Curso de Farmacología General 2018

Química y Farmacia
Guía de Trabajo Práctico: Metabolismo de Fármacos

Marco teórico
El conocimiento de las vías metabólicas de nuevas moléculas es muy importante para
predecir sus parámetros farmacocinéticos que finalmente determinan su dosis y régimen
de dosificación. La caracterización de las reacciones de metabolización, al menos a nivel
cualitativo, permite determinar posibles interacciones entre fármacos a nivel metabólico,
que pueden afectar la eliminación individual de cada uno de ellos. Los estudios in vitro de
metabolización de fármacos se realizan generalmente usando microsomas hepáticos, las
cuales son estructuras artificiales derivadas del retículo endoplásmico que se forman
durante el proceso de homogenización celular y que son purificadas mediante
ultracentrifugación. Los microsomas contienen enzimas de membrana asociadas a la
metabolización de fármacos como las enzimas del citocromo P450 (reacciones de fase I) y
transferasas como la UDP-glucuronosiltransferasa, una de las enzimas más importantes en
las reacciones de Fase II. Sin embrago, los microsomas no contienen enzimas solubles y
tampoco los cofactores necesarios para las reacciones de metabolización, los que deben ser
suplementados en las reacciones in vitro.

La expresión de las enzimas responsables del metabolismo de fármacos puede ser inducida
por la administración de algunos fármacos o agentes químicos. Este efecto se verifica
mediante un aumento de la expresión de los genes que codifican para enzimas del
citocromo P450 o transferasas de Fase II. El pirazol, compuesto orgánico que actúa como
un inhibidor de la deshidrogenasa alcohólica, también ha mostrado ser un potente inductor
de la expresión del CYP450 y transferasas en el hígado de ratas y/o ratones tratados
sistémicamente con este compuesto.

La cumarina es un flavonoide con múltiples aplicaciones industriales y farmacéuticas. Un

derivado de la cumarina, la 4-hidroxi-cumarina, posee acciones anticoagulantes y es el
principio activo de numerosos medicamentos indicados para el tratamiento y prevención
de condiciones tromboembólicas. En humanos la cumarina es metabolizada en Fase I por el
citocromo P450 a 7-hidroxicumarina. Este metabolito es posteriormente transformado en
fase II al conjugado 7-0-glucuronido de cumarina por acción de la enzima UDP-
glucuronosiltransferasa, el que finalmente es excretado vía renal (Figura 1). Un
metabolismo similar de la cumarina se verifica en ratones y ratas.

Figura 1. Estructura de la cumarina y sus metabolitos principales

Aprovechando las diferencias en las propiedades fluorescentes de los metabolitos 7-

hidroxicumarina y 7-0-glucuronido de cumarina, en este trabajo práctico se desarrollará un
ensayo in vitro para demostrar la transformación del metabolito fluorescente 7-
hidroxicumarina en el conjugado no fluorescente 7-0-glucuronido de cumarina por acción
de la enzima UDP-glucuronosiltransferasa presente en microsomas hepáticos de ratón.
También se evaluará el efecto de la inducción enzimática resultante del tratamiento previo
de los animales con pirazol.

Materiales:

1. Suspensión de microsomas hepáticos de ratón control

2. Suspensión de microsomas hepáticos de ratón tratado previamente con pirazol
3. Solución de 7-hidroxicumarina 100 µM
4. Tampón sustrato (Tris-HCl 100 mM, MgCl2 2,5 mM, pH 7,4)
5. Tris-HCl 100 mM, pH 7,4
6. Ácido Uridin-difosfoglucoronico trisodico (UDPGA) 5 mM en Tris-HCl 100 mM pH 7,4
7. Microtubos de 1,5 mL
8. Baño termorregulado
9. Lámpara UV
Procedimiento:

1. Usted recibirá dos 2 tubos conteniendo aproximadamente 60 µL de microsomas de

ratón control o inducido con pirazol. Manténgalos siempre en hielo.
2. En microtubo de 1,5 mL monte las siguientes mezclas de reacción:
Tubo/reactivo 1 (Control) 2 3
Microsomas --- 50 µL 50 µL
7-hidroxicumarina 100 µM 50 µL 50 µL 50 µL
Tampón Sustrato 300 µL 300 µL 300 µL
Tris-HCl 100 mM pH 7,4 100 µL 50 µL 50 µL

3. Mezcle suavemente mediante inversión e incube a 37°C durante 5 minutos en el baño

termorregulado.
4. Agregue a cada tubo 50 µL de UDPGA 5 mM, mezcle suavemente mediante inversión.
5. Observe los tres tubos bajo luz UV y anote sus observaciones. Tenga precaución de no
exponer su piel ni sus ojos a la luz UV.
6. Regrese y mantenga los tubos a 37°C en el baño termorregulado y repita la observación
bajo luz UV a los 10, 20, 30 y 60 minutos de iniciada la reacción. Anote sus
observaciones.
7. Según sus observaciones, en el informe que se adjunta indique cuál de las muestras de
microsomas provenía de un ratón control y cual de un ratón inducido con pirazol.
Informe Trabajo Práctico “Metabolismo de Fármacos”

Nombres: Fecha:

Número de la muestra de microsoma control: …………………………..

Número de la muestra de microsoma inducido: ……………………………

Justifique su elección: