But. Soc. Cat. Pediatr.

, 41, 315, 1981

ANEMIAS HEMOLÍTICAS POR ALTERACIONES

CONGÉNITAS DEL METABOLISMO Y LA MEMBRANA
ERITROCITARIA. ESTADO ACTUAL DE LOS
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

Joan Lluis Vives Corrons *, Lluis Berga**,

Josep Lluis Aguilar*, Josep M. a Jou * i Anna Ester *

1. Introducción
Los métodos de estudio aplicados al diagnóstico etiológico de las
a nemias hemolíticas han experimentado durante los últimos años un
gran avance. A ello ha contribuido tanto la fácil accesibilidad de los
hematíes a partir de una muestra de sangre como el perfeccionamiento
de los métodos empleados para su estudio que aglutinan los conocimientos
rnás recientes en disciplinas tan diversas como la morfología óptica y

u ltraestructural, la enzimología, el análisis proteico y de permeabilidad y

más recientemente el comportamiento físico o «reológico» de los hematíes

en suspensión. 4

El estudio de la morfología eritrocitaria ha constituido desde siempr

kisiabton
el procedimiento más simple y en muchos casos el más eficaz para el diag- ‘‘EiLloTECA
u östico de las anemias hemolíticas. Tal sucede en la esferocitosis heredi-

t aria (EH) donde su omisión puede conducir a múltiples e innecesarias

determinaciones analíticas. En muchos casos, la morfología óptica con-
vencional del frotis puede complementarse con el empleo de colorantes
vitales. Entre ellos destacan el azul de metileno nuevo (NMB) para eI
recuento de reticulocitos y el azul de Cresil brillante (ACB) para el aná-
lisis de posibles precipitados hemoglobínicos intraeritrocitarios (hemoglo-
binas inestables). La incubación de una muestra de sangre con agentes

(*) Laboratori Central d'Hematologia i Escola Professional d'Hematologia

«Farreras Valentí». Hospital Clinic i Provincial. Universitat de Barcelona
(*") Escola Técnica Superior d'Enginyers. Universitat Politécnica de Bar-
celona

315
oxidantes, como por ejemplo la acetilfenilhidrazina (APH), constituye un
procedimiento muy sencillo para valorar el poder reductor eritrocitario.
Cuando éste se halla disminuido tal como sucede ,por ejemplo, en el
déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), la incubación de los
hematíes en APH da lugar a abundantes precipitados hemoglobínicos
denominados «cuerpos de Heinz».

El simple examen de la morfología eritrocitaria mediante el micros-

copio óptico y la realización de pruebas de laboratorio tan sencillas como
el estudio de la resistencia osmótica eritrocitaria (ROE) o la prueba de la
hemólisis en medio ácido (prueba de Ham-Dacie) son muchas veces sufi-
cientes para confirmar el diagnóstico.

Cuando ello no es así, se impone el empleo de otros procedimientos

cuya naturaleza vendrá determinada por la historia clínica y exploración
física del paciente.

Dentro del grupo de anemias hemolíticas congénitas no hemoglobino'

páticas, la más frecuente es la EH y en segundo lugar el déficit de G6PD
( 32 33 ). En la mayoría de los casos, no obstante, el comportamiento clínico
del paciente permite establecer el diagnóstico ya que mientras la EH
cursa con anemia hemolítica crónica, el déficit de G6PD lo hace con herno
aguda en general después de la ingesta de algún medicamento (sulfa--lis
midas o aspirinas) o de habas (favismo).

En el presente trabajo se revisan los procedimientos actuales para el

diagnóstico etiológico de las anemias hemolíticas no hemogloninopáticas
cuya naturaleza y sistemática de aplicación vendrá siempre determinada
por la clínica y los antecedentes familiares del paciente.

2. Aspectos clínicos
Como en cualquier tipo de patología, el diagnóstico de la anemia h e-
mol tica debe basarse siempre en la realización de una historia clínica d e
y examen físico minucioso del paciente. En muchos casos esto es-tald
suficiente para establecer una orientación etiológica que deberá confir
mediante la realización de las correspondientes pruebas compl e--marse
mentarias ( 1 ' 32 ").

En la orientación etiológica de un proceso hemolítico son de gran

valor, determinados datos tales corno la edad del paciente, el inicio Y
características del cuadro anémico, el origen étnico y la existencia o no de
antecedentes familiares. La edad del paciente es importante por cuanto en
los niños, una anemia hemolítica tiene casi siempre un origen congénito
mientras que en los adultos es más probable que sea adquirida. Los ante'
•cedentes personales de ictericia neonatal o de frecuentes «hepatitis», así
como la existencia de antecedentes familiares son también de gran valor
para conocer el inicio y las características del síndrome hemolítico.

316
 El origen étnico tiene valor cuando el paciente pertenece a un área
geugráfica donde es frecuente un determinado tipo de anemia hemolítica
Congénita. En nuestro medio mediterráneo, las causas más frecuentes de
a nemia hemolítica congénita no hemoglobinopática son la esferocitosis
hereditaria (EH), que cursa con un cuadro clínico de anemia crónica, y el
déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) que lo hace en forma
de hernölisis aguda. Las otras causas de anemia hemolítica congénita son
mucho más raras (Tabla I). La exploración física minuciosa del paciente
tiene también un gran valor orientativo. Así, cuando la anemia hemolítica

TABLA I
CAUSAS DE ANEMIA HEMOLITICA CONGENITA

DEFECTOS CONGENITOS DE LA MEMBRANA ERITROCITARIA

Esferocitosis hereditaria (EH)

b) Eliptocitosis congénita (EC)
c) Piropoiquilocitosis congénita (PPC)
d) Estomatocitosis congénita e Hidrocitosis
e) Dessicitosis (Xerocitosis)
2. HEMOGLOBINOPATIAS

a) Hemoglobinopatías estructurales
— Hemoglobinopatía S (anemia falciforme) y otras hemoglobino-
patías estructurales
— Hemoglobinas M (Metahemoglobinemia)
b) Talasemias
— a-talasemia
— 5-talasemia
— Oß-talasemia
— Hemoglobina Lepore
— Hemoglobinas con alargamiento de una cadena globínica.

3. ERITROENZIMOPATIAS
a) Déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD)
b) Déficit de piruvatokinasa (PK)
e)Déficit de fosfoglucosaisomerasa
d) Déficit de Pirimidina 5'-nucleotidasa (P5N)
e) Enzimopatías con afectación y/o muscular
— Déficit de Triosa fosfatoisomerasa (TPI)
— Déficit de Fosfofructokinasa (PFK)
— Déficit de Fosfogliceratokinasa (PGK)
— Déficit de Glutation sintetasa (GS)
f) Exceso de Adenosina deaminasa

317
se acompaña de esplenomegalia (palpable o radiológica) y/o signos de
litiasis biliar debe considerarse siempre un mecanismo crónico. La litiasis
biliar en un niño o en un sujeto joven es en muchos casos el primer sigilo
clínico de la EH, la cual, al igual que otras formas de anemia hemoltfica
crónica, suele acompañarse de alteraciones óseas características tales cornO
deformaciones craneofaciales e imágenes radiológicas peculiares («cráneo
en cepillo»). Por el contrario, la aparición de una anemia aguda accmp a
-fiademsónorcua(hemglbinr)uscadepl-
nomegalia, debe orientar hacia una hemólisis por defecto del poder red uc-
tor eritrocitario (déficit de G6PD). En este caso el interrogatorio debe
descartar la existencia de ingesta previa de medicamentos o habas.
La asociación de anemia hemolítica crónica no esferocítica (AHCNE)
a manifestaciones extrahematológicas tales como transtornos neurológicos
o musculares, deben orientar el diagnóstico hacia ciertos defectos cong é
-nitosdelmab,ridexcponals(éfitdrwne"
rasa, fosfogliceratokinasa y fosfofructokinasa) ").

3. Exámenes hematológicos básicos

Los exámenes hematológicos básicos son, excepto la morfología e ritro-
citaria, de escasa ayuda en la catalogación etiológica de una anemia errio-
lítica congénita no hemoglobinopática.
El hemograma suele caracterizarse por una anemia de intensidad va-
riable, normocroma y normocítica que se acompaña de un aumento, en
general intenso, del número de reticulocitos. Los índices eritrocitario5 sue"
len hallarse dentro de los límites normales excepto el volumen corpuscular
medio (VCM) que puede estar aumentado ( > 100 fl) especialmente cu and°
la cifra de reticulocitos es elevada. En un síndrome hemolítico secundario
a un trastorno estructural de la membrana conocida como piropoiq uilo-
citosis congénita (" 7 ) se ha descrito una gran disminución del VCM ( > 25
fl). Las alteraciones de la concentración corpuscular media de la hert ogi°-
bina (CCMH) pueden ser orientativas de ciertos trastornos de la n enl-
brana eritrocitaria tales como la EH, ciertas formas raras de alteración con-
génita de la misma (estomatocitosis y desincocitosis congénitas). En la e°
y desicocitosis congénita el valor de CCMH suele hallarse aumentado o en el
límite superior de normalidad ( > 36 g/d1) mientras que en la estomac tosis
congénita, caracterizada por un aumento del contenido acuoso eritroc tari°
(hidrocitosis), el valor de la CC1V1H suele hallarse disminuido (26-28 g/d1) (52)'
Al contrario de lo que sucede con los parámetros hematológicos bási"
cos, el examen de la morfología eritrocitaria a partir de un frotis sanguíneo
correctamente realizado y teñido puede ser de gran valor diagnóstico. Debe
tenerse en cuenta, no obstante, que la realización del frotis somete a los
hematíes a unos efectos mecánicos capaces de producir deformacion es Y
aplanamientos que en ocasiones pueden enmascarar pequeñas alteraciones

318
Mo rfológicas ( 3 ) • Ello puede evitarse mediante la observación directa en el
M icroscopio óptico de una muestra de sangre total fijada inmediatamente
después de la extracción, en glutaraldehido ( 1 ') o mediante el empleo del
Mi croscopio electrónico de barrido (MEB). Con todo, un buen frotis sanguí-
neo correctamente realizado y teñido permite, en la mayoría de los casos,
est ablecer el diagnóstico. Tal sucede en la EH donde los hematíes se carac-
te rizan por su pequeño diámetro y su mayor contenido hemoglobínico (es-
fer ocitos). Otra alteración morfológica fácil de apreciar mediante el simple
e xamen morfológico de los hematíes es la eliptocitosis congénita, caracteri-
zada por la presencia en sangre periférica de un porcentaje superior al 25 %
de eliptocitosis o hematíes ovalo-eliptocíticos.

Las eritroenzimopatías congénitas no suelen, en general, acompañarse

de alteraciones morfológicas eritrocitarias características aunque cuando
existen son de gran valor diagnóstico. Tal sucede en el déficit de G6PD
intnediatamente después de una crisis hemolítica aguda, donde se puede
ap reciar una distribución anómala de la hemoglobina por la cual esta se
h alla concentrada en uno de los extremos del hematíe. Tales hematíes reci-
ben el nombre de «eccentrocitos» (Fig. 1) y ponen de manifiesto una falta
de poder reductor eritrocitario frente a los agentes oxidantes ( 19 ). Las en-

F IGURA 1: Eccentrocitos en un caso de déficit de G6PD y Favismo (MGGx800).

tro enzimopatías de las glucosis anaerobia y especialmente el déficit de
Pir uvato kinasa (PK) suelen acompañarse de transformación equinocítica
de los hematíes por la cual algunos de ellos se observan mediante el MEB
Corno esferocitos con una superficie repleta de prominencias cortas y dis-
Puestas regularmente (Fig. 2). En estos casos los «equinocitos» constituyen
la expresión morfológica del descenso del ATP eritrocitario ( 3 ) y pueden ser
täe ilmente diferenciados de los acantocitos propios de la abetalipoproteine-
n'Ida congénita o de otras alteraciones secundarias a trastornos del meta-
bo lismo lipídico (Fig. 3). Finalmente en el déficit de pirimidina 5'nucleoti-

319
dasa (P5'N) es características la presencia de abundante punteado basófil°
debido a una incompleta degradación del RNA como consecuencia de la en-
zimopatía (2'

4. Métodos diagnósticos específicos

Cuando por la clínica y los exámenes hematológicos básicos el diag"
nöstico se orienta hacia un defecto corpuscular congénito debe estudiarse
la localización del mismo mediante el empleo de métodos más específicos . Si
el examen morfológico de los hematíes demuestra la presencia de abuil -

FIGURA 2: Equinocito visto mediante el Microscopio Electrónico de Barrido

(MEB).

FIGURA 3: Acantocito (MEB) en un enfermo afecto de abetalipoproteine1Tli3

(acantocitosis) congénita.

320
d antes esferocitos, la práctica de una resistencia osmótica eritrocitaria
(ROE) permitirá completar el diagnóstico. Por el contrario, si las altera-
ciones morfológicas no son orientativas, deberá procederse a descartar una
e nzimopatía, una hemoglobinopatía estructural o una alteración de mem-
b rana diferente a la EH o eliptocitosis congénita.

4. 1. Alteraciones congénitas de la membrana eritrocitaria

Recientemente se ha atribuido gran importancia a la elevada capacidad

de deformación (deformabilidad eritrocitaria) como factor decisivo en la
supervivencia normal de los hematíes en la circulación sanguínea. Gracias
a su deformabilidad estas células pueden circular a lo largo de capilares
cuyo calibre es muy inferior al de su propio diámetro ( hm) y atravesar la
in icrocirculación esplénica ( 2 ). Esta propiedad depende de tres factores: a)
la forma del hematíe o relación superficie/volumen, b) la viscosidad hemo-
globínica y c) las propiedades viscoelásticas de la membrana. La alteración
de uno o varios de estos factores dificulta el paso de los hematíes a través

TABLA II

ALTERACIONES MORFOLOGICAS ERITROCITARIAS

MAS DESTACADAS QUE PUEDEN APARECER EN EL CURSO
DE DIVERSAS ENFERMEDADES

ENFERMEDAD ,4LTERACION MORFOLOGICA

— ANEMIA HEMOLITICA AUTO- ESFEROCITOS Y MICROESFE-

INMUNE
— a BETALIPOPROTEINEMIA
CONGENITA (ACANTOCITO-
SIS)
— HEPATOPATIAS CRONICAS
— INSUFICIENCIA RENAL
CRONICA
— ANEMIA HEMOLITICA MI.
CROANGIOPATICA
— MIELOFIBROSIS CON META-
PLASTA MIELOIDE
— ANEMIA FERROPENICA
— ANEMIA MEGALOBLASTICA
Y PERNICIOSA
— ALCOHOLISMO CRONICO
DISERITROPOYESIS ADQUI-
RIDA
ROCITOS
ACANTOCITOS («spur-cells»)
ACANTOCITOS y/o DIANOCITOS
ESQUINOCITOS («burr-cells»)
ESQUISTOCITOS (HEMATIES
EN CASCO)
DACRIOCITOS (HEMATIES EN
LAGRIMA)
ELIPTOCITOS, DIANOCITOS,
MICROCITOS
NIACROOVALOCITOS
MACROCITOS
ANISOPOIQUILOCITOSIS, ANI-
LLOS DE CABOT, PUNTEADO
BASOFILO.

321
de la microcirculación y especialmente del «filtro esplénico» produciendo
su rotura en el interior de los capilares (hernölisis extravascular) ( 2 "). La
alteración de la forma puede apreciarse mediante el simple examen morfo-
lógico del frotis sanguíneo o el de una suspensión de hematíes fijados en
glutaraldehido, y en muchos casos es suficiente para orientar etiológiea-
mente un determinado proceso patológico. Las alteraciones de la membrana
se acompañan casi siempre de modificaciones morfólógicas que muchas
veces son secundarias a procesos patológicos diversos (Tabla II) pero que
en casos más raros obedecen a defectos intríneco o congénitos de la misma
(2j.

La anemia hemolítica crónica por defecto congénito de la membrana,

es, excepto la EH y EC, de diagnóstico difícil ya que en la mayoría de los
casos su mecanismo íntimo se desconoce. No obstante, y debido a que el
número de pacientes con anemia hemolítica «corpuscular» no eritroenzim o-
pätica ni hemoglobinopática que quedan sin catalogación etiológica es rela-
tivamente elevado (aproximadamente un 15-20 %) el interés por el estudio
de la membrana eritrocitaria ha aumentado notablemente en los últimos
arios ('"). Las principales alteraciones congénitas de la membrana eritr°-
citaria identificadas hasta la actualidad vienen resumidas en la Tabla 1 y
entre ellas destaca por su frecuencia la Esferocitosis Hereditaria.
4.1.1. Esferocitosis Hereditaria (EH). En nuestro medio la EH cons
la causa más frecuente de anemia hemolítica constitucional o con"-tiuye
génita, por lo que los métodos aplicados a su dianóstico son de gran interés
clínico. Aunque la historia clínica del paciente o la existencia de anteceden"
tes familiares son, en general, muy orientativos, el diagnóstico viene confir"
mado siempre por la presencia de un número variable de esferocitos en
sangre periférica y un descenso de la resistencia osmótica eritrocitaria
(ROE) especialmente después de incubar la sangre 24 horas a 37° C (11'
Las características de la curva de ROE varían de acuerdo con el porcentaje
de esferocitos (Figura 4) el cual a su vez puede variar ampliamente de un
enfermo a otro. Ello obedece a las características especiales de penetrancia
genética de ésta enfermedad por la cual pueden existir sujetos afectos en
los que prácticamente no se observan esferocitos ni manifestaciones afín-
cas de ningún tipo (portadores asintomáticos). En tales casos el estudio de
la ROE carece de la sensibilidad suficiente para confirmar el diagnóstico
y es necesario recurrir a métodos menos habituales y que no siempre Per-
miten establecer el diagnóstico de forma definitiva. Entre ellos destaca n el
microscopio electrónico de barrido (MEB) y el estudio «in vitro» de la
deformabilidad eritrocitaria (

El Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) permite apreciar e°11

mayor precisión y detalle la morfología eritrocitaria ya que se parte de una
suspensión sanguínea y se evita el efecto mecánico producido sobre los he-
matíes al realizar el frotis. Mediante esta técnica se ha podido apreciar qUe
en la mayoría de los casos de EH, los esferocitos propiamente dichos con,'
tituyen sólo una pequeña fracción del total de hematíes, siendo la mayo

322
de ellos discocitos o estomatocitos en diferentes etapas de transformación
diseo-estomatocitica (Figuras 5 y 6). Debido a que la EH suele acompañarse
de un importante estímulo eritropoyetico con salida a sangre periférica de
lunnerosos reticulocitos inmaduros (Reticulocitos tipo I), éstos pueden ser
ta mbién fácilmente apreciados mediante el MEB (Fig. 7).

El estudio de la defonnabilidad eritrocitaria puede constituir también

u n método diagnóstico complementario por cuanto los esferocitos y esto-
In atocitos son menos deformables que los hematíes normales ( 2 '). La defor-
//l abilidad eritrocitaria puede determinarse mediante diferentes métodos

100

u)
O
50
o
ae

5 6
NaCI (g/1)

'F IGURA 4: Curva de ROE sin incubación. A (5-10% de esferocitos) B (10-60 %

de esferocitos) y C (> 60 % de esferocitos).

F IGURA 5: Esferoestomatocito III (MEB) o etapa previa al esferocito en la

transformación discocito-estomatocito.

323
 FIGURA 6: Esferocito (MEB) en un enfermo afecto de esferocitosis
hereditaria (EH).

FIGURA 7: Reticulocito desviado o tipo I (MEB).

entre los que destacan la viscosimetría ( 2 '1 3 '), la filtración ("), la micro'
pipeta (") y la ektacitometría ("). En la práctica, el sistema más asequible
para el estudio de la deformabilidad eritrocitaria es la filtración de sangre
total o hematíes lavados a través de filtros («Nucleopore"R) de diámetro
preestablecido (en general 5 /un) (26).

Debido a que el mecanismo intrínseco del defecto de membrana en la

EH se desconoce aunque se atribuye a la alteración congénita de alguna
proteína del citoesqueleto ( diversos autores han estudiado su composi-
ción proteica mediante el estudio electroforético de las proteínas solubili"

324
 z adas en dodecilsulfato sódico (SDS). Los resultados obtenidos hasta la
actualidad han sido, no obstante, contradictorios ( 6 3 6 ).

4.1.2. Otras alteraciones congénitas de membrana eritrocitaria. A la

41 le sigue en frecuencia la eliptocitosis congénita (EC) caracterizada por
la Presencia en sangre periférica de eliptocitos en porcentaje superior al
25 % del total de hematíes. A diferencia de la EH, el número de enfermos
cort EC que presentan clínica de anemia hemolítica crónica es inferior al
10 % por lo que su diagnóstico diferencial debe establecerse con otras en-
fermedades que pueden acompañarse de eliptocitosis secundaria tales como
la anemia ferropénica y megaloblástica, la talasemia y ciertos síndromes
Inieloproliferativos (32).

Recientemente y gracias al desarrollo de nuevos métodos diagnósticos

Se han descrito otras alteraciones congénitas de la membrana entre las que
destacan la piropoiquilocitosis congénita (PPC) y los trastornos congénitos
del transporte Na+1K+ (estomatocitosis y desicocitosis congénitas).

TABLA III

ALTERACIONES CONGENITAS DE LA PERMEABILIDAD IONICA

NORMAL HIDROCITOSIS DESICOCITOSIS

k)b
I ic (Na+)

11441/1)
4-10 98 I, 19

; IO (K+)
1) 96-104 40 60

+ K+) IONES
<c„11)
... 100-104 138 I, 79
TOTALES

INTRA CELULAR 68 % 77.6 % 58.7

OLOGIA DISCOTICOS DESICOCITOS

WCITARIA ESTOMATOCITOS

14) 32-36 36
32
' ik-e sistencia osmótica
NORMAL AUMENTADA
:itaria. DISMINUIDA

PERMEABILI- 4, PERMEABILI-
MECANISMO DAD PASIVA Na+ I DAD PASIVA K+

: 325

Ä
 La PPC fue descrita por Zarkowsky y colaboradores ("') y se caracteriza
por un aumento de la membrana eritrocitaria a la sensibilidad térmica. Su
diagnóstico puede realizarse incubando los hematíes del paciente a --F . 44 0 y
observando la aparición de intensa anisocitosis, poiquilocitosis, microesf ero-
citosis y abundantes formas bizarras. En los hematíes normales estas alter a
500C
-cionesmrflógapcenhstqulamrcnzos
•
(") La PPC se acompaña de un descenso muy intenso del VCM que Puede
llegar a alcanzar valores próximos a 25 fl.

Los trastornos congénitos del transporte jónico obedecen a un defect°

de la membrana por el cual existe un aumento de la permeabilidad pasiva
al sodio (estomatocitosis congénita o hidrocitosis) o al potasio (desicocitosis
o xerocitosis) ( 2 ') (Tabla III).

En la estomatocitosis congénita debido a la mayor permeabilidad Pasi-

va al sodio, éste presenta una concentración intraeritrocitaria superior a la
normal. Este defecto no es compensado por una suficiente salida de potasio
y el contenido iónico global así como el del agua intraeritrocitaria se hallan
aumentados (hidrocitosis). La alteración morfológica de este síndrome sera
la estomatocitosis o hematíes con una hendidura en su región central
(Figura 8). El mayor contenido acuoso del hematíe tiene como consecuencia
una dilución de la hemoglobina y un descenso de la CC1V1H ( < 30 gic11).

En la desicocitosis (xerocitosis, para algunos autores), el aumento de la

permeabilidad pasiva del potasio produce una disminución de la concentra'
ojón eritrocitaria de este ion que no llega a ser compensada por un aument°,
del contenido en sodio. Debido a ello, la concentración jónica global asi
como el contenido acuoso del hematíes se hallan disminuidos (deshidratación
eritrocitaria) dando lugar a alteraciones morfológicas eritrocitarias Pecti-
liares (desicocitos) fácilmente apreciables mediante el MEB (Fig. 9). t3

FIGURA 8: Estomatocitos (MGG x 1000)

326
FIGURA 9: Desicocitos (MEB) o hematíes con forma «bizarra» que asemeja
una silla de montar.

d eshidratación eritrocitaria condiciona una mayor concentración hemo-

globínica y por tanto de la CCMH ( < 36 g/dl).
Debido a que las otras formas de anemia hemolítica congénita incluida
la EH no suelen cursar con alteraciones de la concentración iónica intra-
eritrocitaria, el diagnóstico de la estomatocitosis y decicocitosis congénitas
Precisan de la determinación del contenido en sodio y/o potasio eritrocita-
rio lo cual suele realizarse mediante un fotómetro de llama como el que
normalmente se usa en clínica para determinar el sodio y potasio plasma-
ticos (").

4.2. Eritroenzimopatías

Desde la descripción del déficit de G6PD por Carson y colaboradores

en el ario 1956 ( ' 2 ) el conocimiento de las eritroenzimopatías como causa
de hemölisis congénita ha experimentado un gran avance. En la actualidad
existen descritas deficiencias congénitas de prácticamente todas las enzi-
mas de la glucOlisis anaerobia algunas de las cuales se acompañan sólo
de AHCNE pero otras de manifestaciones extrahematológicas tales como
t rastornos neurológicos o musculares (Tabla 1). No obstante, las eritroen-
z imopatías más frecuentes son el déficit de G6PD, PK, glucosafosfatoiso-
merasas (PGI), y probablemente el de P5N, por lo que en presencia de una
elnica compatible el diagnóstico deberá orientarse hacia alguna de ellas
(") • En la actualidad diferentes procedimientos informan desde la simple
existencia de un déficit de actividad enzimática hasta las características y
Mecanismos moleculares de la enzimopatía (1 3 ).

4.2.1. Estudio de la actividad enzimática. La detección de una eritro-

enzimopatía puede hacerse de dos formas: a) mediante métodos cualita-

327
tivos y b) mediante métodos cuantitativos o análisis propiamente dicho
de la actividad enzimática.

Los métodos cualitativos se han aplicado principalmente a la detección

o despitaje del déficit de G6PD y con mucho menor éxito al de otras enzi-
mopatías de la glucólisis eritrocitaria ('"). Para la detección cualitativa del
déficit de G6PD el Comité Internacional para la Estandarización en H e -
matología (ICSH) recomienda la llamada prueba de la «mancha fluor es
( 9 ) que debido a la sencillez de su realización (Figura 10) puede ap1i--cent»
10,.!
100/41
O

__>10/41
10'
Whatman n°1

G6P NADP* 8 340 nm

I G6PD
6PG NADPH2
640 nri2;',.•\

FLUORESCENCIA

FIGURA 10: Prueba de la mancha fluorescente para el diagnóstico del déficit

G6PD. R: Mezcla reactiva, Whatman 0'1 papel de filtro. S: Sangre.

carse al escrutinio de numerosos casos simultáneamente o al estudio de

poblaciones ( 34 ). Asimismo, la presencia de mosaicismo en las mujeres
portadoras o heterozigotas para el déficit de G6PD puede ponerse también
fácilmente de manifiesto mediante un método citoqumico basado en inca-
pacidad de los hematíes deficientes en G6PD para reducir la metahem o-
globina Los métodos cualitativos aplicados a la detección del déficit
de PK se han basado también en el principio de la «mancha fluorescente"
y son por tanto similares a los empleados para el déficit de G6PD ( 5 ). No
obstante las características moleculares del déficit de PK, diferentes a las
del de G6PD, dan lugar a frecuentes falsos negativos» que en cierta forma
invalidan la fiabilidad del método para detectar esta enzimopatía ( I " ).

Los métodos cuantitativos son los únicos recomendados para la con-

firmación diagnóstica de una eritroenzimopatía ( 13 ). En general, aunque
con ligeras diferencias, todos ellos se basan en la elaboración de una reac-
ción enzimätica específica consistente en la mezcla de substrato/s, coen
e iones en un medio tamponado donde la enzima a estudiar cons--zima/s,
tituye la etapa limitante. A esta reacción se acopla la transformación de
un nucleótido adenílico (NAD o NADP) deSde su forma oxidada a reducida

128
O viceversa. Debido a que el NADH y el NADPH presentan una absorción
específica a 340 nm, la medida espectrofotometrica de su velocidad de for-
mación o desaparición permitirá determinar la actividad enzimática. (Fi-
gura 11).

NADP (P) NAD (P) H
2

P
v=
At

1U = CANTIDAD DE ENZIMA NECESARIA

PARA PRODUCIR 1 p. MOL DE P POR
MINUTO A 37° C.

FIGURA II: Fundamento del método para la determinación de la actividad

de las enzimas eritrocitarias. E: Enzima; S: Substrato; P: Producto.

El análisis cuantitativo de las actividades enzimáticas eritrocitarias se

realiza a partir de hemolizados totalmente desprovistos de contaminación
leucocitaria. Esto es especialmente importante en la determinación de
la actividad PK ya que el déficit eritrocitario de esta enzima se acompaña
de una actividad PK leucocitaria normal o incluso elevada, de forma que
la contaminación del hemolizado por leucocitos podría enmascarar la de-
tección de la enzimopatía ( i "). Al objeto de sistematizar la metodología apli-
cada al análisis de las actividades enzimáticas eritrocitarias, en la práctica
clínica el ICSH ha unificado la preparación del hemolizado y ha estandari-
zado los diferentes métodos de análisis correspondientes a cada una de

329
 TABLA IV
VARIACIONES FISIOLGICAS DE LAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS

1. AUMENTO DE ACTIVIDAD
* Reticulocitos y Hematíes fetales
— Hexokinasa
— Aldolasa
— Triosafosfatoisomerasa
— Piruvatokinasa
— Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
— Fosfogluconato deshidrogenasa

Hematíes fetales exclusivamente

— Fosfoglucosaisomerasa
— Glicerinaldehido 3 fosfato deshidrogenasa
— Fosfogliceratokinasa
— Enolasa

2. DISMINUCIONES DE ACTIVIDAD
Hematíes fetales
— Fosfofructokinasa
— Adenilatokinasa
— Glutationperoxidasa
— Acetilcolinesterasa
— NADPH-metahemoglobina reductasa (diaforasa)
* Diseritropoyesis adquirida
— Piruvatokinasa
— Adenilatokinasa

las enzimas a determinar ('). La elaboración de esta metódica ha supuest°

una gran mejora en la detección de cualquier enzimopatía pero especial"
mente de la del déficit de PK ya que evita por completo la contaminación
leucocitaria del hemolizado y permite además detectar variantes con cialé"
tica anormal en las que el déficit sólo se manifiesta cuando la enzima se
halla en presencia de pequeñas concentraciones de substrato. En tales
casos, si se utiliza el método convencional, es decir, una concentración
saturante de substrato, la enzimopatía puede pasar desapercibida ( 7 13)*

Asimismo en la interpretación de los resultados de un estudio enzilná-

tico eritrocitario debe valorarse siempre la edad del paciente y el númer°
de reticulocitos. En los recién nacidos y niños menores de un ario ciertas
enzimas presentan una actividad inferior a la de la edad adulta (deficiell"

330
cias enzimáticas fisiológicas) ,por lo que si este hecho no se considera ade-
c uadamente, pueden producirse importantes errores de interpretación (")
(Tabla IV). El número de reticulocitos es importante por cuanto éstos
Poseen actividades enzimáticas en muchos casos varias veces superiores
a las del hematíe adulto. Debido a ello, un exceso de reticulocitos puede
t ambién enmascarar un déficit enzimático produciendo una falsa «activi-
dad normal» en enzimas que por la cifra de reticulocitos, deberían presen-
tar una actividad varias veces superior a la normal (30).

4.2.2. Estudio de las propiedades moleculares. Una vez identificada

l a enzimopatía y siempre que sea posible, es aconsejable realizar un aná-
l isis de sus propiedades moleculares.

Estos estudios escapan del interés clínico inmediato pero son muy
Útiles para comprender mejor el mecanismo fisiopatológico de la hemólisis.
La enzimopata mejor estudiada desde este punto de vista es el déficit de
G 6PD. Esta enzimopatía junto a su frecuencia, se caracteriza por un ele-
vado polimorfismo genético, de forma que en la actualidad se han descrito
a lrededor de 150 variantes moleculares distintas, muchas de las cuales
son asintomáticas pero otras (aproximadamente 64) se acompañan de
ACHNE ('). Debido al interés genético que suponen los estudios molecula-
res del déficit de G6PD, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha
si stematizado su metódica al objeto de que los resultados obtenidos en
d iferentes laboratorios sean comparables ('). Los parámetros moleculares
recomendados para identificad una variante así como la clasificación general
d e las variantes más frecuentes se resumen en las (Tablas V y VI).

Recientemente el ICSH ha estandarizado también la metódica para el

es tudio molecular de la PK al objeto de poder identificar sus posibles va-

TABLA V

PARAMETROS IMPRESCINDIBLES PARA LA CARACTERIZACION DE LA

G6PD (OMS, 1967)

" ACTIVIDAD ERITROCITARIA (U/g Hb)

" MOVILIDAD ELECTROFORETICA EN GEL DE ALMIDON A pH 8.0
" AFINIDAD APARENTE POR LOS SUBSTRATOS
a) GLUCOSA-6-Fosfato (Km-G6P)
b) NADP (Km-NADP)
UTILIZACION DE LOS ANALOGOS DEL SUBSTRATO
a) 2 Deoxiglucosa-6-fosfato (2dG6P)
b) deamino NADP (D-amino NADP)
CURVA DE pH OPTIMO
--- ESTABILIDAD TERMICA A 46° C.

331
riantes ( 23 ). No obstante, tanto ésta como la correspondiente a la G6PD, se
hallan sólo al alcance de laboratorios especializados o de Referencia.

TABLA VI

CLASIFICACION GENERAL DE LAS VARIANTES DE G6PD

DE ACUERDO CON SUS CARACTERÍSTICAS CLINICO-MOLEULARES

CLASE ACTIVIDAD PROPIEDADES MOLECULARES CLINICA

INESTABILIDAD HEMOLISIS
0%
CINETICA DESFAVORABLE CRONICA

ASINTOMATICA
INESTABILIDAD
2 5-10 % HEMOLISIS
CINETICA FAVORABLE
AGUDA

ASINTOMAT1CA
10-40% VARIABLE HEMOLISIS
AGUDA

60-100 % VARIABLE ASINTOMATICA

AGRADECIMIENTOS
Queremos expresar nuestro agradecimiento a las srtas. M. José Ferrän
y Ni. José Insá por su asistencia técnica en la elaboración de la iconografía
de MEB presentada en este trabajo y a la srta. Teresa Martínez por sti
labor de mecanografiado.

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