Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 1

ESPECTROFOTOMETRÍA DEL VISIBLE

SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA ANALÍTICA

I OBJETIVOS
 Operar adecuadamente el espectrofotómetro
 Obtener espectros o Curva de absorción
 Seleccionar la longitud de onda de trabajo, máxima o analítica

II GENERALIDADES
En cada tipo de sustancias los átomos, iones o moléculas absorben con cierta preferencia longitudes de
onda de una determinada gama de frecuencias; esto hace que los átomos, iones o moléculas puedan
identificarse mediante la longitud de onda a que se da lugar la absorción. En el análisis
espectrofotométrico, las mediciones de absorbancia se realizan ordinariamente a una longitud de onda que
corresponda a un máximo del espectro de absorción.
Para ello en una determinación deberá obtenerse siempre una curva de absorción o espectro de absorción
para ubicar en ella el pico más alto y seleccionar la longitud de onda a la cual se produce ese máximo de
absorción. A esta longitud de onda se denomina longitud de onda analítica, de trabajo o máxima y es la
longitud de onda a la cual se realiza la medición cuantitativa. A esta longitud de onda la variación de
absorbancia por unidad de concentración es máxima, con lo cual se obtiene la sensibilidad máxima.

III FUNDAMENTO
Para encontrar la curva de absorción se irradia a la solución coloreada con energía radiante de una gama de
longitudes de onda de tal manera que a cada longitud de onda se mide su valor de absorbancia o de % de
transmitancia; esta energía absorbida se traduce en un espectro de absorción que es obtenido en función
de los valores de absorbancia o de % de transmitancia frente a las longitudes de onda. En la curva se hace
un barrido espectral y se ubica el máximo pico o valle más profundo que corresponde a un máximo de
absorbancia a una determinada longitud de onda; a esta longitud se denomina longitud de onda analítica,
óptima o de trabajo.

IV ARREGLO EXPERIMENTAL

V APARATOS
 Espectrofotómetro HACH DR 2800
 Cubeta: 2.5 cm de trayecto óptico.
 Región de trabajo: espectro visible (450 - 600 NM)
 Blanco: agua destilada.
Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 2

VI MATERIALES
 Fiolas de 100 y 250 ml.
 Buretas de 25ml.
 Vasos de precipitación de 250ml.

VII REACTIVOS
 Solución Stock de permanganato de potasio 0,1000 N.
 Solución de permanganato de potasio con concentración de 100 mg/L (ppm) de manganeso
 Soluciones estándares o patrones.

VII TÉCNICA
1.- PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
A) PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DÍLUIDA DE 100 PPM EN MANGANESO
Disponer de una solución stock de KMnO4 0.1000 N, previamente valorada. Calcular su
concentración en partes por millón referida a manganeso. Preparar a partir de la solución stock
de 250 ml de una solución de 100 p.p.m. de manganeso
B) PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PATRONES O ESTÁNDARES
Preparar por dilución a partir de la solución diluida de 100 ppm, 100 mililitros de solución de los
siguientes patrones: 2, 4, 6, 8,10, 12, y 16 ppm.

2.- SELECCIÓN DE MODO BÁSICO DE TRABAJO

(a) ENCENDIDO Y APAGADO

 Conecte la toma de alimentación externa en un enchufe de la red eléctrica.
 Pulse el interruptor de encendido/apagado durante aproximadamente un segundo para
encender el instrumento
 Pulse el interruptor de encendido/apagado durante 3 a 5 segundos para apagar el
instrumento. Una señal acústica confirma que el instrumento se ha apagado (no prender
el instrumento rápidamente después de apagarlo, espere unos 20 segundos antes de
volver a encenderlo, para no dañar los sistemas electrónico y mecánico)

(b) DIAGNOSTICO
 Cada vez que se enciende el instrumento, se ejecuta automáticamente una serie de
pruebas de autodiagnóstico para asegurar el correcto funcionamiento de los principales
componentes del sistema
 Este procedimiento, que dura unos dos minutos, autocomprueba el normal
funcionamiento del sistema, pruebas de lámpara, ajustes de filtros, la calibración de las
longitudes de onda y el voltaje. Los distintos tests que funcionan correctamente se
confirman con una marca de verificación.
 Una vez completados los diagnósticos de puesta en mercha, aparece el MENU PRINCIPAL
 Si el instrumento detecta alguna desviación relativa a la última calibración, es
recomendable llevar a cabo una verificación del sistema. (pulsar la tecla INICIO, esta
verificación dura aproximadamente 6 minutos).

(C) MENU PRINCIPAL

 En el menú principal se pueden seleccionar diversos modos de trabajo
Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 3

MENU DE MODO PRINCIPAL

Modo No “ “

1.- PROGRAMAS ALMACENADOS /PROGRAMAS DE CODIGOS DE BARRAS

2.- PROGRAMAS DEL USUARIO
3.- PROGRAMAS FAVORITOS
4.- LONGITUD DE ONDA UNICA
5.- LONGITUD DE ONDA MULTIPLE
6.- LAPSO DE TIEMPO
7.- VERIFICACIONES DEL SISTEMA
8.- RECUPERAR DATOS
9.- CONFIGURACION DEL INSTRUMENTO

(D) MODO LONGITUD DE ONDA UNICA

El modo “longitud de onda única” se puede utilizar de tres maneras. Para mediciones de la muestra a una
longitud, se puede programar el instrumento para medir la absorbancia, el % de transmitancia o la
concentración del analito.
 En el menú principal pulse LONGITUD DE ONDA UNICA
 Pulse OPCIONES para configurar los parámetros

AJUSTE DE PARÁMETROS ANALÍTICOS

Luego que el modo longitud de onda única es seleccionado, aparecen las opciones de configuración de
longitud de onda única. Estos parámetros son los siguientes:

OPCIONES DE CONFIGURACIÓN DE LONGITUD DE ONDA ÚNICA

OPCION
1. MEMORIZAR APAGADO/ENCENDIDO los datos de medición se memorizan automáticamente)

2. % TRANS/ABS/CONC cambia entre % de Transmitancia, lecturas de absorbancia o concentración)

3. LONGITUD DE ONDA ( ) introduce la longitud de onda de la medición, utilice el teclado alfanumerico
para introducir la longitud e onda de medición (rango entre 340-900 nm
4. ICONO TEMPORIZADOR (funciona a modo de cronometro)
5. FACTOR DE CONCENTRACION (factor de multiplicación para convertir los valores de ABS en valores de
concentración)
6. RESOLUCION DE LA CONCENTRACION (seleccione la posición de la coma decimal en las lectruras de
concentración calculadas)
7. GUARDAR COMO PROGRAMA DEL USUARIO (memoriza los parámetros seleccionados como programa
de usuario)
8. RECUPERAR DATOS (recupera datos de medición escaneados de longitudes de onda o lapsos de tiempo
guardados)
9. CONFIGURACION DEL INSTRUMENTO (ajustes de funcionamiento básicos del isntrumento)
Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 4

4 - MEDICIÓN DE ESTÁNDARES A LA LONGITUD DE ONDA UNICA

 Coloque la cubeta de blanco (agua destilada) completamente limpia y seca EN EL SOPORTE
PORTACUBETAS.
 Seleccionar ern opciones la tecla longitud de onda e Introducir la longitud de onda de la medición
utilizando el teclado alfanumérico (450 nm)
 Pulse CERO (La tecla medición sólo se activará cuando se haya realizado la medición del cero).
 Coloque la cubeta de muestra en el soporte portacubetas.Pulse medición y tome nota del valor
de absorbancia
 Realizar mediciones de absorbancia entre 450 a 600 nm a intervalos de 10 nm, calibrando el
instrumento (blanco) a cada cambio de la longitud de onda

5.- PROCESAMIENTO DE DATOS

Cuando la medición termina, se indica y toma datos de absorbancia para cada longitud de onda. Tabular los
datos experimentales obtenidos.

VIII INTERPRETACION DE DATOS

El espectro medido puede ser grabado en copia con la tecla de “COPY “. Imprimir las curvas espectrales en
un sistema de coordenadas teniendo en cuenta los siguientes parámetros:

 Absorbancia frente a longitudes de onda

 Porcentaje de transmitancia frente a longitudes de onda.

IX DISCUSION DE DATOS
Señalar las conclusiones que se desprenden de los gráficos obtenidos.
Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 5

INFORME DE LABORATORIO # 1
SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO

Fecha : 01-09-2017 No GRUPO: 6

ANALISIS: Preparación de la solución de 100 ppm Mn

Preparación de soluciones patrones
Obtención del espectro de absorción
Determinación de la longitud de onda de trabajo

METODO: Espectrofotométrico

MUESTRA: Soluciones patrones

CALCULOS:

A) Cálculo de la concentración de la solución stock de KMnO 4 0.1000N expresada en ppm

referida en Manganeso

𝑚𝑒𝑞 𝐾𝑀𝑛𝑂4 0.031606 𝐾𝑀𝑛𝑂4 54,94 𝑔 𝑀𝑛 1000 𝑚𝑔 1000 𝑚𝑙

0.1000 ( )( )( )( )
𝑚𝑙 1 𝑚𝑒𝑞 𝐾𝑀𝑛𝑂4 158.03 𝑔 𝐾𝑀𝑛𝑂4 1𝑔 1𝐿
𝑚𝑔 𝑀𝑛
= 1098.8
𝐿

B) Cálculo del volumen de la solución stock requerido para preparar una solución de 100
ppm en manganeso para un volumen de 250 ml.

1098.8 𝑝𝑝𝑚 𝑥 𝑉2 = 100 𝑝𝑝𝑚 𝑥 250 𝑚𝑙

𝑉2 = 22.75 𝑚𝑙

C) Cálculos para preparar 100 ml de las soluciones patrones o estándares de 2, 4, 6, 8,10,

12 y 16 ppm

N° Volumen del Volumen final Concentración

patrón stock (ml) (ml) ppm Mn
1 2.0 100 2.0
2 4.0 100 4.0
3 6.0 100 6.0
4 8.0 100 8.0
5 10.0 100 10.0
6 12.0 100 12.0
7 16.0 100 16.0
Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 6

TABLA DE RESULTADOS
OBTENER LOS VALORES DE ABSORBANCIA (ABS) DE LA SOLUCIÓN PROBLEMA EN UN INTERVALO
DE LONGITUDES DE ONDA DE 450 - 600 NM.

TABULACION DE DATOS

LONGITUD ABSORBANCIA %T
DE ONDA
450 0.197 63.53
460 0.250 56.23
470 0.351 44.57
480 0.486 32.66
490 0.646 22.59
500 0.846 14.26
510 0.983 10.40
520 1.200 6.30
530 1.175 6.68
540 1.172 6.72
550 1.089 8.15
560 0.745 17.99
570 0.685 20.65
580 0.362 43.45
590 0.196 63.68
600 0.156 69.89

(a) ESPECTRO DE ABSORCIÓN EN TÉRMINOS DE ABSORBANCIA (ABS) FRENTE A LAS

LONGITUDES DE ONDA (NM )

CURVA DE CALIBRACION (Abs vs ʎ)

1.4

1.2

0.8
Abs

0.6

0.4

0.2

0
450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
longitud de onda ʎ
Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 7

(b) ESPECTRO DEL PORCENTAJE DE TRANSMITANCIA (% T) FRENTE A LONGITUDES DE ONDA

(NM)

CURVA DE TRANSMITANCIA (T% vs ʎ)

80

70

60

50
T%

40

30

20

10

0
450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
Longitud de onda (ʎ)

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

Se obtienen espectros con picos máximos lo que indica que es la longitud de onda de trabajo, que
es inversamente proporcional a la transmitancia.

CONCLUSIONES:

Se opera adecuadamente el espectrofotómetro, obteniéndose así espectros de absorción, para

seleccionar a longitud de onda de trabajo máxima (Analítica)

APELLIDOS Y NOMBRES: ________________________

FIRMA DEL ALUMNO: __________________________

Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 8

CUESTIONARIO
1.- Defínase brevemente:

a) La radiación monocromática y policromática

Radiación monocromática: Radiación electromagnética, especialmente radiación visible, de

solo una frecuencia o longitud de onda. La radiación completamente monocromática no
puede ser producid, pero los láseres producen radiación en una banda de frecuencia muy
estrecha.
Radiación Policromatica: Radiación electromagnética que consiste en mezcla de diferentes
longitudes de onda. Esto no solo se refiere a la radiación visible

b) Espectro de absorción
El espectro de absorción de una materia muestra la fracción de la radiación
electromagnética incidente que un material absorbe dentro de un rango de frecuencias.

c) Porque es importante monocromatizar la radiación policromática

Porque cuando hacemos pasar una luz policromática a través de un objeto, este absorbe
algunas longitudes de onda y transmite las que no absorbe como colores

2.- describir la diferencia entre un espectrofotómetro, colorímetro, y un fotómetro

Espectrofotómetro: Un espectrofotómetro es un instrumento usado en la análisis químico

que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una
misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o
reacciones químicas que se miden en una muestra. También es utilizado en los laboratorios
de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de
espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa y
visuales. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a
través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto
le permite al operador realizar dos funciones: Dar información sobre la naturaleza de la
sustancia en la muestra e indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos
interesa está presente en la muestra.
Colorímetro: Un colorímetro es cualquier herramienta que identifica el color y el matiz para
una medida más objetiva del color. El colorímetro también es un instrumento que permite
medir la absorbancia de una disolución en una frecuencia de luz específica. La frecuencia es
determinada por el operario del colorímetro. Por eso hace posible descubrir
la concentración de un soluto conocido que sea proporcional a la absorción.
Fotómetro: Los fotómetros de luz incidente miden la intensidad de luz que ilumina al
objeto, la que cae sobre él. Para leer los valores de luz incidente se coloca el fotómetro
junto al objeto y se dirige hacia la cámara. Los fotómetros de luz reflejada miden la
intensidad luminosa reflejada por el objeto, la que él emite
3.- En la longitud de onda de trabajo obtenida en la parte experimental a 525 nm calcular la
cantidad de energía que le corresponde a esa radiación. Compararla con una longitud de onda
de 200 nm que corresponde a la región UV
Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 9

𝒉𝒄
𝑬=
𝝀
A 525nm

6.626𝑥10−34 ∗ 3𝑥108
𝐸=
5.25𝑥10−7

𝐸 = 3.78𝑥10−19
A 200nm

6.626𝑥10−34 ∗ 3𝑥108
𝐸=
2𝑥10−7

𝐸 = 9.939𝑥10−19

Se observa que a una longitud de onda de 200nm se obtiene una mayor energía que a 525nm

4.- Que tipo de información proporciona el espectro de absorción

Un espectro de absorción nos proporciona una representación gráfica de la absorbancia de un
analito o (o de otra magnitud equivalente) en función de la longitud de onda de la radiación, l, (o
de otro parámetro relacionado con la energía de la radiación utilizada). El máximo de absorbancia
obtenido en el espectro de absorción de un analito, nos dará la longitud de onda que proporciona
la mayor sensibilidad posible, y por tanto será la que se utilizará en el análisis espectrofotométrico
de dicho analito.

5.- Señale algunas razones por que determina la longitud de onda analítica o de trabajo
Se escoge para el registro y/o la observación de la curva espectral o espectro de la sustancia que
indicará si es adecuado tomar la longitud de onda de máxima absorción u otra banda
característica de la sustancia como longitud de onda para realizar las medidas, la longitud de onda
escogida se conoce como longitud de onda analítica.

6.- Indicar que formas conoce para representar una curva de absorción
La ecuación de Wagner y Nelson está basada en el cálculo de las áreas bajo la curva de absorción,
es decir, aquella área delimitada por el gráfico obtenida al representar la concentración
plasmática en función del tiempo. Métodos fotométricos. Métodos espectrofotométricos.

7.- Que es un espectro de absorción atómica y que es un espectro de absorción molecular

Espectro de absorción atómica: Un espectro de absorción atómica representa la medición de la

concentración de la fase gaseosa de átomos. Ya que la mayoría de las muestras son sólidas o
líquidas, los átomos o iones de los analitos deben ser vaporizados a la flama o en un horno de
grafito. Los átomos adsorben luz visible o ultravioleta y hacen transiciones a niveles de energía
más altos.
Espectro de absorción molecular: La absorción por moléculas poliatómicas, es un proceso
considerablemente más complejo que la absorción atómica, ya que el número de estados de
energía está muy aumentado. - Tanto las moléculas como los átomos tienen un número limitado
de niveles o estados energéticos cuantizados.
 Laboratorio de Análisis Instrumental en Ingeniería II 10

PROCEDIMIENTO

Solución stock de Preparar por dilución a partir de la solución diluida

KMnO4 0.1000 N de 100 ppm, 100 mililitros de solución de los
siguientes patrones: 2, 4, 6, 8,10, 12, y 16 ppm.

Medición de estándares a la longitud de onda única

Seleccionar en opciones la tecla longitud de onda e

Coloque la cubeta de blanco (agua Introducir la longitud de onda de la medición
destilada) completamente limpia y utilizando el teclado alfanumérico (450 nm)
seca en el soporte porta cubetas. Pulse CERO (La tecla medición sólo se activará
cuando se haya realizado la medición del cero).

Coloque la cubeta de muestra en el soporte Realizar mediciones de absorbancia entre 450

portacubetas. Pulse medición y tome nota del valor a 600 nm calibrando el instrumento a cada
de absorbancia cambio de la longitud de onda