Departamento de Engenharia Química - Curso de Engenharia Química

Laboratório de Engenharia Química III

Profa. Dra. Anna Rafaela Cavalcante Braga

CONTAGEM ESPOROS DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS

AUTORES: ALANA PETRINA GOMES; ALINE DI CREDICO; ANAPAULA SILVA;

YGOR VIEIRA MEDEIROS

e-mails: ; alana.petrinag@gmail.com; alinecredico2@gmail.com; a.santos22@outlook.com;

ygor.medeiros@outlook.com

RESUMO –
O experimento de contagem de microrganismos tem como principal objetivo aprimorar
nossos conhecimentos de microbiologia e de bioquímica, aplicados com ênfase nas in-
dústrias e pesquisas científicas. A contagem desses elementos em amostras nos capacita
a entender o mecanismo de atuação desses microrganismos nos vários processos bioló-
gicos fundamentais para a sociedade atual. Neste relatório, estudamos o comportamen-
to de esporos de fungos filamentosos e leveduras através da aplicação de amostras di-
luídas em câmaras de Neubauer e, posteriormente, contabilizadas com o auxílio de um
microscópio.

Palavras Chaves: esporos, leveduras, contagem, câmara, Neubauer.

INTRODUÇÃO Eles não produzem seu próprio ali-

A contagem de bolores e leveduras é
realizada para a padronização e controle de
qualidade de um produto. Portanto, a quan-
tificação de fungos, é essencial para as in-
dústrias manterem a qualidade de seus
produtos e também para estimarem a vida
útil que eles possuem e seguir as boas prá-
ticas de armazenamento, processamento e
as formas de transportes para que a quali-
dade do produto seja mantida até chegar ao
consumidor final.
Fungos
Atualmente, os fungos estão classifi-
cados em um reino chamado reino Fungi.
Podem ser microscópicos formados por
uma única célula, como por exemplo as le-
veduras; ou também pluricelulares, como
por exemplo os bolores.
mento, sendo assim, precisam de matéria
orgânica para sobreviver. Essa característi-
ca dá aos fungos a capacidade de serem
utilizados para produção de alimentos e
bebidas alcóolicas; ou também para fabri-
cação de medicamentos como a penicilina.
Portanto, seu controle e contagem é extre-
mamente importante para padronização
dos resultados.
Com o objetivo de determinar o núme-
ro de esporos de bolores e leveduras, a
Câmara de Neubauer foi o método utiliza-
do para contagem, mostrada na Figura 1,
presente em ANEXO.
Também conhecida como hemocitô-
metro, a Câmera de Neubauer é uma lâmi-
na, normalmente de vidro, utilizada para
contagem de células por unidade de volu-
me de uma solução. Composta por duas
câmaras, independentes, que possuem gra-
des de diferentes tamanhos, formando os
quadrantes, utilizados para análise de dife-
rentes amostras.
Antes de serem colocadas na Câmara
de Neubauer, as amostras devem ser prepa-
radas corretamente. Se a concentração de
fungos for muito alta, poderá haver sobre-
posição e erro na contagem; caso contrário,
a concentração for baixa demais, o resulta-
do levará a um erro estatístico, sendo ne-
cessários mais quadrantes para a contagem.
O número de fungos apropriado para
contagem nesse método é de 30 a 200.
Após a diluição da solução-mãe, a
amostra é colocada, cuidadosamente, no
espaço entre a lamínula e a Câmara de
Neubauer, preenchendo-a completamente.
Após isso, a montagem está pronta para ser
visualizada em microscópio.
MATERIAIS E MÉTODOS
a) Contagem de esporos
Foi utilizado cepas que foram cultiva-
das em placas de Petri, contendo meio
PDA e incubadas a 28ºC por 10 dias.
Em condições de assepsia e próximo a
uma lamparina foi colocado 10 ml da solu-
ção estéril de Tween 80 (0,2% p/v) e al-
gumas pérolas de vidro sobre a placa com
o fungo. Foi agitado manualmente com
auxílio de swab, vagarosamente, para libe-
rar os esporos na solução.
Foi coletada a suspensão de esporos
com o auxílio de pipeta estéril e colocada
num tubo de ensaio estéril, esta é chamada
de suspensão mãe.
Em seguida, foi realizado diluições
sucessivas, em que foi transferido 1 mL da
suspensão mãe para os tubos contendo 9
mL de solução salina (diluição de 10-1) e
repetido até 10-5.
Para a contagem de esporos foi utili-
zado a câmara de contagem (Neubauer) no
qual foi usado o quadrante C para esse ob-
jetivo.
Portanto, com auxílio de uma pipeta,
foi colocado a suspensão de esporos do tu-
bo de diluição de 10-2 sobre a lamínula e
posteriormente esta foi colocada na câmara
para a contagem que deve ser feita apenas
nos 5 sub-quadrantes na diagonal. A conta-
gem é feita com o auxílio de um microscó-
pio óptico.
A fim de estimar o número de esporos
por mililitro foi utilizado a equação (1):
𝑋̅
𝑛º 𝑒𝑠𝑡𝑖𝑚𝑎𝑑𝑜 = 𝑉 × 𝐷 (1)
Sendo: (𝑋̅) a média de esporos, (V)
volume do sub-quadrante que é 4,0x10-6
cm3, (D) diluição utilizada.
b) Contagem de leveduras
A partir do tubo de ensaio contendo
leveduras foram realizadas as diluições
como exposto anteriormente.
Para a contagem de leveduras na câ-
mara de Neubauer deve ser utilizado os
quadrantes A, este é usado para contagem
de células maiores e tem 0,1 mm3 de volume.
Assim, foi colocado na lamínula, com
auxílio da pipeta, a suspensão de leveduras
com a diluição 10-3 e, em seguida, na câ-
mara para a contagem.
Para se obter o número estimado de
leveduras por mililitro foi utilizada a equa-
ção (1), sendo que o volume de cada qua-
drante agora é 1,0x10-4 cm3.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
a) Contagem de esporos
O número total de esporos contados
nos 5 sub-quadrantes foi de 13 e a diluição
utilizada foi de 10-2. Assim, o número
estimado utilizando a equação (1) de
esporos por mililitro foi de 65x106.
b) Contagem de leveduras
A contagem total nos quadrantes A foi
de 347 esporos.
A média dos quadrantes de tipo A foi
aproximadamente de 87 esporos.
Sendo a diluição de 10-3 obtem-se cer-
ca de 87x107 leveduras por mililitro.
Os números podem ser confirmados
na Tabela 1 do ANEXO.
 CONCLUSÕES

Para a contagem de esporos utilizou-se

a diluição de 10-2, levando ao total de 13
esporos somados nos 5 quadrantes diago-
nais. Este número foi um pouco abaixo do
indicado para contagem (entre 30 e 200)
porém, se fosse utilizado a diluição 10-1 o
número seria elevado demais e não seria
possível a contagem. O que pode ser feito
para minimizar o erro, é a contagem de
mais sub-quadrantes, para ter número total
mais assertivo encontrado na solução-mãe.
Para contagem das leveduras, o núme-
ro encontrado para cada quadrante A esta-
va dentro do número indicado para conta-
gem, trazendo maior confiança no resulta-
do para solução-mãe.

REFERÊNCIAS

SAATKAMP, E. KATIA; Monografia Compa-

ração de diferentes meios de Cultura utili-
zados como substratos na contagem de
bolores e leveduras no controle da quali-
dade de erva-mate, 8:10 (1998).
 ANEXO Tabela 1. Contagem de Leveduras dos
quadrantes A
Figura 1: Câmera de Neubauer e lamínulas. Quadrantes
A1 A2 A3 A4
TOTAL (por
quandrante) 107 107 52 81
TOTAL 347
MÉDIA 86,75

Figura 2: Contagem de leveduras nos 4 quadrantes

A da câmara de Neubauer.

Figura 3. Quadrantes A para contagem de

leveduras
RESPONDENDO ÀS PERGUNTAS:

A)

Após 4 diluições, a amostra passa da con-

centração de 1015 células/ml para 1011 cé-
lulas/ml.

B)

Se o Volume é de 2L

𝑋 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
= 107
2000 𝑚𝑙 𝑚𝑙

X = 2x1010 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

0,2 ml <<< 2000ml

Utiliza-se 0,2 ml de solução

Da solução preparada:
(1011 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑙)

1011 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 − 1𝑚𝑙

10
2𝑥10 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 − 𝑋

Resolvendo a regra de 3:
2𝑥1010
X= => X=2𝑥10−1 = 0,2 ml
1011