SELECCIÓN DE LEVADURAS CON FINES INDUSTRIALES Y

SU APLICACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE VINOS

Introducción

El rol de las levaduras en la fermentación

alcohólica, en particular en la transformación
del jugo de la uva en vino, fue claramente
establecido a mediados del siglo IXX. En 1680,
Antonie van Leeuwenhoek , utilizando un
microscopio de su fabricación, llevó a cabo las
primeras observaciones de levaduras a partir de
un mosto de cerveza, aunque sin establecer relación entre esos corpúsculos y la
fermentación alcohólica. A fines del siglo XVIII, comenzaron los estudios
químicos de la fermentación alcohólica con los trabajos de Lavoisier y luego por
Gay-Lussac. Sin embargo, la primera demostración de que la levadura fuera un
organismo vivo, capaz de multiplicarse, y cuya actividad vital se encontrase en el
origen de la fermentación de los líquidos dulces, fue llevada a cabo por el químico
francés, Charles Cagnard de La Tour, en 1837. Esta teoría fue confirmada por
Schwann quién demostró además que la fermentación alcohólica es un proceso
que puede ser detenido por el calor o por ciertos productos químicos; llamó a la
levadura de cerveza “zuckerpilz” es decir “hongo del azúcar”, nombre que dio
origen al termino Saccharomyces utilizado por primera vez por Meyen en
1838. Finalmente, Louis Pasteur en sus dos famosa obras, “Estudios sobre el
vino” (1866) y “Estudios sobre la cerveza” (1876), acreditó esta concepción
vitalista o biológica del rol de la levadura en la fermentación alcohólica. Pasteur
demostró que las levaduras responsables de la fermentación espontánea de la
vendimia prensada o del mosto, provienen de la superficie de la uva, y que de
éstas existen muchas variedades y especies que pueden ser aisladas. Mencionó
incluso que las características gustativas de los vinos pueden verse influenciadas
por la naturaleza de las levaduras al efectuars e la fermentación alcohólica.
Precisó el efecto del oxígeno en la asimilación de los azúcares por las levaduras y
probó que éstas, además del alcohol y el gas carbónico, forman otros productos,
en menor cantidad, entre los cuales encontramos la glicerina.
 Origen de las levaduras del vino, Aunque las levaduras se hallan
diseminadas por toda la naturaleza, aquellas que intervienen en la fermentación
alcohólica para la producción de vinos pueden originarse a partir de la uva o de
la bodega. Las levaduras se encuentran formando parte del ecosistema del viñedo
constituyendo parte de la microbiota del mismo. Llegan a la uva por el viento y
los insectos siendo retenidas en la pruina, una sustancia cérea que recubre la piel
del fruto. De ahí pasan al mosto cuando se rompe la baya en las operaciones
enológicas de la molienda.

Por otro lado, las células de las levaduras también están presentes en las
paredes de las bodegas y equipamientos, incluidos los depósitos de fermentación
y desde allí pueden pasar a formar parte de las fermentaciones. Los restos sólidos
generados luego de la fermentación, el denominado orujo, son utilizados de
manera habitual como fertilizantes en los viñedos, y podrían permitir que algunas
de las cepas de levaduras permanecieran en el campo hasta la siguiente vendimia.
De esta forma las cepas podrían estar presentes en las uvas cosechadas al año
siguiente favoreciéndose su rápida
proliferación durante las
fermentaciones espontáneas. Cabe
destacar que esta práctica podría
influir en la biodiversidad
provocando modificaciones de las
posibles poblaciones autóctonas
de la zona.

CARACTERÍSTICAS DE LAS LEVADURAS

Hay levaduras en la uva cuando llega a la bodega. Las levaduras se pasan la mayor
parte del año en el suelo pero, cuando las uvas están maduras, con la acción del
viento o de los insectos, se depositan en la pruina (es una capa cerosa que recubre
las uvas). Las levaduras que acompañan a la uva se conocen con el nombre de
indígenas o salvajes, y el número y la distribución de las mismas cambia de un
año para otro bien por diferentes condiciones climáticas, por pesticidas, etc.
Las levaduras más abundantes en el mosto, procedentes de las uvas y de los
equipos de la bodega, son de diferentes género, normalmente con un
metabolismo oxidativo, de tipo apiculadas como: Kloeckera,
Hanseniospora, Cándida, Pichia, etc, y en menor cuantía las de tipo
fermentativo: Saccharomyces. Sin embargo éstas últimas se encuentran en
grandes cantidades en las bodegas fijadas en los suelos, los depósitos,
maquinaria, etc.

En la mayoría de las bodegas, al enólogo le gusta conocer y controlar la levadura

que está "trabajando" en su mosto. Para ello se emplean preparaciones de
levaduras comerciales que se conocen con el nombre de LSA (levaduras secas
activas). En el mercado se pueden encontrar más de 400 cepas diferentes de
Saccharomyces cerevisiae, que han sido seleccionadas en diferentes zonas
vitivinícolas del mundo. Cuando uno nunca realiza la fermentación con LSA se
dice que la fermentación las realizan las levaduras autóctonas.

Entre sus Características Enológicas Estudiadas en las LSA se Encuentran:

- Capacidad Fermentativa: Algunas pueden fermentar hasta 13% volumen de

alcohol y otras pueden alcanzar graduaciones mucho mayores (alguna LSA
alcanza niveles de 17-21%, importante tenerlo en cuenta cuando tenemos mostos
con altas graduaciones alcohólicas y que no son habituales en la zona, por lo que
las levaduras autóctonas no están habituadas a ello y no son capaces de completar
la fermentación).

- Necesidades Nutritivas: Algunas son muy exigentes y necesitan muchos

nutrientes, otras precisan menos.

- Producción de Aromas Afrutados: Cada levadura tiene un perfil aromático

diferente.
- Capacidad de Fermentar a Bajas Temperaturas: Se las conoce como
levaduras criófilas o criotolerantes.

- Capacidad de Implantación: Algunas son más agresivas y se implantan con

mucha facilidad.
- Producción de Glicerol: Esta característica puede ser muy variable, porque
existen levaduras que producen hasta 10-12 g/l de glicerol, y son muy adecuadas
para vinos sedosos o de crianza.

- Baja Producción de Ácido Acético: Es uno de los criterios habituales de

selección.

- Producción de Polisacáridos o Manoproteínas: Importante para los

vinos de guarda.

Lo primero que debemos pensar es ¿qué tipo de vino quiero conseguir? A

partir de ahí, elegiremos una levadura u otra.

No es obligatorio añadir levaduras, pero cuando realizamos la

siembra de una levadura seleccionada, nos aseguramos de que el
proceso de fermentación se realiza con un solo tipo de levadura y que
vamos a obtener un vino con los caracteres que buscamos. En estos momentos,
es una práctica habitual en la mayoría de las bodegas.

Ventajas de Realizar la Siembra:

- Seguridad y Rapidez: Con su empleo se favorece que la fermentación se inicie

de forma más rápida y regular y se consigue un mejor consumo de los azúcares
fermentables, de esta forma se reducen los posibles problemas de fermentación.

- Mayor Control Microbiológico: Importante cuando las condiciones

higiénicas no son las adecuadas o la uva viene con un alto nivel de podredumbre
acompañado de mucha flora contaminante.

Inconvenientes:
- Pérdida de Complejidad en el Vino: La fermentación la realiza una sola
especie de levadura, mientras que en la fermentación espontánea participan
varias levaduras diferentes que se van tomando el relevo. Actualmente, con el fin
de mejorar este aspecto, las casas comerciales están ofreciendo la posibilidad de
realizar una fermentación secuencial, realizando una primera siempre con una
levadura No Sacharomyces seleccionada y posteriormente la siembra con
Sach. cerevisae. Estamos empleando las mismas levaduras en diferentes zonas
del mundo, además la levadura inoculada permanece en bodega modificando su
ecosistema microbiológico.

- Pérdida de Tipicidad: Al utilizar todas las bodegas las mismas levaduras se

pierde una parte de la tipicidad. Esto es solo importante en los vinos más básicos.
Por otra parte, el catálogo de levaduras (LSA) existentes es numeroso y por otra
parte la influencia de la levadura en el resultado final es pequeño, solo es una
herramienta más. El efecto de la levadura sobre la calidad final del vino es más
importante en los vinos blancos y rosados que en los tintos.

- Coste Producto: Aunque no son caras, es un gasto más.

Hay que tener en cuenta que no es recomendable mezclar diferentes

levaduras, salvo que la casa comercial lo indique, porque pueden ser
incompatibles y ocasionar problemas durante la fermentación.

CICLO DE CRECIMIENTO DE LAS LEVADURAS

Aunque "pequeñitos", las levaduras son seres vivos que hasta que llegan al
depósito o han estado al aire libre en la viña, o estaban "dormidas" dentro de un
paquete, hasta que las despertamos y, de repente, se encuentran en un sitio
oscuro. Lo primero que deben hacer es adaptarse al nuevo hábitat donde se
encuentran.

Fases de Desarrollo Durante la Fermentación Alcohólica:

- Fase de Latencia o Adaptación: Al principio, la población de levaduras no

aumenta porque se están adaptando a l as condiciones del medio en el que se
encuentran (pH, nutrientes, sulfuroso, nivel de azúcares).

- Fase de Aceleración: Una vez adaptadas, las levaduras empiezan a

multiplicarse. Esta fase junto a la anterior puede durar unas 24 horas
dependiendo de la temperatura, y finaliza al saturarse el mosto de anhídrido
carbónico.
- Fase de Crecimiento Exponencial: La población de levaduras crece
exponencialmente, produciéndose gran desprendimiento de anhídrido
carbónico. Se desarrollan de 4 a 5 generaciones de levaduras.

- Fase de Ralentización: La población de levaduras crece lentamente.

- Fase Estacionaria: Empiezan a faltar nutrientes o algún elemento y las
levaduras que mueren son las que mantienen a las nuevas, la población
permanece estacionaria pero activa, al principio con la levaduras con una gran
actividad fermentativa y poco a poco, a medida que el medio se va volviendo
tóxico (alcohol, ac. grasos de cadena media como C8, C10 y C12) las levaduras
comienzan a sufrir y se multiplican menos y entran en la siguiente fase.

- Fase de Declive: La existencia de muchos elementos tóxicos producidos por

las propias levaduras conlleva a que la población de levaduras disminuya, pero
las que aún están vivas deben terminar de transformar los últimos azúcares. Es
importante llegar a esta fase con gran número de levaduras con buenas
condiciones fisiológicas porque, si no se corre el riesgo de una parada de
fermentación, sobre todo en mostos muy ricos en azúcares.
SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el

microorganismo utilizado, en la elección del mismo se deberían tener en cuenta
ciertos criterios generales que se indican a continuación:

1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable.

2. Su velocidad de crecimiento debería ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluídos fagos.
4. Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de
medios de cultivo de costo reducido.
5. Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida
de sus características particulares.
6. Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.

Si el objetivo del proceso es un producto, éste debería ser de alto rendimiento

y de fácil extracción del medio de cultivo.

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por

aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos. A nivel
industrial, en general, cada firma posee su propia colección de organismos,
muchos de los cuales han sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación
o de ingeniería genética. Sin embargo, estas cepas sólo son empleadas por la
industria que las posee, debido al gran valor comercial de las mismas. En algunos
casos se dispone de organismos modificados genéticamente para llevar a cabo
reacciones específicas de biosíntesis, degradación o biocatálisis, los cuales están
protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos
aislados o modificados no son disponibles para uso general en laboratorios.
 Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales como agua, suelo,
plantas y desechos, la elección del material de partida puede hacerse teniendo en
cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son de
interés. Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas se podrían encontrar
organismos adaptados a la degradación de estos productos químicos; o en larvas
de insectos muertos agentes causales de la muerte. Elegida la fuente de
aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica elegida para el
mismo; en este caso las alternativas son:

A) Aislamiento directo,

B) Enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.

Una vez efectuado el muestreo y selección para el aislamiento de una cepa de

interés, la misma deberá ser caracterizada. En este procedimiento se debe tener
en cuenta que la composición química del material a partir del cual se va a realizar
el aislamiento comienza a variar a partir del momento en que es tomada la
muestra, por lo tanto, ésta se debe procesar rápidamente, tratando de evitar
alteraciones que afecten a la población de interés.

a) Aislamiento directo: En este caso

es deseable que el medio que se utiliza para
el aislamiento permita la máxima expresión
del material genético del organismo. Si se
busca por ejemplo un organismo con acción
antimicrobiana, se puede crecer al potencial
productor, en una caja de Petri en presencia
del o los organismos contra los cuales se requiere la acción antimicrobiana,
observándose la producción del inhibidor por las zonas de inhibición de
crecimiento.

Para la detección de productores de factores de crecimiento tales como

aminoácidos y nucleótidos se utiliza la estimulación del desarrollo de bacterias
auxótrofas por un lisado del organismo. Esto se puede llevar a cabo en medios
sólidos.
 Una vez obtenido el crecimiento en la primera caja, se replica a una segunda,
antes de "matar" las colonias con luz. U.V., por ejemplo. Esta caja es luego
cargada con agar conteniendo una suspensión del organismo auxótrofo al
producto buscado. Después de un período de incubación se observa crecimiento
en forma de halo alrededor de las colonias productoras, lo que permite el
aislamiento de este organismo de la placa réplica.

b) Enriquecimiento del cultivo: Esta técnica consiste en incrementar en

una población mixta el número de organismos de interés en relación al resto. De
esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos
mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones
inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de
sustratos específicos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del
medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan
subcultivos periódicos en medio fresco. Esto lleva a que el organismo de interés
sea el dominante de la población, lo cual facilita su posterior aislamiento en
medio sólido. Se debe considerar en este caso el efecto del medio sobre la
velocidad específica de crecimiento.

La selección de un organismo por este procedimiento depende de su valor de

comparado con los de los otros organismos. Evidentemente el dominante de la
población será el que posea el mayor valor de u para las condiciones de cultivo
empleadas. Sin embargo, no necesariamente será más útil un organismo de u más
alto; puede ser deseable uno con mayor afinidad por el sustrato.

Fermentación alcohólica

La producción del vino es un proceso

muy complejo no solo desde el punto de vista
microbiológico, sino también bioquímico.
Microbioló gicamente implica interacciones
entre levaduras, bacterias y hongos
filamentosos. Entre estos organismos, las
levaduras desempeñan un papel principal ya
que son responsables de llevar a cabo el
proceso metabólico central, la fermentación
alcohólica, ruta catabólica consistente en la transformación de las hexosas
presentes en el mosto en etanol y CO2. Además se originan otros compuestos
fundamentales para las propiedades organolépticas del vino.

El mosto aporta a las levaduras fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y

azufre, que permiten el crecimiento de las mismas. Las fuentes de carbono más
importantes presentes en el mosto, son las hexosas (glucosa y fructosa) que
permiten a las células de levadura obtener energía mediante la fermentación
alcohólica. Esta vía metabólica llamada ruta de Embden- Meyerhof-Parnas
conocida también como glucolisis, tiene lugar en el citoplasma y puede expresarse
mediante la siguiente ecuación global simplificada:

La fermentación del mosto suele desencadenarse de forma natural y

espontánea a partir de las propias levaduras presentes en el mosto, a este tipo de
proceso se le denomina fermentación espontánea. Se caracteriza porque en el
transcurso de la misma intervienen varias especies de levaduras, algunas de las
cuales coexisten en el tiempo y otras que se suceden secuencialmente en función
de distintos factores, como su poder alcoholígeno y la tolerancia a la toxicidad del
etanol.
Sucesión de especies de levaduras durante la fermentación alcohólica

La transformación del mosto de uva en vino mediante la fermentación

alcohólica, es el resultado de la acción combinada de varias especies de levaduras
que se suceden durante dicho proceso. Se puede afirmar que estas fermentaciones
comienzan con el crecimiento de especies de levaduras procedentes de la
superficie de la uva, pertenecientes a los géneros Hanseniaspora, Kloeckera,
Candida, Debaryomyces, Dekkera, Metschnikowia, Pichia,
Torulaspora, Zygosaccharomyces, denominadas en conjunto como
Saccharomyces, también llamadas levaduras de bajo poder fermentativo. Sin
embargo, el número de especies y su presencia durante la fermentación dependen
del área de producción, las características de las prácticas enológicas y del tipo de
vino producido. El crecimiento de estas especies de levaduras está limitado a los
primeros días de fermentación, después de los cuales mueren por el efecto tóxico
del etanol. Al mismo tiempo que éstas van desapareciendo, las levaduras del
género Saccharomyces y principalmente de la especie S. cerevisiae, también
llamadas de alto poder fermentativo, empiezan a multiplicarse hasta convertirse
en las únicas responsables de la fermentación alcohólica.

Dos situaciones diferentes han podido observarse en el estudio de las

fermentaciones espontáneas para producción de vinos: un gran número de cepas
en bajo porcentaje y un menor número de cepas con un patrón dominante.

Fermentación alcohólica inoculada

Las levaduras responsables de

la fermentación alcohólica en bodega
pueden originarse desde tres fuentes:
la superficie de la uva, las superficies
de los equipamientos de bodega y los
cultivos inoculados. En ocasiones la
combinación de un sulfitado excesivo
y bajas temperaturas retar dan el inicio de la fermentación. En estos casos, y en
aquellos en los que el productor de vinos desea conducir la fermentación
alcohólica con un tipo concreto de levaduras, se recurre a la adición de cultivos
puros de levaduras al mosto, a esto se le denomina fermentación inoculada. Se
pueden emplear como inóculo o bien levaduras nativas o bien levaduras
comerciales. Se denominan levaduras nativas a aquellas que se aíslan y utilizan
en vinificaciones de una misma zona. Por otro lado, las levaduras seleccionadas
comerciales disponibles en el mercado han sido aisladas de una determinada
región, pero se comercializan para ser utilizadas en cualquier otra zona distinta
de donde fue seleccionada

La inoculación de levaduras se justifica porque aporta una serie de ventajas

al proceso de vinificación si se compara con la fermentación espontánea. Entre
estas ventajas cabe destacar un inicio y desarrollo de fermentación más rápido y
menor producción de acidez volátil, asociado a una calidad del producto más
uniforme entre diferentes tanques y cosechas. Se aprecian también aportes
concretos a la calidad organoléptica debidas a las características específicas de
cada cepa de levadura y que sirven como criterios de selección de estas para su
uso enológico.

Selección de cepas de levaduras nativas

El uso de cepas locales seleccionadas

ofrece algunas ventajas como su capaci dad
de competencia en el mosto debido
fundamentalmente a que las levaduras
locales presentan adaptaciones a distintas
condiciones ambientales características de
una región en particular, lo cual permitiría
que dicha cepa sea el agente biológico más importante en cuanto a su
responsabilidad en el proceso de. La selección de una levadura nativa apropiada
podría ser una buena solución para mantener las características típicas de los
vinos de una región vitivinícola y así minimizar la pérdida de tipicidad de los
vinos inoculados, garantizando una uniformidad del producto a lo largo de los
años. El proceso de selección de nuevas cepas de levadura para uso en enología
comienza con el aislamiento de levaduras a partir de diferentes sustratos como
uvas, mostos frescos o vinos en última fase de la fermentación.
Levaduras secas activas

La necesidad de asegurar la fermentación y la calidad del producto, ante el

hecho de que hay un gran número de variables que intervienen en una
fermentación espontánea, ha favorecido que el uso de las levaduras secas activas
(LSA) se haya convertido e n una práctica habitual en enología. La inoculación
con LSA favorece un inicio más rápido de fermentación (normalmente se reduce
la fase de latencia) y un consumo total de los azúcares fermentables, reduciendo
los posibles problemas enológicos como:
comienzos de fermentación tardíos,
fermentaciones languidecentes,
detenciones del proceso antes del
agotamiento completo del azúcar. Estas
interrupciones constituyen un peligro
grave, no solamente por la dificultad de
reiniciar el proceso, sino también porque en tal situación puede temerse que
ocurran desviaciones bacterianas que provocarían un aumento de la acidez
volátil, deteriorando la calidad del producto. El uso de levaduras secas activas
(LSA) ayuda a la obtención de un producto reproducible y reduce los riesgos de
contaminación. Esta práctica permite tanto un mayor control microbiológico, lo
que no es posible en fermentaciones espontáneas, como así también la obtención
de un producto de calidad más uniforme a lo largo de las diferentes vendimias.
Por otro lado, contrariamente a estos beneficios, puede perderse algo de
complejidad organoléptica en el producto final.

Recuperación de levadura

A lo largo del proceso de fermentación, la levadura se desarrolla

prodigiosamente, constituyendo un producto muy valioso, tanto al ser
recuperada para su empleo como alimento animal (en crema o seca) o para
recircularla al proceso y reiniciar la fermentación.

Decisivo en la calidad de la levadura recuperable, es el modo de conducir

el proceso fermentativo, el esmero con que se realicen todas las operaciones y la
preocupación constante para evitar los errores.
 Después de la fermentación, las levaduras son separadas por
centrifugación y lavadas. Se pasan por filtros prensas o rotatorios para disminuir
el contenido de agua, hasta obtener un producto de 68 o 70% de humedad,
conocido como levadura prensada, la cual se envasa en bloques o en forma
granulada en sobres de nylon. Esta levadura se almacena bajo refrigeración.

La levadura seca activa, es otra variante de la levadura panadera y se utiliza

en caso de no existir refrigeración o por requerirse períodos prolongados de
almacenamiento. Consiste en secar la levadura en secadores de lecho fluidizado
de atomización o al vacío. Se obtiene una levadura con 8% de humedad que
conserva su actividad biológica. El producto se envasa en recipientes herméticos.

Tanto la producción de levadura como la de etanol son reacciones

exotérmicas, por lo que es necesario eliminar el calor desprendido en el
transcurso de la fermentación y mantener la temperatura cerca del valor óptimo
(33 a 34°C); de lo contrario la temperatura aumenta hasta 40 o 42°C con sensibles
pérdidas en el rendimiento. Se considera un índice apropiado de liberación de
calor el de 287 Kcal DE-1 de etanol formado.

Actualmente la recuperación de levadura es solo como producto

secundario de las destilerías y consideramos que, debido a la importancia
nutritiva de este producto, se hace necesaria la implementación de tecnologías
que mejoren la composición de la levadura y poder ampliar su perfil de uso.

Factores a tener en cuenta para el crecimiento y desarrollo de la levadura

Presión osmótica: La nutrición de la levadura es un proceso puramente

osmótico, es importante evitar medios hipertónicos o hipotónicos para evitar la
plasmoptisis y plasmólisis. El estrés osmótico puede causar una disminución en
el volumen celular, afecta, además, la velocidad de fermentación, así como la
viabilidad celular.

Temperatura: Las altas temperaturas ocasionan una disminución de la

biomasa, producto de un descenso en el contenido de proteínas, RNA; DNA y
aminoácidos libres e induce a la rigidez de la membrana celular. Temperaturas
muy bajas provocan un estado de latencia en la célula, deteniendo su desarrollo.

Desecación: Es uno de los principales agentes que inhiben las

actividades y desarrollo de los microorganismos.

Luz: En general la luz es perjudicial para los microorganismos que carecen

de clorofila, o cualquier otro pigmento que les permita usar la energía de las
radiaciones en el proceso de fotosíntesis.

PH: El pH óptimo en el cual se desarrollan mejor los microorganismos,

está entre 4 y 5. Las levaduras tienen la ventaja de que soportan, medios más
ácidos, que otros microorganismos, lo que es aprovechado en los procesos
industriales para mantener el medio controlado de bacterias que puedan
competir por el substrato.

Alcohol: El efecto del etanol en la célula es una combinación de inhibición

del crecimiento y disminución de la viabilidad, puede actuar como inhibidor de
la fermentación a partir de un 8%, no es recomendable terminar la fermentación
con un grado alcohólico muy elevado.

Repercusión de las condiciones de cultivo en la producción de alcohol

y levadura.

Las diferentes respuestas que se han observado en el metabolismo de la

levadura S. cerevisiae, cuando se cultiva bajo distintas concentraciones de
glucosa y oxígeno disuelto, pueden ser explicadas por la saturación de la
oxidación del NADH a nivel de la cadena respiratoria e influyen en la
acumulación de compuestos de reserva en la levadura.
 El hombre puede intervenir en los parámetros productivos, pudiendo,
dentro de un proceso, reducir y hasta eliminar la fase de crecimiento celular. Esto
ocurre en el proceso, por ejemplo, como el de "Melle - Boinot ", donde la
recirculación de las levaduras (crema de levadura) desde las separadoras
centrifugas, permite una inoculación del mosto, prácticamente ideal.

La productividad típica de un proceso discontinuo clásico en batch es de

1.8 a 2.5g de etanol por litro de fermentador en una hora. Esta productividad
puede aumentarse de manera sensible si se recircula la levadura producida en el
fermentador o se emplea la fermentación continua. En estos casos los valores
típicos se encuentran entre 5 y 8g de etanol por litro de fermentador por hora,
aseguró que la fermentación continua aumenta la eficiencia química del proceso,
obteniéndose mayores cantidades de etanol, refiriendo que los métodos de
fermentación continua se empezaron a patentar en la década de los 1950 y desde
entonces han hecho que la industria de las bebidas alcohólicas haya
experimentado un crecimiento apreciable. Afirmó, que cuando se utiliza la
fermentación continua, se elimina el llenado y vaciado de los fermentadores y
también la necesidad de controladores, equipos de enfriamiento, etc., que son
instalados solamente en los fermentadores donde hay necesidad de hacerlo,
eliminando con esto la ociosidad y el costo de inversión, mientras que el riesgo de
contaminación incrementa, por lo que se requiere mayor esterilidad en el
proceso.

Tendencias Actuales Del Uso De Levadura S. cerevisiae

La levadura Saccharomyces cerevisiae es la fuente tradicional de

invertasa, que tiene un apreciable significado comercial y se emplea en modo
creciente en la producción de bebidas, en la industria repostera y en la
agricultura, así como para fines investigativos y tecnológicos. Debido a la
propiedad de las levaduras de acumular cantidades variables de los minerales
presentes en su medio de cultivo, el contenido de minerales de células de
levadura, cultivadas en un medio particular de propagación, puede ser ajustado
para resultar de significación como suplemento de salud o nutricional para
animales y humanos, al respecto, planteó que los microorganismos son capaces
en general de incorporar a su biomasa cantidades apreciables de minerales aun
cuando no los necesiten para su funcionamiento, pudiendo ser empleadas como
levaduras enriquecidas.

Por otro lado, los esfuerzos que se han hecho para emplear las levaduras
como suplemento seco en dietas animales y humanas con la finalidad de combatir
el hambre y aumentar la productividad no han dado los resultados esperados,
afirman que el problema está en el hecho de que un nuevo alimento no solo debe
ser nutricionalmente valioso, sino que además debe ser organolépticamente
satisfactorio y económicamente rentable.

Características del genoma de las levaduras vínicas

Las levaduras vínicas son usualmente diploides, poliploides o incluso

aneuploides. La longitud de los cromosomas en estas levaduras es altamente
polimórfica y esto resulta en una extensa variabilidad en capacidad de
esporulación y viabilidad de las esporas. La ploidía de las levaduras vínicas puede
proveerlas con ventajas adaptativas a ambientes cambiantes o, tal vez representa
una forma de incrementar la dosis de genes que son importantes para la
fermentación. Por otro lado, las levaduras vínicas son predominantemente
homotálicas (HO), lo cual significa que luego de la esporulación la célula hija
puede cambiar su “mating type”, conjugar con una célula de tipo opuesto y luego
formar una nueva célula con contenido de ADN 2n que es homozigota para todos
los genes excepto para el locus MAT, que son los que codifican para el tipo sexual.
Esta capacidad para realizar extensos cambios genómicos significa que las
levaduras vínicas no poseen estabilidad genética

Técnicas moleculares de diferenciación entre cepas de levaduras

El origen, el desarrollo y la sucesión de varias especies y/o cepas de

levadura puede evaluarse utilizando técnicas moleculares específicas que
permiten la diferenciación y tipificación entre éstas. En los últimos años se han
empleado diferentes técnicas en el estudio de la microbiología enológica.
Mantenimiento o conservación de los cultivos
Los objetivos de la conservación de los cultivos se podrían resumir en los
siguientes aspectos:
a) preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus
propiedades bioquímicas.
b) preservar los niveles de su productividad inicial.
c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Esto
último puede ser un factor esencial en la selección de un método de preservación.

En todo trabajo de Microbiología se deben conocer las características de la

población con la cual se va a trabajar (propiedades morfológicas y bioquímicas).
En este sentido, tanto en la conservación como en el desarrollo del cultivo, ya sea
el que suministra o el que recibe la cepa, deberían usar las mismas técnicas
metodológicas. Tanto para el mantenimiento, preparación y propagación de
inóculos se deben usar métodos reproducibles que no produzcan variaciones o
pérdidas de las características de la cepa empleada.
Los métodos de preservación o mantenimiento más importantes son los
siguientes:

Subcultivos

Es un método común de conservación, que

consiste en el repique periódico del cultivo en un
medio nutritivo fresco. El intervalo de transferencia
varía con el microorganismo, debiendo
considerarse el medio adecuado para cada especie.
Una vez desarrollados los cultivos s e mantienen a 4
°C durante lapsos que oscilan entre 15 días y 2
meses. Los inconvenientes que presenta son varios:

a) Incremento de la posibilidad de mutación con cada transferencia, con

pérdida de las características del organismo.
b) Riesgo de contaminación
c) Alteraciones en el medio de cultivo, durante la estadía en frío, en la cual se
produce una desecación gradual del mismo.

Mantenimiento bajo capa de aceite

Es una técnica simple y efectiva para prolongar la conservación de muchos

organismos y consiste en cubrir completamente el cultivo después de su
desarrollo en medio sólido, con una capa de aceite mineral o vaselina estéril. Los
cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o aún mejor
en heladera por períodos de varios años. Algunos autores sostienen que en estas
condiciones los microorganismos pueden continuar reproduciéndose, con
posibilidades de aparición de mutantes; sin embargo, se acepta que estas
alteraciones no se observan hasta los tres años de mantenimiento.
Congelación

La congelación es una técnica de

elección, ya sea para cortos o largos períodos
de tiempo. A esto ha contribuido también la
mayor disponibilidad de nitrógeno líquido
(196 °C) y el mejoramiento de los equipos de
refrigeración. La técnica involucra el
crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa
las células son más resistentes a los daños por congelación y descongelación, que
las de fase exponencial. También es aconsejable utilizar una densidad celular
elevada en la congelación, debido a que, cuando parte de las células se lisan se
liberarían sustancias crioprotectoras que aumentarían el porcentaje de células
sobrevivientes.

Las células a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un

agente crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de
cultivo. El más empleado es glicerol al 10%, aunque otros agentes como
dimetilsulfóxido, glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo, lactosa y extrato
de malta, han sido también empleados.

En caso de nitrógeno líquido, la conservación podría prolongarse por años,

asegurando una buena provisión del mismo y disponiendo de equipos con
sistemas de alarma en caso de fluctuaciones de temperatura. El método ha sido
utilizado ampliamente con hongos y actinomycetes, los cuales han sido
mantenidos en estas condiciones varios años. También se puede utilizar tierra
para la conservación directa de suspensiones de esporas.

Preservación en celulosa

La técnica consiste en embeber tiras de papel de filtro con una suspensión

densa de organismos en suero, glutamato de sodio u otro agente, las mismas son
posteriormente colocadas en tubos para su posterior secado bajo vacío. De esta
forma se han logrado conservar cepas de Streptomyces y Salmonella por períodos
de hasta 2 años a temperatura ambiente.
Liofilización

La liofilización está considerada como el método más adecuado para la

preservación de microorganismos. La técnica involucra el congelamiento de un
cultivo seguido por un secado bajo vacío, lo cual resulta en la sublimación de agua
de la suspensión celular. La ventaja es que la mayoría de los organismos
sobreviven al secado y el cultivo es fácilmente mantenido aún a temperatura
ambiente sin pérdida significativa de viabilidad. La liofilización es apropiada para
la conservación de la mayoría de las bacterias, encontrándose que las Gram-
positivas sobreviven mejor que las Gram-negativas cuando se las liofiliza y
mantiene en condiciones similares. También se emplea en la conservación de
esporos, actinomycetes y muchos hongos incluidas levaduras. Sin embargo, no es
adecuada para células animales, algas y hongos en fase de micelio. La técnica
consiste en partir de un cultivo de fase estacionaria (donde las células son
usualmente más resistentes) resuspendiendo las células con un medio
crioprotector, en el cual se obtenga una alta densidad celular. Unas pocas gotas
de suspensión celular son transferidas a una ampolla, la cual es congelada a
aproximadamente -40 °C y deshidratada mediante una sublimación en vacío.
Este debe ser mantenido en 5-10 um mediante una bomba. El secado continúa
hasta llegar a valores de humedad del orden del 1%; luego, la ampolla es sellada
bajo vacío. Se debe evitar la formación de radicales libres que se producen por
exposición de las células al oxígeno, ya que están asociados con pérdida de
viabilidad; de allí la importancia de mantener el vacío. El medio empleado en la
liofilización es un factor importante en el proceso. Entre los agentes
recomendados están la leche descremada en concentraciones del 10 al 20%; suero
equino, mezclas de suero, glucosa y extrato de levadura; suero fetal bovino, etc.

Bibliografía:

 Suárez, C. (2016). Levadura Saccharomyces cerevisiae y la producción de

alcohol. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar. Recuperado
de http://www.redalyc.org/pdf/2231/223148420004.pdf
 Vásquez, C. (2016). Actualización en caracterización molecular de
levaduras de interés industrial. Revista Colombiana de Biotecnología,
 18(2), 129-139.
DOI: https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61530
 Chimeno, S. (2015). Caracterización de un cepario de levaduras para uso
Enológico mediante técnicas moleculares (tesis de grado). Universidad
Nacional de Cuyo, Mendoza, Argentina.