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UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
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Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN
PROFESORES
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GRUPO:
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Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN
ÍNDICE
Índice __________________________________________________________________________________ 3
Práctica No. 9 Cuantificación de microorganismos coliformes por la técnica del número más probable (NMP) 72
Práctica No. 12 Efecto de los factores fisicoquímicos sobre el crecimiento microbiano __________________ 106
Agares_________________________________________________________________________________ 119
Caldos _________________________________________________________________________________124
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INSTRUCCIONES GENERALES
I.- EVALUACIÓN
1.- El laboratorio representa el 100 % del curso total y cada práctica se evalúa de la siguiente
forma:
Trabajo experimental: 20%
Examen exploratorio 20%
Examen escrito de conocimientos 20 %
Discusión de la práctica: 20%
1. Objetivos 0.5 %
2. Análisis de resultados: 7%
Informe de la práctica 20 % 3. Discusión: 7%
4. Conclusiones: 5%
5. Bibliografía: 0.5 %
2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas,
aprobar el 80% de las prácticas efectuadas y obtener un promedio mínimo de seis.
3.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la
práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte
correspondiente.
4.- La calificación de cada departamental será el promedio de las calificaciones de las prácticas que
estén dentro del periodo y el examen.
5.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene la
calificación, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.
6.- Se elige un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los alumnos miembros del equipo
hayan elaborado el reporte. Si no es así el alumno que no lo presento tendrá cero.
7.- Cuando a un equipo le toque preparar los materiales para utilizarse en la práctica o bien la
esterilización de material limpio y /o sucio y no lo realice tendrá cero en la práctica.
II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS
8.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:
9.- El cuaderno de reporte de prácticas debe ser de tamaño profesional forrado de color blanco
(2BM1), Negro (2BM2) y gris (2BM3) y en la portada se colocará una etiqueta con el título de la
asignatura, el nombre de los tres alumnos que conforman el equipo, colocando en primer término el
del dueño del cuaderno, de manera remarcada o con letra más grande y en la parte superior derecha
se pondrá una etiqueta de 5 cm con el número de equipo.
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22.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo
práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
23.- Después de terminada la práctica, el material debe ser entregado limpio por el equipo
responsable a la persona encargada del almacén.
24.- Evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica.
25.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un
lugar de trabajo donde se manejan cultivos y aparatos delicados.
26.- La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará
condicionada a la autorización del profesor responsable de la práctica, y en caso de retirar su material
de la incubadora deberá traer bata, además traerá su material que va a necesitar.
27.- Una vez esterilizado el material que contenga agar se dejará enfriar y posteriormente se
depositará en una bolsa de plástico para su desecho.
28.- Equipo que no traiga el material biológico solicitado en la práctica no se le permitirá la entrada.
IV BREVES REGLAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
1.- Las reglas de seguridad son para TODAS las personas que estén en el laboratorio.
2.- Uso de bata de laboratorio. Las batas protegen de contaminaciones químicas o biológicas, por
ello se recomienda su cambio al salir de laboratorio.
3.- Lavarse las manos al inicio y al final cada práctica: Recordar que se manejan microorganismos
patógenos.
4.- El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Cualquier material que no se utilice
en la realización de la práctica debe estar apartada del área de trabajo. Antes de comenzar
desinfectar la superficie de trabajo.
5.- Prohibido comer, beber, fumar y mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay
que evitar llevarse las manos a la boca, nariz ojos u oídos.
6.- No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores o pipetas automáticas.
7.- Evitar generar aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fácilmente inhalados.
Todas las operaciones bruscas como el manejo rápido de las asas pueden generar microparticulas
que pueden ser inhaladas por el analista. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor
de la flama del mechero en un área de 15 cm o en una campana de seguridad.
8.- Evitar desplazarse en el laboratorio.
9.- Las ventanas deben estar cerradas, ya que las corrientes de aire originan contaminaciones en los
cultivos.
10.- El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contengan cultivos. Se debe
realizar con una canastilla y si se saca de la incubadora o refrigerador, sacar dicho material de una
sola vez y siempre colocar el material de forma segura para evitar que se caigan.
11.- Bajo ningún concepto se deben sacar muestras contaminadas del laboratorio.
12.- El material contaminado debe esterilizarse antes de procesarlos como residuos. El material
de vidrio debe esterilizarse para luego lavarse, secarse y volverse a emplear.
13.- El material de vidrio roto depositarlo en los contenedores específicos y designados en el
laboratorio
14.- El botiquín de primeros auxilios está en el interlaboratorio
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15.- La mesa de trabajo se debe limpiar con una esponja que contenga benzal como desinfectante,
este proceso se hace antes y después de terminar la sesión de laboratorio.
16.- En caso de accidente. Avisar inmediatamente al profesor, en caso de derrame del cultivo se
deberá cubrir con un desinfectante y dejar actuar por cinco minutos, para luego limpiar con la esponja.
17.- Tomar las precauciones necesarias en el suministro de gas, evitar la presencia de sustancias
inflamables, revisar periódicamente las instalaciones y la flama del mechero beberá estar en azul,
para ello el mechero cuenta con una entrada de la cantidad de aire con el que se obtiene una mezcla
de aire-gas, de forma que la llama tenga oxigeno suficiente.
18.- Incendio de disolventes. En el caso de que se produzca un accidente al incendiarse un
solvente, nunca soplar, se deberá emplear una franela mojada para cubrir el recipiente. Si el fuego se
extiende, usar el extintor dirigiéndolo a la base de las llamas.
19.- Utilización de luz Ultravioleta. Nunca se debe mirar directamente el foco emisor, deberán
protegerse los ojos con las gafas y cualquier zona de la piel expuesta a la radiación con guantes.
20.- Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada de personas ajenas al grupo que
visiten a los alumnos y a profesores.
21.- Los alumnos con el pelo largo se lo recogerán, no se permite el uso de flecos.
22.- Queda prohibido el uso de celulares y aparatos electrónicos durante el desarrollo de la práctica.
23.- Al entrar al laboratorio evitar, traer chamarra, bufanda, guantes y la bata deberá estar abrochada.
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Actividades:
I.- Lectura y discusión de Normas Oficiales Mexicanas (NOM)
A. NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos
biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
B. NOM-026-STPS-1998, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por
fluidos conducidos en tuberías
Desinfección del área de trabajo
Código de colores (instalaciones de gas)
Uso del contenedor para punzocortantes
Botiquín
Extinguidores
C. Norma oficial mexicana NOM-120-SSA1-1994, bienes y servicios. prácticas de higiene y sanidad
para el proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas.
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PRÁCTICA No. 1
MICROSCOPÍA
UNIDAD: I Normatividad en el laboratorio y microscopía
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general
El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación para ser observada en el microscopio
compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo
1.2 Objetivos específicos
1.2.1 El alumno manejará la forma correcta de utilizar el microscopio compuesto
1.2.2 El alumno realizará correctamente la técnica de iluminación de Köhler
2.- INTRODUCCIÓN
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el
instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un
sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los
microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos
elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la
mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.
Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen
diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo
tenemos a:
Microscopio óptico
Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de
mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o
un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos
objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen
hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de
la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.
Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con
longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con
objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no
puede aumentar la resolución.
El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas:
1. Sistema de iluminación;
2. Sistema óptico
3. Sistema mecánico.
El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar
eficazmente la preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo
y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que
permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.
El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el
movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base,
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cámara de televisión. El tubo generalmente está diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija
entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el
laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.
Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita,
poseen aumento propio, apertura numérica y está diseñada para trabajar con diferentes campos.
Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos
permite saber a detalle cuáles son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1)
2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos
3.- El lado superior derecho la apertura numérica.
4.- El lado inferior la distancia mecánica
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos
6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (tabla 2)
En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que:
Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,
10= No requiere cubreobjetos ó
0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.
Anillo superior.- Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del
aumento:
Aumentos totales: El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene
multiplicando el número de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo
y por el número de aumentos que tiene el objetivo con el que se esta observando.
Distancia mecánica: Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del
microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular,
la distancia mecánica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular,
esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm.
Poder de resolución: El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene
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para discernir entre dos puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada. El poder de
resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio electrónico
de 6 Ángstrom.
Apertura numérica: Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del
microscopio, ya sea del condensador o del objetivo.
Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha
las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en
distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción
experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que
pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos
ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de
luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las
porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos
densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes
semifinos no coloreados.
La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro
porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas
individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para
observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el
Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.
Cada uno de los microscopios tiene una función determinada, en este y en este caso este tipo de
microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, además en este tipo de microscopio
también se realiza la técnica de iluminación de Köhler
f) Limpiar la parte óptica del microscopio con papel seda, nunca hacerlo con la bata.
g) Se dará la clasificación del microscopio según el sistema mecánico, óptico y el de iluminación.
h) Conectar el microscopio a la toma de corriente
i) Bajo las instrucciones del profesor realizar la técnica de Köhler.
4.1 Cuidado y limpieza del microscopio
Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:
a) Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector
de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.
b) Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el
cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.
c) Las partes mecánicas se deben lubricar y se limpian por fuera con una brocha de cerdas suaves.
Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio.
d) Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos
e) Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica.
f) Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o
remover residuos de aceite de inmersión.
4.2 TÉCNICA DE ILUMINACIÓN DE KÖHLER
A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler
propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación se forma de dos diafragmas: un
diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un
diafragma llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador.
Pasos a seguir para la iluminación de Köhler.
1.- Luz amarilla (bajo voltaje)
2.- Ajustar la distancia interpupilar
3.- Ajustar las dioptrías
4.- Abrir el diafragma de campo e iris
Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio
7.- Observar y cerrar el diafragma dispuesto en 8.- Bajar algo el condensador, hasta obtener
el pie del microscopio máxima nitidez de la imagen del diafragma
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9.- Centrar el diafragma de campo luminoso en 10.- Abrir el diafragma de campo luminoso
el campo visual, recurriendo a los dos tornillos casi hasta el borde del campo visual,
el condensador centrando con exactitud y abrirlo hasta que
desaparezcas detrás del borde del campo
visual.
11.- Regular el contraste de la imagen con 12.- Insertar el filtro azul, regular la intensidad
ayuda del diafragma del condensador. de la luz con el control del voltaje.
13.- A cada cambio de objetivo: enfocar con el 14.- Al utilizar objetivos panorámicos de bajo
micrométrico y contrastar con el diafragma del aumento rebatir la lente frontal del
condensador. condensador sin alterar su altura.
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5.2 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:
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PRACTICA No. 2
PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO
UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopía.
1. OBJETIVOS
Objetivo general
El alumno realizará preparaciones en fresco para ser observadas en el microscopio óptico, realizará
preparaciones fijas para ser observada en el microscopio óptico.
I.2 Objetivo específicos
1.2.1 El alumno realizará una preparación en fresco de una muestra de agua estancada
1.2.2 El alumno realizará varios frotis para realizar preparaciones fijas simples y diferenciales
2. INTRODUCCIÓN
La gran mayoría de los microorganismos son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del
microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena
observación microscópica es necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que
los objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser
percibidos a través del microscopio, además de que los microorganismos carecen de una coloración
natural, hay que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la
imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante
Tinción simple: En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico, se
utiliza solamente para incrementar el contraste de la célula que adsorberá el colorante y quedará
teñido del mismo color.
Tinción diferencial: Se utilizan una combinación de colorantes para dar diversos complejos coloridos
y como ejemplo tenemos la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen.
Tinciones específicas: Incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y la cápsula. Estas técnicas se
basan en la estructura que se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad por los colores
utilizados mayor que el resto de la célula.
Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico
generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más
adecuadamente, Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la
determinación de la movilidad.
Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el
microscopio de contraste de fases, en donde la característica más importante de este tipo de
microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teñirlos.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1 EQUIPO
Microscopio óptico
3.2 MATERIAL
Portaobjetos Frasco gotero con solución de fucsina
fenicada
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4.2 Examen en fresco de agua estancada y de una muestra con azul de algodón lactofenol
a) Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae, en el puente de
coloración.
b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e) Lavar los frotis con agua de la llave.
f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos.
g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.
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j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X)
a. Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta
que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la
preparación.
b. Dejar que el frotis se enfríe y lavar con agua de la llave.
c. Cubrir el frotis con safranina por un minuto.
d. Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión.
b) Edad del cultivo: Un microorganismo Gram positivo de un cultivo joven presenta una pared celular
sin alteración. El mismo microorganismo, si sufre daño en la pared por alguna causa puede teñirse y
observarse como una bacteria Gram negativa. Esto indica la importancia de la pared para la
retención o salida del colorante.
c) Tinción de Gram decolorada: Esto nos ocurre cuando dejamos actuar por más de 30 segundos el
alcohol-acetona, entonces la preparación resultará Gram negativa, debido al tiempo prolongado de
exposición con el decolorante.
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Realiza el esquema de la preparación en fresco.
40X
100X
5.3 ¿Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?
5.4 ¿Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco?
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PRACTICA No. 3
ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL PARA MICROBIOLOGÍA
UNIDAD II: Esterilización
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno preparará material de uso en microbiología para su esterilización y elegirá el método
adecuado de acuerdo al tipo de material o sustancia.
I.2 Objetivo específicos
1.2.1 El alumno preparará el material de vidrio e instrumental para esterilizarlo por calor seco y
húmedo
1.2.2 El alumno esterilizará el material previamente preparado, por calor seco y calor húmedo.
1.2.3 El alumno realizará el proceso de filtración a través de membrana
1.2.4 El alumno utilizará bioindicadores de acuerdo al método empleado.
2. INTRODUCCIÓN
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A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material
mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una
esterilización completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo.
Radiaciones ionizante y no ionizante:
La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre
pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros
pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.
Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula.
Filtración a través de Membranas
Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es
decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas
de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las
dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro).
Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado,
asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como
bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm
2 Métodos químicos
Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y propiolactona)
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos
carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en
la industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos
electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y
además cancerígeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20
% de CO2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la
velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a
4 h a 54°C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de oxido
de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido
de etileno residual porque es muy tóxico.
La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva
después de varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más
rápidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser
cancerígena.
3 Métodos bacteriológicos para verificar las técnicas de esterilización (Pruebas de esterilidad).
En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que
manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril,
para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y
posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.
Método de la tira de papel
Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Geobacillus stearothermophilus se
presentan en una envoltura con dos compartimientos. En el primero está la tira testigo, que se ha
esterilizado (testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se
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Tres cuadros de papel Kraf de 6 X 60 cm para Un tubo de ensaye de 13 x 100 sin tapón
envoltura de pipeta de 10 ml. Dos tubos de ensaye con 3 ml de caldo nutritivo
Tres cuadros de papel Kraf de 33 X 40 cm para sin esterilizar (se preparan el día de la práctica)
caja de Petri Tres tubos de ensaye con 3 ml de caldo nutritivo
Tres cuadros de papel Kraf de 22x22 cm para estéril
envoltura de pinza o tijera. Un frasco con alcohol
Tres cuadros de gasa doble de 12X20 cm para Cuatro matraces con 50 ml de caldo nutritivo estéril
tapón de matraz.
Tres cuadros de gasa doble de 7 X 15 cm para
Tres cuadros de gasa doble de 15 X 25 cm para tapón de tubo
tapón de matraz.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
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4.2.3 PIPETAS
a. Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy
compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip
b. Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón
c. Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo
con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de
equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
4.2.4 MATRACES
a. Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo
las instrucciones del profesor.
b. Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.
c. En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No
anotar los datos sobre el gorro de papel.
4.2.5 PINZAS Y TIJERAS
a. Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta.
b. Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.
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b) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril sin tira de esporas, es el testigo (-).
Resultado
(turbidez)
5.4 Explicar por qué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye
5.5 Qué explicación darías si después de la esterilización, el tubo que contiene la tira de esporas hay
crecimiento después de la incubación.
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel
Kraf para su esterilización por calor seco y húmedo.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así
como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1 Enlistar la bibliografía consultada
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PRACTICA No.4
NUTRICIÓN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS AERÓBICOS
No. DE UNIDAD: III Nutrición y Cultivo Microbiano
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo General.
El alumno preparará diferentes medios de cultivo en base a sus componentes, uso y consistencia,
utilizando la NOM-065 SSA1-1993 Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de
cultivo y los utilizará para cultivar microorganismos.
1.2 Objetivos específicos
2.1 El alumno preparará medios de cultivos complejos, diferenciales, enriquecidos, indicadores y
sintéticos de acuerdo a la NOM–065-SSA-1993, a las necesidades nutricionales de un
microorganismo, los esterilizará y vaciará para su uso.
2.2 Utilizará los medios de cultivo de acuerdo a su presentación final para cultivar microorganismos y
comparará el crecimiento de acuerdo a la clasificación.
2.- INTRODUCCIÓN
Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones
inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas
grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos.
La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera
preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas
interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados.
Nutrición.
A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el
anabolismo se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:
a.- Nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer.
b.- Nutrientes útiles pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son
esenciales. Algunos nutrientes son monómeros a partir de los cuales las células forman las
macromoléculas y otras estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de
energía sin ser incorporados directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un
nutriente puede desempeñar ambas funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos:
macronutrientes y micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o
pequeñas respectivamente y factores de crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos
orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se
necesita en gran proporción. Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan
pequeñas que es imposible determinar cuánto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que
un micronutriente esté presente en el medio en que un microorganismo está creciendo, debido a que
los componentes del medio pueden contener tales micronutrientes en pequeña cantidad como
contaminantes.
Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que obtienen del medio que las
rodea. Los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos
adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos
medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten crecer.
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Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de
cultivo, formulado con un fin específico, y el cual deberá contener:
a) Fuente de carbono
b) Fuente de nitrógeno
c) Fuente de azufre
d) Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o
vitaminas que no pueden sintetizar)
e) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).
f) Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos o
metales pesados.
g) Indicadores de potencial oxido-reducción.
h) Agar como el agente gelificante o soporte.
Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias
de los medios de cultivo. Generalidades.
Medios selectivos.
Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en
una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.
Medios selectivos de enriquecimiento.
Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben
la reproducción de otros.
Medios diferenciales.
Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en
el medio o en las características típicas de las colonias.
Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.
Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de
microaerofilia.
Medios de transporte.
Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del
producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.
Medios para filtración a través de membrana.
Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el
crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.
Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del
medio de la membrana.
Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
En el caso de los hongos, el medio de cultivo que más se utiliza es el agar de papa y dextrosa, ya que
tiene un pH de 3,5 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser
más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina;
para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se
llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar extracto de malta y el agar rosa de
bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico.
En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, y el
objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento, identificación u obtención de masa celular.
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Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los
medios de cultivo como son:
a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)
b. Los materiales que deben encontrase en condiciones de limpieza
c. Si se debe aplicar calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad,
desnaturalización, caramelización o pérdida de actividad nutricional.
d. pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante
e. Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación
comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.
Cultivo microbiano.
Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos se encuentran en consorcio y en
raras ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una
muestra, se encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un
cultivo puro. Un cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie.
El cultivo de microorganismos se puede realizar en medio sólido, semisólido o líquido.
Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo
gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formación
de estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por picadura
(introduciendo el asa en el agar) si se trata de hongos filamentosos.
Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo
proveniente de una placa.
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
a) Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio
por la superficie inclinada del agar.
b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo
longitudinalmente.
La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce
en el medio líquido agitando suavemente el asa.
a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos
con agar inclinado
b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son: turbidez,
un sedimento, una película superficial, o combinados.
c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo
Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se
puede hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo
primario. Estas características son útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales
apropiadas para completar la identificación de los microorganismos, aunque cabe señalar que la
identificación de microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya
que se requiere otras pruebas bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas.
Agar bacteriológico
El agar utilizado en bacteriología es un medio que está libre de metales, compuestos nitrogenados,
sales insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos.
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El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas
rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente
el agar es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan
como polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es
variable, con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas
utilizadas. El agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%,
en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unión de sus
partículas, que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al
enfriarse, ya no cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a
medida que la solución disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 – 40 °C.
Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los
medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a que:
a) Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias
marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.
b) Su estabilidad química, le permite mantener el medio en estado sólido.
c) Su punto de fusión, superior a 80 °C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se
incuban hasta temperaturas de 65 °C.
d) Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 °C, permite mezclarlos en forma líquida.
e) Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente al
1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos.
f) Su empleo en concentraciones muy bajas permiten la obtención de medios semisólidos en los
cuales se pueden realizar pruebas de movilidad.
Clasificación de medios de cultivo
I Los medios de cultivo por su estado de agregación pueden ser: líquidos, semisólidos y
sólidos
a) Medios líquidos. Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de
microorganismos o bien para la producción de algún metabolito.
b) Medios semisólidos. Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad.
c) Medios sólidos. Se utiliza para obtener colonias aisladas de microorganismos.
II.- Por su uso se clasifican en:
a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos
microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del microorganismos
o grupo de microorganismos de interés.
b) Medios de enriquecimiento. Son medios que estimulan la multiplicación de algún
microorganismo.
c) Medios selectivos de enriquecimiento.- Son medios que estimulan la multiplicación de algún
germen determinado e impiden la reproducción de otros.
d) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores ácido base y de redox para
detectar cambios en el medio o en las características típicas de la colonia.
e) Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.- Son medios de cultivo para aquellos gérmenes
que requieran condiciones anaeróbicas o de microaerofilia. Incluyendo medios reductores como el
caldo tioglicolato y el uso de jarras de anaerobiosis.
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Los medios para realizar antibiogramas o para medir los halos de inhibición de sustancias
desinfectantes o antisépticas generalmente son medios que no contienen inhibidores como el agar
Mueller Hinton, agar cuenta estándar y agar de soya y tripticaseína.
Para cada medio de cultivo se deben de introducir controles, por ejemplo para el Agar de papa y
dextrosa se siembran las siguientes cepas de referencia.
Microorganismo Cepa Resultado
Candida albicans ATCC 10231 Bueno
Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 Bueno
Trichophyton mentagrophytes ACTT9533 Bueno
Para el agar con eosina y azul de metileno los controles de actividad son:
Esto se realiza para garantizar que el medio de cultivo funciona adecuadamente y puede ser utilizado,
además es parte del control de calidad de los medios de cultivo.
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a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de
medio indicada por el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
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a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de
medio indicada por el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm
limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de
esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 60 ml de medio.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
c) Calentar solo si es necesario hasta disolverlo completamente.
d) Medir con una probeta 50 ml y colocarlo en un matraz de 125 ml, colocarle su tapón y gorro
e) Vaciar 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados,
taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote de lámina.
f) Esterilizar a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase y guardar en refrigeración.
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que dice el envase para preparar la cantidad que se indique.
b) Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolución completa.
d) Tapar el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del frasco
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de
medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape
o con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.
4.5.1 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar cajas de Petri)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de
medio indicada por el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
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4.5.2 MEDIO COMPLEJO (Agar Papa y Dextrosa para preparar tubos de ensaye)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de
medio indicada por el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm
limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de
esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.
4.5.3 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar matraces con 80 ml)
h) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 80 ml del medio.
i) Colocar el medio en un matraz de 125 ml y adicionar el agua necesaria.
j) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
k) Tapar el matraz previamente etiquetado que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
l) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
m) Este medio se utilizará para la realización de la técnica de vaciado en placa y para ello será
necesario fundir el medio y cuando este a 45 °C se le adicionará 1.4 ml de ácido tartárico al 10%
estéril por cada 100 ml de medio preparado y homogeneizar.
a) Pesar con cuidado la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que
indique el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolución completa y colocar 3 ml en tubos de 13 x 100 mm.
d) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase
e) Dejar los tubos en el bote y dejar que estos solidifiquen en posición vertical.
NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIÓN QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
SESIÓN II
4.2 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA (ESTRÍA CRUZADA, SIMPLE, POR PUNTO Y
MASIVA)
Se utilizarán cajas con agar EMB o Agar sangre para la realización de la estría cruzada.
a) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama del mechero.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se indica en el
esquema y esterilizar el asa cada vez que se realiza una estría.
f) Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 horas.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.
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a) Se utilizarán tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinada y AGS
b) Tomar una asada de la bacteria proporcionada y sembrar por estría en “S” la
superficie del medio inclinado de agar nutritivo.
c) Tomar una asada del (micelio y esporas) proporcionada y sembrar por estría en
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4.7 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO (Se emplearán tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales)
4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO (Se emplearán tubos con medio SIM)
d. Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado,
filamentoso o rizado.
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En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilización, el
aspecto final del medio y cuál es su clasificación en base a su consistencia y composición.
Caldo Glucosa sales 110°C /10 ´ Líquido Simple /sintético Tubo y matraz
Ejemplo
Agar Glucosa sales
Agar Nutritivo
EMB
PDA
SIM
Agar sangre
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5.2 ¿Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de Petri?
5.3- De los siguientes medios, mencionar en qué consiste su capacidad diferencial o selectiva y qué
tipos de microorganismos crecen en ellos? Agar Rosa de Bengala y Agar Papa Dextrosa.
5.4 ¿Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?
5.5 De los medios usados indica cuáles son específicos para mohos y cuáles para bacterias y ¿por
qué?
5.6 Cuando se siembran hongos en medio líquido, describe cómo es el crecimiento con y sin
agitación.
5.7 ¿En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben
tomar?
5.8 Anota la morfología colonial de un moho y de una bacteria, indicando de que medio lo obtuviste.
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Discutir con base a la Norma Oficial Mexicana la clasificación de los medios y a las características de
la morfología colonial (macroscópica) para cada especie microbiana.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la
bibliografía consultada y al objetivo de la práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA
8.1 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª
Edición. Interamericana. México. 140 p.
8.2 Manual de medios de cultivo Bioxon parte 1 y 2
8.3 NOM-065-SSA1-1993, Bienes y servicios. Que establece las especificaciones sanitarias de los
medios de cultivo. Generalidades.
8.4 Schiegel, G. Microbiología General. Edición. Omega. 1997. España. 654 p.
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PRACTICA No 5
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBICOS
UNIDAD IV: Ubicuidad y aislamiento de microorganismos
1. OBJETIVOS:
El alumno practicará las técnicas de aislamiento y cuantificación de microorganismos de muestras
biológicas siguiendo las recomendaciones de las Normas Oficiales Mexicanas.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1.2.1 El alumno practicará las diferentes técnicas de aislamiento y recuento de microorganismos.
1.2.2 Aplicará la técnica de las diluciones para disminuir la carga microbiana de las muestras con base
en las normas oficiales, NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de
Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico y NOM-110-SSA1-1994 Preparación y Dilución
de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico, 092 NOM-092-SSA-1994, Método para la
cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1–1994, Bienes y servicios. Método para la
cuenta de mohos y levaduras en alimentos
2. INTRODUCCIÓN
Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes
en una muestra, forzándolos a crecer en medios de cultivos. No todos los microorganismos pueden
cultivarse en medios de cultivo como el caso de los organismos biotróficos y consorcios microbianos
difíciles de separar (parásitos obligados), los cuales se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante
(virus, rickettsias, hongos).
En el estudio microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo puro y
luego su posterior identificación (familia, género y especie).
-Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que
presumiblemente se ha obtenido a partir de una sola célula. En un cultivo puro, no necesariamente
todas las células que lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas
de ellas sufran mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que
componen una especie se denomina cepa.
Las diferentes técnicas de aislamiento son la estría cruzada, el vaciado en placa y la extensión con
varilla, pero en ocasiones la muestra tiene gran cantidad de microorganismos que tenemos que
recurrir a la realización de:
Realización de diluciones (NOM-110-SSA1–1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico)
La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los
microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis.
La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el
número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la
observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
Dilución primaria, es la suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del
producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.
Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado
volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de
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esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales
adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
Estría cruzada en placa:
Esta técnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estrías cruzadas
sobre la superficie de un medio sólido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias
separadas que generalmente corresponden a un cultivo puro, aquí no se puede hacer un recuento.
TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA:
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de
elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia
proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de
variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error
en la cuenta en caso contrario seguir las indicaciones de la NOM 092
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de
colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.
TÉCNICA DE EXTENSIÓN EN PLACA CON VARILLA ACODADA
Esta técnica se utiliza para el aislamiento y recuento de microorganismos, donde el inóculo se
distribuye con la varilla, previamente esterilizada. La cantidad de inóculo utilizado puede ser de 0,1 o
0,5 ml.
En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que
deseamos es ver la producción de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos
productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidón.
El aislamiento nos sirve para obtener la morfología colonial, microscópica y observar alguna
característica como hidrólisis o hemólisis.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
3.1 MATERIAL POR EQUIPO
Cuatro Cajas de Petri estériles Cuatro cajas de Petri con Agar Nutritivo
Cajas de Petri con EMB o medio selectivo Cilindro con pipetas de un ml estériles
Matraz con 100 ml de ACS o PDA Seis frascos de dilución con 90 ml de
solución salina al 0.85%
Balanza granataria
3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO
3.2.1 Muestra de queso, agua de sabor, leche en punto de venta, helado, etc.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor y según el siguiente esquema.
4.1.1 DILUCIONES
a. Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de
microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).
b. Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en
baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando
vigorosamente.
44
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c. Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente
representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
d. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 10 ml de la muestra si es muestra líquida y 10 g si es
muestra sólida y diluir con 90 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a
ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente (todo en condiciones de esterilidad).
e. Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la
pipeta.
f) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular,
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de
análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado.
En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
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d) Incluir una caja sin inóculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad.
e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
f) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran.
g) Para bacterias y levaduras 37°C 24 a 48 horas.
h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias
i) Si se cuenta la última dilución y no tiene entre 25 y 250 sino más, y las colonias están bien
distribuidas, dividir la placa en dos y contar solo una mitad, el resultado se multiplica por dos, si aún
tenemos muchas colonias, dividir la placa en cuatro y solo contar un cuadrante y el resultado se
multiplica por cuatro, y si todavía tenemos muchas contar 5 cm2, sumarlos y sacar un promedio, el
resultado se multiplica por 65, cuando la placa utilizada sea de 100 X 15 mm.
j) Para el aislamiento y recuento de mohos es el mismo procedimiento solo que ahora hay que
acidificar el PDA con 1.4 ml de acido tartárico al 10 % por cada 100 ml de medio, incubar a 28 °C de
3 a 5 días y contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 15 y 150 colonias.
a. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio
de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente.
b. Etiquetar las cajas en la base previamente a su inoculación y correr por duplicado.
c. Inocular 0.1 ml de las dos últimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del
medio.
d. Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero.
e. Enfriar la varilla, una vez fría extender el inoculo por toda la superficie del agar nutritivo.
f. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.
g. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
h. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
i. Para bacterias 37°C 24 a 48 horas.
j. Se procede a contar el número de bacterias haciendo los cálculos como en la técnica de vaciado en
placa.
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a. Este sistema de siembra en estrías en placas de Petri con medios sólidos y es el procedimiento
habitual para aislar microorganismos. (En caso de duda ver la práctica anterior.)
b. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran, según el tipo de producto y/o microorganismo de que se trate.
c. Realizar la morfología colonial de las colonias que estén previamente aisladas.
5 CUESTIONARIO:
5.1 Informe de resultados de la técnica de Vaciado en placa:
No. de UFC/ml
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PRÁCTICA No. 6
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
UNIDAD III: Identificación bacteriana
TEMA: 3.4 Conservación de microorganismos
1. OBJETIVOS:
El alumno diferenciará cada uno de los métodos de conservación de cepas de acuerdo a sus
características y deducirá el mejor método para conservar al microorganismo de acuerdo al resultado
de viabilidad.
1.2 Objetivos específicos
1.2.1 El alumno conocerá métodos de conservación de cepas y conservará algunas cepas para
concluir cual es el más adecuado en función del resultado de viabilidad y tipo de microorganismos.
1.2.2 El alumno realizará pruebas de viabilidad microbiana para elegir el mejor método de acuerdo al
tipo de microorganismos conservado.
2. INTRODUCCIÓN
En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que preservar,
teniéndose varios métodos para su conservación, aunque necesario tomar en cuenta las
características del microorganismo, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el
mejor método, pues sucede que nuestra cepa de interés puede en un momento dado sufrir daños
como la deshidratación, cambios genéticos o perdida de la viabilidad.
Las tres condiciones que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en un
laboratorio son:
Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservación;
Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos del 70-80% de las células, y
Que estas células permanezcan genéticamente estables.
Las dos primeras condiciones no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica
microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen
varios métodos de conservación. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres
apartados, que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y
métodos restringidos.
A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se detiene el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no
han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de
generaciones sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método. Los
métodos de conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.
Conservación por congelación.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a 0°C, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células
de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así
conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde
todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro
factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método es la
edad de las células, velocidad en la congelación y descongelación, temperatura de almacenamiento: y
empleo de agentes crioprotectores.
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suspender en agua estéril células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en
criotubos, en este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células /ml en el caso
de bacterias y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en
suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la
suspensión se hace en agua de mar diluida.
C.- Métodos restringidos.
En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir
a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la
liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.
a).- Desecación en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente que se impregna con una solución muy densa de células y se
deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que
se llama desecación líquida porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido
congelación previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay
que evitar que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura
disminuya demasiado, ocasionando la congelación incontrolada de las células.
b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos
productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método
es barato y de fácil conservación.
c).- Desecación en bolitas de alginato.
Éste es un procedimiento eficaz, las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación
del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire
hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar
en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso
a –80ºC debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de
alginato. Este es un método que se está utilizando para la conservación de algas y células vegetales.
Para demostrar la eficiencia de un método de conservación en cepas se tiene que determinar el
porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica,
bioquímica, la virulencia y la antigenicidad, para garantizar que l cepa es efectiva.
3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1. EQUIPO
Incubadora a 35 ° C Autoclave
Congelador Horno
Refrigerador Balanza digital
3.2. MATERIAL
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3.4. REACTIVOS:
Escherichia coli Agar eosina azul de metileno Rhizopus sp Agar de papa y dextrosa
Pseudomonas. aeruginosa
Staphylococcus aureus Agar de sal y manitol Agar cetrimida
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
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DÍA 2
3) A partir del matraz sembrar por estría simple 3 tubos con agar de soya y tripticaseína, e incubarlo a
35 °C y por 24 horas. Recuerda que se te debe proporcionar 2 tubos con tapón de baquelita y uno con
tapón de algodón.
4) Etiquetar cada uno de los tubos, anotando el nombre de la cepa, fecha de siembra, fecha de
conservación y fecha en que se determinará la viabilidad.
DÍA 3 Después de la incubación realizar lo siguiente
Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C
Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a
temperatura de refrigeración de 4 °C
Matraz con 30 ml de BHI y la cepa que te La suspensión es para obtener el número de células /
ha tocado ml
Conservación en congelación
5) Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
6) Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos
últimas diluciones. Incubar a 35 °C durante 24 h y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera
sabemos cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a
continuación.
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por estría cruzada o simple y verifica si hay crecimiento del
microorganismo, recordar utilizar el medio adecuado según el tipo de microorganismos que se ha
conservado y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.
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Bacillus subtilis AN
Micrococcus luteus AN
S. aureus ASM
S. cerevisiae ACS
P. aeruginosa Agar cetrimida
Al tubo (eppendorff)
1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas e incubar las placas
5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad
Al tubo con arena
1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina
2.- Tomar un g de arena y realizar las cinco diluciones
3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas
5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad
PARA MOHOS: DÍA 1
1.- Realizar una preparación en fresco del moho (Lo correcto para verificar la pureza es un
microcultivo, pero en este momento aún no conoces la técnica).
2.- Sembrar un tubo de 13 X 100 mm con PDA inclinado con tapan de algodón
3.- Sembrar dos tubos de 13 X 100 mm con PDA y tapón de baquelita
4.- Sembrar un tubo de 16 X 150 mm con PDA y tapón de baquelita
5.- Incubar los tubos por 5 días a 28 °C
DÍA 6 Después de la incubación realizar lo siguiente
Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C
Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de refrigeración de 4 °C
Tubo de 16 X 150 mm con tapón de baquelita Realizar una suspensión, para ello colocarle aproximadamente 3 ml de solución salina y
con la ayuda del asa resuspender para tener la cosecha de esporas y poder obtener el
No de células / ml
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2.- Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff
previamente etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el
congelador.
3.- Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
4.- Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos
últimas diluciones. Incubar a 28 °C durante 5 días y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera
sabemos cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a
continuación.
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por punto y verificar si hay crecimiento del microorganismo, utilizar
el agar de papa y dextrosa y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.
Rhizopus sp PDA
Penicillium sp PDA
Al tubo (eppendorff)
1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C
5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad
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5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
Llenar la siguiente tabla: Antes de la conservación
Método /cepa Temperatura Refrigeración Refrigeración + Congelación Arena
ambiente Crecimiento + Aceite UFC/ml UFC/g
Crecimiento +
Escherichia coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
Aspergillus niger
Penicillium sp
5.1 Según el microorganismos que conservaste ¿Cuál es el mejor método para consérvalo?
5.1 Investiga otros métodos de conservación como la liofilización.
5.2 ¿Cual el papel del crioprotector?
5.3 Menciona el periodo máximo de conservación de cada uno de los métodos utilizados en la práctica
5.4 investiga la morfología colonial en la bibliografía del microorganismo que conservaste y el medio
que utilizaste
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PRACTICA No.7
CRECIMIENTO MICROBIANO
UNIDAD V: Crecimiento Microbiano
1. OBJETIVOS
El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué
ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular.
1.2 Objetivos Específicos
1.2.1 El alumno llevará a cabo una proliferación de crecimiento celular de de Escherichia coli en
cultivo sumergido y agitación (fermentación) a nivel matraz por 24 horas.
1.2.2 El alumno cuantificará el número de microorganismos viables a través del recuento por
diluciones y vaciado en placa como unidades formadoras de colonias (UFC).
1.2.3 El alumno estimará el crecimiento microbiano por la técnica de turbidimetría.
1.2.4 El alumno cuantificará el número de microorganismos por cuenta directa con la técnica de
conteo en cámara de Neubauer.
1.2.5. El alumno comparará los resultados obtenidos con CGS y caldo Luria, para determinar el mejor
medio de cultivo en función de la cantidad de masa celular producida.
2. INTRODUCCIÓN
Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están
aumentando de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de
microorganismos o poblaciones de miles de millones.
Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que
crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos
requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la
presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y
nitrógeno, las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgánicos de crecimiento.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos
células, la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente.
El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se
duplique, es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los
organismos unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente
entre los diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de
una a tres horas.
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de
células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al
número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido.
Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy
pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.
Los métodos recomendados para medir la población son:
Recuento en placa Diluciones seriadas.
Siembra por vaciado en placa. Siembra por extensión con varilla
Filtración Método del número más probable
Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer).
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La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad
específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega μ en la fase exponencial del
crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X0 y Xt en los tiempos t0 y t, en la fase
de crecimiento exponencial según
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de
células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al
número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido.
Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable
por la técnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cámara de Neubauer y
por turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su
extinción, en algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro.
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b) La torunda depositarlo en un recipiente que contenga benzal, de la misma manera limpiar el cubreobjetos
(cubrehematocimetro) y colocarlo sobre la cámara.
c) Con una pipeta coloca la muestra de S. cerevisieae, entre la cámara y el
portaobjetos, para que por cohesión se llene la cámara, La cámara de
Neubauer es una cámara de conteo. Se trata de un portaobjetos con una
depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen.
Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separación entre dos líneas
consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada le
corresponde a un mm2. La depresión central del cubreobjetos está
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre
con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 mm, y el
volumen es de 0.1 mm3, es decir 0.1 µl.
d) Colocar la cámara en la platina y enfocar con 10 y 40 X
e) Contar para las levaduras en los cuadrantes denominados en la figura A,B.C y D, sumar los valores
obtenidos, sacar un promedio; multiplicar por 10 000 y las unidades son células/ml.
f) Retira la cámara, límpiala y ahora coloca una muestra de E. coli, pero ahora utiliza el cuadrante de
en medio y contar los cuadros sombreados, de igual forma contar el número de células, sumarlos y
obtener el promedio, después multiplicar por 25 y luego por 10 000, obteniéndose No. de
células/ml.
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SESIÓN II
Organización de las cinéticas: Se realizarán 4 cinéticas en todo el grupo con las siguientes
consideraciones
Cinética A Cinética B Cinética C Cinética D
Equipos 1,2 y dos alumnos Equipos 3 y 4 y un alumno Equipos 6,7 y dos alumnos Equipos 8 y 9 y un alumno
del equipo 5 del equipo 5 del equipo 10 del equipo 10
150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% 150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5%
Volumen del inóculo 10 ml 10 ml 10ml
Si la As es de 0.8-0.9
b.- Tomar la otra celda espectrofotométrica y colocar aproximadamente 3.5 ml, colocar la celda
en el vaso de precipitados que contiene la celda (blanco) y se la dará a un compañero para que
realice la lectura en el espectrofotómetro. (Esta segunda celda no es necesaria sanitizarla)
d.- De lo que queda en la pipeta colocar una gota en la cámara de Neubauer y dársela al
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e.- Con lo que queda en la pipeta realizar un Gram para corroborar la pureza del matraz semilla
y desechar la pipeta en el benzal.
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
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5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de UFC/ ml.
Tiempo Conteo Promedio Resultado
To Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T1 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T2 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T3 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T4 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T5 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T6 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T7 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T8 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
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