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OBJETIVO GENERAL:
Conocer algunos métodos de determinación colorimétrica y espectrofotométrica para
concentración de proteínas en matrices liquidas y sólidas.
Objetivos específicos:
a) Obtener el espectro de absorción del colorante E123.
b) Determinar el coeficiente de absortividad molar K del colorante E123.
c) Determinar la concentración de una muestra problema.
FUNDAMENTO TEORICO
La espectrofotometría es una de las técnicas instrumentales más utilizadas para la
detección especifica de las proteínas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.) y
estado de agregación (sólido, líquido, gas).
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía
interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el
de la fotosíntesis en plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está
compuesta de fotones cada uno de los cuáles tiene una energía:
onda fija λ e intensidad I0. Este haz de luz penetra en la cubeta de análisis donde se
encuentra la muestra. Un detector sensible a la luz mide la intensidad del haz a la salida
If.
lo cual da lugar a la Ley de Lambert – Beer para la absorción que relaciona la intensidad
a la salida de la muestra I f , con la intensidad inicial I0, la concentración de moléculas y
la distancia recorrida por la luz en la muestra, L:
PROCEDIMIENTO
PARTE A
Actividad 1.- Preparación de las disoluciones colorantes
Preparación de 4 disoluciones patrón de colorante E-123 a partir de una disolución
concentrada del colorante (concentración 0,15 g/l de colorante rojo E-123) que se
proporciona ya preparada.
Cada grupo utilizará la disolución concentrada para preparar las siguientes 4
disoluciones más diluidas que serán las que se midan en el espectrofotómetro:
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué, en el caso concreto del colorante considerado, no era necesario usar un
tampón de pH, sino que se realizaron las medidas en agua destilada sin tampón?
Recurrir a datos de la literatura para contestar a esta pregunta.
3. La absortividad molar de una solución del complejo formado por Bi(III) y tiourea es
9,32x103 L/mol x cm a 470 nm. ¿Cuál es la absorbancia de una solución 3,79x10-5M
de este complejo si se mide a 470 nm en una celda de 1 cm?
5. Una solución de clorofila en etanol cuya concentración es de 0,08 mg/mL tiene una
Abs de 0,8 y una solución de clorofila de concentración desconocida tiene una Abs
de 0,120. Diga: a) ¿Qué coloca en el tubo blanco? b) ¿Cuántos mg de clorofila hay
en un mL de la solución problema? c) ¿Cuántos mg en un L?
ANEXO
Este colorante, al igual que la mayoría de los colorantes de su clase y de otras clases,
puede perder un protón (H+) en medio básico:
En las condiciones en las que se realiza esta práctica, el color se debe a la molécula
neutra. A menudo, el anión correspondiente tiene otro color o es incoloro. Esto se podría
comprobar en la práctica echando unas gotas de NaOH 1 M a una pequeña cantidad de
la disolución 4. También sería posible, en una ampliación a la práctica, medir el espectro
de un segundo colorante y ver como interfiere en la determinación de la concentración
de E-123.
MANUAL DE LABORATORIO DE CINÉTICA 6
BIOQUÍMICA