See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/28134532

Caracterización de un nuevo geminivirus asociado con los síntomas de moteado

amarillo de la okra (Abelmoschus esculentus) en México

Article · January 2004

Source: OAI

CITATIONS READS
5 85

4 authors:

Rodolfo De La Torre Almaráz Alejandro Monsalvo

Universidad Nacional Autónoma de México Universidad Nacional Autónoma de México
54 PUBLICATIONS 140 CITATIONS 16 PUBLICATIONS 58 CITATIONS

SEE PROFILE SEE PROFILE

Jesus Méndez-Lozano Rafael Francisco Rivera-Bustamante

Instituto Politécnico Nacional Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute
44 PUBLICATIONS 454 CITATIONS 140 PUBLICATIONS 2,894 CITATIONS

SEE PROFILE SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Molecular Biology Plant View project

Quercus View project

All content following this page was uploaded by Rafael Francisco Rivera-Bustamante on 31 May 2014.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO GEMINIVIRUS
ASOCIADO CON LOS SÍNTOMAS DE MOTEADO AMARILLO
DE LA OKRA (Abelmoschus esculentus) EN MÉXICO

CHARACTERIZATION OF A NEW GEMINIVIRUS ASSOCIATED WITH

OKRA (Abelmoschus esculentus ) YELLOW MOTTLE SYMPTOMS IN
MÉXICO

Rodolfo De La Torre-Almaráz1, Alejandro C. Monsalvo-Reyes1, Jesús Méndez-Lozano2 y Rafael F. Rivera-Bustamente3

1
Unidad de Biotecnología y Prototipos. ENEP-Iztacala.UNAM. México, D. F. Apartado Postal
54090. (drodolfo@servidor.unam.mx). 2CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa. Apartado Postal 280, Guasave,
Sinaloa.
3
CINVESTAV-IPN-IRAPUATO. Km 9.5 Carr. Irapuato-León. Guanajuato.
 R A
E B
S S
U T
M R
E A
N C
T
En 2000 y 2001, en campos
de producción de okra During 2000 and 2001, in
(Abelmoschus esculentus okra (Abelmoschus
(L.) Moench) en los Estados esculentus L. Moench)
de Guerrero y Morelos, se production units in the
observó una enfermedad States of Guerrero and
que causa un rayado Morelos, México, a disease
amarillo y distor- sión was detected which causes
severa del fruto, moteado y yellow streaking and severe
mosaico amarillo brillante, distortion of the fruit,
dis- torsión y reducción del bright yellow mottle and
tamaño de hojas. En mosaic, distortion and
algunas ocasiones y en reduction of leaf size. On
pocas plantas de okra con
certain occasions, in a few
síntomas, se logró
symptomatic okra plants, it
identificar va- riantes de los
was possible to identify
virus AMV, TBSV, INSV y
variants of the viruses
a un potyvirus descono-
AMV, TBSV, INSV and an transmitted by grafting. The grafting of Datura stramonium
cido, enfermas,
okra por transmisión
causó rayado y moteado amarillo en plantas de
unknown potyvirus, by and
mecánica
okra en
sanas sugiriendo plantas
la presencia de un virus de ADN. El análi-
means of mechanical Capsicum annum
inoculated by meansplant segments, with
of biobalistics which hadfrom
DNA beendiseased
previously
indicadoras
sis de hibridacióny tipo diferen-
Dot blot, usando una sonda general (gen
de transmission to indicator okra
plants, caused yellow streak and mottling in healthy okra plants,
ciales,
la así como
proteína de la por ensayos
cápside del Pepper huasteco virus) y el ensayo de
serológicos ELISA. Sin and differential plants, as suggesting the presence of a DNA virus. Results from a Dot blot
PCR (utilizando oligonucleótidos degenerados para amplificar el
embargo, nin- guno well as through ELISA
gen de la proteína dede
la ellos
cápside), confirmaron la presencia de un hybridization analysis using a general probe (protein gene of
causó síntomas visibles en serological assays.
geminivirus en todas las plantas de okra con los síntomas de mo- the Pepper huasteco virus capsid), and the PCR-based assay
plantasamarillo
teado de okra However, none of
sanas en de campo y de las injertadas
procedentes the above
en el (using degenerated oligonucleotides to amplify the protein gene
pruebas deUntransmisión
invernadero. caused visible symptoms
fragmento de ADN viral de 632 bp, obtenido inde
of the capsid) confirmed the presence of a geminivirus in all of
mecánica,
los ensayossugiriendo
de la PCR, que fue clonado y secuenciado (Númeroinde
healthy okra plants
the okra plants presenting symptoms of yellow mottle from the
estos virus
acceso de ARN
AF349113). El no son de lamechanical
análisis transmission
secuencia sugiere que este vi- field and those which had been grafted in the greenhouse. A
responsables
rus de
es un nuevo begomovirus tests, which suggests
la que muestra relaciones that
fragment of 632bp viral DNA, obtained from the PCR assays,
sintomatología
filogenéticas con elobservada
Squash leaf curl these
virusRNA viruses
y el Sida are not
golden was cloned and sequenced (Access No. AF349113). The
en cam-
mosaic
giere po. Se
elvirus.
nombre Elsu-
injerto
de Okra de responsible
yellow mottle virus (OYMV)for parathe
este sequence
analysis suggests that this virus is a new begomovirus showing
plantas de okra enfermas a
patógeno. symptoms observed in the
phylogenetic relationship to the Squash leaf curl virus and Sida
plantas sanas, causó field. When healthy okra
golden mosaic virus. The name Okra yellow mottle virus
síntomas clave:
Palabras de rayado
Angú, envirus
frutoADN. plants were graft- (OYMV)
y moteado foliar, inoculated with scions from is proposed for this pathogen.
confirmando
Recibido: la pre-2002.
Diciembre, senciaAprobado: Diciembre, 2003.
symptomatic okra plants,
Publicado
de un agentecomo ARTÍCULO
patogénico no en Agrociencia 38: 227-238. 2004. Key words: Angú, DNA virus.
symptoms of streaking in
transmisible de manera the fruit and foliar mottling
mecá- nica pero sí por were observed, which 227
injerto. El injerto de
confirms the presence of a
segmentos de plantas de
pathogenic agent that is
Datura stramonium y
not transmissible by
Capsicum annuum
mechanical means, but
previamente inoculadas por
which is
biobalística, utilizando
ADN total procedente de
plantas de
228 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
2004
 DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 229
OKRA I Morelos hay una M I
N tendencia similar. La A N
T disminución del T T
R E R
O rendimiento de la okra R O
D puede ser causada por I D
U enferme- dades, entre A U
C L C
C
las que destaca una que T
E
I causa moteado y S I
Ó mosaico foliar de color O
N N
amarillo intenso (Figura Y
1A), que luego causa
kra, angú, or
deformación y
Malvaceae), es reducción severa de la
M gumbo
un cultivo de É (Abelmeschus
lámina foliar (Figura T
origen africano, esculentus.
1B). O
in- troducido en D Malvaceae), is a
Los frutos de las
México O crop of African
plantas enfermas
probablemente a S origin, probably

O
presentan rayas o
mediados introduced into
bandas alargadas de
de la década de 1970 S México in the
color amarillo, e
desde los Estados mid 1970s from
deformación y p
Unidos. Su culti- vo se a the United States. It was
enrollamiento, así como
inició en Iguala, r first cultivated in Iguala,
pequeñas a
Guerrero, y después se Guerrero, and later in
protuberancias o gra- c
extendió a Baja i Baja California Sur,
nos en la epidermis
California Sur, Jalisco, ó Jalisco, Michoacán
(Figura 1C). Esta n
Michoacán, Morelos Morelos, Tamaulipas
enfermedad ade- más
Tamaulipas y Yucatán. and Yucatán. The total
de afectar el d
La superficie total cultivated area is nearly
rendimiento, reduce la e
cultivada es cercana a 15 000 ha of both
calidad de fru- tos, que
15 000 ha, de temporal rainfed and irrigated
son desechados si v
y riego, con un rendi- i land, with an average
presentan un exceso de
miento promedio de r fruit yield of 6.0 t ha−1.
cual- quiera de los u
fruto de 6.0 t ha−1. Los The main producer
síntomas descritos, s
principales Estados States, in both area and
particularmente del
productores por production, are
rayado amarillo, aún T
superficie y por r Tamaulipas, Guerrero,
teniendo el tamaño
producción son a and Morelos. The
Tamaulipas, Guerrero y comercial apropiado. n produce is exported to
Morelos. El fruto de Por el tipo de s
m
the United States and
okra se ex- porta a los síntomas observados en France. The total
i
Estados Unidos y las plantas de okra, s cultivated area and
Francia. La superficie cultivadas en Morelos y i average yield in
Guerrero, a esta ó
total sembrada y el n Guerrero is 261 ha and
rendimiento promedio enferme- dad se le
6.0 t ha−1, and in
es 216 ha y 6.0 t ha−1 en denomina moteado Morelos, 252 ha with
m
Guerrero, y 252 ha con amarillo de la okra. Es e 12.4 t ha−1. In both
pro- bable que los c
12.4 ton ha−1 en á States, the harvested
Morelos. En ambas síntomas observados en
n area is doubled or
entidades la superficie okra, en el campo, sean i tripled, because of
cosechada de okra se de naturaleza viral por c rainfed and irrigated
agentes aún no a
duplica o triplica, por production (DGEA,
las siembras de caracteriza- dos en SARH, 1990).
México. Por tanto, el Porciones de hojas, tallos,
temporal y riego In Guerrero, okra
objetivo del presente raíces y flores de plantas de
(DGEA. SARH, 1990). production and
trabajo fue determinar la okra con síntomas del
La producción y cultivated area have
etiología de la moteado amarillo, fueron
superficie cultivada de decreased to the point
enfermedad del motea- maceradas en solución
okra ha dis- minuido en that several packing
Guerrero, al extremo de do amarillo de la okra plants have closed due
que varias empacadoras que se cultiva en los to lack of production,
han cerrado por falta de Estados de Guerrero y and in Morelos there is
producción, y en Morelos. a similar tendency. The
 230
decrease in okra yield AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO
(three 2,toMARZO-ABRIL
four true leaves)
2004 of the following
may be due to diseases, A
an outstanding example N
D
of which causes an
intense yellow mottle
and mosaic on leaves M
(Figure E
T
1A), and later causes H
deformation and severe O
reduction of the leaf D
lamina (Figure 1B). S
The fruit of the
diseased plants present S
e
yellow streaks or long p
yellow bands, a
deformation and curling, r
a
in addition to small t
protuberances or i
granulation in the o
n
epidermis (Figure 1C).
Besides affecting yield,
o
this disease reduces the f
quality of the fruit,
which is rejected when t
it presents an excess of h
any of the described e
symptoms, especially
v
the yellow streak, even i
when it has reached the r
appropriate commercial u
s
size.
Because of the type
M
of symptoms observed e
on okra plants c
cultivated in the States h
of Morelos and a
n
Guerrero, the disease i
was named okra yellow c
mottle virus. It is likely a
l
that the symptoms
observed on okra in the
t
field are of a viral r
nature caused by agents a
that have not yet been n
s
characterized in m
México. Therefore, the i
objective of this study s
s
was to determine the i
etiology of the yellow o
mottle disease in okra n
cultivated in the States
of Guerrero and Portions of leaves,
Morelos. stems, roots and flowers of
okra plants with yellow
M mottle symptoms were
A macerated in a buffer
T solution of phosphates 0.02
E M pH 7.0-DIECA (1g 10−1
R
I mL). The macerate of each
A portion of affected plant was
L used independently to rub
S onto leaves of seedlings
 DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 231
OKRA

A B C

Figura 1. Síntomas virales en plantas de okra en parcelas comerciales de los Estados de Guerrero y Morelos. A) Síntomas de moteado
amarillo en plántulas; B) síntomas de moteado amarillo, reducción y deformación de hojas de plantas maduras; C) rayado
amarillo y deformación de frutos.
Figure 1. Viral symptoms in okra plants at commercial plots of the States of Guerrero and Morelos. A) Symptoms of yellow mottle
in seedlings; B) symptoms of yellow mottle, reduction and deformation of leaves of mature plants; C) yellow streaking and
deformation of fruits.
232
amortiguadora de fosfatos AGROCIENCIA VOLUMENen
de okra, recolectadas 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
indicator species: symptoms appeared. The
2004
0.02 M pH 7.0-DIECA (1g 10 campo, y con síntomas del Gomphrena globosa, grafted plants with viral
mL−1). El macerado de cada moteado amarillo. El injerto se Chenopodium symptoms were later used to
porción de planta afectada fue fijó al portainjerto con cinta amaranticolor, C. quinoa, graft onto healthy okra plants
utilizado en forma parafilm, las plantas se Beta vulgaris, Cucumis produced in a greenhouse
independiente para frotar hojas cubrieron con bolsas de sativus, C. melo, Cucurbita (Dijkstra and De Jager, 1998).
de plántulas (tres a cuatro plástico por pepo var. Gray Zucchini,
hojas verda- deras) de las 10 d y se mantuvieron en Pisum sativum var. Sta E
siguientes especies invernadero (25 a 30 oC) hasta Elena, Vigna unguiculata L
I
indicadoras: Gomphrena la aparición de síntomas. Las var. Blackeye, V. S
globosa, Chenopodium plantas injertadas con unguiculata subsp. A
amaranticolor, C. quinoa, síntomas de origen viral fue- sisquepedalis, Phaseolus
Beta vulgaris, Cucumis ron utilizadas para injertar vulgaris var. Madero, Datura s
sativus, C. melo, Cucurbita posteriormente plantas de okra stramonium, Nicotiana e
r
pepo var. Gray Zucchini, sanas pro- ducidas en glutinosa, N. rustica, N. o
Pisum sativum var. Sta Elena, invernadero (Dijkstra y De tabacum var. xanthi, N. l
Vigna unguiculata var. Jager, 1998). benthaminana, Lycopersicon o
g
Blackeye, V. unguiculata esculentum var. Royal Ace,
i
subsp. sisquepedalis, E Capsicum annuum var. c
Phaseolus vulgaris var. n Ancho, and Abelmoschus a
s l
Madero, Datura stramonium, a esculentus. The plants were
Nicotiana glutinosa, N. y kept in a greenhouse (25 to
o a
rustica, N. tabacum var. 30 oC) until symptoms
s
xanthi, N. benthaminana, appeared (Dijkstra and De s
Lycopersicon esculentum var. s Jager, 1998). a
e y
Royal Ace, Capsicum r
annuum var. Ancho y o T
Abelmoschus esculentus. Las l r Okra leaves and flowers
ó a with yellow mottle symptoms
plantas se mantu- vieron en n
g collected in the field were
invernadero (25 a 30 oC) hasta i s
c m analyzed with the double
la aparición de síntomas
o i sandwich enzyme-linked
(Dijkstra y De Jager, 1998).
s serological assay (DAS-
s
E ELISA) on two days for the
T i
L detection of different types of
r o
I
a n RNA virus. The indicator and
S
n A differential plants used in the
s b
m separation of the virus in a
y
i Hojas y flores de okra greenhouse that exhibited
s recolectadas en campo con los some symptom of likely viral
i g
ó síntomas de moteado amarillo r origin, were also analyzed by
n fueron analizadas con el a ELISA. Commercial
ensayo serológico ligado a f polyclonal antiserums were
t
p enzimas en doble sandwich i used to detect the Tomato
o (DAS-ELISA) en dos días, n spotted wilt virus (TSWV),
r g
para la detec- ción de Impatiens necrotic spotted
diferentes tipos de virus de virus (INSV), Alfalfa mosaic
i
ARN. Las plantas indicadoras Tomato, chili, D. virus (AMV), Cucumber
n
j y diferenciales utilizadas en la stramonium and okra plants mosaic virus (CMV), Tobacco
e separación de virus en 20 cm tall with five to six true mosaic virus (TMV), Tobacco
r leaves (five plants per species,
t invernadero, que manifestaron ringspot virus (TRSV),
o algún síntoma de probable all produced from seed in a Tobacco streak
origen viral también fueron greenhouse) were grafted
Plantas de tomate, chile, laterally with scions from
D. stramonium y okra con okra plants with yellow mottle
cinco a seis hojas verdaderas symptoms collected in the
y 20 cm de altura (cinco field. The graft was attached
plantas por especie, todas to the rootstock with parafilm
producidas por semilla en tape, the plants were covered
invernadero), fueron with plastic bags for 10 d and
injertadas lateralmen- te con kept under greenhouse
púas procedentes de plantas conditions (25 to 30 oC) until
DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 233
OKRA
234
analizadas por ELISA. Se AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO o 2, MARZO-ABRIL virus (TSV), Tomato bushy
2004 r
utilizaron antisueros A stunt virus (TBSV), and
policlonales comer- ciales D Tobacco etch virus (TEV).
N b
para la detección de los virus i The antiserums and
de la marchitez manchada del o procedures were acquired
v b
tomate (Tomato spotted wilt from Agdia Co. (USA).
i a
virus, TSWV), de la mancha r Absorbance of the possible
l
necrótica del Impatiens a í antigen antibody reactions
l s
(Impatiens necrotic spotted were recorded in a
t
virus, INSV), del mosaico de Microlector with a 492 nm
Dado que los síntomas de i
la alfalfa (Alfalfa mosaic c filter, at 20 and 60 min after
origen viral pueden ser a
virus, AMV), del mosaico del the addition of the substrate.
causados por geminivirus,
pepino (Cucumber mosaic The reaction was considered
virus cuyo genoma está
virus, CMV), del mosaico del Plántulas con dos a cuatro positive if absorbance was
constituido de ADN, se hojas verdaderas de chile,
tabaco (Tobacco mosaic virus, equal to or above the reading
realizó la extracción de ADN
TMV), de la mancha anular tomate, N. rustica, N. of the positive controls for
total de 1g de hojas de las tabacum var. xanthi, N.
del tabaco (Tobacco ringspot each virus included in the
muestras de okra recolectadas
virus, TRSV), del estriado del glutinosa y N. benthamiana, serological detection
en campo, así como de así como C. quinoa, C.
tabaco (Tobacco streak virus, equipment (Clark and Adams,
plantas sanas de okra
TSV), del enanismo arbustivo amaranticolor fueron 1977).
cultivadas a partir de semilla inoculadas por biobalística
del tomate (Tomato bushy
en invernadero y que se
stunt virus, TBSV) y del usando micropartículas de V
utilizaron como testigos tungsteno (50 µL), mezcladas i
jaspeado del tabaco (Tobacco
negativos (Dellaporta et al., r
etch virus, TEV). Los con 5 µL de ADN viral (1 µL
1983). Veinte microlitros del a
antisueros y procedimientos L−1) que se obtuvo de las l
extracto de ADN fueron
de uso fueron adquiridos en plantas indicadoras inocula-
fraccionados por
Agdia Co. (EE.UU.) La das por transmisión mecánica D
electroforesis en geles de N
absorbencia de las posibles y por injerto en el
agarosa (1.0 %), conducida en A
reacciones antígeno invernadero, pero sólo de las
solución amortiguadora TBE
anticuerpo fueron re- gistradas que se confirmó por
1x (0.089 M Tris-base, 0.082 e
en un Microlector con filtro de hibridación tipo Dot-blot x
M ácido bórico, 0.002 M t
492 nm, 20 y 60 min después (descrita más ade- lante) que
EDTA pH 8.0), a 100 V, por r
de la adición del sustrato. La estaban infectadas con
1 h. En la electroforesis, a
reacción fue considerada geminivirus. Las partículas de c
además del ADN extraído de
positiva si la absorbencia era tungs- teno impregnadas con t
plantas de okra enfermas, se i
igual ó superior a la lectura de ADN viral fueron proyectadas
incluyó ADN total de plantas o
los testigos positivos para hacia la parte su- perior de las
infectadas con el virus n
cada virus, incluidos en el plántulas con presión de helio
huasteco del chile PHV
equipo de detección a 800 o 1200 psi usando un a
(Pepper huasteco virus.
serológica (Clark y Adams, acelerador Du Pont (PDS- n
Familia Geminiviridae, d
1977). 1000). Las hojas de las plantas
Género Begomoviridae) como
bombardea- das fueron
testigo positivo, ADN A del a
E lavadas brevemente con agua
x PHV (monómero), n
destilada para retirar el exce- a
t linearizado con la enzima so de desechos del bombardeo. l
r Hind III, y como referencia
a El ensayo de transmisión por y
c ADN total de plantas sanas y s
biobalística se realizó por i
c el marcador de peso
triplicado. Las plantas s
i molecular 1 kb (Sambrook et
ó bombardeadas fueron
n al., 1989; Torres-Pacheco et
mantenidas en laboratorio por Given that symptoms of
al., 1996). 12 h, después transferidas a viral origin can be caused by
y una cámara bioclimática geminivirus, whose genome is
T
constituted of DNA, total
a r
a DNA was extracted from
n
á n 1 g of leaves of okra samples
l s
collected in the field, as well
i m
i as from healthy okra plants
s
i s grown from seed in the
s i greenhouse, which were used
ó
n as negative controls
d (Dellaporta et al., 1983).
e Twenty microliters of the
p
DNA extract DE LAfractioned
were TORRE-ALMARÁZ et al.: UN
confirmed NUEVO
to be GEMINIVIRUS
infected by ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 235
OKRA
by electrophoresis in agar gels geminivirus by Dot-blot type
(1.0%), conducted in a TBE hybridization (described
buffer solution 1x (0.089 M below). The tungsten particles
Tris-base, impregnated with viral DNA
0.082 M boric acid, 0.002 M were projected onto the upper
EDTA pH 8.0), at 100 V for 1 part of the seedlings with
h. In the electrophoresis, in helium pressure at 800 or
addition to the DNA extracted 1200 psi using a Du Pont
from diseased okra plants, accelerator (PDS-1000). The
total DNA of plants infected leaves of the bombarded
by the Pepper huasteco virus, plants were washed briefly
family Geminiviridae, genus with distilled water to remove
Begomoviridae (PHV), was the excess of residues from the
included as a positive control, bombardment. The assay of
DNA A from PHV transmission by biobalistics
(monomer), linealized with was performed in triplicate.
the enzyme Hind III, and as a The bombarded plants were
reference total DNA from kept in laboratory conditions
healthy plants and the for 12 h and later transferred
molecular weight marker 1 kb to a bioclimatic chamber with
(Sambrook et al., 1989; white light and a uniform
Torres- Pacheco et al., 1996). temperature of 25 oC until
symptoms appeared. The
T plants were transferred to the
r greenhouse (25 to 30 oC)
a
where they were kept for the
n
s mechanical transmissions and
m grafting tests (Garzon et al.,
i
1993).
s
s Leaves of chili plants
i bombarded with DNA
o obtained from okra plants
n
with yellow mottle symptoms
and exhibiting some
b
y symptom of probable viral
origin were used for
b mechanical transmission in
i okra seedlings with two to
o
four true leaves and
b
a transmission by grafting on
l 20-cm tall okra plants, as
i described above, until
s
t symptoms appeared.
i
c
s

Chili, tomato, N. rustica,

N. tabacum var. xanthi, N.
glutinosa and N. benthamiana,
as well as C. quinoa, C.
amaranticolor seedlings, with
two to four true leaves, were
inoculated by biobalistics
using microparticles of
tungsten (50 µL), mixed with
5 µL of viral DNA (1 µL L−1)
obtained from the indicator
plants inoculated by
mechanical transmission and
by grafting in the greenhouse,
but only from those that were
236 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
2004
 DE LA
con luz blanca TORRE-ALMARÁZ
y temperatura et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS(Amplitaq
Science). ASOCIADO AL MOTEADO
ADN polimerasa AMARILLO
M DE 237
OKRA Perkin-Elmer), y 1 µL (100 o
de 25 oC continua, hasta la Para el ensayo Dot-blot,
ng) de las muestras de okra l
aparición de síntomas. Las el ADN de las muestras fue e
plantas se transfirieron al transferido directamente a sospechosas de estar c
invernadero (25 a 30 oC), don- membranas de Nylon Hybond infectadas con geminivirus, de u
muestras de malezas que l
de se conservaron para realizar (+), aunque también fue
a
ensayos de transmisión fraccionado por electroforesis crecen junto a la okra y de
r
mecánica y por injerto en geles de agarosa y aquellas que se utilizaron
(Garzón et al., 1993). posteriormente transferido por como testigos negativos y h
Hojas de plantas de chile capilaridad a una membrana positivos. La mezcla de y
reacción fue incubada en un b
bombardeadas con el ADN de Nylon Hybond (+). Las
r
obtenido de plantas de okra membranas fueron termociclador Perkin Elmer i
con síntomas de moteado prehibridadas e hibridadas a para 35 ciclos de reac- ción. d
Cada ciclo consistió en la i
amarillo, y que manifesta- ron 65 oC, en condi- ciones de alta
o z
algún síntoma de probable astringencia, usando en su incubación por 1 min a 94 C,
a
origen viral, fueron utilizadas oportunidad la sonda respec- 1 min a t
para la transmisión mecánica tiva. Las autoradiografias i
o
en plántulas de okra con dos a fueron preparadas colocando n
cuatro hojas ver- daderas, y las membra- nas hibridadas en
transmisión por injerto en casetes para exposición To detect the presence of
plantas de okra de 20 cm de utilizando película Kodak X- geminivirus in the samples
alto, como se describió Omat. Durante la exposición collected in the field, as well
previamente, hasta la la película y membrana fueron as in plant material
aparición de síntomas. alma- cenadas a temperatura mechanically inoculated with
ambiente por 2 h (Surzycki, biobalistics or grafting,
H 1999; Sambrook et al., 1989). initially a Dot-blot type
i
b molecular hybridization was
r Amplificación de ADN viral performed, and later one of
i por reacción en cadena de la the Southern type, to precisely
d polimerasa (PCR) determine the molecular size
a
c of the virus involved. As a
i La prueba de la PCR se primer, a fragment of the
ó realizó únicamente con el cloned gene of the protein
n ADN de las muestras de okra capsid of the PHV was used.
que mostraron síntomas del The primer was marked with
m
moteado amarillo y que the “Genes images random
o
l estaban infectadas por primer labeling” kit
e geminivirus según los ensayos (Amersham Life Science).
c
de hibridación tipo Dot-blot. For the Dot-blot assay,
u
l La amplificación del DNA from the samples was
a ADN viral por la PCR se directly transferred to Nylon
r hizo con los oligonucleótidos Hybond (+) membranes,
MOT/CP, que amplifican un although it was also
Para detectar la presencia segmento de 650 pb del fractionated by
de geminivirus en las componente A de geminivirus electrophoresis in agarosa
muestras recolec- tadas en y que incluye la región común gel and later transferred by
campo, así como en el (RC) y parte del gen de la capilarity to Nylon Hybond
material vegetativo inoculado proteína de la cápside (CP) (+) membrane. The
mecáni- camente, por injerto o (Ascencio-Ibañez et al., membranes were
por biobalística, se realizó una 2 prehybridized and hybridized
hibridación molecular tipo 0
0 at 65 oC, under conditions of
Dot-blot y después una del
2 high astringency, with the
tipo Southern para precisar el
) timely use of the respective
tamaño molecular del virus .
primer. The auto- radiographs
involucrado. Como sonda se La mezcla final de
were prepared by placing the
utilizó el fragmento del gen reacción de la PCR (50
µL volumen total) hybridized membranes in
clonado de la proteína de la
tenía 2.5 mM MgCl , buffer de cassettes for exposure, using
cápside del virus huasteco del 2
reacción 1x, 200 µM mezcla Kodak X-Omat film. During
chile (PHV). La sonda fue
de dNTP’s, exposure, the film and
marcada con el kit “Genes 0.2 µM de cada membrane were stored at
Images random prime oligonucleótido, 2.5 unidades room temperature for 2 h
labelling” (Amersham Life de Taq ADN polimerasa (Surzycki, 1999; Sambrook
et238
al., 1989). AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
2004
s
Amplificiation of viral DNA e
by polymerase (PCR) chain q
reaction u
e
n
The PCR test was c
performed only with DNA i
from the okra samples that n
g
exhibited symptoms of yellow
mottle and, in the dot-blot
The product of
hybridization tests, were
amplification was separated
shown to be infected by
from the agar matrix
geminivirus.
(GenClean) and cloned in E.
For amplification of the
coli strain DH5a, using the
viral DNA by PCR, MOT/CP
vector pCR TOPOII
oligonucleotides were used.
(Invitrogen) (Sambrook et al.,
These amplify a 650 pb
1989). The cloned products
segment of the A component
were analyzed in a
of geminivirus and include a
sequencer, Applied
common region (CR) and
Biosystem Genetic Analyzer
part of the capsid protein
377. The nucleotide sequence
gene (CP) (Ascencio-Ibañez
was compared for
et al., 2002).
identification with sequences
The final PCR reaction
available in the GenBank
mixture (50 µL total volume)
database using the Clustal
consisted of 2.5 mM MgCl2,
method (MegAlign, DNA
1x reaction buffer, 200 µM Star software, Madison, WI)
mixture of dNTP’s, (Sanger et al., 1977).
0.2 µM of each
oligonucleotide, 2.5 units of
Taq DNA polymerase
(Amplitaq DNA polymerase
Perkin-Elmer), and 1 µL
(100 ng) of the okra samples
suspected of being infected
by geminivirus, of samples of
weeds that grow near the
okra, and of those that were
used as negative and
positive controls. The
reaction mixture was
incubated in a Perkin Elmer
thermocycler for 35 cycles of
reaction. Each cycle
comprised incubation for 1
min at 94 oC, 1 min at 56 oC
and 1 min at 72 oC for 35
cycles. The amplified
products were analyzed
directly by electrophoresis
in 1.4% agar gels (Mehta et
al., 1994).

C
l
o
n
i
n
g

a
n
d
DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 239
OKRA
240o AGROCIENCIASVOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
separar de hojas, tallos o
56 C y 1 min a 72 oC por 35 2004 C
R
ciclos. Los productos U
raíz, recolectadas en E
amplificados fue- ron S cam- po (Van Vloten, S
U
analizados directamente por I 1981).
Ó L
electroforesis en geles de Otro virus que se T
N
agarosa a separó de flor y follaje S
1.4% (Mehta et al., 1994). S fue el virus de la
mancha necrótica del A
e N
C p Impatiens (INSV), D
l a cuyos da- ños más
o significativos fueron la
n r D
a a aparición de un mosaico I
c c y moteado suave, S
i i después patrones C
ó U
n ó perineales, primero
S
n cloróticos y al final S
y necróticos, en las hojas I
inoculadas de D. O
d N
s e stramonium, C. annuum
e y N. rustica (Figura
c S
v 2B). La necrosis de las
u e
e i hojas pronto se p
n r generalizó hasta causar a
c u la muerte de la planta.
i r
a s El INSV tampoco a
c indujo síntomas por t
i Transmisión mecánica transmisión mecánica en
ó
i
n
plantas de okra en el o
Los casos donde se inver- nadero (Brunt, n
El producto de separó algún virus por 1995).
amplificación fue separado de transmi- sión mecánica, Un tercer virus o
la matriz de agarosa se caracterizaron detectado fue el del f
(GenClean) y clonado en E. considerando los sínto- enanismo arbus- tivo
coli cepa DH5a utilizando el mas obtenidos por del tomate (TBSV), el t
vector pCR TOPOII inoculación mecánica en cual fue propagado a h
(Invitrogen) (Sambrook et al., plantas indicadoras y partir de hojas y raíces e
1989). Los productos clonados después en plantas de plantas de okra.
fueron analizados en un diferenciales (algunas se TBSV causó lesio- nes v
secuenciador Applied incluyen en las figuras locales necróticas, i
Biosystem Genetic Analizer respectivas). Además, se manchas irregulares de r
377. La secuencia nucleotídica confirmó su identidad color blan- quecino y u
fue comparada para su mediante ensayos deformación severa de s
identifi- cación con secuencias serológicos tipo ELISA. hojas en Datura
disponibles en la base de datos Se separó e stramonium; lesiones Mechanical
del GenBank, utilizando el identificó al virus locales necróticas y transmission
método Clustal (MegAlign, mosaico de la alfalfa deformación de hojas en
DNA Star software, Madison, (AMV), que causó chile; y pequeñas The cases in which a
WI) (Sanger et al., 1977). lesiones locales lesiones locales virus was separated by
necróticas y mosaico en necróticas en forma de mechanical transmission
R Gomphrena globosa y anillo, hiponastia y were characterized
E C. amaranticolor con deformación en hojas considering the
S mosaico sistémico; symptoms obtained by
U
L
además de lesiones mechanical inoculation
T locales cloróticas en in indicator plants and
A Vigna sinnensis (Figura later in differential
D 2A). En plantas de okra plants (some are
O
S no se observó ningún included in the
tipo aparente de respective Figures).
Y síntomas. Este virus se Also, their identity was
separó fácilmente de los confirmed with ELISA-
D pétalos frescos de la type serological assays.
I okra, pero no se logró The alfalfa mosaic
virus DE LA TORRE-ALMARÁZ
(AMV) was et al.:
small UN NUEVO
localized GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE
necrotic 241
OKRA
separated and ring-shaped lesions,
identified; this virus hyponasty, and
caused localized deformation of leaves in
necrotic lesions and tomato (Figure 2C).
mosaic in Gomphrena This virus did not cause
globosa and C. any type of symptom in
amaranticolor, with okra plants inoculated in
systemic mosaic as well the greenhouse
as local chlorotic (Martelli, 1990).
lesions in Vigna Finally, a fourth
sinensis (Figure 2A). In virus was separated by
okra plants, no apparent mechanical
type of symptoms was transmission. This virus
observed. This virus caused small necrotic
was easily separated semi- circular spots,
from fresh okra petals, mosaic, and leaf
but it could not be deformation in N.
separated from leaves, tabacum var. Xanthi. In
stems or roots collected D. stramonium, it
in the field (Van caused severe
Vloten, 1981). deformation of leaves,
Another virus that yellow chlorotic mottle,
was separated from and multiple small pale
flower and foliage was yellow spots (Figure
the Impatiens necrotic 3A). In N. benthamiana
spot virus (INSV). The plants, the virus
most significant damage caused a light yellow
this virus caused was mosaic, severe
the appearance of a soft deformation and
mosaic and mottle; later reduction in size of the
oak-leaf patterns rest of the inoculated
appeared, first chlorotic leaves (Figure 3B). The
and finally necrotic, on characteristics of the
inoculated D. induced symptoms in
stramonium, C. annuum inoculated hosts,
and N. rustica leaves principally D.
(Figure 2B). The leaves stramonium and N.
necrosis soon benthamiana, indicate
generalized until that these plants were
causing death of the infected by at least one
plant. However, INSV potyvirus, similar to
transmitted mechanically the Tobacco etch
did not induce virus (TEV).
symptoms in okra plants
in the greenhouse
(Brunt, 1995).
A third virus
detected was the
Tomato bushy stunt
virus (TBSV), which
was propagated from
leaves and roots of okra
plants. TBSV caused
localized necrotic
lesions, irregular
whitish spots and severe
deformation in Datura
stramonium leaves,
localized necrotic
lesions and deformation
of leaves in chili, and
242 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
2004

A B C

Figura 2. Síntomas inducidos por virus separados de okra por transmisión mecánica en plantas diferenciales: A) Lesiones locales
cloróticas por virus mosaico de la alfalfa (AMV) en Vigna unguiculata; B) mosaico por virus de la mancha necrotica del
Impatiens (INSV) en N. rustica; C) anillos necróticos por virus enanismo arbustivo del tomate (TBSV) en tomate, en
invernadero.
Figure 2. Symptomps induced by virus separated from okra by mechanical transmission in differential plants: A) Localized chlorotic
lessions by Alfalfa mosaic virus (AMV) in Vigna unguiculata; B) mosaic by Impatiens necrotic spotted virus (INSV) in N.
rustica; C) necrotic rings by Tomato bushy stunt virus (TBSV) in tomato, in the greenhouse.
de tomateDE
OKRA
LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE
(Figura 2C). r However, this virus did and leaf deformation. 243

Este virus no causó a not cause symptoms in Therefore, the

ningún sín- toma en n okra plants inoculated symptoms associated
plantas de okra s mechanically (Purcifull, with the disease of okra
inoculadas en m 1981). yellow mottle were
invernadero (Martelli, i Summarizing, none reproduced only by
1990). s of the RNA viruses grafting on healthy
Finalmente, se i separated by mechanical greenhouse okra plants.
separó, por transmisión ó transmission from The ELISA serological
mecánica, un cuarto n indicator and assays did not indicate
virus que causó differential plants, were infection by an RNA-
pequeñas manchas p able to reproduce the type virus.
semicirculares o symptoms observed in
necróticas, mosaico y r okra plants in the field. E
deformación foliar en L
N. tabacum var. Xanthi. i T I
En D. Stramonium este n r S
virus causó deforma- j a A
ción severa de hojas, e n
moteado clorótico r s s
t m e
amarillo y múlti- ples
o i r
manchas pequeñas
amarillas pálidas (Figura s o
El injerto de ramas s l
3A). En plantas de N.
con hojas de okra i o
benthamiana este virus
recolectadas en campo o g
causó un mosaico
causó moteado y n i
amarillo claro,
mosaico amarillo, con c
deformación severa y
ligera deformación y b a
reducción del ta- maño
reducción de la lámina y l
del resto de las hojas
foliar, en plantas de okra
inoculadas (Figura 3B).
producidas por semilla g a
Las características de
en el invernadero r s
los síntomas inducidos
(Figura a s
en los hospedantes
4A). El injerto de ramas f a
inoculados,
de okra enfermas causó t y
principalmente en D.
amarillamiento y i s
stramonium y N.
deformación ligera de n
benthamiana, indican
hojas en tomate, g With ELISA, direct
que estas plantas
mientras en chile se detection of virus in
estaban in- fectadas por
observaron síntomas de Grafting scions with field okra plants with
al menos un potyvirus,
mosaico, moteado, leaves of okra collected yellow mottle symptoms
semejante al virus
deformación severa de in the field caused was negative in all of
jaspeado del tabaco
hojas y enanismo; en D. yellow mottle and the cases. Therefore,
(Tobacco etch virus,
mosaic, with slight leaf with this technique it
TEV). Sin em- bargo,
deformation and was not possible to
este virus no causó
reduction of the leaf identify any known
síntomas en plantas de
lamina, in okra plants virus related to the
okra por inoculación
produced from seed in symptoms observed in
mecánica (Purcifull,
the greenhouse (Figure the okra plants from the
1981).
4A). Grafting scions of field or in material
En resumen,
diseased okra caused obtained by grafting in
ninguno de los virus de
yellowing and slight the greenhouse.
ARN separados por
deformation in tomato However, in the few
transmisión mecánica en
leaves, while in chili, cases in which
plantas indicadoras y
symptoms of mosaic, separation of a virus
dife- renciales, fue
mottle, severe from okra plants was
capaz de reproducir los
deformation of leaves, achieved by mechanical
síntomas observa- das
and stunting were transmission to host
en plantas de okra en el
observed. In D.
campo.
stramonium, it caused
mosaic, yellow mottle
T
244 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
2004
 DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE
OKRA
A B
Figura 3. Síntomas inducidos por geminivirus y un potyvirus en
asociación, separados de okra por transmisión mecáni-
ca: A) Moteado y lesiones locales necróticas en D.
stramonium; B) mosaico y deformación de hojas en N.
benthamiana, en invernadero.
Figure 3. Symptoms induced by geminivirus and a potyvirus in
association, separated from okra by mechanical
transmission: A) Motting and localized necrotic
lessions in D. stramonium; B) mosaic and deformation
of leaves in N. benthamiana, in the greenhouse.
stramonium causó mosaico, moteado amarillo y defor-
mación de hojas. Por tanto, los síntomas asociados con
la enfermedad del moteado amarillo de la okra sólo se
re- produjeron por injerto en plantas de okra sanas en
inver- nadero. Los ensayos serológicos con ELISA no
indicó la infección de virus del tipo ARN.
Ensayos serológicos de
ELISA
La detección directa de virus en plantas de okra, del
campo, con síntomas de moteado amarillo, utilizando
ELISA, fue negativa en todos los casos. Por tanto, con
esta técnica no se pudo establecer la identidad de algún
virus conocido que se relacionara con los síntomas
observados en las plantas de okra en campo o en el
material obtenido por injerto en invernadero. Sin
embargo, en los pocos ca- sos donde se logró separar
algún virus de plantas de okra, por transmisión
mecánica a plantas de hospedantes indicadoras y
diferenciales, sólo en éstas se detectaron infecciones por
los virus AMV, INSV, TBSV y TEV.
Es probable que el alto contenido de sustancias
mucilaginosas, que se obtienen al macerar los tejidos de
okra, afectó la detección serologica de estos virus, pero
no su transmisión mecánica a otros hospedantes.
Extracción y análisis de ADN viral
Transmisión por
biobalística
La transmisión por biobalística causó síntomas
seve- ros en plantas de chile: amarillamiento y
epinastia en
245
A B
Figura 4. Síntomas inducidos por un geminivirus separado de
okra: A) por injerto, moteado, mosaico amarillo y de-
formación de hojas en okra; B) por biobalística, defor-
mación apical de hojas en chile, en condiciones de in-
vernadero.
Figure 4. Symptoms induced by a geminivirus separated from
okra: A) By grafting, motting, yellow mosaic and
deformation of leaves in okra; B) by biobalistics,
apical deformation of leaves in chili, in the
greenhouse.
indicator and differential plants, it was only in these
that infections by the AMV, INSV, TBSV and TEV
viruses were detected.
It is likely that the high content of mucilaginous
substances, obtained when okra tissue is macerated,
affected the serological detection of these viruses, but
not their mechanical transmission to other hosts.
Extraction and analysis of viral DNA
Transmission by biobalistics
Transmission by biobalistics caused severe
symptoms in chili plants: yellowing and epinasty in
leaves, as well as deformation of branches and
reduction of plant size (Figure 4B). In some plants of
N. tabacum var. Xanthi, N. benthamiana and N.
glutinosa tenuous light yellow mosaic was observed,
localized only in inoculated leaves, the rest of the new
leaves did not exhibit symptoms. Because of the
severity of the symptoms, chili plants inoculated by
biobalistics were selected to conduct tests of
transmission by grafting in new chili and okra plants.
Molecular hybridization
Infections by geminivirus were detected by dot-blot
type hybridization in all of the okra plants with yellow
mottle symptoms collected in Iguala, Guerrero, and
Mazatepec, Morelos. This assay permitted the rapid
and reliable analysis of a large number of okra samples
with yellow mottle symptoms, before performing the
PCR.
 DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 235
OKRA

hojas, deformación de ramas y reducción del tamaño de Infections by geminivirus were detected in okra plants
236
la planta (Figura 4B). En AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
algunas plantas
2004
de N.
tabacum var. xanthi, N. benthamiana y N. glutinosa se
observó un mosaico tenue amarillo claro, localizado
sólo en las ho- jas inoculadas; el resto de las nuevas
hojas no presentó síntomas. Por la severidad de
síntomas, se seleccionaron las plantas de chile
inoculadas por biobalística, para rea- lizar pruebas de
transmisión por injerto a plantas nuevas de okra y chile.
Hibridación molecular
Se detectaron infecciones por geminivirus en todas
las plantas de okra con los síntomas de moteado amari-
llo, recolectadas en Iguala, Guerrero, y Mazatepec,
Morelos, mediante el ensayo de hibridación del tipo
Dot- blot. Este ensayo permitió un análisis rápido y
confiable de un gran número de muestras de okra con
los síntomas de moteado amarillo, antes de realizar la
PCR. Se detec- taron infecciones por geminivirus en
las plantas de okra injertadas con material del campo,
así como en plantas de D. stramonium y N.
benthamiana inoculadas mecáni- camente y en las
plantas inoculadas por bombardeo (Fi- gura 5).
Amplificación de ADN viral por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)
El análisis electroforético de los productos de la PCR
A
del ADN total obtenido de plantas de okra con síntomas
de moteado amarillo y recolectadas en campo, mostró
una banda 650 pb, predicha para los oligonucleótidos
Mot/CP que amplifican partes de la región intergenética
C
y del gen de la proteína de la cápside de geminivirus
(Figura 6, Carril 2). Además, se obtuvo bandas del mis-
mo peso en las plantas de okra y de los hospedantes
diferenciales inoculadas por injerto y bombardeo, así
como de una maleza (Melampodium divaricatum) que
crece abundantemente en el cultivo de okra (Figura 6,
Carril 4).
También se detectaron bandas del mismo peso en las
plantas de D. stramonium y N. benthamiana inoculadas
mecánicamente con macerados de hojas de okra con
moteado amarillo; estas plantas estaban infectadas por
TEV (datos no mostrados).
Clonación y secuenciación
El producto obtenido por la PCR se clonó y poste-
riormente se estableció su secuencia, misma que se de-
positó en el Genbank con el número de acceso
AF349113. El análisis por comparación de un fragmen-
to de 200 bases, que corresponde al gen de la proteína
de la cápside (CP), sugiere que el virus aislado de
plantas
grafted with material from the field, as well as on D.
stramonium and N. benthamiana plants inoculated
mechanically and in plants inoculated by bombardment
(Figure 5).
Amplification of viral DNA by polymerase chain
reaction (PCR)
The electrophoretic analysis of the PCR products of
total DNA obtained from okra plants with yellow
mottle symptoms collected in the field, exhibited an
expected
650 pb band when the oligonucleotides Mot/CP were
used; these direct the amplification of the intergene
region and the capsid protein gene (Figure 6. Track 2).
Also, bands of the same weight were obtained in okra
and differential host plants inoculated by grafting and
inoculated by bombardment, as well as from a weed
(Melampodium divaricatum), which grows abundantly
in okra crops (Figure 6, Track 4).
Also, bands of the same weight were detected in D.
stramonium and N. benthaminana plants inoculated
mechanically with macerates of okra leaves with yellow
mottle; these plants were infected by TEV (data not
shown).
1 2 3 4 5 6
B
D
E
Figura 5. Ensayo de hibridación del tipo Dot-blot, utilizando
como sonda el gen CP de Pepper huasteco virus.
Muestras de okra positivas para geminivirus: A2, A5,
C1 y C2; mues- tras de tomate y chile infectadas con
geminivirus, utili- zadas como testigos positivos: A3,
A6, B4, B6, D5, D6, E3 y E5; muestras E2 y E6
plantas sanas testigos nega- tivo; muestra E1 testigo
positivo de PHV para la sonda. El resto son muestras
negativas de okra.
Figure 5. Dot-blot hybridization test, using the CP gene of
Pepper huasteco virus as a probe. Samples of okra
tested positive for geminivirus: A2, A5, C1 and C2;
samples of tomato and chili infected with geminivirus
used as positive controls: A3, A6, B4, B6, D5, D6, E3,
and E5; samples E2 and E6 healthy plants negative
controls; sample E1 positive control of PHV for the
probe. The rest are negative okra samples.
 4 Melampodium Cloning virus is proposed to
1 2 3 4 divaricatum
5 6 7 8 (product of 650 and designate this pathogen,
pb); track 5 Sida sequenci although it is necessary
accuta (negative); ng to continue molecular
track 6 PHV analysis of the entire
(positive control);
track 7 negative
The product genome.
control (no 650 obtained by PCR was In other countries it
pb band); track 8 cloned and later its has been determined
MPM 1 kb. sequence was that okra is susceptible
established and to the viruses Abelia
de okra con moteado deposited in the latent tymovirus,
amarillo, pertenece a los Genbank with access Abutilon mosaic
begomovirus. El number AF349113. The begomovirus, Alfalfa
análisis de la secuencia analysis by comparison mosaic alfamovirus,
de los primeros with a fragment of 200 Beet curly top
64 aminoácidos del bases, corresponding to curtovirus, Beet mosaic
650 pb fragmento the protein caspid (PC) potyvirus, Beet western
correspondiente a la CP gene, suggests that the yellows luteovirus,
(la región menos virus separated from Bhendi yellow vein
conservada dentro del okra plants with yellow mosaic begomovirus,
gen de la CP en las mottle belongs to the Clitoria yellow vein
especies de group of tymovirus, Cotton leaf
Figura 6. Electroforesis en begomoviruses. The
geminivirus), mostró el curl begomovirus,
gel de agarosa
(0.8 %) de mayor porcenta- je de analysis of the sequence Cucumber mosaic
productos de la identidad (89%) con el of the first 64 amino cumovirus, Epirus
PCR, utilizando Squash leaf curl virus, acids of the fragment cherry ourmiavirus,
los corresponding to the PC
pero suficiente para Okra leaf curl
oligonucleótidos
Mot/CP, con considerarlo como un (the least preserved begomovirus,
ADN total de geminivirus dife- rente. region within the PC Rhynchosia mosaic
plantas de okra y El análisis de sólo la gene in species of begomovirus, Sweet
en varias malezas
parte derecha de la geminiviruses) had the potato ringspot
de este cultivo.
Carril 1 MPM 1 región intergenética (de highest percentage of nepovirus, Tobacco
Kb; carril 2 la orquilla a CP) indicó identity (89%) with ringspot nepovirus,
Okra (pro- ducto una identidad de 85% Squash leaf curl virus, Tobacco streak
de 650 pb); carril
con el Sida golden but it was sufficient to ilarvirus and
3 Poinsettia
pulcherrima (ne- mosaic virus, pero aún consider it a different Watermelon mosaic 2
gativo); carril 4 dife- rente ésta y otras geminivirus. The potyvirus (Brunt et al.,
Melampodium especies de geminivirus analysis of only the right 1997).
divaricatum
conocidos (Brown et side of the intergene In the present study,
(producto de 650
pb); carril 5 al., 1999; Padidam et region (from the loop to the viruses INSV, TBSV
Sida accuta al., 1995; Regenmortel the PC) indicated an and TEV are reported
(negativo); carril et al., 1997). 85% identity with Sida for the first time to be
6
PHV (testigo
Según los análisis de golden mosaic virus, but infecting okra in
positivo); carril 7 la secuencia del still different from this México; only AMV had
testigo negativo fragmento clonado del and other known species been described in other
(sin banda de 650 geminivirus causante of geminiviruses regions of the world. All
pb); carril 8
MPM 1 kb. del moteado amarillo de (Brown et al., 1999; of these viruses were
Figure 6. Electrophoresis la okra, éste pudiera Padidam et al., 1995; characterized after
in agar gel eventualmente ser una Regenmortel et al., separation and
(0.8%) of PCR especie diferente de 1997). mechanical transmission
products, using
Mot/CP virus no reportada According to the to indicator and
oligonucleotides, previamente, Por tanto, analysis of the sequence differential hosts.
with total DNA se sugiere el nombre de of the cloned fragment However, these viruses
from okra plants Okra yellow mottle of the geminivirus that could not be detected in
and several weeds
of this crop. virus para causes okra yellow the macerates of okra
Track 1 MPM mottle virus, this could tissue by serology
1 Kb; track 2 eventually be a (ELISA), nor did they
Okra (product different, previously
of 650 pb);
cause apparent
track 3 unreported virus. symptoms in the okra
Poinsettia Therefore, the name plants inoculated
pulcherrima Okra yellow mottle mechanically in the
(negative); track
greenhouse. It is
possible that mechanical
transmission of these
viruses from okra to
okra is blocked by some
chemical element
present in the leaves of
this plant. This allows
us to conclude that
natural infection of
these viruses occurs
through the intervention
of insect vectors.
It was determined
that the symptoms of the
yellow mottle disease in
okra, observed in the
field, were induced
DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 237
OKRA
238 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
implicaciones
designar este patógeno, bloqueada por algún
2004
consistently in okra
aunque es necesario ele- mento químico epidemiológicas para plants produced in the
continuar con el análisis presente en las hojas de ambos patógenos en el greenhouse only by
molecular del genoma esta planta. Esto cultivo de la okra. grafting or biobalistics.
completo. permite concluir que la In these plants, the
En otros países se ha infección natural de C presence of a
O
determinado que la okra estos virus es por N
geminivirus was always
es sus- ceptible a los intervención de insectos C determined using the
virus Abelia latent vectores. L PCR assay or molecular
tymovirus, Abutilon Se determinó que los U hybridization.
mosaic begomovirus, síntomas de la S The molecular
I
Alfalfa mosaic enfermedad del moteado O analysis of the complete
alfamovirus, Beet curly amarillo de la okra, N Common Region and
top curtovirus, Beet observados en campo, E part of the CP gene of
mosaic potyvirus, Beet fue- ron inducidos S the geminivirus
western yellows consistentemente en associated with the
Aunque se separaron
luteovirus, Bhendi plantas de okra pro- yellow mottle disease of
los virus AMV, INSV,
yellow vein mosaic ducidas en el okra indicates that we
TBSV y un potyvirus
begomovirus, Clitoria invernadero, sólo por are apparently dealing
semejante a TEV de
yellow vein tymovirus, injerto o biobalística. En with a geminivirus not
plantas de okra con los
Cotton leaf curl estas plantas siempre se previously described.
begomovirus, Cucumber determinó la presencia Therefore, the complete
mosaic cumovirus, de un geminivirus characterization of its
Epirus cherry utilizando el ensayo de genome is justified.
ourmiavirus, Okra leaf PCR o por hibrida- ción Occasionally,
curl begomovirus, molecular. mechanical transmission
Rhynchosia mosaic El análisis molecular of the geminivirus was
begomovirus, Sweet de la Región Común achieved in D.
potato ringspot completa y parte del gen stramonium and N.
nepovirus, Tobacco CP, del geminivirus benthamiana plants, but
ringspot nepovirus, asociado con la en- always in association
Tobacco streak ilarvirus fermedad del moteado with a potyvirus similar
y Watermelon mosaic 2 amarillo de la okra, to TEV. This situation
potyvirus (Brunt et al., indicó que se trata, al will have to be studied
1997). parecer de un more in detail, given
En este trabajo se geminivirus no descrito that TEV is not a
reporta por primera vez previa- mente. Por tanto, recognized pathogen of
los virus INSV, TBSV se justifica la okra and mechanical
y TEV que infectan la caracterización transmission is relatively
okra en México; sólo el completa de su genoma. low in most
AMV se había descrito Eventualmente, se geminiviruses.
en otras regiones del logró transmitir Moreover, this type of
mun- do. Todos estos mecánicamente al interactions (synergism
virus se caracterizaron geminivirus en plantas in transmission) could
después de se- pararlos de D. stramonium y N. have epidemiological
por transmisión benthamiana, pero implications for both
mecánica a hospedantes siempre en asociación pathogens in the
indicadoras y con un potyvirus cultivation of okra.
diferenciales. Sin semejante a TEV. Esta
embargo, estos virus no situación tendrá que es- C
se pudieron detectar en tudiarse más a fondo, O
N
los macerados de tejidos dado que TEV no es un C
de okra por serología patógeno reconocido de L
(ELISA), ni causaron okra y la transmisión U
síntoma aparente en las mecánica es relati- S
I
plantas de okra vamente baja en la O
inoculadas mayoría de los N
mecánicamente en in- geminivirus. Además, S
vernadero. Es posible este tipo de
que la transmisión interacciones Although the
mecánica de estos virus (sinergismo en la viruses AMV, INSV,
de okra a okra, sea transmisión) tendría TBSV, and a potyvirus
similar to DETEVLA TORRE-ALMARÁZ
were et al.:
foliar, UN NUEVO
ninguno de GEMINIVIRUS
ellos ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 239
OKRA
separated from okra causó síntomas en
plants with symptoms plantas de okra después
of yellow streak of the de una inoculación
fruit and yellow mottle mecánica e independien-
leaves, none of them te. Sin embargo, no se
caused symptoms in descarta que estos virus
okra plants after puedan estar
mechanical and relacionados con parte
independent de la compleja
inoculation. However, it sintomatologia de origen
is not ruled out that viral observada en
these viruses could be campo.
related to part of the
complex
symptomatology of
viral origin observed in
the field.
It was determined
that the principal causal
agent of the symptoms
of yellow mottle in okra
is a geminivirus
belonging to the genus
Begomovirus and
related to Squash leaf
curl virus and Sida
golden mosaic virus.
The molecular analyses
indicated that this virus
could be a new,
different viral species
not previously reported.
Therefore, the name
Okra yellow mottle
virus is proposed to
designate this pathogen.
The determination of
this characteristics of
the complete genome of
this geminivirus, its
origin and natural
reservoirs, as well as
the characteristics of
possible mechanical
transmission in co-
infection with other
viruses, are important
aspects.

—End
of the
Englis
h
versio
n—

síntomas de rayado
amarillo del fruto y
moteado amari- llo
240 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
2004
 DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE 241
Se determinó
OKRA
que el principal agente causal de los Clark, M. F., and A. M. Adams. 1977. Characteristics of microplate
síntomas de moteado amarillo en la okra es un method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection
of plant viruses. J. Gen. Virol. 34: 475-483.
geminivirus, perteneciente al género Begomovirus y re- DGEA. SARH. 1990. Anuario estadístico de la producción agrícola
lacionado con el Squash leaf curl virus y con el Sida de los Estados Unidos Mexicanos. México.
golden mosaic virus. Los análisis moleculares indicaron Dijkstra, J., and C. P. De Jager. 1998. Practical Plant Virology.
que este virus pudiera ser una especie viral diferente no Protocols and Exercises. Springer, Berlin. 459 p.
Dellaporta, S. L., J. Woods, and J. B. Hicks. 1983. A plant
reportada previamente. Por tanto, se propone el nombre minipreparations, version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21.
de Okra yellow mottle virus para designar este Garzón-Tiznado, J. A., I. Torres-Pacheco., J. T. Ascencio-Ibañez,
patógeno. La determinación de las características del L.
genoma com- pleto de este geminivirus, su origen y Herrera-Estrella, and R. Rivera-Bustamante. 1993. Inoculation of
peppers with infectious clones of a new geminivirus by a biolistic
reservorios natura- les, así como las características de la procedure. Phytopathology 83: 514-521.
posible transmisión mecánica en coinfección con otros Martelli, P. G. 1990. Tomato bushy stunt tombusvirus. In: Brunt, A.
virus, son aspectos importantes. A., K. Crabtree, M. J. Dallwitz, A. J. Gibbs, L. Watson, and E.
J. Zurcher. (eds.). (1996 onwards). Plant Viruses Online:
Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th
RECONOCIMIENTOS August 1996. URL http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/
Mehta, P., J. A. Wyman, M. K. Nakhla, and D. P. Maxwell.
Esta investigación fue totalmente financiada por el Programa de 1994. Polymerase chain reaction detection of viruliferous Bemisia
Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica tabaci
with 2 tomato infecting geminiviruses. J. Econ. Entomol. 87:
(PAPIIT) de la UNAM, México, Proyecto IN207601 “Movilidad 1285-
celular de un nuevo geminivirus por coinfección con una variante del 1290.
tobacco etch virus”. Se contó también con el apoyo logístico del Padidam, M., R. N. Beachy, and C. M. Fauquet. 1995. Classification
Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma and identification of geminiviruses using sequence comparisons.
J. Gen. Virol. 76: 249-263.
Chapingo. Purcifull, E. D. 1981. Tobacco etch potyvirus In: Brunt, A. A., K.
Crabtree, M. J. Dallwitz, A. J. Gibbs, L. Watson, and E. J.
Zurcher. (eds.). (1996 onwards). Plant Viruses Online:
Descriptions and
th
Lists from the VIDE Database. Version: 20 August 1996. URL
LITERATURA CITADA http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/
Regenmortel, M. H. V., D. H. Bishop, C. M. Fauquet, M. A. Mayo, J.
Ascencio-Ibañez, J. T., G. R. Argüello-Astorga, J. Méndez-Lozano, Maniloff, and C. H. Calisher. 1997. Guidelines to the
and R. F. Rivera-Bustamante. 2002. First report of Rhynchosia demarcation of virus species [news]. Arch. Virol. 142: 1505-
golden mosaic virus (RhGMV) infecting tobacco in Chiapas, 1518.
México. Plant Disease 86 (6): 692. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular
Brown, J. K., K. M. Ostrow, A. M. Idris, and D. C. Stenger. 1999. Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory,
Biotic, molecular, and phylogenetic characterization of bean Cold Spring Harbor, NY.
calico mosaic virus, a distinct Begomovirus species with Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing
affiliation in the squash leaf curl virus cluster. Phytopathology with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:
89: 273-280. 5463-5467.
Brunt, A. A. 1995. Impatiens necrotic spot tospovirus. In: Brunt, A. Surzycki, S. 1999. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer
A., K. Crabtree, M. J. Dallwitz, A. J. Gibbs, L. Watson, and E. Verlag Berlin. pp: 233-262.
J. Zurcher. (eds.). (1996 onwards). Plant Viruses Online: Torres-Pacheco. I., J. A. Garzón-Tiznado, J. K. Brown, A. Becerra
Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th F., and R. Rivera-Bustamante. 1996. Detection and distribution
August 1996. URL http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/ of geminiviruses in Mexico and the Southern United States.
Brunt, A. A. 1997. Known susceptibilities of Malvaceae. In: Brunt, Phytopathology 86: 1186-1192.
A. A., K. Crabtree, M. J. Dallwitz, A. J. Gibbs, L. Watson, and Van Vloten, D. L. 1981. Alfalfa mosaic alfamovirus. In: Brunt, A.
E. J. Zurcher. (eds.). (1996 onwards). Plant Viruses Online: A., K. Crabtree, M. J. Dallwitz, A. J. Gibbs, L. Watson, and E.
Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th J. Zurcher. (eds.). (1996 onwards). Plant Viruses Online:
August 1996. URL http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/ Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th
August 1996. URL http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/
 242 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL
2004
View publication stats