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14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…

Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos
Modulares para o Melhoramento do Tratamento ou Diagnóstico do Envenenamento Crotálico
Marcos B. Luiz,1,2 Soraya S. Pereira,1 Nidiane D. R. Prado,1Naan R. Gonçalves,1 Anderson M. Kayano,1 Leandro S. Moreira-Dill,1Juliana C. Sobrinho,1 Fernando B. Zanchi,1 André L. F

Informações do autor ► Notas do artigo ► Informações sobre direitos autorais e licença ► Isenção de responsabilidade

1. Introdução Vamos para:

Recentemente, a Organização Mundial da Saúde (OMS) restabeleceu o envenenamento por picadas de cobra em seu portfólio de Doenças Tropicais Negligenciadas
[ 1 ]. Essa classificação pode ajudar a intensificar o combate a esse problema de saúde pública, especialmente na África, Ásia, Oceania e América Latina, onde cerca
de 20.000 a 90.000 pessoas morrem de acidentes ofídicos, de estimados 421.000 a 1.841.000 casos a cada ano [ 2 ]. No Brasil, durante o período de 2001 a 2012,
cerca de 27.200 casos de acidentes ofídicos e 115 óbitos relacionados foram registrados por ano [ 3 ]. O gênero Bothrops foi responsável pela maioria dos casos
relatados, seguido pelos gêneros Crotalus , Lachesis e Micrurus [ 3 ].
Embora haja menor incidência de envenenamento crotálico, quando comparados aos acidentes ofídicos botrópicos, esses acidentes apresentam a maior taxa de
letalidade (1,87%) [ 4 , 5 ]. O envenenamento é caracterizado por neurotoxicidade e distúrbios de coagulação, juntamente com toxicidade muscular e renal
[ 6 ]. Lesões locais leves, principalmente edema e eritema, podem ser observadas [ 7 , 8 ]. A maioria dos sintomas de envenenamento é causada pelos compostos
proteicos do veneno [ 6 ]. Cerca de 90% do veneno de C. durissus terrificus é composto de proteínas; entre eles estão fosfolipases A 2 (PLA 2 ) [ 9]. Aos 24 kDa, a
CTX, que constitui cerca de 50% do teor de proteína do veneno, é um heterodímero que consiste em um enzimaticamente activa PLA 2da subunidade (CB) e uma
subunidade ácida sem enzimática ou actividade tóxica (CA) [ 10 ]. O CTX é responsável pelos efeitos neurotóxicos, miotóxicos e nefrotóxicos do envenenamento.
O tratamento do envenenamento é realizado pela administração de imunoglobulina G (IgG) ou fragmentos F (ab ') / F (ab') 2 obtidos principalmente de animais
hiperimunizados [ 11 ]. Apesar dos diferentes perfis farmacocinéticos da IgG inteira e fragmentos de anticorpos, não foram observadas diferenças substanciais na
neutralização da atividade tóxica de alguns venenos [ 11 , 12 ]. A segurança terapêutica antivandômica pode ser comprometida por falhas no processo de purificação
do produto [ 11 , 13]. Além disso, a produção industrial de seroterápicos é insatisfatória. A disponibilidade e acessibilidade deficitárias, o alto custo do produto, a
inviabilidade do uso de cavalos em países endêmicos de zoonoses e o baixo número de laboratórios envolvidos na produção são questões que precisam ser
contornadas para melhorar a produção de antiveneno [ 11 , 14 , 15 , 16 ]. Assim, a busca por métodos alternativos e complementares para tratamentos de picada de
cobra é constante [ 17 , 18 ].
Anticorpos monoclonais (mAbs, 150 kDa), propostos como agentes terapêuticos [ 18 , 19 , 20 , 21 ], apresentam uma distribuição semelhante à dos agentes
soroterápicos de primeira geração (IgG policlonais) [ 12 , 22 ]. Além disso, os mAbs requerem humanização [ 23 ] e devem exigir uma preparação oligoclonal contra
as principais proteínas do veneno [ 18 ]. Para além dos mAbs, podem ser obtidas as formas recombinantes F (ab ′) e scFv (fragmento variável de cadeia simples)
[ 24 ]. Com aproximadamente 25 kDa, os scFv são menos imunogênicos e apresentam maior biodistribuição, quando comparados com IgGs inteiros
[ 25 , 26 ,27 ]. Estes fragmentos podem ser produzidos em sistemas de expressão procariótica [ 24 , 28 ]; no entanto, eles têm alta depuração renal [ 29 ]. Assim,
formas multivalentes, como sc (Fv) 2 (~ 60 kDa) e [sc (Fv) 2 ] (~ 120 kDa) foram propostas [ 30 ]. A baixa estabilidade, solubilidade e afinidade dessas moléculas
continuam a ser um desafio para sua aplicação clínica [ 31 , 32 ].
Para além da IgG convencional, os camelídeos produzem anticorpos funcionais desprovidos de cadeias leves e domínios CH1, referidos como anticorpos de cadeias
pesadas de camelídeos (HCAb) com aproximadamente 90 kDa [ 33 ]. O local de reconhecimento de antígeno dos HCAbs é formado por um único domínio chamado
VHH [ 34 ]. Com um tamanho medido em nanômetros e um pequeno peso molecular (15 kDa), o repertório de VHH pode ser recombinado, clonado e expresso em
vetores, utilizando um sistema procariótico na forma solúvel, resultando em fragmentos com alta especificidade antigênica e afinidade [ 35 ]. Uma alta identidade
com VH humano (mais de 80%) justifica a baixa imunogenicidade dos VHHs [ 36]. CDRs mais longas, principalmente CDR3, permitem o reconhecimento de sítios
enzimáticos por VHH, inacessíveis a anticorpos murinos ou humanos [ 37 ]. Além disso, quando comparado a outros fragmentos de anticorpos, os VHHs apresentam
maior estabilidade térmica [ 38 ].
Analisando as características do VHH camelídeo, juntamente com a necessidade de desenvolver antivenenos mais eficazes, este estudo teve como objetivo
selecionar e caracterizar VHHs de Lama glama capazes de inibir as atividades de fosfolipase, citotoxicidade e miotóxica de CTX isoladas de veneno de C. durissus
terrificus .

2. Resultados Vamos para:

2.1. Imunização por L. glama, Construção de Biblioteca e Seleção de VHHs Anti-Crotoxina


O esquema de imunização com L. glama , utilizando adjuvante completo e incompleto de Freund, mostrou-se satisfatório. Obteve-se um t�ulo m�imo de anti-
soro (1 x 10 6 ) ap� a segunda imuniza�o, como observado por ensaios de ELISA ( Figura 1A). Após o reforço final, o ADNc foi sintetizado a partir do ARN
total extraído de 1,5 × 10 7 linfócitos. A amplificação do repertório de genes de VHH por RT-PCR, e a sua recombinação no fagemídeo fen-1-6xHis permitidos para
a construção da biblioteca VHH com cerca de 3,6 x 10 12 clones usando a E. coli TG1 estirpe. Um total de 5,3 × 10 11As partulas de fago recombinante foram
recuperadas ap infeco da biblioteca de VHH imune com o fago auxiliar VCSM13. Após três rodadas de bioprospecção, realizadas separadamente contra CTX, CB e
CA, foram selecionados 220 clones para CTX, 220 para CB e 88 para CA. Todos os clones demonstraram o tamanho esperado para a VHH por PCR em colônia. No
entanto, quando testados por ELISA, 58 (26%), 76 (34%) e 2 (2%) VHHs apresentaram valores de absorbância superiores ao ponto de corte estipulado (2 DO médio
de amostras negativas mais dois desvios padrão), considerados positivo para CTX, CB e CA, respectivamente ( Figura 1 B).

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figura 1

Desenvolvimento de anti-crotoxina VHH. ( A ) monitoramento da resposta imune do lhama. O soro foi diluído para 1:10 6 ( v / v ) e a ligação específica a CTX, CB e CA foi
detectada por ELISA indireto. O animal mostrou uma resposta rápida e forte após a segunda imunização (isto é, no dia 14). O reforço final realizado no dia 28 mostrou
absorção máxima, até cinco vezes a do soro pré-imune; ( B) reatividade clonal de VHHs selecionadas contra CTX, CB e CA (marrom). Após três rodadas de filtração, 220
clones selecionados contra crotoxina e CB e 88 contra CA foram submetidos a ensaios de ELISA. Destes, cinquenta e oito (58), setenta e oito (78) e dois (02) foram positivos,
respectivamente. Todas as medidas foram realizadas em triplicado. Em branco, cinza e preto, os clones positivos nos painéis 1, 2 e 3, respectivamente. O controle negativo
(NC) foi realizado utilizando soro de lhama pré-imune. Barras de erro representam o desvio padrão. Um asterisco (*) indica clones submetidos a sequenciamento de DNA; ( C)
alinhamento da sequência de aminoácidos das VHHs anti-crotoxina. As regiões estruturais (FR), bem como as regiões determinantes de complementaridade (CDR), são
indicadas por setas; duas cisteínas conservadas estão marcadas em vermelho; As substituições de marca registrada VHH no FR2 estão marcadas em azul, em negrito e
sublinhadas. Um par de cisteína adicional, nos clones KF498602 e KF498603 , é sombreado. A proeminência da ansa CDR3 nos clones KF498605e KF498604 , com 21
resíduos de aminoácidos, também é digna de nota. Um cólon (:) representa aminoácidos altamente conservados; um asterisco (*) representa resuos de aminoido idticos; um
período (.) significa aminoácidos um pouco semelhantes, mas diferentes e um branco representa aminoácidos ou intervalos dissimilares.

2.2. Análise de Sequência de VHHs Anti-Crotoxina


Dez clones, que mostraram as melhores absorbâncias em ELISA, foram sequenciados e um alinhamento de múltiplas seqüências entre eles revelou quatro perfis de
seqüência para CB e um perfil para CA. Estas sequências foram depositadas na base de dados do GenBank sob os seguintes números de acesso: KF498602 (clone
Ctx-17), KF498603 (clone Ctx-21), KF498604 (clone Cb-16), KF498605 (clone Cb-42) e KF498606 (clone Ca -12). Todos os clones apresentaram o aminoácido
marcado VHH estabelecido em FR2 (Y / F37; E44; R45; G / F47), com a exceção de KF498606 . Além disso, o KF498606 apresentou uma região CDR3 mais curta
com apenas cinco resíduos de aminoácidos ( Figura 1C). Com 98% e 97% de semelhança, KF498602 e KF498603 , e KF498604 e KF498605 apresentaram CDR3
feita de 18 (ATELISSCASTWYDAYSYW) e 21 (AASDEGTGSPGSLYTPDPYDY) resíduos de aminoácidos, indicando que eles se originaram de duas células B
ancestrais comuns. Embora duas cisteínas conservadas de VHH / VH, que formam a ligação dissulfeto canônica cruzada entre FR1 e FR3, tenham sido observadas
em todos os clones, apenas KF498602 e KF498603 apresentaram um par extra de cisteínas, o que pode permitir a formação de um extra ligação dissulfureto entre
FR2 e CDR3. Após a expressão de pET22b-VHH recombinante ( KF498602 , KF498603 , KF498604, KF498605 ) na estirpe de E. coli BL21 (DE3), os clones
foram purificados por IMAC. Aproximadamente 2 a 6 mg de proteína recombinante por litro de cultura foram obtidos.

2.3. Análise de Imunorreatividade Cruzada e Western Blot


Além de poderem reconhecer os venenos CB, CTX e C. durissus terrificus , os clones purificados KF498602 , KF498603 , KF498604 e KF498605 puderam
interagir com os venenos de C. durissus cascavella e C. durissus collilineatus . No entanto, quando testados contra toxinas e venenos do gênero Bothrops , não
apresentaram reatividade em ELISA, demonstrando sua especificidade para o gênero Crotalus ( Figura 2 A). O clone KF498604destacou-se por apresentar a maior
intensidade de sinal, com uma absorbância 10 vezes maior que o ponto de corte. A especificidade clonal foi confirmada por anise Western blot ( Figura 2 B), que
demonstrou capacidade de ligao de VHH para formas de monero de CB de 14,2 kDa, previamente verificadas por um sistema de espectrometria de massa MALDI-
TOF2 (AXIMA TOF2, Shimadzu, Jap) (dados n mostrados). VHHs também foram capazes de reconhecer formas multiméricas de CB sob condições não redutoras
por eletroforese. O VHH KF498604 apresentou a maior capacidade de reconhecimento, confirmando os resultados do ELISA.

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Figura 2

Avaliação da especificidade e termoestabilidade dos VHHs. ( A ) reatividade cruzada de anti-crotoxina VHHs. Reatividade in vitromostrando diferentes níveis de interação de
VHHs selecionados KF498602 ; KF498604 ; KF498605 ; KF498606 com venenos de serpentes e toxinas isoladas. Absorbância obtida pelos ensaios de ELISA realizados em
placas revestidas com 10 µg / mL de cada antígeno e VHH na proporção de 1: 1 ( p / p ). As linhas tracejadas representam o corte. Todas as medidas foram realizadas em
triplicado. Para o controle negativo (NC), o VHH não relacionado foi utilizado em poços revestidos com CTX. Cada valor representa a média ± SEM de amostras em
triplicado; ( B) análise de especificidade das VHHs com CB por Western blot. Imunotransferência demonstrando a interação dos clones selecionados com formas monoméricas
(14 kDa) e multiméricas de CB em uma membrana de nitrocelulose; ( C ) termoestabilidade funcional de VHHs usando ELISA. Porcentagem de sinal em ELISA contra CB
de KF496802 (azul) e KF496804 (verde), após aquecimento de 25 a 95 ° C por 1 h, em comparação com as amostras de pré-aquecimento. Cada valor representa a média ±
SEM de amostras em triplicado.

2.4. Avaliação da Estabilidade Térmica de VHHs Selecionadas e Análise de Interação por SPR
Quando expostas a diferentes condições de temperatura durante 1 h, KF498602 e KF498604 VHHs demonstraram reactividade contra CB em ELISA. Ambos os
clones permaneceram completamente ativos em uma faixa de temperatura de 25 a 55 ° C e acima de 75% quando foram incubados a 85 ° C. Entre 55 e 85 ° C, foi
observada redução na atividade de VHH. No entanto, KF498604 permaneceu 100% ativo, mesmo quando aquecido a 95 ° C ( Figura 2 C).
As afinidades de KF498602 e KF498604 VHHs para CTX foram medidos por SPR. Após obtenção dos sensogramas de ligação e dissociação, os parâmetros
cinéticos, utilizando o modelo de Langmuir 1: 1, com ajuste altamente confiável, evidenciados pelos baixos valores de Chi 2 obtidos (≤ 1 UR), foram determinados
( Tabela S1 ). Enquanto KF498604 mostrou afinidade para CTX em uma faixa nanomolar (KD = 81,3 nM), KF498602 demonstrou uma menor afinidade (KD = 1,7
mM). Injeção de KF498202 a uma taxa equimolar em um chip sensor CM5-CTX, após a saturação do sinal de interação entre CTX e KF498604(91,3 UR),
promoveu um aumento de 113% no ganho de sinal (194,6 UR), sugerindo que esses clones interagem com diferentes determinantes antigênicos da toxina ( Figura 3
A).

Figura 3

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Avaliação da interação cinética e capacidade de neutralização dos VHHs. ( A ) análise da interação cinética entre VHHs e CTX por SPR. Grânulos de sensores obtidos após a
injeção de KF498604 e KF498602 , em concentrações de 2,5 a 0,002 μM, em um chip CM5 revestido com crotoxina. KD = constante de afinidade dos clones. Sensorgram
obtido após injeção de KF498604 e co-injeção de KF498602 . O ganho de sinal (103 RU) na superfície do sensorquente após a injecção de KF498602 indica que estes clones
interagem com diferentes epítopos de crotoxina; ( B ) in vitroinibição da atividade da fosfolipase CB e CTX por VHHs selecionados. A análise fluorimétrica da inibição foi
avaliada utilizando fosfolípidos fluorescentes sintéticos e toxinas pré-incubadas com VHH seleccionados durante 30 min a 37 ° C em diferentes proporções (1: 5; 1:10 e
1:40 p / p ). A atividade da toxina sobre os fosfolipídios, na ausência de VHH, foi utilizada como controle positivo e considerada como tendo 100% de atividade. Os controles
negativos foram realizados usando reações médias sem toxinas. Cada valor representa a média ± SEM de amostras duplicadas; ( C) inibição da citotoxicidade induzida por CB
em miotubos do músculo esquelético C2C12 murino por VHH. A citotoxicidade (citólise) foi estimada pela libertação de desidrogenase lática (LDH) no meio de cultura após 3
h de exposição a uma solução pré-incubada contendo CB e o KF498604 a uma proporção de 1: 2,5 ( p / p ). Uma redução significativa na liberação de LDL foi observada em
células expostas à solução contendo CB e VHH (59,3%, *** p <0,05), quando comparadas com amostras incubadas apenas com CB; ( D) in vivoneutralização da
miotoxicidade induzida por CTX pela VHH. A miotoxicidade foi estimada pelos níveis plasmáticos de creatina quinase (CK) em camundongos Swiss após 3 h de
administração intramuscular das preparações pré-incubadas (37 ° C por 1 h) contendo CTX e KF498604 VHH nas proporções de 1:10, 1:20 e 1:40 ( p / p ). O controle
negativo foi realizado com PBS ou VHH e, como controle positivo, os animais foram injetados com CTX sem adição de VHH. Cada valor representa a média ± SEM. O teste
de Bonferroni foi usado para medir significância. Uma redução significativa nos níveis de CK foi observada no plasma de camundongos expostos a CTX e VHH em todas as
proporções (1:10 = 46%; 1:20 = 63%; 1:40 = 78%, *** p<0,05) em relação àqueles expostos apenas à toxina.

2.5. Inibição In Vitro e In Vivo da Atividade de CTX por VHHs


A capacidade dos VHHs selecionados para inibir a atividade da fosfolipase de CTX e CB foi avaliada por fluorimetria, usando fosfolipídios sintéticos acil-NBD-
PC. Os resultados demonstraram o potencial inibitório dos VHHs KF498604 e KF498605 sobre a atividade do heterodímero CTX e seu monômero CB. O
KF498604foi capaz de inibir cerca de 80% na razão 1:40 (toxina / VHH), enquanto o KF498605 demonstrou inibição acima de 60% na proporção de 1:20 ( Figura 3
B). Os KF498602 e KF498603 clones não mostraram inibição toxina expressivo.
A neutralização do efeito citotóxico do CB em miotubos murinos pelo clone KF498604 foi verificada utilizando a solução pré-incubada na proporção de 1: 2,5
(toxina / VHH). Os resultados demonstraram uma redução significativa nos níveis de LDH liberados (59,3%, p <0,05), quando comparados ao controle realizado
apenas com CB ( Figura 3 C). KF498604 A capacidade de VHH de inibir o efeito miot�ico da CTX, realizada in vivo, foi observada em todas as raz� toxina /
VHH testadas, especialmente a 1:40, que mostrou uma redu�o do n�el de CK de 78,80% ( p <0,05) ( Figura 3 D).

2.6. Modelagem e Interface de Ligação dos VHHs e CTX


Muitos modelos putativos de semelhança de alto nível com as sequências alvo ( KF498602 , KF498603 , KF498604 , KF498605e KF498606 ) foram revelados
através de uma pesquisa BLAST. As estruturas selecionadas para modelagem são mostradas na Tabela S2 . A avaliação do gráfico Ramachandran para VHHs
selecionadas mostrou mais de 90% de resíduos de aminoácidos em regiões favoráveis. A qualidade do modelo também foi analisada comparando a estrutura prevista
com o modelo via superposição e avaliação atômica de RMSD. O RMSD do traço Cα entre todas as estruturas e modelos de homologia é menor que 2.00 Å,
indicando que os modelos gerados são bastante semelhantes aos modelos ( Tabela S2). As melhores interações entre os VHHs e o CTX estão representadas na
Figura 4 . A Tabela 1 mostra as ligações de hidrogênio formadas entre os VHHs e as toxinas no modelo final de ancoragem.

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Figura 4

Resultados de ancoragem mostrando os locais de ligação de VHH na superfície da crotoxina, isoforma CA2CBb. Representações de desenhos animados de estruturas de
interação VHH-CTX (vista lateral) cobertas por uma superfície branca, onde as cadeias α, β e γ de CA são mostradas na fita ciano, CB em castanho claro e a VHH é mostrada
como uma fita laranja. O sítio ativo de CB (His48, Asp49, Tyr53 e Asp99) é representado em verde e a alça de ligação de Ca2 + (Try28, Cys29, Gly30, Trp31, Gly32) em
azul. ( A ) KF498602 -CTX; ( B ) KF498603 -CTX; ( C ) KF498604 -CTX; ( D ) KF498605 -CTX; ( E ) KF498606 -CTX; ( F) representação superficial
da interação KF498604 –CTX (vista lateral); ( G ) representação superficial da estrutura cristalina da crotoxina (vista frontal, PDB ID 3R0L). Os locais de interação foram
ampliados para mostrar as ligações de hidrogênio formadas entre os resíduos de aminoácidos. Enquanto os clones KF498602 e KF498603 reconhecem CB de uma região
oposta ao sítio catalítico ( N- terminal α-hélice A e α-hélice D, principalmente), KF498604e KF498605 interagem com a interface CA-CB da crotoxina e, apesar de não
contato com o sítio catalítico (His48, Asp49, Tyr53 e Asp99), bloqueiam estereoquimicamente o acesso do substrato como demonstrado em ( C , D, F ). KF498605 VHH
também interage com CA em uma região oposta ao local catalítico do CB.

tabela 1
Interações moleculares entre os resíduos de aminoácidos dos VHHs e CTX.

Aminoácidos CTX Distâncias


Clone Domínio VHH
Anticorpo Antígeno Domínio (A)

FR2 Arg-47 Glu-12 N -terminal α-hélice A (CB) 1.8/1.9/1.8

CDR3 Trp-117 Glu-12 N -terminal α-hélice A (CB) 2

FR2 Arg-47 Arg-14 N -terminal α-hélice A (CB) 1.9

FR2 Arg-47 Phe-11 N -terminal α-hélice A (CB) 1.7


CDR3 Ser-115 Arg-97 α-hélice D (CB) 2.1
KF498602
CDR3 Tyr-114 Arg-97 α-hélice D (CB) 1.8
CDR3 Trp-110 Arg-14 N -terminal α-hélice A (CB) 1.8

FR2 Glu-46 Lista-7 N -terminal α-hélice A (CB) 1.7


CDR3 Asp-112 Gln-33 Corrente α (CA) 2.0/2.0
FR2 Glu-46 Arg-14 N -terminal α-hélice A (CB) 1.8

CDR3 Asp-112 Arg-97 α-hélice D (CB) 1.8/1.8/1.9


CDR3 Asp-112 Arg-14 N -terminal α-hélice A (CB) 1.9

CDR3 Tyr-114 Arg-14 N -terminal α-hélice A (CB) 1.7


2+
CDR3 Tyr-111 Gly-32 Loop de ligação de Ca (CB) 1.8
KF498603 2+
FR2 Arg-47 Gly-31 Loop de ligação de Ca (CB) 1.7/2.2
FR2 Arg-47 Gln-37 Loop (CB) 1.9
FR1 Ala-2 Lys-7 N -terminal α-hélice A (CB) 1.7

FR1 Glu-3 Lista-7 N -terminal α-hélice A (CB) 1.7

FR3 Asp-64 Cys-75 β-wing (CB) 2.1


CDR2 Arg57 Gly-52 α-hélice C (CB) 1.7
CDR3 Tyr-117 Gly117 ExtensãoC-terminal (CB) 1.8
FR3 Tente-62 Asp78 β-wing (CB) 1.9/2.5
KF498604
CDR2 Thr-60 Asp78 β-wing (CB) 2
CDR3 Glu-103 Arg 116 ExtensãoC-terminal (CB) 2.0/1.9
CDR3 Gly-104 Arg 116 ExtensãoC-terminal (CB) 1.7
CDR1 Ala-35 Ser-119 ExtensãoC-terminal (CB) 2.2

CDR2 Arg-57 Asp-78 Corrente β (CA) 1.8/1.8/2.0


CDR1 Asn-33 Thr-121 ExtensãoC-terminal (CB) 1.8

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3. Discussão Vamos para:

Antivenenos capazes de neutralizar toxinas no sangue e tecidos profundos e apresentar efeitos adversos mínimos associados à administração de imunoglobulinas não
humanas são desafios que a comunidade científica tem enfrentado ao longo dos anos. Assim, diferentes abordagens têm sido propostas para tecnologias inovadoras e
de custo efetivo para desenvolver uma nova geração de antivenenos, dada a crise global de antiveneno [ 12 , 14 , 17 , 18, 39 ].
Considerando esses desafios, a epidemiologia do envenenamento crotálico no Brasil, a relevância da CTX no envenenamento por veneno de serpente C. durissus
terrificus , bem como a versatilidade biotecnológica e o potencial terapêutico dos anticorpos camelídeos de domínio único, selecionamos VHHs anti-crotoxina após
a construção de um imunizado Biblioteca de fago de L. glama VHH.
A imunização com L. glama , realizada após o “protocolo de imunização de múltiplas doses e baixo volume e baixo volume” [ 40 ], provou ser satisfatória. Os
animais apresentaram título máximo de anti-soro (1:10 6 ), comparável com outros esquemas de imunização [ 41 , 42 ]. Com 3,6 x 1012 clones, a diversidade da
biblioteca de VHH imune era esperada ao explorar a especificidade e afinidade do anticorpo desenvolvidas naturalmente após a imunização.
Três rodadas de bioprospecção, realizadas com o objetivo de selecionar clones de alta afinidade [ 43 ], foram suficientes para selecionar quatro VHHs com perfis
anti-CB ( KF498602 , KF498603 , KF498604 e KF498605 ), e um VHH com um perfil anti-CA ( KF498606 ) . A marca registrada VHH, apresentada na maioria

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dos perfis, está normalmente relacionada à alta capacidade de hidrofilicidade e remodelação após a exposição a temperaturas desnaturantes (60-80 ° C)
[ 35 , 38 , 44 ]. Um par extra de cisteínas em KF498602 e KF498603pode permitir a formação de uma ponte dissulfeto entre FR2 e CDR3, o que poderia conferir
maior rigidez à alça CDR3, aumentando a estabilidade VHH [ 34 , 35 , 45 ]. A maioria dos clones mostrou regiões CDR3 mais longas (18-21 resíduos de
aminoácidos) quando comparadas com a VH humana (~ 14 aa). De fato, as CDRs de VHH são geralmente maiores para fornecer uma superfície antigênica
compensatória, dada a ausência de domínios VL nos HCAbs [ 34 , 46 ]. A baixa capacidade de seleção de clones anti-CA, a ausência parcial da marca VHH e a
reduzida alça CDR3 de KF498606 podem estar relacionadas à ausência de atividade enzimática ou citotóxica e, acima de tudo, à atividade imunomoduladora desta
subunidade CTX [ 47 ,48,49].
Os quatro clones responsivos ao CB apresentaram reatividade cruzada apenas com o veneno de serpente do gênero Crotalus , demonstrando especificidade, uma
característica importante para o diagnóstico de picada de cobra ou soroterapia [ 50 , 51 ]. VHHs selecionados não mostraram interação com outras toxinas (giroxina,
convulxina, crotamina) predominantes no veneno de C. durissus terrificus [ 9 ]. Além disso, o perfil de expressão de CTX em venenos de C. durissus cascavella , C.
durissus collilineatus e C. durissus cumanensis é de cerca de 72,0%, 67,4% e 2,6%, respectivamente [ 52]. Essa variação justifica a reatividade diferenciada dos
VHHs entre os venenos analisados. Além disso, os VHHs anti-crotoxina foram capazes de reconhecer formas monoméricas e multiméricas de CB em Western blot,
após eletroforese sob condições não redutoras [ 53 ], confirmando os resultados de ELISA e especificidade clonal.
Em relação à estabilidade térmica, os dois perfis de VHH analisados demonstraram alta resistência à desnaturação induzida pelo calor. Sua estabilidade contra
mudanças de temperatura, especialmente entre 25 e 55 ° C, é uma vantagem importante para aplicações terapêuticas e diagnósticas, principalmente em países
tropicais e subtropicais. Observou-se que os valores de temperatura de fusão do VHH variam entre 60 e 80 ° C [ 44 , 54 , 55 ], justificando a redução da atividade do
clone a estas temperaturas. Embora KF498602apresenta um par extra de cisteínas em sua seqüência de aminoácidos, sugerido para formar uma ligação dissulfeto
extra para estabilizar a estrutura VHH, a capacidade de reconhecimento deste clone foi reduzida em 50% quando aquecido a 95 ° C. Isso também foi observado na
VHH anti-triclocarban, selecionada por [ 56 ]. A ausência desta ligação dissulfureto extra em KF498604 reforça a ideia de que a alta termoestabilidade de VHHs está
relacionada com as substituições de aminoácidos típicas presentes nos HCAbs camelídeos [ 57 ]. Além disso, ambos os clones exibiram atividade mesmo após
incubação a 85 ° C (85%), enquanto scFv [ 38 ], mAbs [ 58 ] e IgG 1 policlonal [ 56] são renderizados inativos, demonstrando robustez de VHH. Além das
substituições de aminoácidos, a capacidade do VHH reenrolado com alta eficiência para sua conformação nativa provavelmente se deve à baixa complexidade da
estrutura do VHH [ 57 ]. A seleção realizada nos permitiu obter clones com afinidade na faixa micro e nanomolar, como observado em estudos anteriores, que
selecionam VHHs com alta capacidade de reconhecer e neutralizar toxinas animais [ 41 , 42 ]. A análise de SPR demonstrou que KF498604mostrou melhor
afinidade para CTX (KD = 81,34 nM) do que KF498602(KD = 1,7 μM), confirmando resultados detectados por ELISA e análises de Western blot. Além disso,
abordagens de SPR foram usadas para avaliar epítopos de interação de VHH. Semelhante ao observado com VHHs anti-TcdA [ 59 ] e anti-hemaglutinante [ 60 ], um
ganho de sinal de 103 RU na superfície do sensor foi observado com a injeção do VHH KF498602 após a saturação do sinal de interação KF498604 / CTX. Isto
sugere que estes clones interagem com diferentes epítopos no heterodímero.
KF498604 e KF498605 demonstraram inibição significativa da atividade da CTX e da fosfolipase CB in vitro. Foi observado que anticorpos policlonais e
monoclonais, capazes de inibir a atividade da fosfolipase CB in vitro, são potenciais inibidores da atividade miotóxica e neurotóxica da CTX in vivo. Isto demonstra
a participação do CB nos efeitos tóxicos do CTX [ 61 , 62 ]. Como o CTX não apresenta qualquer efeito sobre os miotubos murinos [ 63], o CB foi escolhido para
realizar ensaios de inibição da citotoxicidade ( Figura S1). A ausência do efeito citotóxico de CTX pode estar relacionada à baixa dissociação do heterodímero que é
dependente dos sítios da membrana celular, que pode estar ausente ou ser menor nos modelos celulares utilizados [ 63 , 64 ]. O VHH KF498604 foi capaz de reduzir
a liberação de LDH relacionada ao efeito citotóxico do CB sob os miotubos, demonstrando sua capacidade de reconhecer e bloquear a interação do CB com a
membrana celular.
A liberação de CK, relacionada ao efeito miotóxico da CTX em camundongos, foi significativamente inibida ( p <0,05) pela VHH KF498604 em até 78% na maior
proporção (1:40 w / w ), demonstrando o potencial efeito protetor da VHH em vivo . Foi demonstrado que a atividade miotóxica do CB está relacionada à sua
atividade de fosfolipase, que é reduzida pela modificação química do His48, um importante resíduo do sítio catalítico juntamente com o Asp99 [ 65 ]. O
KF498604 VHH foi capaz de inibir a atividade da fosfolipase, assim como a atividade citotóxica e miotóxica da subunidade CB do CTX, indicando alguma
correlação entre esses efeitos.
A estrutura cristalográfica da isoforma CA2CBb [ 10 ] demonstra um bloqueio parcial do acesso do substrato ao sítio catalítico da subunidade CB através da
interação dos resíduos Trp31 e Trp70 com Asp99 e Asp89 na subunidade CA. Entretanto, o sítio ativo de CB ainda é acessível de uma direção lateral [ 66 ], o que
poderia explicar a atividade catalítica do heterodímero CTX observada em ensaios com fosfolípides sintéticos e miotubos murinos in vitro , bem como em avaliações
de miotoxicidade in vivo.
Acoplamento molecular sugerido que KF498604 e KF498605VHHs de interagir com a interface do CA-CB de CTX, e, apesar de não haver contacto com o sítio
catalítico (His48, Asp49, Tyr53 e Asp99), os clones estericamente bloquear o acesso do substrato ( Figura 4 F). A maior parte da superfície de contato ocorre entre
os VHHs e a subunidade CB, justificando a alta capacidade inibitória do KF488604 contra atividades de fosfolipase, citotóxicas e miotóxicas. Além disso, ambos os
VHHs interagem com os resíduos da região C-terminal do CB, o que poderia contribuir para a inibição da atividade neurotóxica
[ 67 ]. KF498602 e KF498603reconhecem CB em uma região oposta ao sítio catalítico ( N-terminal α-hélice A e α-hélice D, principalmente), que não bloqueiam o
acesso ao substrato [ 10 ]. Como proposto anteriormente [ 66 ], a região N- terminal da CB , exposta ao solvente, pode se constituir em importante sítio
farmacológico da CTX. Esta região pode permitir a ligação do receptor pré-sináptico CTX nas junções neuromusculares, com subseqüente dissociação da
subunidade CA, permitindo a interação do terminal C do CB com o alvo e a liberação do sítio catalítico do CB, desencadeando sua neurotoxicidade. Assim, embora
eles não inibam a atividade da fosfolipase, esses clones podem ser úteis em estudos sobre os mecanismos neurotóxicos dos ensaios de CTX e de neutralização.
Dadas as características das VHHs selecionadas, bem como o envolvimento da miotoxicidade sistêmica na lesão renal aguda (LRA), uma das principais causas de
morte entre vítimas de envenenamento crotálico [ 68 , 69 , 70 , 71 ], consideramos esses clones ferramentas promissoras para diagnóstico ou tratamento de
envenenamento crotálico. Assim, essas ferramentas estão sendo usadas em nosso laboratório como “blocos modulares” para obter diferentes produtos VHH. Quer
sejam VHHs mono ou biespecíficos, ou HCAbs reconstituídos, as construções serão ótimas para gerar preparações oligoclonais humanizadas contra as principais
toxinas em venenos crotálicos. A capacidade protetora contra os efeitos neurotóxicos e nefrotóxicos desencadeados por CB, crotoxina e veneno bruto está sendo
investigada.

4. Materiais e Métodos Vamos para:

4.1. Declaração de ética


Procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as recomendações do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), e
foram aprovados pela Comissão de Ética em Uso Animal (CEUA) da Fiocruz Rondônia sob protocolo número 2012/11 e 2014/11. . O estado de saúde dos animais
foi verificado rotineiramente por um veterinário. Todos os grupos de animais (camundongos) foram monitorados regularmente (intervalos de 5 min) até o final do
período experimental e não houve morte não intencional de animais. Após anestesia tópica (gotas oftálmicas de tetracaína) para sangramento retro-orbital, os
camundongos foram eutanasiados por luxação cervical, conforme a Resolução Normativa nº 13 do CONCEA, de 20 de setembro de 2013
( http://www.mct.gov.br/upd_blob/ 0228 / 228451.pdf). The licenses related to access to Brazilian genetic resources for scientific purposes are: Instituto Brasileiro do
Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis–IBAMA, Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade–ICMBio (Number: 27131-1) and
Conselho de Gestão do Patrimônio Genético–CGEN/Brazil (Number 010627/2011-1).

4.2. Imunização Camelid e Monitoramento de Resposta Imunológica Humoral


Após avaliação do estado clínico dos animais, um jovem macho Lama glama foi imunizado por via subcutânea cinco vezes, em intervalos semanais, com doses
crescentes de CTX (100 µg e 200 µg), subunidades CB e CA (50 µg e 100 µg cada), mais adjuvante completo ou incompleto de Freund (Sigma-Aldrich, Saint Louis,
MO, EUA) ( Tabela S3 ).
A resposta imune de L. glama foi monitorada por imunoensaio ELISA. Poços de placas de microtitulação (Nunc MaxiSorp-, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha)
foram revestidas com 1 ug de CTX, CB ou CA diluída em PBS (NaCl 1,37 M, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 8,5 x 10 -2 M, KH 2 PO 4 1,5 x 10-2M , KC1 2,7 x 10-2M , pH
7,4) e incubado durante a noite a 4ºC. Depois de ser lavado três vezes com PBST (Tween-20 a 0,05% em PBS), os locais inespecíficos foram bloqueados com PBSM
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(1% de leite desnatado em PBS) durante 24 h. Em seguida, diluições em série (1:10 2 ; 1:10 3 ; 1:10 4 ; 1:10 5 , 1:10 6) do soro em PBSM, recolhido a cada semana,
foram adicionados aos poços e as placas foram incubadas durante 24 h a 4 ° C. As amostras foram lavadas com PBST, e de coelho anti-IgG de lama 2 / IgG 3 [ 72 ] a
uma diluição de 1: 12.000 em PBSM foi adicionado. O excesso de anticorpos foi removido por lavagem e a IgG de murganho anti-coelho conjugada com peroxidase
(Sigma Aldrich), a uma diluição de 1: 40.000 em PBSM, foi incubada durante 5 h. A reaco foi revelada utilizando 100 / po de tetrametilbenzidina (TMB, Merck
KGaA, Darmstadt, Alemanha) e bloqueada por 100 / po de ido sulfico (0,32 M) ap 30 min. As absorvâncias foram medidas a 450 nm num leitor de microplacas. O
controle negativo foi realizado utilizando soro pré-imune de lhama. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

4.3. Seleção de VHHs Anti-Crotoxina


Três dias após o reforço final, recolheram-se cinquenta mililitros de sangue animal para isolar os linfócitos utilizando Ficoll-Paque Plus (Merck KGaA, Darmstadt,
Alemanha). O RNA total foi extraído de 1,5 × 10 7 células utilizando o reagente Trizol (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EUA), e a síntese de cDNA foi
realizada com o Sistema de Síntese de Primeira Cadeia SuperScript III para RT-PCR (Invitrogen). Um reportório do gene VHH, bem como uma biblioteca imune, e
fagos recombinantes expressando VHHs fundidos com a proteína III do fago auxiliar VCSM13 foram obtidos de acordo com [ 38 , 42 ].
Seleção de anti-crotoxina, anti-CB e anti-CA VHHs foi realizada por biopanning. Para isso, os imunotubos MaxiSorb (Sigma-Aldrich) foram adsorvidos
separadamente com 1 mg de CTX, CB e CA em PBS e incubados por 24 horas a 4 ° C. O excesso de CTX, CB e CA foram removidos por lavagem com PBST e as
amostras foram bloqueadas em PBSM durante 2 h. Depois de serem lavados três vezes com PBST, os fagos VHH recombinantes, previamente incubados em PBSM,
foram adicionados aos imunotubos e as amostras foram incubadas a 37 ° C sob homogeneização durante 30 min. Subsequentemente, as amostras foram lavadas 15
vezes com PBST e 15 vezes com PBS. As partículas de fago VHH ligadas foram eluídas com HCl 100 mM e neutralizadas com Tris-HCl 1 M, pH 7,5. Os eluentes
foram transferidos separadamente para 10 mL de E. coliAs culturas de TG1 (A600 0,5) e as amostras foram incubadas durante 1 h sem agitao e durante 1 h com
agitao a 37. Após centrifugação a 4000 xg , os sobrenadantes foram descartados, os pellets ressuspensos em 2YT, plaqueados em 2YT / amp / glu e incubados
durante a noite a 30 ° C. Os clones individuais foram recolhidos para duas rondas subsequentes de bioprospecção. Os clones selecionados foram analisados por PCR
de colônia e por ELISA, a fim de verificar a presença e reatividade de VHHs contra alvos selecionados, respectivamente.
Para realizar o ELISA, mL positivo de E. coli TG1 (A 600 0,5) culturas e as amostras foram incubadas por 1 h sem agitação e por 1 h com agitação a 37 ° C. Após
centrifugação a 4000 xg , os sobrenadantes foram descartados, os pellets ressuspensos em 2YT, plaqueados em 2YT / amp / glu e incubados durante a noite a 30 °
C. Os clones individuais foram recolhidos para duas rondas subsequentes de bioprospecção. Os clones selecionados foram analisados por PCR de colônia e por
ELISA, a fim de verificar a presença e reatividade de VHHs contra alvos selecionados, respectivamente. Os clones foram cultivados em 1 mL (2YT / amp) e a
expressão de VHH foi induzida com 3 mM de isopropil-d-tiogalactopiranósido (IPTG) (A 6000,9) durante 16 h a 30. Após centrifugação, 50 µL de sobrenadantes
contendo VHH solúvel foram utilizados para realizar o ensaio, como descrito anteriormente. Os soros pré e imunes de lama foram usados como controles negativo e
positivo, respectivamente. Os clones positivos foram sequenciados, analisados e submetidos ao GenBank.

4.4. Expressão e Purificação de VHHs Anti-Crotoxina


Quatro clones positivos foram subclonados num vector pET-22b + (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). Assim, os VHH recombinantes seleccionados, clonados
no plasmídeo pHEN-1-6xHis, foram amplificados por PCR utilizando os seguintes iniciadores: VHNDEF (5'-GGAATTC CATATG GCCGA (G / C) GT (G / C) - 3)
e VHXHOR ( 5'-CCG CTCGAGTGAGGAGACGG-′3). Os locais de reconhecimento da endonuclease de restrição para Nde I e Xho I estão sublinhados.
Os fragmentos VHH, compostas de aproximadamente 400 pb, foram excisados do gel de agarose, digerido com Nde I e Xhoendonucleases de I, e inserido num
vector pET-22b + expressão, em um quadro com o poli-histidina (His) sequência de marcador. Após a transformação em E. coli BL21 (DE3) (Nova Inglaterra
Biolabs, Ipswich, MA, EUA), os clones foram cultivados em 30 mL de meio LB contendo 100 μg / mL de ampicilina (LB amp), sob agitação a 37 ° C. durante a
noite. Dez mililitros dessas culturas foram transferidos para 1 L de LB amp e quando sua absorbância (A 600) atingiu cerca de 0,7, a expressão proteica foi induzida
com IPTG 1 mM. As culturas foram incubadas sob agitação a 37 ° C durante 8 h. Após a centrifugação, os sedimentos foram ressuspensos em 20 mL de Tris-HCl 50
mM (pH 8,0). Para realizar a ruptura das células bacterianas, as amostras foram pré-tratadas com 1 mg / mL de lisozima à temperatura ambiente por 1 he sonicadas
por 3,5 min, com pulsos de 1 min (Misonix Ultrasonic Processor, Qsonica, Newtown, CT, EUA). Os corpos de inclusão foram recuperados após centrifugação a
15.000 × g por 15 min, ressuspensos em tampão de lavagem (Tris-HCl 50 mM, Na 2 HPO 4 50 mM, NaCl 300 mM e Triton X-100 a 1%, pH 7,4) e incubadas em
gelo durante 10 min. Este passo foi repetido mais uma vez. Triton X-100 foi removido com tampão Tris-HCl. As amostras foram centrifugadas e ressuspensas em
tamp de dissoluo (50 mM Tris-HCl, 50 mM de Na 2 HPO 4 , NaCl 300 mM e ureia 8 M), e, em seguida, incubou-se a 4 ° C durante 1 hora e centrifugou-se. Os
VHHs foram purificados por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) usando Talon Co 2+resina pré-carregada (GE Healthcare, Marlborough,
MA, EUA), sob condições desnaturantes, de acordo com as instruções do fabricante. A renaturação de VHHs foi realizada por diafiltração em PBS, usando
dispositivos de filtro Amicon Ultra-2 de 10 kDa (Merck Millipore, Billerica, MA, USA). A concentração de proteína VHH solúvel foi determinada pelo método de
Smith (1985) [ 73 ] com um kit de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EUA).

4.5. Análise de Imunoreatividade Cruzada de VHHs Anti-Crotoxina


A fim de verificar a especificidade dos VHHs purificados ( KF498602 , KF498603 , KF498604 e KF498605 ), ensaios de imunorreatividade cruzada foram
realizados por ELISA com diferentes venenos e toxinas dos gêneros Bothrops e Crotalus . Os poços das placas de microtitulação foram revestidos com 1 µg de
veneno de serpente obtido do Serpentário de Proteínas Bioativas, Batatais, Brasil ( B. atrox , B. bilineata , B. diporus , B. brasili , B. jararaca , B. jararacussu , B.
leucurus , B. marajoensis ,B. moojeni, B. urutu , C. atrox , C. durissus cascavella , C. durissus collilineatus , C. durissus cumanensis e C. durissus terrificus ),
juntamente com 1 µg de oito toxinas diferentes (Bothropstoxin I e II, de B. jararacussu e convulxina, crotamina, crotapotina, crotoxina e giroxina de C. durissus
terrificus). As placas foram incubadas a 4 durante a noite, lavadas com PBST e os locais n especicos foram bloqueados com PBSM durante 5 h. Subsequentemente,
foi adicionado um micrograma dos VHH purificados (pré-incubados em PBSM) e o ensaio foi realizado como descrito anteriormente. Soro imune de lhama (1:
1000) foi utilizado como controle positivo e um anti-BthTX VHH ( KC329718 ) [ 42 ] (10 µg / mL), como controle negativo. Todos os ensaios foram realizados em
triplicado.

4.6. Análise Western Blot de VHHs Anti-Crotoxina


A fim de confirmar a especificidade de VHHs para CB, foi realizada análise de Western blot. Dez microgramas de CB foram reduzidos, submetidos a electroforese
em SDS-PAGE a 12,5% e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Os sítios reactivos foram bloqueados com 5% de leite desnatado em tampão TBS
(TBSM) a 4 ° C durante a noite. Após a lavagem três vezes com TBS / Tween 20 a 0,1% (TBST), as tiras foram incubadas com 0,2 mg / mL de cada VHH anti-
crotoxina ( KF498602 , KF498603 , KF498604 e KF498605) durante a noite. As tiras foram lavadas de novo com TBST e incubadas com IgG2 / IgG3 de coelho
anti-lhama (1: 1000 em 5% de TBSM) durante a noite. Depois de serem lavadas, as amostras foram incubadas com IgG anti-coelho de ratinho conjugada com
peroxidase (1: 3000 em 5% de TBSM) durante 6 h. As tiras foram lavadas e os sinais reactivos foram detectados ap incubao com perido de hidrogio em soluo de
diaminobenzidina (DAB) (SIGMAFAST? DAB com Metal Enhancer Tablets, Sigma-Aldrich). O soro imune do lhama (1: 1000) foi utilizado como controle positivo
e um anti-BthTX VHH (KC329718-0,2 mg / mL) [ 42 ], como controle negativo.

4.7. Análise de estabilidade térmica de VHHs anti-crotoxina


Estudos de estabilidade térmica foram realizados para verificar a capacidade de ligação de VHHs anti-crotoxina selecionados em ensaios de ELISA, após exposição
a diferentes temperaturas, segundo Tabares-da Rosa et al. [ 56 ], com modificações. Quarenta microlitros de clones purificados KF498602 (0,440 μg / μL)
e KF498604 (0,729 μg / μL) foram incubados a 25, 45, 55, 65, 75, 85 e 95 ° C em um termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA , EUA) por 1 h. As
amostras foram centrifugadas a 2500 × g , à temperatura ambiente por 5 min, e as concentrações do sobrenadante foram determinadas pelo método de Smith (1985)
[ 73 ] .]. VHHs sol�eis (1 �) foram incubados em PBSM e utilizados para realizar um ensaio ELISA em placas de microtitula�o revestidas com 1 � de CB,
como descrito anteriormente. Os resultados foram expressos como uma porcentagem de sinal (450 nm) das amostras aquecidas em relação ao controle,
correspondendo aos clones não aquecidos.

4.8. Análises de Interacção por Ressonância Plasmónica de Superfície (SPR)


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 7/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
A análise de interacção entre KF498602 e clones KF4998604 e CTX foi realizada por SPR utilizando um sistema BIAcore T200 (GE Healthcare), de acordo com
[ 42 ], com modificações. A camada de dextrano do chip sensor CM5 foi ativada por uma mistura 1: 1 ( v / v ) de 0,4 M EDC (1-Etil-3-3-
dimetilaminopropilcarbodiimida) e 0,1 M NHS ( N-hidroxisuccinimida) a uma taxa de fluxo de 5 / min. CTX foi diluída em C 2 H 3 NaO 2 tampão (10 mM, pH 5,5)
e injectada numa célula de fluxo seleccionado para imobilização. Uma solução de 1 MH 2 NCH 2 CH 2O OH-HCl foi injetado para bloquear os grupos reativos
remanescentes na célula de fluxo. A célula de fluxo de controlo foi preparado com H 2 NCH 2 CH 2 OH-HCl sozinho. Para medies cinicas, o CM5-CTX foi
submetido a diluies em sie de VHHs (2,5 a 0,002) no tamp de corrida HBS-p (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM e Tween 20 a 0,005%, pH 7,4). O
ensaio cinico foi realizado a um caudal de 30 / min a 25.
De modo a verificar se o epítopo de interacção de CTX é ou não comum a ambos os clones, foi realizado um ensaio adicional. Após a saturação da interação
KF498604 (2,5 μM) -CM5-CTX, o chip sensor foi lavado com tampão de corrida HBS-p e KF498202(razão molar VHH / VHH 1: 1) foi injetado. Seguindo
obtenção sensograma, regeneração chip foi realizada com uma solução de AIW seguido por uma solução ICW durante 30 s cada (volumes iguais de A-C 2 H 2 O 4 ,
H 3 PO 4 , CH 2 O 2 , e C 3 H 4 O 4 , cada um a 0,15 M, pH 5,0; C-20 mM de EDTA; I-KSCN (0,46 M), MgCl2 (1,83 M), ureia (0,92 M), guanidina-HCl (1,83
M); Água desionizada W) segundo Andersson; Hämäläinen e Malmqvist [ 74]. As respostas de ligação foram calculadas subtraindo as RUs obtidas a partir de ambas
as células de controlo em branco e injeções de tampão de corrida. As análises cinéticas foram realizadas ajustando os sensogramas obtidos com o modelo de
Langmuir 1: 1 usando o software de avaliação BIA (versão 1.0, GE Healthcare).

4.9. Inibição In Vitro das Atividades de Fosfolipase CTX e CB


A inibição das atividades da CTX e da fosfolipase CB em lipídios fluorescentes foi realizada como descrito por [ 42 ]. O fosfolípido fluorescente (Acil-NBD- acilo -
NBD-PC, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EUA) foi reconstituída em clorofórmio, secou-se sobre um baixo fluxo de N 2 , e dissolvido em NaCl 150 mM para se
obter uma 1 mg / mL de solução estoque. Os ensaios foram realizados em 150 µL em placas opacas, em comprimentos de onda de 460 nm (excitação) e 534 nm
(emissão), 37 ° C e em intervalos de 3 s entre cada leitura, durante 5 min, usando Espectrômetro de Fluorescência Spectra Max M4 (Molecular Devices, San Jose,
CA, EUA) e Software SoftMax 6.0 (Molecular Devices, San Jose, CA, EUA). O meio de reação padrão continha 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM de CaCl 2e 5
de fosfolidos. A fim de verificar a capacidade dos VHHs de inibir as atividades da fosfolipase, 0,08 µg e 0,04 µg de CTX e CB, respectivamente, foram pré-
incubados com os VHHs KF498202 e KF498604 (1: 5; 1:10 e 1:40 p / p). ) durante 30 min a 37. As reações padrão com CTX ou CB isoladamente foram usadas
como controles positivos. Essas reações produziram 186 e 115 unidades de fluorescência, respectivamente, correspondendo a 100% de atividade da PLA 2 . O
controle negativo foi realizado com o meio de reação padrão sozinho.

4,10. Inibição In Vitro da Citotoxicidade do CB por VHHs Selecionados


A inibição da citotoxicidade dos CB pelas VHHs anti-crotoxina foi avaliada pela determinação da liberação de desidrogenase láctica (LDH) a partir de células de
mioblastos murinos danificadas, diferenciadas em miotubos, como descrito anteriormente [ 64 , 75 ]. A cultura de células C2C12 foi estabelecida em frascos de 25
cm 2contendo 5 mL de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma), suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, sigma), HEPES 2 g / L,
HCO 3 - 3,7 g / L , gentamicina (50 µg / mL) e incubadas em CO 2 a 5%atmosfera a 37 ° C. Após atingir a confluência total, as células não aderentes foram
removidas por lavagem com DMEM e foram adicionados 2 mL de solução de tripsina-EDTA a 500 U / mL (Sigma). Ap incubao a 37 durante 5 min, foram
adicionados 5 mL de meio DMEM suplementado e os frascos foram centrifugados a 300 g , 24 durante 10 min. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 1
mL de DMEM. Uma aluota foi dilua 1: 100 ( v / v ) em soluo azul de tripano a 0,4% (Sigma) de modo a contar as culas vieis sob um microscio tico (40x) utilizando
uma cara de Neubauer. As células foram transferidas para microplacas de 96 poços do tipo Costar ®(Sigma) em uma densidade inicial de 2,0 × 10 4células / poço e
incubadas nas mesmas condições até atingir 100% de confluência. Os sobrenadantes foram removidos e 200 µl de DMEM suplementado com 1% de FBS e
gentamicina (50 µg / mL) foram adicionados para diferenciação celular em miotubos [ 76 ]. Quatro a seis dias de incubação foram necessários para a formação de
uma longa camada de miotubos multinucleados, utilizados nos ensaios de citotoxicidade. Para o ensaio de neutralização, o CB na sua dose citotóxica mínima
previamente determinada (20 µg) ( Figura S1 ) foi incubado a 37 ° C durante 1 h com o clone KF498604 numa proporção de 1: 2,5 ( p / p) em PBS. Em seguida, 150
µl da solução foram transferidos para poços contendo a cultura de myotube em 50 mL de DMEM suplementado com 1% de FBS. Após incubação a 37 ° C por 3 h,
em atmosfera de 5% de CO 2 , os sobrenadantes foram coletados para determinar a atividade da LDH utilizando kits diagnósticos (Bioclin, Belo Horizonte, MG,
Brasil). Os resultados foram expressos como LDH U / L. Triton X-100 a 0,1% e 20 µg / poço de Bothropstoxin II foram usados como controlos positivos e PBS
como controlo negativo. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

4,11. Neutralização in vivo da miotoxicidade por CTX por VHHs


O efeito neutralizante na miotoxicidade induzida por CTX em camundongos foi analisado pela determinação da atividade sérica da creatina quinase (CK). Assim,
CTX na sua dose miotica mica previamente determinada (MMD) (1,5) ( Figura S2 ) foi incubada a 37 durante 1 h com o VHH KF498604 em razs de 1:10, 1:20 e
1:40 ( w / w) em PBS. Então, grupos contendo 5 camundongos machos (28-30 g) receberam uma injeção im de 50 µL de toxina / VHH no músculo gastrocnêmio. Os
animais de controlo positivo foram injectados com CTX e os controlos negativos receberam 50 de PBS ou VHH. Após 3 h, foi coletado sangue do plexo orbital para
determinar a atividade da creatina quinase utilizando kits diagnósticos (Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brasil). Os resultados foram expressos como CK U / L.

4,12. Modelagem e Ancoragem Molecular de VHHs Anti-Crotoxina


A fim de investigar os resíduos de aminoácidos que participam do reconhecimento de antígeno-anticorpo, realizamos modelagem de homologia de cinco VHHs
selecionados, seguindo a metodologia descrita por [ 42 ]. Após a modelagem, o servidor ClusPro2.0 [ 77 ] foi utilizado para prever as interações entre VHHs
modelados e a isoforma CT 2 CAb CBB (código de acesso ao PDB: 3R0L). O modo de anticorpo foi selecionado com as regiões não CDR mascaradas
automaticamente [ 78]. As estruturas de VHH foram submetidas como receptor e CTX como o ligante. O ClusPro selecionou as 1000 melhores soluções de
pontuação, agrupou-as de acordo com as considerações do Desvio Quadrático Médio da Raiz (RMSD), e o menor escore ClusPro, representando a maior
probabilidade de interação antígeno-anticorpo, foi selecionado [ 79].

Agradecimentos Vamos para:

The authors thank the Program for Technological Development in Tools for Health-PDTIS-FIOCRUZ, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) (grants 477760/2012-0 and 459046/2014-4), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da
Amazônia Legal (BIONORTE/CNPq/MCT), Fundação de Amparo ao Desenvolvimento das Ações Científicas e Tecnológicas e à Pesquisa de Rondônia (FAPERO).
Marcos B. Luiz was supported by a fellowship from Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). The authors thank Amy Nicole
Grabner for reviewing the manuscript’s English.

Materiais Suplementares Vamos para:

As informações a seguir estão disponíveis online em http://www.mdpi.com/2072-6651/10/4/142/s1 , Figura S1: Avaliação da atividade citotóxica de Crotalus
d. veneno de terrificus, CTX e CB em mioblastos de mculo esquelico C2C12 murino; Figura S2: Determinação da atividade miotóxica de CTX em
camundongos; Tabela S1: Cronograma de imunização de Lhama com as subunidades CTX e CA e CB; Tabela S2: Análise de interação por SPR; Tabela S3: Dados
dos estudos in silico

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Contribuição Principal Vamos para:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5923308/ 8/11
14/05/2018 Anticorpos de Domínio Único Camelídeo (VHHs) contra a Crotoxina: Uma Base para o Desenvolvimento de Blocos Modulares par…
VHHs específicos para o gênero Crotalus foram capazes de inibir a fosfolipase; atividade citotóxica e miotóxica da CTX in vitro e in vivo . Como a miotoxicidade
sistêmica na lesão renal aguda (LRA) é uma das principais causas de morte entre vítimas de envenenamento crotálico, consideramos esses clones como ferramentas
promissoras no tratamento do envenenamento crotálico.

Contribuições do autor Vamos para:

MBL, CFCF, SSP, LSMD, JPZ, FBZ, ALF e RGS conceberam e projetaram os experimentos; MBL, SSP, NRG, NDRP, AMK, LSMD, JCS, FBZ e CFCF realizaram
os experimentos; MBL, CFCF, SSP, LSMD, ALF, AMS e RGS analisaram os dados; A MBL e o CFCF escreveram o artigo.

Conflitos de interesse Vamos para:

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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