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Iniciación
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo
condiciones estrictamente higiénicas, con el propósito de transferir un tejido que
crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza, dentro de
un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y
tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de
los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una
masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán
presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros
órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un
microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio
exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente
confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo, que pueda
entrar al mismo, crecerá de forma oportunista a una velocidad mucho más rápida
que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos
crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben
proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar
que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de
un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido.
Algunos tejidos cultivados son lentos en su crecimiento. Para ellos habría dos
opciones: (i) la optimización del medio de cultivo, (ii) El cultivo sano y creciendo
vigorosamente tejidos o variedades. Necrosis podría estropear los tejidos
cultivados. Generalmente, plantas variedades son diferentes en cultivo de tejidos
de necrosis. De este modo, mediante el cultivo de forma saludable y creciendo
vigorosamente variedades (o tejidos) se puede controlar.
Los tejidos también necesitarán de un suministro de los
elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal,
también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una
mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y
desarrollo de estos tejidos particulares.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es
necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la
de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de
los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más
que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.
Sistemas para los cultivos
En las últimas décadas se han desarrollado diferentes sistemas para los cultivos
de protoplastos, células, tejidos y órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo en
suspensión (suspensiones celulares), el cual constituye una forma para mantener
y propagar células vegetales.
Descripción y manipulación de las suspensiones celulares
Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares
distribuidos en un medio en movimiento. Estas suspensiones pueden ser
permanentes mediante el suministro continuo de nutrimentos.
Medios de cultivo
Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha
utilizado el medio MS desarrollado por Murashige y Skoog (1962) para el cultivo
de tejidos de tabaco, como también el medio B-5 de Gamborg et al. (1968).
También se han utilizado otros medios, pero su composición no difiere mucho de
los citados.
A menudo, los medios óptimos para la inducción y crecimiento de callos a partir de
explantes primarios no son los mismos que para el establecimiento de
suspensiones celulares; el nivel óptimo de auxinas y citocininas, p.ej. puede ser
diferente .
En ocasiones las células en suspensión necesitan de suplementos
orgánicos, aminoácidos, CH, extracto de levadura, y AC; la auxina más utilizada es
2,4-D.
Iniciación de las suspensiones
Las suspensiones celulares se inician generalmente mediante la incubación de
trozos de callos friables en medios líquidos que, están en movimiento continuo.
Comúnmente se emplean matraces Erlenmeyer, en los cuales se deposita el
medio líquido con los trozos de callo dispersos en él, hasta llenar
aproximadamente 1/5 de la capacidad de estos frascos; estos se ponen luego a
incubar en un agitador giratorio a 80-150 rpm, bajo luz continua y a 25 °C de
temperatura. Mediante subcultivos semanales, las suspensiones celulares quedan
establecidas después de varios días.
Durante los primeros subcultivos es recomendable usar una tasa de dilución baja
(por ej. 1:1 a 1:4) utilizando cuatro partes de medio fresco por cada parte de
suspensión celular. Posteriormente se puede utilizar una tasa de dilución más alta,
según el objetivo para el cual se haya establecido la suspensión.
Objetivos
El cultivo de tejidos vegetales es utilizado como herramienta fundamental en un
número importante de áreas y técnicas de la investigación y la producción vegetal,
todas ellas relacionadas con lo que actualmente se conoce como biotecnología
vegetal.
A continuación se enumeran algunas de las más importantes:
Embriogénesis somática.
Tipos de morfogénesis
En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar
embriones o bien, brotes, raíces y/o flores. La embriogénesis somática y la
organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in
vitro de especies vegetales.
La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura
similar a un embrión cigótico sin que medie la fertilización de las gametas,
mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores.
Estos órganos se obtienen a partir de una célula o de un grupo de células a través
de un complejo proceso denominado regeneración. La regeneración comprende
diferentes fases que se suceden de manera similar tanto para la organogénesis
como para la embriogénesis somática.
Estas fases se denominan: adquisición de la competencia, fase de inducción y
fase de realización. En la primera fase, las células no responden al estímulo
organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de
desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son
receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa con el tipo,
concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio
de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las
sucesivas divisiones para formar el órgano determinado.
A partir de la siembra in vitro de diferentes explantos relativamente grandes y en
condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos
órganos de manera directa, sin la formación de callo.
Si la formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si
en cambio, se induce la formación de embriones somáticos, este proceso se
denominará embriogénesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un
explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin
ninguna función predeterminada, se iniciará la producción de callos o
suspensiones celulares. La diferenciación de órganos a partir de callos,
denominada morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de
los meristemoides.