Professional Documents
Culture Documents
Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos
Modulares para o Melhoramento do Tratamento ou Diagnóstico do Envenenamento Crotálico
Marcos B. Luiz,1,2 Soraya S. Pereira,1 Nidiane D. R. Prado,1Naan R. Gonçalves,1 Anderson M. Kayano,1 Leandro S. Moreira-Dill,1Juliana C. Sobrinho,1 Fernando B. Zanchi,1 André L. F
Informações do autor ► Notas do artigo ► Informações sobre direitos autorais e licença ► Isenção de responsabilidade
Recentemente, a Organização Mundial da Saúde (OMS) restabeleceu o envenenamento por picadas de cobra em seu portfólio de Doenças Tropicais Negligenciadas
[ 1 ]. Essa classificação pode ajudar a intensificar o combate a esse problema de saúde pública, especialmente na África, Ásia, Oceania e América Latina, onde cerca
de 20.000 a 90.000 pessoas morrem de acidentes ofídicos, de estimados 421.000 a 1.841.000 casos a cada ano [ 2 ]. No Brasil, durante o período de 2001 a 2012,
cerca de 27.200 casos de acidentes ofídicos e 115 óbitos relacionados foram registrados por ano [ 3 ]. O gênero Bothrops foi responsável pela maioria dos casos
relatados, seguido pelos gêneros Crotalus , Lachesis e Micrurus [ 3 ].
Embora haja menor incidência de envenenamento crotálico, quando comparados aos acidentes ofídicos botrópicos, esses acidentes apresentam a maior taxa de
letalidade (1,87%) [ 4 , 5 ]. O envenenamento é caracterizado por neurotoxicidade e distúrbios de coagulação, juntamente com toxicidade muscular e renal
[ 6 ]. Lesões locais leves, principalmente edema e eritema, podem ser observadas [ 7 , 8 ]. A maioria dos sintomas de envenenamento é causada pelos compostos
proteicos do veneno [ 6 ]. Cerca de 90% do veneno de C. durissus terrificus é composto de proteínas; entre eles estão fosfolipases A 2 (PLA 2 ) [ 9]. Aos 24 kDa, a
CTX, que constitui cerca de 50% do teor de proteína do veneno, é um heterodímero que consiste em um enzimaticamente activa PLA 2da subunidade (CB) e uma
subunidade ácida sem enzimática ou actividade tóxica (CA) [ 10 ]. O CTX é responsável pelos efeitos neurotóxicos, miotóxicos e nefrotóxicos do envenenamento.
O tratamento do envenenamento é realizado pela administração de imunoglobulina G (IgG) ou fragmentos F (ab ') / F (ab') 2 obtidos principalmente de animais
hiperimunizados [ 11 ]. Apesar dos diferentes perfis farmacocinéticos da IgG inteira e fragmentos de anticorpos, não foram observadas diferenças substanciais na
neutralização da atividade tóxica de alguns venenos [ 11 , 12 ]. A segurança terapêutica antivandômica pode ser comprometida por falhas no processo de purificação
do produto [ 11 , 13]. Além disso, a produção industrial de seroterápicos é insatisfatória. A disponibilidade e acessibilidade deficitárias, o alto custo do produto, a
inviabilidade do uso de cavalos em países endêmicos de zoonoses e o baixo número de laboratórios envolvidos na produção são questões que precisam ser
contornadas para melhorar a produção de antiveneno [ 11 , 14 , 15 , 16 ]. Assim, a busca por métodos alternativos e complementares para tratamentos de picada de
cobra é constante [ 17 , 18 ].
Anticorpos monoclonais (mAbs, 150 kDa), propostos como agentes terapêuticos [ 18 , 19 , 20 , 21 ], apresentam uma distribuição semelhante à dos agentes
soroterápicos de primeira geração (IgG policlonais) [ 12 , 22 ]. Além disso, os mAbs requerem humanização [ 23 ] e devem exigir uma preparação oligoclonal contra
as principais proteínas do veneno [ 18 ]. Para além dos mAbs, podem ser obtidas as formas recombinantes F (ab ′) e scFv (fragmento variável de cadeia simples)
[ 24 ]. Com aproximadamente 25 kDa, os scFv são menos imunogênicos e apresentam maior biodistribuição, quando comparados com IgGs inteiros
[ 25 , 26 ,27 ]. Estes fragmentos podem ser produzidos em sistemas de expressão procariótica [ 24 , 28 ]; no entanto, eles têm alta depuração renal [ 29 ]. Assim,
formas multivalentes, como sc (Fv) 2 (~ 60 kDa) e [sc (Fv) 2 ] (~ 120 kDa) foram propostas [ 30 ]. A baixa estabilidade, solubilidade e afinidade dessas moléculas
continuam a ser um desafio para sua aplicação clínica [ 31 , 32 ].
Para além da IgG convencional, os camelídeos produzem anticorpos funcionais desprovidos de cadeias leves e domínios CH1, referidos como anticorpos de cadeias
pesadas de camelídeos (HCAb) com aproximadamente 90 kDa [ 33 ]. O local de reconhecimento de antígeno dos HCAbs é formado por um único domínio chamado
VHH [ 34 ]. Com um tamanho medido em nanômetros e um pequeno peso molecular (15 kDa), o repertório de VHH pode ser recombinado, clonado e expresso em
vetores, utilizando um sistema procariótico na forma solúvel, resultando em fragmentos com alta especificidade antigênica e afinidade [ 35 ]. Uma alta identidade
com VH humano (mais de 80%) justifica a baixa imunogenicidade dos VHHs [ 36]. CDRs mais longas, principalmente CDR3, permitem o reconhecimento de sítios
enzimáticos por VHH, inacessíveis a anticorpos murinos ou humanos [ 37 ]. Além disso, quando comparado a outros fragmentos de anticorpos, os VHHs apresentam
maior estabilidade térmica [ 38 ].
Analisando as características do VHH camelídeo, juntamente com a necessidade de desenvolver antivenenos mais eficazes, este estudo teve como objetivo
selecionar e caracterizar VHHs de Lama glama capazes de inibir as atividades de fosfolipase, citotoxicidade e miotóxica de CTX isoladas de veneno de C. durissus
terrificus .
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 1/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
figura 1
Desenvolvimento de anti-crotoxina VHH. ( A ) monitoramento da resposta imune do lhama. O soro foi diluído para 1:10 6 ( v / v ) e a ligação específica a CTX, CB e CA foi
detectada por ELISA indireto. O animal mostrou uma resposta rápida e forte após a segunda imunização (isto é, no dia 14). O reforço final realizado no dia 28 mostrou
absorção máxima, até cinco vezes a do soro pré-imune; ( B) reatividade clonal de VHHs selecionadas contra CTX, CB e CA (marrom). Após três rodadas de filtração, 220
clones selecionados contra crotoxina e CB e 88 contra CA foram submetidos a ensaios de ELISA. Destes, cinquenta e oito (58), setenta e oito (78) e dois (02) foram positivos,
respectivamente. Todas as medidas foram realizadas em triplicado. Em branco, cinza e preto, os clones positivos nos painéis 1, 2 e 3, respectivamente. O controle negativo
(NC) foi realizado utilizando soro de lhama pré-imune. Barras de erro representam o desvio padrão. Um asterisco (*) indica clones submetidos a sequenciamento de DNA; ( C)
alinhamento da sequência de aminoácidos das VHHs anti-crotoxina. As regiões estruturais (FR), bem como as regiões determinantes de complementaridade (CDR), são
indicadas por setas; duas cisteínas conservadas estão marcadas em vermelho; As substituições de marca registrada VHH no FR2 estão marcadas em azul, em negrito e
sublinhadas. Um par de cisteína adicional, nos clones KF498602 e KF498603 , é sombreado. A proeminência da ansa CDR3 nos clones KF498605e KF498604 , com 21
resíduos de aminoácidos, também é digna de nota. Um cólon (:) representa aminoácidos altamente conservados; um asterisco (*) representa resuos de aminoido idticos; um
período (.) significa aminoácidos um pouco semelhantes, mas diferentes e um branco representa aminoácidos ou intervalos dissimilares.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 2/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
Figura 2
Avaliação da especificidade e termoestabilidade dos VHHs. ( A ) reatividade cruzada de anti-crotoxina VHHs. Reatividade in vitromostrando diferentes níveis de interação de
VHHs selecionados KF498602 ; KF498604 ; KF498605 ; KF498606 com venenos de serpentes e toxinas isoladas. Absorbância obtida pelos ensaios de ELISA realizados em
placas revestidas com 10 µg / mL de cada antígeno e VHH na proporção de 1: 1 ( p / p ). As linhas tracejadas representam o corte. Todas as medidas foram realizadas em
triplicado. Para o controle negativo (NC), o VHH não relacionado foi utilizado em poços revestidos com CTX. Cada valor representa a média ± SEM de amostras em
triplicado; ( B) análise de especificidade das VHHs com CB por Western blot. Imunotransferência demonstrando a interação dos clones selecionados com formas monoméricas
(14 kDa) e multiméricas de CB em uma membrana de nitrocelulose; ( C ) termoestabilidade funcional de VHHs usando ELISA. Porcentagem de sinal em ELISA contra CB
de KF496802 (azul) e KF496804 (verde), após aquecimento de 25 a 95 ° C por 1 h, em comparação com as amostras de pré-aquecimento. Cada valor representa a média ±
SEM de amostras em triplicado.
2.4. Avaliação da Estabilidade Térmica de VHHs Selecionadas e Análise de Interação por SPR
Quando expostas a diferentes condições de temperatura durante 1 h, KF498602 e KF498604 VHHs demonstraram reactividade contra CB em ELISA. Ambos os
clones permaneceram completamente ativos em uma faixa de temperatura de 25 a 55 ° C e acima de 75% quando foram incubados a 85 ° C. Entre 55 e 85 ° C, foi
observada redução na atividade de VHH. No entanto, KF498604 permaneceu 100% ativo, mesmo quando aquecido a 95 ° C ( Figura 2 C).
As afinidades de KF498602 e KF498604 VHHs para CTX foram medidos por SPR. Após obtenção dos sensogramas de ligação e dissociação, os parâmetros
cinéticos, utilizando o modelo de Langmuir 1: 1, com ajuste altamente confiável, evidenciados pelos baixos valores de Chi 2 obtidos (≤ 1 UR), foram determinados
( Tabela S1 ). Enquanto KF498604 mostrou afinidade para CTX em uma faixa nanomolar (KD = 81,3 nM), KF498602 demonstrou uma menor afinidade (KD = 1,7
mM). Injeção de KF498202 a uma taxa equimolar em um chip sensor CM5-CTX, após a saturação do sinal de interação entre CTX e KF498604(91,3 UR),
promoveu um aumento de 113% no ganho de sinal (194,6 UR), sugerindo que esses clones interagem com diferentes determinantes antigênicos da toxina ( Figura 3
A).
Figura 3
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 3/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
Avaliação da interação cinética e capacidade de neutralização dos VHHs. ( A ) análise da interação cinética entre VHHs e CTX por SPR. Grânulos de sensores obtidos após a
injeção de KF498604 e KF498602 , em concentrações de 2,5 a 0,002 μM, em um chip CM5 revestido com crotoxina. KD = constante de afinidade dos clones. Sensorgram
obtido após injeção de KF498604 e co-injeção de KF498602 . O ganho de sinal (103 RU) na superfície do sensorquente após a injecção de KF498602 indica que estes clones
interagem com diferentes epítopos de crotoxina; ( B ) in vitroinibição da atividade da fosfolipase CB e CTX por VHHs selecionados. A análise fluorimétrica da inibição foi
avaliada utilizando fosfolípidos fluorescentes sintéticos e toxinas pré-incubadas com VHH seleccionados durante 30 min a 37 ° C em diferentes proporções (1: 5; 1:10 e
1:40 p / p ). A atividade da toxina sobre os fosfolipídios, na ausência de VHH, foi utilizada como controle positivo e considerada como tendo 100% de atividade. Os controles
negativos foram realizados usando reações médias sem toxinas. Cada valor representa a média ± SEM de amostras duplicadas; ( C) inibição da citotoxicidade induzida por CB
em miotubos do músculo esquelético C2C12 murino por VHH. A citotoxicidade (citólise) foi estimada pela libertação de desidrogenase lática (LDH) no meio de cultura após 3
h de exposição a uma solução pré-incubada contendo CB e o KF498604 a uma proporção de 1: 2,5 ( p / p ). Uma redução significativa na liberação de LDL foi observada em
células expostas à solução contendo CB e VHH (59,3%, *** p <0,05), quando comparadas com amostras incubadas apenas com CB; ( D) in vivoneutralização da
miotoxicidade induzida por CTX pela VHH. A miotoxicidade foi estimada pelos níveis plasmáticos de creatina quinase (CK) em camundongos Swiss após 3 h de
administração intramuscular das preparações pré-incubadas (37 ° C por 1 h) contendo CTX e KF498604 VHH nas proporções de 1:10, 1:20 e 1:40 ( p / p ). O controle
negativo foi realizado com PBS ou VHH e, como controle positivo, os animais foram injetados com CTX sem adição de VHH. Cada valor representa a média ± SEM. O teste
de Bonferroni foi usado para medir significância. Uma redução significativa nos níveis de CK foi observada no plasma de camundongos expostos a CTX e VHH em todas as
proporções (1:10 = 46%; 1:20 = 63%; 1:40 = 78%, *** p<0,05) em relação àqueles expostos apenas à toxina.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 4/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
Figura 4
Resultados de ancoragem mostrando os locais de ligação de VHH na superfície da crotoxina, isoforma CA2CBb. Representações de desenhos animados de estruturas de
interação VHH-CTX (vista lateral) cobertas por uma superfície branca, onde as cadeias α, β e γ de CA são mostradas na fita ciano, CB em castanho claro e a VHH é mostrada
como uma fita laranja. O sítio ativo de CB (His48, Asp49, Tyr53 e Asp99) é representado em verde e a alça de ligação de Ca2 + (Try28, Cys29, Gly30, Trp31, Gly32) em
azul. ( A ) KF498602 -CTX; ( B ) KF498603 -CTX; ( C ) KF498604 -CTX; ( D ) KF498605 -CTX; ( E ) KF498606 -CTX; ( F) representação superficial
da interação KF498604 –CTX (vista lateral); ( G ) representação superficial da estrutura cristalina da crotoxina (vista frontal, PDB ID 3R0L). Os locais de interação foram
ampliados para mostrar as ligações de hidrogênio formadas entre os resíduos de aminoácidos. Enquanto os clones KF498602 e KF498603 reconhecem CB de uma região
oposta ao sítio catalítico ( N- terminal α-hélice A e α-hélice D, principalmente), KF498604e KF498605 interagem com a interface CA-CB da crotoxina e, apesar de não
contato com o sítio catalítico (His48, Asp49, Tyr53 e Asp99), bloqueiam estereoquimicamente o acesso do substrato como demonstrado em ( C , D, F ). KF498605 VHH
também interage com CA em uma região oposta ao local catalítico do CB.
tabela 1
Interações moleculares entre os resíduos de aminoácidos dos VHHs e CTX.
Antivenenos capazes de neutralizar toxinas no sangue e tecidos profundos e apresentar efeitos adversos mínimos associados à administração de imunoglobulinas não
humanas são desafios que a comunidade científica tem enfrentado ao longo dos anos. Assim, diferentes abordagens têm sido propostas para tecnologias inovadoras e
de custo efetivo para desenvolver uma nova geração de antivenenos, dada a crise global de antiveneno [ 12 , 14 , 17 , 18, 39 ].
Considerando esses desafios, a epidemiologia do envenenamento crotálico no Brasil, a relevância da CTX no envenenamento por veneno de serpente C. durissus
terrificus , bem como a versatilidade biotecnológica e o potencial terapêutico dos anticorpos camelídeos de domínio único, selecionamos VHHs anti-crotoxina após
a construção de um imunizado Biblioteca de fago de L. glama VHH.
A imunização com L. glama , realizada após o “protocolo de imunização de múltiplas doses e baixo volume e baixo volume” [ 40 ], provou ser satisfatória. Os
animais apresentaram título máximo de anti-soro (1:10 6 ), comparável com outros esquemas de imunização [ 41 , 42 ]. Com 3,6 x 1012 clones, a diversidade da
biblioteca de VHH imune era esperada ao explorar a especificidade e afinidade do anticorpo desenvolvidas naturalmente após a imunização.
Três rodadas de bioprospecção, realizadas com o objetivo de selecionar clones de alta afinidade [ 43 ], foram suficientes para selecionar quatro VHHs com perfis
anti-CB ( KF498602 , KF498603 , KF498604 e KF498605 ), e um VHH com um perfil anti-CA ( KF498606 ) . A marca registrada VHH, apresentada na maioria
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 5/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
dos perfis, está normalmente relacionada à alta capacidade de hidrofilicidade e remodelação após a exposição a temperaturas desnaturantes (60-80 ° C)
[ 35 , 38 , 44 ]. Um par extra de cisteínas em KF498602 e KF498603pode permitir a formação de uma ponte dissulfeto entre FR2 e CDR3, o que poderia conferir
maior rigidez à alça CDR3, aumentando a estabilidade VHH [ 34 , 35 , 45 ]. A maioria dos clones mostrou regiões CDR3 mais longas (18-21 resíduos de
aminoácidos) quando comparadas com a VH humana (~ 14 aa). De fato, as CDRs de VHH são geralmente maiores para fornecer uma superfície antigênica
compensatória, dada a ausência de domínios VL nos HCAbs [ 34 , 46 ]. A baixa capacidade de seleção de clones anti-CA, a ausência parcial da marca VHH e a
reduzida alça CDR3 de KF498606 podem estar relacionadas à ausência de atividade enzimática ou citotóxica e, acima de tudo, à atividade imunomoduladora desta
subunidade CTX [ 47 ,48,49].
Os quatro clones responsivos ao CB apresentaram reatividade cruzada apenas com o veneno de serpente do gênero Crotalus , demonstrando especificidade, uma
característica importante para o diagnóstico de picada de cobra ou soroterapia [ 50 , 51 ]. VHHs selecionados não mostraram interação com outras toxinas (giroxina,
convulxina, crotamina) predominantes no veneno de C. durissus terrificus [ 9 ]. Além disso, o perfil de expressão de CTX em venenos de C. durissus cascavella , C.
durissus collilineatus e C. durissus cumanensis é de cerca de 72,0%, 67,4% e 2,6%, respectivamente [ 52]. Essa variação justifica a reatividade diferenciada dos
VHHs entre os venenos analisados. Além disso, os VHHs anti-crotoxina foram capazes de reconhecer formas monoméricas e multiméricas de CB em Western blot,
após eletroforese sob condições não redutoras [ 53 ], confirmando os resultados de ELISA e especificidade clonal.
Em relação à estabilidade térmica, os dois perfis de VHH analisados demonstraram alta resistência à desnaturação induzida pelo calor. Sua estabilidade contra
mudanças de temperatura, especialmente entre 25 e 55 ° C, é uma vantagem importante para aplicações terapêuticas e diagnósticas, principalmente em países
tropicais e subtropicais. Observou-se que os valores de temperatura de fusão do VHH variam entre 60 e 80 ° C [ 44 , 54 , 55 ], justificando a redução da atividade do
clone a estas temperaturas. Embora KF498602apresenta um par extra de cisteínas em sua seqüência de aminoácidos, sugerido para formar uma ligação dissulfeto
extra para estabilizar a estrutura VHH, a capacidade de reconhecimento deste clone foi reduzida em 50% quando aquecido a 95 ° C. Isso também foi observado na
VHH anti-triclocarban, selecionada por [ 56 ]. A ausência desta ligação dissulfureto extra em KF498604 reforça a ideia de que a alta termoestabilidade de VHHs está
relacionada com as substituições de aminoácidos típicas presentes nos HCAbs camelídeos [ 57 ]. Além disso, ambos os clones exibiram atividade mesmo após
incubação a 85 ° C (85%), enquanto scFv [ 38 ], mAbs [ 58 ] e IgG 1 policlonal [ 56] são renderizados inativos, demonstrando robustez de VHH. Além das
substituições de aminoácidos, a capacidade do VHH reenrolado com alta eficiência para sua conformação nativa provavelmente se deve à baixa complexidade da
estrutura do VHH [ 57 ]. A seleção realizada nos permitiu obter clones com afinidade na faixa micro e nanomolar, como observado em estudos anteriores, que
selecionam VHHs com alta capacidade de reconhecer e neutralizar toxinas animais [ 41 , 42 ]. A análise de SPR demonstrou que KF498604mostrou melhor
afinidade para CTX (KD = 81,34 nM) do que KF498602(KD = 1,7 μM), confirmando resultados detectados por ELISA e análises de Western blot. Além disso,
abordagens de SPR foram usadas para avaliar epítopos de interação de VHH. Semelhante ao observado com VHHs anti-TcdA [ 59 ] e anti-hemaglutinante [ 60 ], um
ganho de sinal de 103 RU na superfície do sensor foi observado com a injeção do VHH KF498602 após a saturação do sinal de interação KF498604 / CTX. Isto
sugere que estes clones interagem com diferentes epítopos no heterodímero.
KF498604 e KF498605 demonstraram inibição significativa da atividade da CTX e da fosfolipase CB in vitro. Foi observado que anticorpos policlonais e
monoclonais, capazes de inibir a atividade da fosfolipase CB in vitro, são potenciais inibidores da atividade miotóxica e neurotóxica da CTX in vivo. Isto demonstra
a participação do CB nos efeitos tóxicos do CTX [ 61 , 62 ]. Como o CTX não apresenta qualquer efeito sobre os miotubos murinos [ 63], o CB foi escolhido para
realizar ensaios de inibição da citotoxicidade ( Figura S1). A ausência do efeito citotóxico de CTX pode estar relacionada à baixa dissociação do heterodímero que é
dependente dos sítios da membrana celular, que pode estar ausente ou ser menor nos modelos celulares utilizados [ 63 , 64 ]. O VHH KF498604 foi capaz de reduzir
a liberação de LDH relacionada ao efeito citotóxico do CB sob os miotubos, demonstrando sua capacidade de reconhecer e bloquear a interação do CB com a
membrana celular.
A liberação de CK, relacionada ao efeito miotóxico da CTX em camundongos, foi significativamente inibida ( p <0,05) pela VHH KF498604 em até 78% na maior
proporção (1:40 w / w ), demonstrando o potencial efeito protetor da VHH em vivo . Foi demonstrado que a atividade miotóxica do CB está relacionada à sua
atividade de fosfolipase, que é reduzida pela modificação química do His48, um importante resíduo do sítio catalítico juntamente com o Asp99 [ 65 ]. O
KF498604 VHH foi capaz de inibir a atividade da fosfolipase, assim como a atividade citotóxica e miotóxica da subunidade CB do CTX, indicando alguma
correlação entre esses efeitos.
A estrutura cristalográfica da isoforma CA2CBb [ 10 ] demonstra um bloqueio parcial do acesso do substrato ao sítio catalítico da subunidade CB através da
interação dos resíduos Trp31 e Trp70 com Asp99 e Asp89 na subunidade CA. Entretanto, o sítio ativo de CB ainda é acessível de uma direção lateral [ 66 ], o que
poderia explicar a atividade catalítica do heterodímero CTX observada em ensaios com fosfolípides sintéticos e miotubos murinos in vitro , bem como em avaliações
de miotoxicidade in vivo.
Acoplamento molecular sugerido que KF498604 e KF498605VHHs de interagir com a interface do CA-CB de CTX, e, apesar de não haver contacto com o sítio
catalítico (His48, Asp49, Tyr53 e Asp99), os clones estericamente bloquear o acesso do substrato ( Figura 4 F). A maior parte da superfície de contato ocorre entre
os VHHs e a subunidade CB, justificando a alta capacidade inibitória do KF488604 contra atividades de fosfolipase, citotóxicas e miotóxicas. Além disso, ambos os
VHHs interagem com os resíduos da região C-terminal do CB, o que poderia contribuir para a inibição da atividade neurotóxica
[ 67 ]. KF498602 e KF498603reconhecem CB em uma região oposta ao sítio catalítico ( N-terminal α-hélice A e α-hélice D, principalmente), que não bloqueiam o
acesso ao substrato [ 10 ]. Como proposto anteriormente [ 66 ], a região N- terminal da CB , exposta ao solvente, pode se constituir em importante sítio
farmacológico da CTX. Esta região pode permitir a ligação do receptor pré-sináptico CTX nas junções neuromusculares, com subseqüente dissociação da
subunidade CA, permitindo a interação do terminal C do CB com o alvo e a liberação do sítio catalítico do CB, desencadeando sua neurotoxicidade. Assim, embora
eles não inibam a atividade da fosfolipase, esses clones podem ser úteis em estudos sobre os mecanismos neurotóxicos dos ensaios de CTX e de neutralização.
Dadas as características das VHHs selecionadas, bem como o envolvimento da miotoxicidade sistêmica na lesão renal aguda (LRA), uma das principais causas de
morte entre vítimas de envenenamento crotálico [ 68 , 69 , 70 , 71 ], consideramos esses clones ferramentas promissoras para diagnóstico ou tratamento de
envenenamento crotálico. Assim, essas ferramentas estão sendo usadas em nosso laboratório como “blocos modulares” para obter diferentes produtos VHH. Quer
sejam VHHs mono ou biespecíficos, ou HCAbs reconstituídos, as construções serão ótimas para gerar preparações oligoclonais humanizadas contra as principais
toxinas em venenos crotálicos. A capacidade protetora contra os efeitos neurotóxicos e nefrotóxicos desencadeados por CB, crotoxina e veneno bruto está sendo
investigada.
The authors thank the Program for Technological Development in Tools for Health-PDTIS-FIOCRUZ, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) (grants 477760/2012-0 and 459046/2014-4), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da
Amazônia Legal (BIONORTE/CNPq/MCT), Fundação de Amparo ao Desenvolvimento das Ações Científicas e Tecnológicas e à Pesquisa de Rondônia (FAPERO).
Marcos B. Luiz was supported by a fellowship from Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). The authors thank Amy Nicole
Grabner for reviewing the manuscript’s English.
As informações a seguir estão disponíveis online em http://www.mdpi.com/2072-6651/10/4/142/s1 , Figura S1: Avaliação da atividade citotóxica de Crotalus
d. veneno de terrificus, CTX e CB em mioblastos de mculo esquelico C2C12 murino; Figura S2: Determinação da atividade miotóxica de CTX em
camundongos; Tabela S1: Cronograma de imunização de Lhama com as subunidades CTX e CA e CB; Tabela S2: Análise de interação por SPR; Tabela S3: Dados
dos estudos in silico
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 8/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
VHHs específicos para o gênero Crotalus foram capazes de inibir a fosfolipase; atividade citotóxica e miotóxica da CTX in vitro e in vivo . Como a miotoxicidade
sistêmica na lesão renal aguda (LRA) é uma das principais causas de morte entre vítimas de envenenamento crotálico, consideramos esses clones como ferramentas
promissoras no tratamento do envenenamento crotálico.
MBL, CFCF, SSP, LSMD, JPZ, FBZ, ALF e RGS conceberam e projetaram os experimentos; MBL, SSP, NRG, NDRP, AMK, LSMD, JCS, FBZ e CFCF realizaram
os experimentos; MBL, CFCF, SSP, LSMD, ALF, AMS e RGS analisaram os dados; A MBL e o CFCF escreveram o artigo.
1. QUEM É Um Processo Sistemático Tecnicamente Conduzido para a Adopção de Doenças Adicionais como DTNs. [(acessado em 15 de dezembro de
2017)];Disponível online:https://www.who.int/neglected_diseases/diseases/systematic_technically_driven_process/en/
2. Kasturiratne A., Wickremasinghe AR, de Silva N., Gunawardena NK, A. Pathmeswaran, Premaratna R., L. Savioli, Lalloo DG, de Silva HJ A carga global de
picada de cobra: Uma análise de literatura e modelagem com base em estimativas regionais de envenenamento e mortes. PLoS Med. 2008; 5 : e218 doi: 10.1371 /
journal.pmed.0050218. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
3. Chippaux JP Epidemiologia dos envenenamentos por animais terrestres peçonhentos no Brasil com base em relatos de casos: de fatos óbvios a contingências. J.
Venom. Anim Toxinas Incl. Trop. Dis. 2015; 21 : 13-29. doi: 10.1186 / s40409-015-0011-1. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
4. Bochner R., Struchiner CJ Epidemiologia da mordida de cobra nos últimos 100 anos no Brasil: uma revisão. Cad. Saude Publica. 2003; 19 : 7–16. doi: 10.1590 /
S0102-311X2003000100002. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
5. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de Vigilância Epidemiológica. Caderno 14. Acidentes por Animais Peçonhentos. [(accessed
on 15 December 2017)];Available online: https://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/ gve_7ed_web_atual. pdf.
6. Azevedo-marques M.M., Hering S.E., Cupo P. Acidente Crotálico. In: Cardoso J.L.C., editor. Animais Peçonhentos no Brasil: Biologia, Clínica e Terapêutica dos
Acidentes. 2nd ed. Sarvier Editora, FAPESP; São Paulo, Brasil: 2009. pp. 91–97.
7. Bucaretchi F., Herrera S.R.F., Hyslop S., Baracat E.C.E., Vieira R.J. Snakebites by Crotalus durissus ssp. in children in Campinas, São Paulo, Brazil. Rev. Inst.
Med. Trop. São Paulo. 2002;44:133–138. doi: 10.1590/S0036-46652002000300004. [PubMed][Cross Ref]
8. Pinho FM, DM Zanetta, Burdmann EA Insuficiência renal aguda após o snakebite Crotalus durissus : um estudo prospectivo em 100 pacientes. Rim
Int. 2005; 67 : 659-667. doi: 10.1111 / j.1523-1755.2005.67122.x. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
9. Georgieva D., Ohler M., Seifert J., von Bergen M., Arni RK, Genov N., Betzel C. Serpente Venomic da correlação de Crotalus durissus terrificus com atividades
farmacológicas. J. Proteome Res. 2010; 9 : 2302–2316. doi: 10.1021 / pr901042p. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
10. Faure G., Xu H., Saul FA A estrutura cristalina da crotoxina revela os principais resíduos envolvidos na estabilidade e toxicidade desta potente heterodimérica β-
neurotoxina. J. Mol. Biol. 2011; 412 : 176-191. doi: 10.1016 / j.jmb.2011.07.027. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
11. Theakston RD, Warrell DA, Griffiths E. Relatório de um workshop da OMS sobre padronização e controle de antivenenos. Toxicon. 2003; 41 : 541-557. doi:
10.1016 / S0041-0101 (02) 00393-8. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
12. Gutiérrez JM, León G., Lomonte B. Relações farmacocinético-farmacodinâmicas da terapia com imunoglobulinas para
envenenamento. Clin. Pharmacokinet. 2003; 42 : 721–741. doi: 10.2165 / 00003088-200342080-00002. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
13. De Silva HA, Ryan NM, de Silva HJ Reações adversas ao antiveneno de cobra, e sua prevenção e tratamento. Fr. J. Clin. Pharmacol. 2016; 81 : 446-452. doi:
10.1111 / bcp.12739. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
14. Brown NI Consequências da negligência: Análise do mercado de antiveneno de cobras africanas subsaariana e do contexto global. PLoS
Negl. Trop. Dis. 2012; 6 : e1670 doi: 10.1371 / journal.pntd.0001670. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
15. Gutiérrez JM Melhorando a disponibilidade e a acessibilidade do antiveneno: Ciência, tecnologia e além. Toxicon. 2012; 60 : 676-687. doi: 10.1016 /
j.toxicon.2012.02.008. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
16. Morais V., Massaldi H. Avaliação econômica da produção de antiveneno de serpentes no sistema público. J. Venom. Anim Toxinas Incl. Trop. Dis. 2006; 12 :
497-511 doi: 10.1590 / S1678-91992006000300012. [ Referência cruzada ]
17. Alvarenga LM, Zahid M., di Tommaso A., Juste MO, Aubrey N., Billiald P., fragmentos de anticorpos neutralizadores da toxina do Muzard J. Engenharia veneno
e o seu potencial terapêutico. Toxinas 2014; 6 : 2541-2567. doi: 10.3390 / toxins6082541. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
18. Laustsen AH, Solà M., Jappe EC, Oscoz S., Lauridsen LP, Engmark M. Tendências biotecnológicas no desenvolvimento de antivenenos de aranhas e
escorpiões. Toxinas 2016; 8 : 226 doi: 10,3390 / toxinas8080226. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
19. Huang Z., P. Phoolcharoen W., I. Lai, Piensook K., Cardineau G., Zeitlin L., Whaley KJ, Arntzen CJ, HS Mason, Chen Q. Produção rápida de alto nível de
anticorpos monoclonais em tamanho real. plantas por um sistema de replicão de DNA de vetor único. Biotechnol. Bioeng. 2010; 106 : 9–17. doi: 10.1002 /
bit.22652. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
20. Anticorpos Monoclonais Siddiqui MZ como Diagnósticos; uma avaliação. Indian J. Pharm. Sci. 2010; 72 : 12–17. doi: 10.4103 / 0250-
474X.62229. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
21. Sharma MC, GP de Tuszynski, Blackman MR, Sharma M. Eficácia a longo prazo e mecanismo a jusante do anticorpo monoclonal anti-anexina A2 (mAb anti-
ANX A2) em um modelo pré-clínico de câncer de mama humano agressivo. Cancer Lett. 2016; 373 : 27-35. doi: 10.1016 /
j.canlet.2016.01.013. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
22. Chippaux JP, Goyffon M. Venenos, antivenenos e imunoterapia. Toxicon. 1998; 36 : 823-846. doi: 10.1016 / S0041-0101 (97) 00160-
8. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
23. Tjandra JJ, Ramadi L., McKenzie IF Desenvolvimento de resposta humana anti-anticorpo murino (HAMA) em pacientes. Immunol. Cell Biol. 1990; 68 : 367-
376. doi: 10.1038 / icb.1990.50. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
24. Fragmentos de anticorpos Nelson AL: Esperança e campanha publicitária. MAbs. 2010; 2 : 77–83. doi: 10.4161 /
mabs.2.1.10786. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
25. Roskos LK, Davis CG, Schwab GM A farmacologia clínica de anticorpos monoclonais terapêuticos. Drug Dev. Res. 2004; 61 : 108–120. doi: 10.1002 /
ddr.10346. [ Referência cruzada ]
26. Batra SK, Jain M., Wittel UA, Chauhan SC, Colcher D. Pharmacokinetics e biodistribuição de anticorpos geneticamente
modificados. Curr. Opin. Biotechnol. 2002; 13 : 603-608. doi: 10.1016 / S0958-1669 (02) 00352-X. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 9/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
27. Colcher D., Bird R., Roselli M., Hardman KD, Johnson S., Pope S., Dodd SW, MW Pantoliano, Milenic DE, Schlom J. Direcionamento de tumor in vivo de uma
ligação de antígeno recombinante de cadeia única proteína. J. Natl. Cancer Inst. 1990; 82 : 1191-1197. doi: 10.1093 / jnci /
82.14.1191. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
28. Nelson AL, Reichert JM Desenvolvimento de tendências para fragmentos de anticorpos terapêuticos. Nat. Biotechnol. 2009; 27 : 331–337. doi: 10.1038 /
nbt0409-331. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
29. Pavlinkova G., Beresford GW, Stand BJ, Batra SK, Colcher D. Farmacocinética e biodistribuição de construções de anticorpo de cadeia única manipuladas do
MAb CC49 em xenoenxertos de carcinoma do cólon. J. Nucl. Med. 1999; 40 : 1536-1546 [ PubMed ]
30. Goel A., Colcher D., J. Baranowska-Kortylewicz, Augustine S., Booth BJ, Pavlinkova G., Batra SK Fet de cadeia única tetravalente geneticamente modificada
do anticorpo monoclonal pancancinoma CC49: Melhor biodistribuição e potencial para aplicação terapêutica . Cancer Res. 2000; 60 : 6964–6971. [ PubMed ]
31. Miller BR, Demarest SJ, A. Lugovskoy, Huang F., Wu X., Snyder WB, Croner LJ, Wang N., Amatucci A., Michaelson JS, et al. Engenharia de estabilidade de
scFvs para o desenvolvimento de anticorpos biespecíficos e multivalentes. Protein Eng. Des. Sel. 2010; 23 : 549-557. doi: 10.1093 / protein /
gzq028. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
32. Wang R., Xiang S., Feng Y., Srinivas S., Zhang Y., Lin M., Wang S.. Produção de engenharia do anticorpo scFv funcional em E. coli por co-expressão da
molécula chaperona Skp. Frente. Célula. Infectar. Microbiol. 2013; 3 : 72-79. doi: 10.3389 /
fcimb.2013.00072. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
33. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa EB, Bendman N., Hamers R. Anticorpos de ocorrência natural
desprovidos de cadeias leves. Lett. Nat. 1993; 363 : 446-448. doi: 10.1038 / 363446a0. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
34. Muyldermans S. Nanocorpos: Anticorpos naturais de domínio único. Annu Rev. Biochem. 2013; 82 : 775-797. doi: 10.1146 / annurev-biochem-063011-
092449. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
35. Kolkman JA, Law DA Nanocorpos - Das lhamas às proteínas terapêuticas. Drug Discov. Hoje Technol. 2010; 7 : 139–146. doi: 10.1016 /
j.ddtec.2010.03.002. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
36. Cortez-Retamozo V., Lauwereys M., Hassanzadeh GG, Gobert M., K. Conrath, Muyldermans S., De Baetselier P., Revets H. Endotação de tumor eficiente por
fragmentos de anticorpos de domínio único de camelos. Int. J. Câncer. 2002; 98 : 456-462. doi: 10.1002 / ijc.10212. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
37. Harmsen MM, De Haard HJ Propriedades, produção e aplicações de fragmentos de anticorpos de domínio único de
camelídeos. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007; 77 : 13–22. doi: 10.1007 / s00253-007-1142-2. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
38. Arbabi-Ghahroudi M., A. Desmyter, L. Wyns, R. Hamers, Muyldermans S. Seleção e identificação de fragmentos de anticorpo de domínio único a partir de
anticorpos de cadeia pesada de camelo. FEBS Lett. 1997; 414 : 521-526. doi: 10.1016 / S0014-5793 (97) 01062-4. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
39. Warrell DA Mordeduras Venenosas, Picadas e Envenenamento. Infectar. Dis. Clin. N. Am. 2012; 26 : 207–223. doi: 10.1016 /
j.idc.2012.03.006. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
40. Thanongsaksrikul J., Srimanote P., Maneewatch S., Choowongkomon K., Tapchaisri P., Makino S., Kurazono H., Chaicumpa W. Um VHH que neutraliza a
actividade de metaloproteinases de zinco da neurotoxina botulinica do tipo A. J. Biol . Chem. 2010; 285 : 9657-9666. doi: 10.1074 /
jbc.M109.073163. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
41. Richard G., Meyers AJ, MD McLean, M. Arbabi-Ghahroudi, MacKenzie R., Hall JC Neutralização in vivo de a-cobratoxina com anticorpos de domínio único de
Llama de alta afinidade (VHHs) e um anticorpo VHH-Fc. PLoS ONE. 2013; 8 : e69495 doi: 10.1371 /
journal.pone.0069495. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
42. Prado ND, Pereira SS, da Silva MP, Morais MS, Kayano AM, LS Moreira-Dill, Luiz MB, Zanchi FB, FULL AL, Huacca ME, et al. Inibição da miotoxicidade
induzida pelo veneno de Bothrops jararacussu e fosfolipases isoladas A2 por Fragmentos de Anticorpos Específicos de Único Domínio Camelid. PLoS
ONE. 2016; 11 : e0151363 doi: 10.1371 / journal.pone.0151363. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
43. Bradbury AR, Marks JD Anticorpos a partir de bibliotecas de anticorpos fágicos. J. Immunol. Métodos. 2004; 290 : 29–49. doi: 10.1016 /
j.jim.2004.04.007. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
44. Dumoulin M., K. Conrath, M. Van Meirhaeghe, Meersman F., Heremans K., LG Frenken, S. Muyldermans, Wyns L., Matagne A. Fragmentos de anticorpo de
domínio único com alta estabilidade conformacional. Protein Sci. 2002; 11 : 500-515 doi: 10.1110 /
ps.34602. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
45. Govaert J., Pellis M., Deschacht N., Vincke C., K. Conrath, Muyldermans S., Saerens D. duplo efeito benéfico da ligação dissulfureto interloop para fragmentos
de anticorpo de domínio único. J. Biol. Chem. 2012; 287 : 1970-1979. doi: 10.1074 / jbc.M111.242818. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
46. Vu KB, Arbabi-Ghahroudi M., Wyns L., Muyldermans S. Comparação de sequências VH de lama de anticorpos convencionais e de cadeia
pesada. Mol. Immunol. 1997; 34 : 1121–1131. doi: 10.1016 / S0161-5890 (97) 00146-6. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
47. Sampaio SC, Hyslop S., Fontes MR, Prado-Franceschi J., Zambelli VO, Magro AJ, Brigadeiro P., Gutierrez VP, Cury Y. Crotoxina: Novas atividades para uma
beta-neurotoxina clássica. Toxicon. 2010; 55 : 1045-1060. doi: 10.1016 / j.toxicon.2010.01.011. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
48. Landucci EC, Antunes E., Donato JL, R. Faro, H. Hyslop, Marangoni S., B. Oliveira, Cirino G., de Nucci G. Inibição do edema de pata de rato induzida por
carragenina pela crotapotina, um polipeptídeo complexado com fosfolipase A 2 . Fr. J. Pharmacol. 1995; 114 : 578-583. doi: 10.1111 / j.1476-
5381.1995.tb17178.x. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
49. Garcia F., MH Toyama, Castro FR, Proença PL, Marangoni S., Santos LM Crotapotina induzida modificação da resposta proliferativa de linfócitos T através da
interferência com a síntese de PGE 2 . Toxicon. 2003; 42 : 433-437. doi: 10.1016 / S0041-0101 (03) 00198-3. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
50. Janssen M., Freyvogel TA, Meier J. Relação antigênica entre o veneno do nigth causus maculatus e venenos de outros viperídeos. Toxicon. 1990; 28 : 975-
983. doi: 10.1016 / 0041-0101 (90) 90026-4. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
51. CH Tan, Tan NH, KY Tan, Kwong KO Antiveneno neutralização cruzada dos venenos de Hydrophis schistosus e Hydrophis curtus , duas cobras marinhas
comuns nas águas da Malásia. Toxinas 2015; 7 : 572-581. doi: 10.3390 / toxins7020572. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
52. Boldrini-França J., Corrêa-Netto C., Silva MM, Rodrigues RS, De La Torre P., Pérez A., Soares AM, Zingali RB, Nogueira RA, Rodrigues VM, et al. Veneno e
antivenômica de serpentes da subespécie Crotalus durissus do Brasil: avaliação da variação geográfica e sua implicação no manejo da picada de cobra. J.
Proteom. 2010; 73 : 1758–1776. doi: 10.1016 / j.jprot.2010.06.001. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
53. Marchi-Salvador DP, Corrêa LC, Magro AJ, Oliveira CZ, Soares AM, Fontes MR Insights sobre o papel do estado oligomérico nas atividades biológicas da
crotoxina: Estrutura cristalina de uma fosfolipase A2 tetramérica formada por duas isoformas de crotoxina B de Veneno de Crotalus durissus
terrificus. Proteínas 2008; 72 : 883-891. doi: 10.1002 / prot.21980. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
54. TN de Baral, Murad Y., Nguyen TD, Iqbal U., Zhang J. Isolamento de anticorpo de domio individual funcional por imunizao de cula completa: Implicaes para
tratamento de cancro. J. Immunol. Métodos. 2011; 371 : 70-80. doi: 10.1016 / j.jim.2011.06.017. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
55. Olichon A., Schweizer D., Muhldermans S., de Marco A. Aquecimento como um método de purificação rápida para recuperar domínios VH e VHH
termotolerantes corretamente dobrados. BMC Biotechnol. 2007; 7 : 1–8. doi: 10.1186 / 1472-6750-7-7. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
Ú
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 10/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
56. Tabares-da Rosa S., Rossotti M., Carleiza C., Carrión F., Pritsch O., Ahn KC, Último JA, Hammock BD, González-Sapienza G. A seleção competitiva de
bibliotecas de anticorpo de domínio único permite o isolamento de alta Anticorpos anti-hanseno-afinidade que não são favorecidos na resposta imune do
lhama. Anal. Chem. 2011; 11 : 7213-7220. doi: 10.1021 / ac201824z. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
57. Omidfar K., Rasaee MJ, S. Kashanian, Paknejad M., Bathaie Z. Estudos de termoestabilidade em anticorpo de domínio único de Camelus bactrianus (camelo
bactriano) específico para o receptor do factor de crescimento epidérmico mutante expresso por Pichia . Biotechnol. Appl. Biochem. 2007; 46 : 41–49. [ PubMed ]
58. Van der Linden RH, Frenken LG, de Geus B., Harmsen MM, Ruuls RC, Stok W., de Ron L., Wilson S., Davis P., Verrips CT Comparação de propriedades físico-
químicas de fragmentos de anticorpos de VHH de lhama e anticorpos monoclonais de murganho. Biochim. Biofísica Acta. 1999; 1431 : 37-46. doi: 10.1016 / S0167-
4838 (99) 00030-8. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
59. Hussack G., Arbabi-Ghahroudi M., van Faassen H., Songer JG, Ng KK, MacKenzie R., Tanha J. Neutralizao da toxina A de Clostridium difficile com anticorpos
de domio ico visando o domio de ligao ao receptor celular. J. Biol. Chem. 2011; 286 : 8961-8976. doi: 10.1074 /
jbc.M110.198754. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
60. Hufton SE, Risley P., Bola CR, Major D., Engelhardt OG, Poole S. A amplitude da actividade de neutralização cruzada do subtipo de um anticorpo de domínio
único para a hemaglutinina da gripe pode ser aumentada por valência do anticorpo. PLoS ONE. 2014; 9 : e103294 doi: 10.1371 /
journal.pone.0103294. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
61. Choumet V., MS Jiang, Radvanyi F., Ownby C., Bon C. Neutralização da potência letal e inibição da atividade enzimática de uma neurotoxina fosfolipase A 2 ,
crotoxina, por anticorpos não precipitantes (Fab) FEBS Lett. 1989; 244 : 167-173. doi: 10.1016 / 0014-5793 (89) 81185-8. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
A expressão de fragmentos de anticorpos recombinantes humanos foi capaz de inibir parcialmente a atividade da fosfolipase do veneno de Crotalus durissus
terrificus . Clínico Básico. Pharmacol. Toxicol 2009; 105 : 84-91. doi: 10.1111 / j.1742-7843.2008.00322.x. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
63. Ponce-Soto LA, Lomonte B., Rodrigues-Simioni L., Novello JC, Marangoni S. Caracterização biológica e estrutural de crotoxina e nova isoforma de crotoxina B
PLA2 (F6a) do veneno de cobra de Crotalus durissus collilineatus . Protein J. 2007; 26 : 221-230. doi: 10.1007 / s10930-006-9063-
y. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
64. Lomonte B., Angulo Y., Rufini S., Cho W., Giglio Jr., Ohno M., Daniele J. JJ, Geoghegan P., Gutiérrez JM Estudo comparativo da atividade citolítica das
fosfolipases A2 miotóxicas no endotélio de camundongos (tEnd) e células do músculo esquelético (C2C12) in vitro. Toxicon. 1999; 37 : 145–158. doi: 10.1016 /
S0041-0101 (98) 00171-8. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
65. Soares AM, Mancin AC, Cecchini AL, Arantes CE, França SC, Gutiérrez JM, Giglio JR Efeitos de modificações químicas de crotoxina B, a subunidade de
fosfolipase A2 de crotoxina do veneno de cobra de Crotalus durissus terrificus , nas suas atividades enzimáticas e farmacológicas. Int. J. Biochem. Cell
Biol. 2001; 33 : 877-888. doi: 10.1016 / S1357-2725 (01) 00065-6. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
66. Fernandes CA, Pazin WM, Dreyer TR, Bicev RN, Cavalcante WL, CL Fortes-Dias, Ito AS, CL Oliveira, Fernandez RM, Fontes MR Estudos biofísicos sugerem
um novo arranjo estrutural da crotoxina e fornecer insights sobre o seu mecanismo tóxico. Sci. Representação 2017; 7 : 1–15. doi: 10.1038 /
srep43885. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
67. Curin-Serbec V., Délot E., Faure G., Saliou B., Gubensek F., Bon C., Choumet V. Os anticorpos antipeptídicos dirigidos à parte c-terminal da ammodioxina e
reagem com a subunidade da crotoxina PLA2 e neutralizar sua atividade farmacológica. Toxicon. 1994; 32 : 1337-1348. doi: 10.1016 / 0041-0101 (94) 90406-
5. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
68. Azevedo-Marques MM, Cupo P., Coimbra, Hering, Rossi, Laure, Myonecrosis, mioglobinúria e insuficiência renal aguda induzida por envenenamento por
serpente sul-americana ( Crotalus durissus terrificus ) no Brasil. Toxicon. 1985; 23 : 631-636. doi: 10.1016 / 0041-0101 (85) 90367-
8. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
69. Gutiérrez JM, Ponce-Soto LA, Marangoni S., Lomonte B. Miotoxicidade sistêmica e local induzida por fosfolipases do grupo II do veneno de serpente A2:
Comparação entre crotoxina, crotoxina B e um homólogo Lys49 PLA2. Toxicon. 2008; 51 : 80-92. doi: 10.1016 /
j.toxicon.2007.08.007. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
70. Amaral C.F., de Rezende N.A., da Silva O.A., Ribeiro M.M., Magalhães R.A., dos Reis R.J., Carneiro J.G., Castro J.R. Insuficiência renal aguda secundária a
acidentes ofídicos botrópico e crotálico. Análise de 63 casos. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 1986;28:220–227. doi: 10.1590/S0036-
46651986000400003.[PubMed] [Cross Ref]
71. Jorge MT, Ribeiro LA Epidemiologia e quadro clínico de uma mordida acidental da cascavel sul-americana ( Crotalus durissus ) Rev. Inst. Med. Trop. São
Paulo 1992; 34 : 347-354. doi: 10.1590 / S0036-46651992000400013. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
72. Pereira SS, Moreira-Dill LS, Morais MS, Prado ND, Barros ML, Koishi AC, Mazarrotto GA, GM Gonçalves, Zuliani JP, Calderon LA, et al. Novos fragmentos
de anticorpos camelídeos visando a nucleoproteína recombinante de Araucaria hantavirus: um protótipo para o diagnóstico precoce da síndrome pulmonar por
hantavírus. PLoS ONE. 2014; 9 : e108067 doi: 10.1371 / journal.pone.0108067. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
73. Smith PK, Krohn Ri, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, MD Provenzano, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC. Medição de proteína usando
ácido bicinconínico. Anal. Biochem. 1985; 150 : 76–85. doi: 10.1016 / 0003-2697 (85) 90442-7. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
74. Andersson K., Hämäläinen M., Malmqvist M. Identificação e otimização de condições de regeneração para ensaios de biossensores baseados em afinidade. Uma
abordagem de coquetel multivariada. Anal. Chem. 1999; 71 : 2475-2481. doi: 10.1021 / ac981271j. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
75. Lomonte B., T. Tarkowski, Bagge U., Hanson LA Neutralização das atividades citolítica e miotóxica das fosfolipases A2 do veneno da serpente Bothrops
asper por glicosaminoglicanos da família heparina / sulfato de heparam. Biochem. Pharmacol. 1994; 47 : 1509-1518. doi: 10.1016 / 0006-2952 (94) 90525-
8. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
76. Ebisui C., T. Tsujinaka, T. Morimoto, Kan K., I. Iijima, Yano M., Kominami E., Tanaka K., M. Monden M. Interleukin-6 induz proteólise pela ativação de
proteases intracelulares (catepsinas B e L, proteassoma) em myotubes C2C12. Clin. Sci. (Lond.) 1995; 89 : 431-439. doi: 10.1042 /
cs0890431. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
77. Chen R., Li L., Weng Z. Zdock: Um algoritmo de ancoragem de proteínas no estágio inicial. Proteínas 2003; 1 : 80–87. doi: 10.1002 /
prot.10389. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
78. Brenke R., Hall DR, Chuang GY, Comeau SR, T. Bohnuud, D. Beglov, Schueler-Furman O., Vajda S., Kozakov D. Aplicação de potenciais estatísticos
assimétricos à ancoragem anticorpo-proteína. Bioinformática. 2003; 28 : 2608–2614. doi: 10.1093 / bioinformática /
bts493. [ Artigo livre de PMC ] [ PubMed ] [ referência cruzada ]
79. Kozakov D., R. Brenke, Comeau SR, Vajda S. PIPER: Um programa de empacotamento de proteínas baseado em FFT com potenciais
emparelhados. Proteínas 2006; 65 : 392-406. doi: 10.1002 / prot.21117. [ PubMed ] [ referência cruzada ]
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 11/11