ligar a fragmentos mayores de 100 kb de ADN heterólogo. El desarrollo de este
tipo de vectores permite clonar fragmentos muy grandes de ADN, lo cual ha sido de
particular importancia para el análisis y secuenciación de genomas de eucariotes superiores,
incluyendo el genoma humano (3).

Expresión de genes heterólogos

Aún cuando la bacteria E. coli constituye un magnífico sistema para la expresión de genes
heterólogos, la levadura también ha jugado un papel importante en el desarrollo de los
sistemas de expresión heteróloga. A continuación se mencionan algunas de las
características del sistema de levadura: a) a diferencia de lo que ocurre en E. coli, las
proteínas producidas en la levadura carecen de endotoxinas, b) en algunos casos, los
productos producidos en la levadura poseen mayor actividad biológica que los expresados
en E. coli, c) la levadura es capaz de llevar a cabo modificaciones post-traduccionales como
la miristilación, la acetilación de extremos amino terminales, y el procesamiento
proteolítico, indispensables para que el producto posea actividad biológica, y d) las
proteínas heterólogas secretadas por cepas de levadura especialmente diseñadas son
fácilmente recuperadas del medio de cultivo. Vale la pena mencionar que la primera vacuna
humana aprobada obtenida por las técnicas de ADN recombinante, y el primer producto
para uso alimenticio, la renina, fueron producidos en levadura (14, 19).

El análisis funcional del genoma de la levadura provee nuevas herramientas para el estudio
de la genómica.

Análisis global de la transcripción: El transcriptoma

S. cerevisiae fue el primer eucariote cuyo genoma fue secuenciado en su totalidad; aún
cuando esta tarea implicó un esfuerzo enorme, el verdadero reto consiste ahora en
determinar el papel biológico de cada uno de los cerca de 6000 genes de esta levadura, y
por supuesto, el mecanismo de acción que utiliza cada proteína para llevar a cabo procesos
celulares específicos. Esta tarea tendrá que ser llevada a cabo para cada uno de los genomas
que se han ido secuenciando (16), y por lo tanto, un grupo importante de científicos que
coordinaron el proyecto del genoma de S. cerevisiae diseñaron estrategias que permiten
estudiar los patrones de expresión genética de cada uno de los genes, y la función de cada
uno de sus productos, a escala genómica (26).

Una estrategia que se ha utilizado para asignar una función a un ORF dado, es la de estudiar
su secuencia y tratar de predecir, en base a comparaciones con secuencias de otros genes,
cual podría ser su función. Sin embargo existen genes cuya función no se conoce, a pesar
de que se han estudiado por décadas y se han hecho estudios genéticos exhaustivos, y
cuando se analiza su secuencia ésta no presenta una homología significativa con secuencias
previamente identificadas, y por tanto no es posible asignarles una función utilizando este
criterio. En otros casos, aún cuando algunos ORFs tengan homología significativa con
secuencias encontradas en las bases de datos, ésto no es suficiente para determinar el papel
real de dicha proteína. Una estrategia que se ha desarrollado ha sido el estudio de la
expresión de todos los ORFs de levadura de manera eficiente y sistemática (5). Para este

25
efecto, se cuenta con la colección completa de todos los ORFs que constituyen el genoma
de la levadura. Por medio de un robot se coloca, de manera ordenada, una pequeña gota de
cada uno de los ORFs sobre una laminilla de vidrio (Fig. 24 y 25), esto constituye lo que se
denomina un arreglo de genes (array o microarray). Estos arreglos se utilizan para llevar a
cabo hibridizaciones con una variedad de productos marcados, por ejemplo, cADN
obtenido de ARN mensajero extraído de células crecidas en diferentes condiciones. Así, si
nosotros obtenemos cADN a partir del ARN mensajero de células de levadura cultivadas de
manera independiente en medio rico y en medio rico adicionado de NaCl 1M, y marcamos
cada uno de los dos cADNs con diferentes pseudocolores, podremos hibridizar nuestra
laminilla con una mezcla de ambas poblaciones de cADN. La laminilla posteriormente se
lee por medio de un microscopio de fluorescencia acoplado a una computadora apropiada,
lo que nos permitirá generar una imagen (Fig. 23 y 24). El análisis de los colores y su
intensidad nos permitirá determinar cuáles de los 5800 ORFs incrementan o disminuyen su
expresión cuando las levaduras se encuentran en presencia de sal. Así se ha iniciado el
estudio de la función de genes cuya secuencia no presentaba homología con genes
conocidos, y por ende era imposible asignarles una función (16).

Estudio de el conjunto de proteínas presentes en la célula en una condición dada: El

Proteoma

Uno de los paradigmas más importantes de la biología es el que establece que el ADN se
transcribe a ARN, el cual se traduce, generándose todas las proteínas que están presentes en
los diferentes momentos del ciclo celular. Son las proteínas las responsables de mantener el
funcionamiento de la célula, y es por ello que el estudio simultáneo de todo el juego de
proteínas presentes en los diferentes momentos de la célula ha resultado de gran interés; la
disciplina que se ocupa de este estudio se denomina proteómica. De manera general, las
nuevas metodologías que se han desarrollado permiten el uso de geles para separar cada
una de las proteínas presentes en la célula en una condicion determinada, generándose una
imagen como la que se muestra en la Figura 26, posteriormente, haciendo uso de la
espectroscopía de masas podemos conocer la composición de aminoácidos, que aunado a
los datos de carga y tamaño proporcionados por el análisis de las imágenes de los geles, nos
permitirá proponer un número pequeño de ORFs que pudieran presuntamente codificar para
cada una de las proteínas (21).

El análisis del transcriptoma y del proteoma de un organismo como la levadura son dos
estrategias extremadamente útiles, que nos permitirán conocer el funcionamiento y el
producto de cada uno de los genes que constituyen a la levadura S. cerevisiae. Esto sin duda
repercutirá en el conocimiento global del funcionamiento de una célula, ya que como
hemos mencionado, una de las ventajas del estudio de esta levadura es el hecho de que la
células de este organismo eucariote están organizadas de manera similar a las células de
otros organismos eucariotes. Así mismo, muchas proteínas de la levadura están
relacionadas tanto en sus estructura como en su función a sus contrapartes en mamíferos.

26
 MAS DE LA CEREVISAEE
La levadura S. cerevisiaees probablemente elmicroorganismo más ampliamente utilizado
porel hombre a través del tiempo; aunque no setuviera, en un principio, conciencia plena
de laparticipación del microorganismo en la elabora-ción de diversos alimentos como el
pan o las bebi-das alcohólicas (5 y 6). El alcohol o etanol es el producto de la fer-
mentación alcohólica efectuada por microorganis-

mos, que tienen la capacidad de fermentar la glu-cosa (7).El desarrollo tecnológico

alcanzado en la pro-ducción de levadura de panificación a finales delsiglo XIX y principios
del XX, permitió conocer afondo los mecanismos biológicos de multiplicaciónde esta
levadura y contar con el equipamientonecesario para su producción (8). Este trabajo
sepropone indagar sobre la producción de alcohol ylevadura, así como las tendencias
actuales de suproducción en Cuba y el mundo. Levaduras. GeneralidadesLevadura es un
nombre genérico que agrupa auna variedad de organismos unicelulares, inclu-yendo
especies patógenas para plantas y anima-les, así como especies no solamente inocuas
sinode gran utilidad (9).Las levaduras han sido utilizadas, desde laantigüedad, en la
elaboración de cervezas, pan yvino, pero los fundamentos científicos de su culti-vo y uso
en grandes cantidades fueron descubier-tos por el microbiólogo francés Louis Pasteur en
elsiglo XIX (10 y 11).Se conocen cepas diferentes y específicas paracada labor
(panificación, destilería, producción deextractos de levadura y uso en animales) (12).Las
levaduras son organismos eucariotas congran diversidad respecto a su tamaño, forma
ycolor. Son consideradas hongos unicelulares ygeneralmente sus células son ovaladas,
pero tam-bién pueden encontrarse en forma esférica, cilín-drica o elíptica. Son mayores
que las bacterias,alcanzando un diámetro máximo de entre cuatro ycinco μm. Se
reproducen por fisión binaria o gema-ción y algunas pueden ser dimórficas o bifásicas
ycrecen como micelio bajo condiciones ambientalesespeciales (13 y 14). Son resistentes
a antibióticos,sulfamidas y otros agentes antibacterianos deforma natural. Se conoce la
secuencia completa desu genoma y se mantiene en constante revisión, loque ha
permitido la manipulación genética de loscasi 6600 genes que codifican el genoma de
leva-dura (15).Los constituyentes macromoleculares de laslevaduras incluyen proteínas,
glicoproteínas, poli-sacáridos, polifosfatos, lípidos y ácidos nucleicos(16). Su pared celular
comprende entre 15 y 25 %de la masa seca de la célula y sus principales com-ponentes
son polisacáridos (80-90 %), esencial-mente glucanos y mananos, con una menor contri-
bución de quitina, además de proteínas y lípidos(17 y 18).El contenido de proteínas en las
levadurasvaría entre el 40 y el 50 % de su peso seco y tienenuna excelente calidad en
función de su perfil deaminoácidos esenciales (19 - 21).La mayoría de las levaduras
toleran un rangode pH entre 3 y 10, pero les resulta favorable unmedio ligeramente ácido
con un pH entre 4,5 a 6,5.Son capaces de competir con la bacteriaStreptococcus bovis, el
principal productor de ácidoláctico en el rumen, por azúcares solubles (22). Las levaduras
más estudiadas en el mundo soncepas provenientes de las especies: Saccharo-myces
cerevisiae(levadura panadera comercial),Kluyveromyces fragilisy Candida utilis.
Estasespecies son consideradas como aptas para el con-sumo humano o GRAS (por las
siglas en inglés deGenerally Recognized As Safe) (23).Saccharomyces cerevisiae.
Característicasgene-ralesSaccharomyces cerevisiae, es una levaduraque constituye el
grupo de microorganismos másíntimamente asociado al progreso y bienestar dela

27
humanidad; su nombre deriva del vocabloSaccharo(azúcar), myces(hongo) y
cerevisiae(cerveza) (24). Es una levadura heterótrofa, queobtiene la energía a partir de la
glucosa y tieneuna elevada capacidad fermentativa (25). Puedeaislarse con facilidad en
plantas y tierra, así comodel tracto gastrointestinal y genital humano. Es un producto del
proceso de producción dealcohol, que a su vez constituye una valiosa fuen-te de
proteínas y vitaminas para la alimentaciónanimal (26), citado por Solano y Carro (27) y
(28).Por su parte García (29), destaca que en la formu-lación de piensos para aves y
cerdos se emplea lalevadura de recuperación de la fermentación alco-hólica, por ser un
componente rico en proteínas. El uso más extendido está enmarcado en lapanificación y
en las industrias de fabricación decerveza, vinos y alcohol. La levadura inactivadapor
temperatura se usa como fuente de nutrimen-tos en alimentación animal y humana, tanto
enforma de levadura íntegra como a partir de susderivados (30 y 31).Esta levadura es una
de las especies conside-rada como microorganismo GRAS, por lo que hasido aprobada
para su uso como aditivo alimenta-rio (32-34). Se ha aseverado que la crema de levadura
S.cerevisiaeconcentrada , alcanza valores de mate-ria seca (MS) de 18-20 % y un
contenido de prote-ína bruta (PB) de 32-36 % sobre base seca (35).Por otro lado, algunos
autores (36) sostienen quela composición promedio de proteína verdadera esde 40,20 %,
mientras que otros (37), registraronvalores algo inferiores en el entorno de 39
%.21ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 50 (1) enero - abril, 2016

Los principales componentes promedio que laintegran según Otero y García (36, 37)
citado porOtero y Yamada (38 y 39), se relacionan en latabla 1.Respecto a la composición
de la levadura derecuperación de destilerías (40), se afirma que lavariabilidad está en
dependencia de las condicio-nes específicas de producción en cada fábrica dealcohol y
de su régimen de operación.Proceso tecnológico para la producción de alcoholy levadura
Saccharomyces cerevisiaeLa levadura de recuperación de cerveza lacomponen las
células inviables deshidratadas dela levadura Saccharomyces cerevisiaeo S. ovarumen
algunos casos (38). Esta levadura histórica-mente ha sido utilizada en la producción de
alco-hol con resultados satisfactorios (41). García y Estévez (37 y 42), coinciden al descri-
bir el proceso de producción de alcohol por vía fer-mentativa a través de la conversión de
hexosas enetanol según la siguiente ecuación:Hexosas + Levadura Etanol + CO2+
Levadura + ΔLa levadura, además de ser el elemento quecataliza la reacción, constituye
un producto inevi-table de la misma, pudiéndose disminuir su repro-ducción, pero no
eliminarla totalmente (43 - 46).La miel final es convertida de forma directa enhexosas, por
la acción de la enzima invertasa,producida por la propia levadura en el transcursodel
proceso (47 y 48).La miel final de caña se diluye con agua, seajusta el pH con ácido
sulfúrico y se le añadenitrógeno y fósforo en forma de sales solubles.La levadura
proveniente de un cultivopuro de laboratorio se propaga mediantepasos sucesivos
estériles en condicionesaeróbicas hasta obtener volúmenes de 1 a2 m3Se aumenta la
biomasa en el prefer-mentador con un volumen que oscila entre10 y 20 % del
fermentador. En esta etapa seañade miel con una concentración de azú-cares de unos
100 g l-1en condiciones noestériles. Cuando la levadura se encuentraa mediados de la
fase de crecimiento es ino-culada en el fermentador, donde comienzala fermentación
alcohólica en condicionesanaeróbicas con una concentración de azú-cares de 150 a 160
g l-1.La levadura crece simultáneamentecon la producción de alcohol por espacio deunas
20 horas. La velocidad de fermenta-ción aumenta de forma rápida hasta alcanzar
elmáximo al término de las 15 horas. La producciónde alcohol continúa entonces a una
velocidaddecreciente, concluyendo el ciclo de 24 a 30 horasde fermentación, para obtener
una concentraciónfinal de alcohol de 6 a 7 % de volumen (37).Recuperación de levaduraA
lo largo del proceso de fermentación, la leva-dura se desarrolla prodigiosamente,
constituyen-do un producto muy valioso, tanto al ser recupe-rada para su empleo como

28
alimento animal (encrema o seca) como para recircularla al proceso yreiniciar la
fermentación (49).Decisivo en la calidad de la levadura recupera-ble, es el modo de
conducir el proceso fermentati-vo, el esmero con que se realicen todas las opera-ciones y
la preocupación constante para evitar loserrores (42).Después de la fermentación, las
levaduras sonseparadas por centrifugación y lavadas. Se pasanpor filtros prensas o
rotatorios para disminuir elcontenido de agua, hasta obtener un producto de68 o 70 % de
humedad, conocido como levaduraprensada, la cual se envasa en bloques o en
formagranulada en sobres de nylon. Esta levadura sealmacena bajo refrigeración.La
levadura seca activa, es otra variante de lalevadura panadera y se utiliza en caso de no
exis-tir refrigeración o por requerirse períodos prolon-gados de almacenamiento. Consiste
en secar lalevadura en secadores de lecho fluidizado de ato-mización o al vacío. Se
obtiene una levadura con8 % de humedad que conserva su actividad bioló-gica. El
producto se envasa en recipientes hermé-ticos.22ICIDCA sobre los derivados de la caña
de azúcar 50 (1) enero - abril, 2016Tabla1.Composición de la levaduraSaccharomyces
cerevisiaeComponentes (%)(36), cit. (38)(37)(38)(39) Polisacáridos 29,71 34,1 36 31,40
Trehalosa NR 5 NR NR Ácidos nucleicos y nucleótidos 10,65* 10,8 7,41* 9,00*
Fosfolípidos 1,18 4,5 2,63 0,5 Triglicéridos NR 2,5 NR NR Esteroles NR 1 NR NR Ceniza
8,32 3,1 7,34 4,60 Proteína 40,20 39 44,7 42,67 Fte. (36 – 39). NR (No referido).
*(Expresado en ARN)

Tanto la producción de levadura como la deetanol son reacciones exotérmicas, por lo que
esnecesario eliminar el calor desprendido en eltranscurso de la fermentación y mantener
latemperatura cerca del valor óptimo (33 a 34 °C);de lo contrario la temperatura aumenta
hasta40 o 42 °C con sensibles pérdidas en el rendimien-to. Se considera un índice
apropiado de liberaciónde calor el de 287 Kcal l-1de etanol formado.En Cuba,
actualmente la recuperación delevadura es solo como producto secundario de
lasdestilerías y se considera que debido a la impor-tancia nutritiva de este producto, se
hace necesa-ria la implementación de tecnologías que mejorenla composición de la
levadura y poder ampliar superfil de uso.Factores a tener en cuenta para el crecimiento
ydesarrollo de la levaduraPresión osmótica: la nutrición de la levadura esun proceso
puramente osmótico, es importan-te evitar medios hipertónicos o hipotónicospara evitar la
plasmoptisis y plasmólisis. Elestrés osmótico puede causar una disminuciónen el volumen
celular, afecta además, la velo-cidad de fermentación, así como la viabilidadcelular
(50).Temperatura: las altas temperaturas ocasionanuna disminución de la biomasa,
producto deun descenso en el contenido de proteínas,RNA; DNA y aminoácidos libres e
induce a larigidez de la membrana celular. Temperaturasmuy bajas provocan un estado
de latencia enla célula, deteniendo su desarrollo (51). Desecación: es uno de los
principales agentes queinhiben las actividades y desarrollo de losmicroorganismos.Luz:
en general la luz es perjudicial para losmicroorganismos que carecen de clorofila,
ocualquier otro pigmento que les permita usarla energía de las radiaciones en el proceso
defotosíntesis.pH: el pH óptimo en el cual se desarrollan mejorlos microorganismos, está
entre 4 y 5. Laslevaduras tienen la ventaja de soportar,medios más ácidos, que otros
microorganis-mos, lo que es aprovechado en los procesosindustriales para mantener el
medio controla-do de bacterias que puedan competir por elsustrato (52 y 53).Alcohol: el
efecto del etanol en la célula es unacombinación de inhibición del crecimiento
ydisminución de la viabilidad, puede actuarcomo inhibidor de la fermentación a partir deun
8 %. Riegel (54) afirma, que no es recomen-dable terminar la fermentación con un
gradoalcohólico muy elevado.Influencia de las condiciones de cultivo en la pro-ducción de
alcohol y levaduraLas diferentes respuestas que se han observa-do en el metabolismo de
la levadura S. cerevisiae,cuando se cultiva bajo distintas concentracionesde glucosa y
oxígeno disuelto, pueden ser explica-das por la saturación de la oxidación del NADH

29
anivel de la cadena respiratoria (55), e influyen enla acumulación de compuestos de
reserva en lalevadura.El hombre puede intervenir en los parámetrosproductivos,
pudiendo, dentro de un proceso,reducir y hasta eliminar la fase de crecimientocelular.
Esto ocurre en el proceso, por ejemplo,como el de "Melle - Boinot ", donde la recircula-
ción de las levaduras (crema de levadura) desdelas separadoras centrífugas, permite una
inocu-lación del mosto, prácticamente ideal (42). La productividad típica de un proceso
discon-tinuo clásico en batch es de 1,8 a 2,5 g de etanolpor litro de fermentador en una
hora. Esta pro-ductividad puede aumentarse de manera sensi-ble si se recircula la
levadura producida en el fer-mentador o se emplea la fermentación continua.En estos
casos los valores típicos se encuentranentre 5 y 8 g de etanol por litro de fermentadorpor
hora.Hutkins (56), aseguró que la fermentacióncontinua aumenta la eficiencia química del
pro-ceso, obteniéndose mayores cantidades de etanol,refiriendo que los métodos de
fermentación conti-nua se empezaron a patentar en la década de los50 y desde entonces
han hecho que la industriade las bebidas alcohólicas haya experimentadoun crecimiento
apreciable. Estévez (42) afirmó, que cuando se utiliza lafermentación continua, se elimina
el llenado yvaciado de los fermentadores y también la nece-sidad de controladores,
equipos de enfriamiento,etc., que son instalados solamente en los fermen-tadores donde
hay necesidad de hacerlo, elimi-nando con esto la ociosidad y el costo de inver-sión,
mientras que el riesgo de contaminación seincrementa, por lo que se requiere mayor
esteri-lidad en el proceso. En una fábrica de Sáo Joáo, Brasil, se alcan-za una
productividad global de 6,41 m3.h de alco-hol en fermentadores de 350 m3en una fermen-
tación continua en simple etapa con recirculación(57).En la actualidad se han realizado
estudios decinética para la producción de etanol utilizando23ICIDCA sobre los derivados
de la caña de azúcar 50 (1) enero - abril, 2016

la levadura S. cerevisiae (57), donde se han regis-trado valores de 50,5 g/L a las 24 h,
partiendo de100 g/L con un rendimiento del 97,2 %, en condi-ciones de fermentación, que
han permitido cono-cer el tiempo en el que se consume el sustrato, asícomo la producción
de etanol.En el proceso de producción de levadura, debetenerse especial cuidado en el
control estricto dela oxigenación, debido a la tendencia de estemicroorganismo a desviar
su metabolismo haciala producción de etanol en condiciones de anaero-biosis. Este
comportamiento puede evitarse si sepropaga en modo fed batchen el que los azúcaresse
suministran al medio a través de un programaque garantiza bajas concentraciones de
sustratotodo el tiempo (58).Cuando el proceso de producción de alcohol serealiza de
manera eficiente, es posible obteneralrededor de 30 kg de crema de levadura, con 20
%de concentración en volumen/hectolitro de alcoholque se produzca
(59).Situaciónactualdelaproduccióndealcoholylevadura S. cerevisiaeLos dos principales
productores de alcohol, sonEstados Unidos y Brasil, que juntos producen el70 % del total
producido a nivel mundial (EstadosUnidos a partir del maíz y Brasil de la caña deazúcar),
seguidos por China, India y Francia (60).Incentivos del mercado han provocado el
desarro-llo de crecientes industrias en países comoTailandia, Filipinas, Guatemala,
Colombia yRepública Dominicana y en Europa, tantoAlemania como España han
incrementado consi-derablemente su producción de etanol, pero losporcentajes siguen
siendo pequeños comparadoscon los de Brasil y Norte América (61).La producción de
levadura S. cerevisiae, enalgunos de estos países ha estado en correspon-dencia con la
producción de alcohol, sin embargo,muchos de ellos no recuperan levadura para
finesalimenticios, sino que la recirculan al proceso deproducción de alcohol (62).Brasil
utiliza dentro de su tecnología, el san-grado de la levadura, al respecto Andrietta
(63),plantea que esto es una estrategia inteligente yrentable, que evita la acumulación
excesiva de lamasa celular. La sangría, ayuda a mantener unaconcentración estable de
las celulas en el proceso,evitando así un aumento en el volumen de fer-mentación a ser

30
tratado, lo que mejora las condi-ciones del tratamiento ácido, disminuyendo el con-sumo
de ácido sulfúrico y consecuentemente laacidez de la fermentación, además permite el
con-trol de la edad promedio de las celulas de levadu-ra, manteniendo la población jóven
en el proceso.La crema de levadura sangrada, es sometida aun proceso llamado
fermentación endógena,donde por las condiciones estresantes, la levaduraconsume sus
propias reservas de carbohidratos ycomo consecuencia de este fenómeno, aumenta
lacomposición de proteína celular, haciéndose nece-saria, antes de secar la levadura, la
desalcoholiza-ción de la crema que puede ser realizada por des-tilación o lavado.En la
producción de levaduras, Cuba, duranteel período de 1975 a 1990, con la instalación de
10fábricas, fue capaz de alcanzar, en conjunto, másde 120 000 toneladas por año (6),
producción quedifiere mucho de la situación actual, debido a queen las destilerías, la
recuperación de levadurasestá limitada al fondaje excedente en los fermen-tadores,
cuestión que afecta no solo la cantidad delevadura, sino también su calidad. La figura 5
muestra la producción de levaduraSaccharomyces cerevisiae, para alimento animal,en los
últimos 10 años, según datos obtenidos dela Dirección de Derivados de Azcuba.
Tendencias actuales del uso de levadura S. cerevi-siaeLas levaduras se emplean
actualmente para laproducción comercial de cantidades relevantes dealcohol
dehidrogenasa, gliceraldehído-3-hidroge-nasa, hexoquinasa, lactato hidrogenasa,
glucosa-6-fosfato hidrogenasa, así como Coenzima A,nucleótidos difosfopiridinos y mono,
di y tri-fosfa-tos de adenina, guanina, citidina y uridina, citadopor Otero (38, 64). La
levadura Saccharomycescerevisiaees la fuente tradicional de invertasa,que tiene un
apreciable significado comercial y seemplea en modo creciente en la producción
debebidas, en la industria repostera y en la agricul-tura, así como para fines investigativos
y tecnoló-gicos (38). 24Figura 1. Producción de levadura S. cerevisiaepara alimento
animal en los últimos 10 años.Fuente: Dirección de derivados de Azcuba.ICIDCA sobre
los derivados de la caña de azúcar 50 (1) enero - abril, 2016

Debido a la propiedad de las levaduras de acu-mular cantidades variables de los

minerales pre-sentes en su medio de cultivo, el contenido deminerales de células de
levadura, cultivadas enun medio particular de propagación, puede serajustado para
resultar de significación comosuplemento de salud o nutricional para animalesy humanos.
Al respecto Otero (65) planteó que losmicroorganismos son capaces, en general,
deincorporar a su biomasa cantidades apreciables deminerales aun cuando no los
necesiten para sufuncionamiento, pudiendo ser empleadas comolevaduras enriquecidas
(38).Un ejemplo de esta técnica, que ha recibidoespecial atención desde alrededor del
año 2000, esel empleo de levaduras para obtener selenio orgá-nico que será empleado
como suplemento alimen-ticio debido a su similitud con la forma en que esteelemento se
encuentra en la naturaleza (66).El uso de las levaduras como probióticos esampliamente
utilizado en la alimentación de losrumiantes y presentan buenas perspectivas defuturo en
la UE, ya que constituyen una de lasalternativas más válidas al uso de aditivos anti-
bióticos tras su prohibición en el año 2006 (67).Por otro lado, los esfuerzos que se han
hechopara emplear las levaduras como suplemento secoen dietas animales y humanas
con la finalidad decombatir el hambre y aumentar la productividadno han dado los
resultados esperados (68).Chacon (69) afirma que el problema está en elhecho de que un
nuevo alimento no solo debe sernutricionalmente valioso, sino que además debeser
organolépticamente satisfactorio y económica-mente rentable. Estos dos apartados son el
"talónde Aquiles" de la SCP (proteína unicelular o leva-duras) y a la vez el reto del
profesional en alimen-tos. Por otro lado asegura, que es un hecho que enel comercio y la
industria, donde las fuerzas demercado operan, la proteína unicelular no encuen-tra aún
un nicho competitivo y que bajo las condi-ciones actuales deben ejecutarse
sustancialesmejoras en todos los sentidos para que las levadu-ras puedan llegar a ser

31
competitivas con otrasfuentes de proteína más atractivas como la soja, laalfalfa o la harina
de pescado, coincidiendo conOtero (38), al asegurar que para lograr el estable-cimiento
de una industria a partir de las poten-cialidades de las levaduras, es preciso un equipode
investigación y desarrollo comprometido endiferentes áreas como fisiología de levaduras,
bio-logía molecular, tecnología de fermentación y pro-pagación y dado el caso, en
nutrición animal yhumana. Actualmente, debido a la escases del petróleo ylos precios en
alza del mercado, se está convir-tiendo en un hecho cada vez más importante
elreplantearse la posibilidad de utilizar alcoholcomo combustible. Así, en la actualidad son
varioslos países que están estudiando el empleo del eta-nol, obtenido de la biomasa,
como combustible,bien como componente único, o en mezclas
congasolinas.CONCLUSIONESLas condiciones, en las que se obtiene la S.cerevisiaeen
Cuba, limitan el uso de esta levadu-ra, por lo que se sugiere la necesidad, de diseñaruna
planta de recuperación de esta levadura, quepermita su utilización, no solo como nutriente
sinoademás en la elaboración de productos con carac-terísticas probióticas para
animales.25REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. Quiao, S. Production of single cell
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Guerrero Legarreta, eds) Laslevaduras y sus productos derivados como ingredientes en la
industria de alimentos". Universidad

CERVISAEE EN LA PRODUCCION DE VINO

Saccharomyces cerevisiae (S. ellipsoideus) es unade las más importantes en enología ya
que es la responsable de la fermentación de la mayor parte de los azúcares del mosto. Su
poder alcohológeno es elevado (17º) y es bastante resistente al SO2
(250 mg/L).
II.4.- UTILIZACIÓN DE LAS LEVADURAS EN VINIFICACIÓN La fermentación del
mosto suele desencadenarse de forma natural y espontánea a partir de las propias levaduras
presentes en el mosto, a este tipo de fermentación se le denomina fermentación espontánea.
Se caracteriza porque en el transcurso de la misma intervienen varias especies de levaduras,
algunas de las cuales coexisten en el tiempo y otras se suceden secuencialmente en función
de su poder alcohológeno. En la sucesión de especies primero suelen intervenir las
levaduras de primera fase generalmente asporógenas y luego las de segunda fase en su

32
mayoría esporógenas, de modo que S. cerevisiae domina durante la mayor parte del tiempo,
pudiendo ser desplazado al final por S. bayanus. En ocasiones la conjunción de un sulfitado
excesivo y bajas temperaturas retardan el inicio de la fermentación. En estos casos, y en
aquellos en los que el vinicultor desea conducir la F.A. con un tipo concreto de levaduras,
se recurre a la adición de levaduras al mosto. Se pueden emplear o bien levaduras
autóctonas, preparando lo que se ha dado en llamar un pie de cuba, o bien levaduras
comerciales. En el primer caso se parte de una fracción pequeña de la propia vendimia, las
uvas más sanas, cuyo mosto se deja fermentar espontáneamente. Cuando la fracción está en
plena fermentación puede ser utilizada como inóculo para el resto del mosto. En el segundo
caso se suele recurrir al empleo de las denominadas levaduras secas activas (LSA). Bajo el
aspecto de polvos secos, que a menudo deben ser rehidratados en agua tibia antes de su
utilización, las LSA son levaduras deshidratadas generalmente pertenecientes a las especies
S. cerevisiae y S. bayanus. III.- LA FERMENTACIÓN ALCOHOLICA (F.A.) Podemos
definir la F.A. como el proceso bioquímico por el cual las levaduras transforman los
azúcares del mosto en etanol y CO2 (Zambonelli, 1988; Navarre, 1994). Para que la F.A.
tenga lugar, el mosto ha de hallarse en condiciones de limitación de oxígeno. En
condiciones de aerobiosis las levaduras se multiplican abundantemente con un rendimiento
en biomasa muy alto ya que se consigue 1 g de levadura por cada 4 g de azúcares
consumidos. En anaerobiosis las levaduras realizan la F.A., es decir degradan los azúcares
de forma incompleta generando etanol, CO2 y energía. En estas condiciones el rendimiento
en biomasa es de tan sólo 1 g de levadura por cada 100 g de azúcares consumidos. III.1.-
MECANISMO BIOQUÍMICO DE LA F.A. La secuencia de reacciones enzimáticas por las
que las levaduras transforman los azúcares del mosto en etanol y CO2 se indican en la
figura 1. III.2.- PRODUCTOS SECUNDARIOS DE LA F.A. Durante la F.A., además de
etanol y CO2 se produce cierta cantidad de otros compuestos, que en gran medida
contribuyen al sabor y aroma final del vino (Peynaud, 1989; Navarre, 1994; Suárez, 1997).
Los más significativos son los siguientes: 1. Glicerol.- Cuantitativamente es el segundo
componente mayoritario del vino después del etanol. Se encuentra en cantidades de 6 a 10
g/L y a él se atribuyen los caracteres de suavidad y aterciopelado del vino. Se genera a
partir de la fosfodihidroxiacetona por reducción y defosforilación de la misma. glucosa
ATP ADP glucosa-6- fosfato fructosa-6-fosfato ATP ADP fructosa-1,6-difosfato
gliceraldehido - 3 fosfato dihidroxiacetona-fosfato 2 NAD 2 Pi 2 NADH2 2 ácido 1-3
difosfoglicérico 2 ADP 2 ATP 2 ácido 3 -fosfoglicérico 2 H2O 2 ácido fosfoenolpirúvico 2
ADP 2 ATP 2 ácido pirúvico 2 CO 2 2 acetaldehido 2 NADH2 2 NAD 2 etanol glucosa
ATP ADP glucosa-6- fosfato fructosa-6-fosfato ATP ADP fructosa-1,6-difosfato
gliceraldehido - 3 fosfato dihidroxiacetona-fosfato 2 NAD 2 Pi 2 NADH2 2 ácido 1-3
difosfoglicérico 2 ADP 2 ATP 2 ácido 3 -fosfoglicérico 2 H2O 2 ácido fosfoenolpirúvico 2
ADP 2 ATP 2 ácido pirúvico 2 CO 2 2 acetaldehido 2 NADH2 2 NAD 2 etanol Figura 1.
Secuencia de reacciones de la fermentación alcohólica. ALTAGA ©1999 Mesas y Alegre:
El papel de los microorganismos en la elaboración del vino 178 NADH2 NAD H2O Pi
Fosfodihidroxiacetona Glicerol-P Glicerol NADH2 NAD H2O Pi Fosfodihidroxiacetona
Glicerol-P Glicerol 2. Acetaldehido.- Aparece durante la F.A. por descarboxilación del
ácido pirúvico, aunque también puede proceder de la oxidación del etanol. En exceso
provoca en el vino la denominada maderización o gusto oxidado. 3. Ácido acético.-
Componente mayoritario de la acidez volátil se produce por la condensación de 2
moléculas de acetaldehido, aunque puede tener otros orígenes no relacionados con la F.A.
En exceso transmite al vino gusto a picado. H2O 2 Acetaldehido Etanol + Ácido acético

33
H2O 2 Acetaldehido Etanol + Ácido acético 4. Ácido succínico.- Presente siempre en el
vino transmite a éste el típico sabor entre salado y amargo que caracteriza a las bebidas
fermentadas. Procede de la carboxilación del ácido pirúvico y posteriores reacciones redox.
CO2 NADH2 NAD H2O NADH2 NAD Pirúvico Oxalacético Málico Fumárico Succínico
CO2 NADH2 NAD H2O NADH2 NAD Pirúvico Oxalacético Málico Fumárico Succínico
5. Acido láctico.- Procede de la hidrogenación del pirúvico, aunque puede tener su origen
en intervenciones bacterianas. NADH2 NAD Ácido pirúvico Ácido láctico NADH2 NAD
Ácido pirúvico Ácido láctico 6. Acetoína, diacetilo y 2-3 butanodiol.- Son los metabolitos
del ciclo diacetilo-acetoínico. Siempre presentes en el vino, en exceso transmiten sabores
lácteos y amargos no deseables. Tienen su origen en la condensación y descarboxilación de
2 moléculas de ácido pirúvico. 2 CO2 NAD NADH2 2 Pirúvico Acetoína 2-3 Butanodiol
NADH2 NAD Diacetilo 2 CO2 NAD NADH2 2 Pirúvico Acetoína 2-3 Butanodiol
NADH2 NAD Diacetilo 7. Otros compuestos.- Con origen en los azúcares se forman
diversos ácidos cuantitativamente minoritarios como cítrico, propiónico, fumárico y
fórmico. Con origen en las sustancias nitrogenadas se forman alcoholes superiores como
isoamílico e isopropílico que proceden de la desaminación y descarboxilación de los
aminoácidos. Por combinación entre ácidos y alcoholes se generan ésteres con fuerte
repercusión en el buqué final del vino, siendo el acetato de etilo el que tiene una
repercusión mayor. III.3.- FACTORES QUE INFLUYEN EN LA F.A. Existen diversos
factores tanto físicos como químicos que inciden positiva o negativamente en el transcurso
de la F.A., ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras, ya sea incidiendo
directamente sobre la propia F.A. (Navarre, 1994). Los más relevantes son los siguientes:
La temperatura.- A mayor temperatura la F.A. transcurre más rápidamente, sin embargo es
menos pura. Se produce menos etanol y más cantidad de compuestos secundarios que a
menudo no conllevan mejora de la calidad del vino. Por otro lado las levaduras tienen en
los 30ºC su temperatura óptima de desarrollo. Por encima de los 35ºC la actividad decrece
rápidamente y en torno a los 45ºC mueren. Por debajo de 10ºC la mayor parte de las
levaduras silvestres son inactivas. El oxígeno.- Aunque la F.A. es un proceso anaeróbico las
levaduras mantienen una leve respiración utilizando para ello el oxígeno combinado a
moléculas del mosto. En caso de carencia de este oxígeno pueden requerirse remontados
del mosto con aireación para evitar la parada de la F.A. Los nutrientes.- Por un lado están
los azúcares, que son fuente de carbono y de energía para las levaduras y que deben
encontrarse en concentración superior a 20 g/L para que la F.A. transcurra a su velocidad
máxima. Por otro están las sustancias nitrogenadas, las sales y los factores de crecimiento
(vitaminas) que normalmente se hallan en el mosto en concentración suficiente para el
desarrollo de las levaduras. Sin embargo en casos de vendimias atacadas de podredumbre
en las que los mohos han consumido parte de estos nutrientes, puede ser necesario
adicionar al mosto complejos vitamínicos y sales de amonio. Los compuestos químicos de
acción negativa.- Por un lado la acumulación de los propios productos de la F.A. pueden
ralentizarla. Por otro lado, esos mismos compuestos junto a otros presentes en el mosto de
forma natural (taninos) o artificial (pesticidas, SO2 , etc.) pueden actuar como inhibidores
del crecimiento de las levaduras

Cienc. Tecnol. Aliment. Vol. 2, No. 4, pp. 174-183, 1999 ISSN 1135-8122 ©1999
ALTAGA
Mesas y Alegre: El papel de los microorganismos en la elaboración del vino

34
Levaduras en el vino: Saccharomyces y no-Saccharomyces
PUBLISHED ON 29 noviembre, 2016 5 Comments
El vino es el resultado de la fermentación alcohólica llevada a cabo por las levaduras
vínicas. Aunque Saccharomyces cerevisiae es considerada como el agente más importante
de esta fermentación, existen otros agentes que participan en este proceso metabólico,
debido al complejo ecosistema microbiano que presenta el mosto de uva.

Estas otras levaduras pertenecen a otros géneros, como por ejemplo

Hanseniaspora/Kloeckera, Pichia, Candida or Metschnikowia. En general, estas levaduras
están implicadas en los primeros estadíos de fermentación. Todo este basto grupo de
levaduras relativos a otros géneros diferentes a Saccharomyces, se denominan levaduras
no-Saccharomyces.

Agentes involucrados en la fermentación alcohólica espontánea del vino

Aún con el complejo medio microbiano y el hecho de que algunas levaduras no-
Saccharomyces pueden iniciar la fermentación alcohólica, S. cerevisiae tiene la habilidad
de imponer su crecimiento sobre el resto de levaduras competidoras. Es por esto que S.
cerevisiae domina la fermentación alcohólica desde estadíos medios hasta el final de
fermentación. También, S. cerevisiae es la levadura vínica que presenta mayor resistencia
al dióxido de azufre. Así, S. cerevisiae fue elegida como levadura óptima para el desarrollo
de la tecnología de los inóculos.

No obstante, hoy en día, está crecido el interés en las no-Saccharomyces para llevar a cabo
la fermentación alcohólica debido a una diferenciación y mejora en la complejidad del vino
final. Los conocimientos actuales sobre las levaduras no-Saccharomyces han derivado en su
uso como inóculo junto a S. cerevisiae en la elaboración del vino.

Generalmente, los vinos inoculados únicamente con no-Saccharomyces presentan gran

concentración de ácido acético y otros compuestos no deseables. Además, en muchas
ocasiones, no son capaces de terminar la fermentación.

Por el contrario, y lo que nos interesa, los vinos inoculados con esta combinación de no-
Saccharomyces y S. cerevisiae presentan mejoras organolépticas respecto a los mismos
vinos inoculados únicamente con S. cerevisiae. Estas mejoras se deben a las actividades
enzimáticas particulares que presentan las levaduras no-Saccharomyces, que están ausentes
en S. cerevisiae, mejorando así la calidad y complejidad del vino.

Concretamente, las no-Saccharomyces más estudiadas para modular el perfil organoléptico

del vino son Kloeckera apiculata, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora guillermondi, H.
uvarum, H. vineae, Starmerella bacillaris (syn. Candida zemplinina), etc. En cuanto a la
producción de vinos más glicéricos (más untuosos en boca) se está usado C. stellata.

También es interesante señalar que los vinos fermentados con estas combinaciones pueden
producir vinos menos alcohólicos. Concretamente se está estudiando la posibilidad de
utilizar Metschnikowia pulcherrima con S. cerevisiae para reducir el grado alcohólico de
los vinos.

35
Imagen destacada: cultivo de una fermentación mixta entre M. pulcherrima (colonias
pequeñas anaranjadas) y S. cerevisiae (colonias grandes de color blanco) en medio YPD.

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ENOLÓGICA•TAGS ÁCIDO ACÉTICO, CANDIDA, DIÓXIDO DE AZUFRE,
ECOSISTEMA MICROBIANO, FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA, GLICEROL,
HANSENIASPORA, INÓCULO, KLOECKERA, METSCHNIKOWIA,
MICROBIOLOGÍA, NO-SACCHAROMYCES, PERFIL ORGANOLÉPTICO, PICHIA,
SACCHAROMYCES CEREVISIAE, SULFITOS

¿Fermentación espontánea o inoculada?

PUBLISHED ON 10 mayo, 2016 10 Comments
Por norma general, las bodegas se sienten orgullosas de exponer a sus visitantes que
realizan una fermentación alcohólica espontánea. En caso contrario, cuando se realiza una
fermentación inoculada, parece que lo ocultan o no se sienten cómodos con manifestarlo.

¿Por qué? ¿Qué diferencias hay? ¿Prestigio? ¿Dinero?

Ya se comentó en una entrada anterior que la principal reacción que transforma el mosto de
uva en vino es la fermentación alcohólica que llevan a cabo las levaduras. Pues bien, el
origen de estas levaduras va a determinar que la fermentación sea espontánea o inoculada.

Fermentaciones
Experimentación en laboratorio de fermentaciones con diferentes combinaciones de
levaduras y bacterias lácticas.
La fermentación espontánea es aquella que se lleva a cabo por la microbiota de levaduras
presente de forma natural en los hollejos de la uva. Se trata de una fermentación en la que
participan gran cantidad de levaduras, que van creciendo y desarrollándose
secuencialmente.

Esta fermentación es impredecible y muy dependiente de las condiciones climáticas de la

añada. Muchas veces la microbiota que presentan las uvas es insuficiente o inadecuada y
puede dar lugar a retrasos de fermentación o paradas de fermentación. Este problema se da
especialmente en vinos blancos, en los cuales, el contacto con los hollejos ha sido mínimo.

36
Por otro lado, esta fermentación presenta una característica que la hace especial. Se
consigue un vino con identidad de la zona geográfica donde se ha elaborado, reflejo del
terruño y el clima de la añada.

Placa pulch
Cultivo de una fermentación mixta entre M. pulcherrima (colonias pequeñas anaranjadas) y
S. cerevisiae (colonias grandes de color blanco) en medio YPD.
Como alternativa a la fermentación espontánea, está la fermentación inoculada. En esta, se
inoculan levaduras “de sobre”. Estas levaduras han sido especialmente seleccionadas
(existe un gran trabajo de investigación y trabajo de laboratorio detrás de esa selección) por
sus excelentes cinéticas de fermentación y con ellas se puede llegar a asegurar un final de
fermentación. Así, los productores pueden asegurar la producción.

La especie de levadura que se suele inocular es Saccharomyces cerevisiae. Lo que se

persigue es que esta levadura “de sobre” se imponga sobre la microbiota natural y sea esta
levadura la que lleve a cabo la fermentación. Esto se consigue inoculando una gran
cantidad de levaduras (muy superior a las poblaciones naturales) muy bien adaptada al
mosto.

Gracias a esto, se puede conseguir un producto más homogéneo durante los años.
Inoculando la misma levadura, se obtendrá un vino más parecido año tras año (poco o nada
influenciado por la microbiota natural).

Además, la fermentación inoculada comienza el proceso de transformación de los azúcares

en etanol inmediatamente y suele durar una semana, aproximadamente. Por el contrario, la
espontánea requiere de una fase de latencia, de aclimatación de las levaduras al mosto y
puede llevar más de dos semanas. Y, ¿esto que supone? Que la fermentación espontánea
inmoviliza tinas y tanques de fermentación por más tiempo (lo que se traduce en pérdidas
de dinero).

Como podéis imaginar, la fermentación espontánea es inviable cuando se manipulan

grandes cantidades de mosto o se trabaja en cooperativa, donde la uva presenta gran
heterogeneidad y los tanques tienen que liberarse en el menor tiempo posible, para así
manipular el mosto en el menor tiempo posible.

Por ello, la fermentación espontánea solo es adecuada cuando se tiene tiempo, espacio y
dinero para realizarla. Únicamente se realiza en bodegas familiares, donde se mima mucho
la producción de los vinos o en gamas altas de productos en bodegas grandes.

Expuesto todo esto, ¿qué opinais? Desde mi humilde punto de vista, hay que juzgar el vino
en su conjunto y no solo por el tipo de fermentación. Lo importante de todo esto es, que si
la materia prima y la elaboración son buenas, el producto será bueno, independientemente
de cómo se haya transformado.

Obviamente, la fermentación espontánea dará como resultado un vino con identidad propia,
y cada añada tendrá mayor diferencia que los vinos de una fermentación inoculada. Ahora

37
bien, la apuesta del productor por la espontánea, también se verá reflejada en el precio del
vino.

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NO-SACCHAROMYCES, PRECIO, SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Levaduras y fermentación alcohólica

PUBLISHED ON 12 abril, 2016 31 Comments
Os presento a los microorganismos más relevantes del vino: las levaduras.

Las levaduras son microorganismos que realizan la fermentación alcohólica. Son las
responsables de transformar los azúcares del mosto en etanol y CO2, transformando el
mosto de uva en vino.

Las levaduras pertenecen al reino Fungi. Son seres unicelulares de vida libre presentes en
todo tipo de ecosistemas. Centrándonos en el mundo enológico, las levaduras se pueden
encontrar en: (1) la uva, y consecuentemente en el mosto y (2) en las instalaciones de la
bodega.

Presencia, identidad e importancia microbiológica

Como ya se ha dicho, dentro del contexto de la elaboración del vino, las levaduras pueden
encontrarse de forma natural en la uva y en las instalaciones de la bodega. Además de estas
levaduras de origen natural, existen las levaduras “de sobre”, inóculos de levadura que se
utilizan para realizar fermentaciones inoculadas.

Cabe destacar que, en lo que a vino se refiere, se distinguen dos tipos de levaduras: (1) las
levaduras Saccharomyces y (2) las levaduras no-Saccharomyces.

Las levaduras del género Saccharomyces son levaduras de fermentación vigorosa y muy
bien adaptadas a fermentar azúcares en bodega. Su presencia en la uva es escasa en
comparación con las levaduras no-Saccharomyces. Sin embargo, en los equipos de
elaboración se encuentran en grandes poblaciones y perfectamente adaptadas al entorno
bodeguero. La principal levadura que pertenece a este género es Saccharomyces cerevisiae.

S. cerevisiae QA23 40x

Cultivo de S. cerevisiae QA23 en medio YPD. Aumentos 40x.
Por otro lado, las levaduras no-Saccharomyces, o dicho de otra manera, las levaduras que
no pertenecen al género Saccharomyces, se encuentran mejor adaptadas al viñedo.
Mayoritariamente se encuentran en la uva. Influenciadas por el terruño y el clima, las

38
diferentes especies de no-Saccharomyces van a aportar particularidades a los vinos, debido
a sus distintas actividades metabólicas. Es por esto que los elaboradores aprecian cada día
más a estas levaduras. Dentro de las no-Saccharomyces encontramos los géneros: Candida,
Hanseniaspora, Torulaspora, Pichia y Metschnikowia, entre otros.

Fermentación alcohólica
La fermentación alcohólica es un metabolismo por el cual las levaduras consumen azúcares
simples y los transforman en etanol y CO2. ¿Qué gana con esto la levadura? La levadura
consigue energía oxidando parcialmente los azúcares a etanol.

ecuación fermentación alcohólica

Ecuación simplificada de la fermentación alcohólica
Una oxidación completa implicaría la transformación de todo el azúcar, tal y como
hacemos los humanos, en CO2 y agua. Este metabolismo oxidativo aerobio (también
denominado respiración, se requiere O2) es más ventajoso energéticamente, y aún así las
levaduras, en condiciones enológicas no lo realizan. ¿Por qué?

Las levaduras están creciendo sobre mosto, un sustrato con una cantidad de azúcares
enorme. Bajo estas condiciones, las levaduras, concretamente las Saccharomyces, son
Crabtree positivas, esto es, que a altas concentraciones de azúcar preferentemente
realizarán la fermentación alcohólica.

Aunque la fermentación sea energéticamente menos rentable, es un metabolismo más

rápido y productor de etanol. El etanol es un compuesto tóxico para los microorganismos,
al que las levaduras Saccharomyces están muy bien adaptadas. Por tanto, este metabolismo
fermentativo, elimina competidores, ayudando a la supervivencia de estas levaduras sobre
otros microorganismos.

Dinámica de la fermentación espontánea

Durante el desarrollo de una fermentación espontánea, las levaduras no-Saccharomyces
comienzan la fermentación y continuan metabólicamente activas durante unos pocos días.
Cuando el grado alcohólico va aumentando, su metabolismo comienza a inactivarse y
comienza un crecimiento vigoroso de las Saccharomyces. En poco tiempo, las levaduras
Saccharomyces se imponen, en el medio, consumen los nutrientes y terminan la
fermentación alcohólica. Finalmente, los azúcares se consumen por completo y las
levaduras se inactivan, dejando un nuevo medio, el vino, para el crecimiento de otros
microorganismos: bacterias lácticas y bacterias acéticas, principalmente.

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CO2, CRABTREE, DIVULGACIÓN, ETANOL, FEATURED, FERMENTACIÓN,
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA, FERMENTACIÓN ESPONTÁNEA,
INVESTIGACIÓN, LEVADURAS, METABOLISMO, MICROBIOLOGÍA, MOSTO,
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Están ahí…
PUBLISHED ON 15 marzo, 2016 25 Comments
La uva, el vino, pasando por el mosto… Son los ecosistemas que ofrece la elaboración del
vino para los microorganismos. Diferentes nichos ecológicos donde los microorganismos
crecen, se multiplican y aportan sus particularidades al medio.

Toda presencia microbiológica en el proceso de elaboración del vino deja su huella en el

producto final. Tanto positiva como negativamente, el vino va a estar influenciado por los
microorganismos que allí crecen.

Levaduras, bacterias lácticas y bacterias acéticas son los microorganismos más importantes
en el vino. Es también habitual encontrar hongos filamentosos (mohos), especialmente en el
corcho. En cualquier caso, la presencia de estos últimos es indeseable en vinos.

Las levaduras van a ser las protagonistas. Van a realizar la fermentación alcohólica del
mosto, para trasformarlo en vino. Van a consumir los azúcares del mosto y los van a
transformar en etanol y CO2. Según las levaduras que lleven a cabo esta fermentación,
también consumirán otras moléculas y dejarán otro tipo de sustancias en el vino, así como
liberar los aromas encerrados en el mosto en forma de precursores aromáticos. De la
levadura por excelencia Saccharomyces cerevisiae y sus “primas” las levaduras no-
Saccharomyces hablaremos más adelante cuando se trate la fermentación espontánea.

Modesta es la presencia o importancia que se le da a las bacterias lácticas. Capitaneadas por

la bacteria láctica más importante en vino; Oenococcus oeni, estas bacterias llevan a cabo la
fermentación maloláctica. Esta fermentación transforma el ácido málico (ácido
dicarboxílico, un ácido fuerte) en ácido láctico (ácido monocarboxílico, un ácido más débil
y agradable en boca). Esta transformación es interesante en vinos tintos y, también, en
blancos de climas fríos donde la acidez del vino es muy elevada. La desacidificación de los
tintos es interesante ya que una acidez excesiva acentúa la astringencia.

Por último, las bacterias acéticas, al contrario que los anteriores microorganismos, son
indeseables. Éstas transforman el etanol del vino en ácido acético (ácido del vinagre). Las
buenas prácticas en bodega permiten controlar la incidencia de estas bacterias acéticas y así
evitar la acetificación del vino.

Para finalizar, un resumen. Los microorganismos principales que encontramos en vino son:

40
Levaduras: llevan a cabo la transformación esencial del mosto a vino; la fermentación
alcohólica.
Bacterias lácticas: transforman el ácido málico en ácido láctico, desacidifican ligeramente
el vino, interesante en ciertos casos.
Bacterias acéticas: producen ácido acético consumiendo etanol. Totalmente indeseables en
la elaboración de un vino.

Imagen de cabecera: micrografías de levaduras no-Saccharomyces creciendo en medio de

cultivo YPD. A) Hanseniaspora uvarum, aumentos: x100. B) Metschnikowia pulcherrima,
aumentos: x100.

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ENOLÓGICA•TAGS ACETIFICACIÓN, BACTERIAS ACÉTICAS, BACTERIAS
LÁCTICAS, DIVULGACIÓN, FERMENTACIÓN, FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA,
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LEVADURAS, MICROBIOLOGÍA, OENOCOCCUS OENI, SACCHAROMYCES
CEREVISIAE

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