UNIVERSIDAD NACIONAL

MAYOR DE SAN MARCOS

TEMA : Cromatografía de gases y Cromatografía líquida

PROFESOR: Rodríguez Best, María Angélica

ALUMNOS: Estrada Peña, Daniela 16100147

Guillén Vásquez, Abraham José 15100150
Inga Casimiro, Manuel Alexander 16100132

E.A. : Microbiología y Parasitología

HORARIO: 2 pm a 4pm

2018
 CROMATOGRAFIA DE GASES

1. Fundamento de la Cromatografía de Gases

En cromatografía de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de
una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un
gas inerte, y a diferencia de la mayoría de los tipos de cromatografía, la fase móvil no
interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el
analito a través de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases: la
cromatografía gas - sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC). La
cromatografía gas - líquido tiene gran aplicación en todos los campos de la ciencia y su
denominación se abrevia normalmente como cromatografía de gases (GC).
La cromatografía gas - sólido se basa en una fase estacionaria sólida en la cual se
produce la retención de los analitos como consecuencia de la adsorción física. La
cromatografía gas - sólido ha tenido una aplicación limitada debido a la retención
semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elución
con colas (una consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorción), de modo
que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de
ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. Es por ello que se trata sólo
brevemente en la final de este tema.
La cromatografía gas - líquido se basa en la distribución del analito entre una fase móvil
gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte. El
concepto de cromatografía gas - líquido fue enunciado por primera vez, en 1941, por
Martin y Synge, quienes fueron también los responsables del desarrollo de la
cromatografía de distribución líquido - líquido. Más de una década tuvo que pasar, sin
embargo, antes de que la importancia de la cromatografía gas - líquido se demostrara
experimentalmente (TEMA 3. CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

2. Indicar del equipo utilizado:

 Marca: Perkin Elmer®
 Modelo: AutoSystem XL
 Software:

3. Describir los componentes de un Cromatógrafo de Gases

 Figura 1. Esquema de un cromatógrafo de gases

 Inyector: los dispositivos de inyección de muestras para cromatografía de gases

tienen la misión de vaporizar la muestra a analizar e incorporar a la corriente de gas
portador que se dirige hacia la columna. La vaporización e introducción de las
muestras en el sistema, debe realizarse cumpliendo una serie de requisitos: la
vaporización de la muestra debe ser lo más rápida posible, la vaporización debe
realizarse sin discriminar ningún componente de la muestra y la muestra debe llegar
a la columna como una banda lo más fina posible (CROMATOGRAFÍA DE GASES,
n.d.).
a) Tipos de inyectores
- Inyectores para columnas empaquetadas.
La inyección de muestras en columnas empaquetadas no presenta problemas
particulares; este tipo de columnas admiten cantidades de muestra
relativamente elevadas, y la inyección de unos cuantos microlitros de muestra
no conduce a una merma apreciable de la eficacia de la columna. La mayoría
de los cromatógrafos comerciales utilizan cámaras de inyección
termostatizadas (figura 2).

Figura 2. Esquema de un inyector para columnas empaquetadas

 Básicamente, un inyector está formado por un bloque metálico, buen
conductor del calor, provisto de un sistema de calentamiento, un termostato
capaz de mantener su temperatura constante y un aislamiento térmico
adecuado; en el interior de este horno, se encuentra alojado el sistema de
inyección (figura 3). En éste, el gas portador, previamente calentado, pasa de
forma continua por el sistema; la muestra es inyectada en el interior de la
cámara, por medio de una microjeringa de precisión, a través de un diafragma
perforable (septum) con capacidad de autosellado en el momento en que se
retira la aguja; una vez inyectada la muestra, ésta es vaporizada de forma
instantánea, mezclándose con el gas portador en una cámara de mezcla
(“liner”) construida de un material lo más inerte posible (acero inoxidable,
níquel, vidrio o cuarzo). La muestra, una vez vaporizada, es arrastrada
rápidamente por la corriente de gas portador en dirección a la columna
(CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

- Inyectores para columnas capilares

Los sistemas de introducción de muestras utilizados para trabajar con
columnas capilares, están basados sobre los mismos principios de los
inyectores utilizados para columnas empaquetadas, por lo que las
consideraciones generales sobre ellos siguen siendo válidas. La diferencia
fundamental entre los sistemas que utilizan columnas empaquetadas y los que
utilizan columnas capilares, radica en que la cantidad de muestra que estas
últimas pueden separar es mucho menor que en el primer caso; por otra parte,
las columnas capilares son muy afectadas por los disolventes, de forma que
los volúmenes que se pueden inyectar en ellas son extremadamente bajos.
Dado que no existen jeringas capaces de medir con precisión volúmenes
inferiores a 0,1 μl, los inyectores utilizados para trabajar con este tipo de
columnas, además vaporizar la muestra y mezclarla con el gas portador,
deberán ser capaces de introducir en la columna sólo una alícuota de la
muestra total inyectada. Existen muchas más técnicas de inyección para
columnas capilares que para columnas empaquetadas, y de entre ellas, se
comentarán a continuación algunas de las más utilizadas (CROMATOGRAFÍA
DE GASES, n.d.).
b) Modos:
- Inyección con división de muestra
Este tipo de inyección (más conocida como inyección “split”), es el más
sencillo de los que se utilizan en cromatografía capilar. El inyector de “split”
(figura 4), consta básicamente de los mismos elementos que un inyector
normal, con la única adición de un sistema de división de flujo a la salida de
la cámara de mezcla. Por medio de este tipo de inyector, el flujo de gas
portador que pasa a través del inyector (y por lo tanto también la muestra
vaporizada), se divide en dos; una parte es introducida en la columna y la otra
escapa fuera del sistema a través de una válvula de aguja que permite regular
la proporción de gas que es introducido en la columna (CROMATOGRAFÍA
DE GASES, n.d.).

Figura 3. Esquema de un inyector de “split”

- Inyección “splitless”
En la técnica de inyección “splitless”, la totalidad de la muestra inyectada es
dirigida hacia la columna, que se mantiene durante la inyección a una
temperatura inferior al punto de ebullición del componente más volátil de la
muestra. La totalidad de la muestra inyectada, lógicamente condensa en la
cabeza de la columna, actuando en este caso el disolvente condensado en la
columna a modo de trampa donde se concentran los componentes a analizar
(efecto solvente). Transcurrido un tiempo adecuado, se abre en el inyector
una válvula de purga con el fin de barrer a la atmósfera el disolvente
vaporizado que pudiera quedar en el inyector; al mismo tiempo, se comienza
un programa de calentamiento de la columna para realizar el análisis
(CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).
 - Inyección en columna
Ya se ha comentado que uno de los principales problemas de los sistemas de
inyección utilizados con columnas capilares, es la posibilidad de
discriminación entre los componentes de la muestra durante los procesos de
vaporización de la muestra y paso de la muestra vaporizada a la columna.
Evidentemente, la única forma de asegurarse de que la muestra que alcanza
la columna se corresponde al 100 % con la muestra inyectada, es realizar la
inyección directamente en la columna. Este sistema ha sido diseñado para
posibilitar la introducción de muestras directamente en el interior de columnas
capilares. Es evidente que la introducción de una muestra por medio de una
jeringa directamente en el interior de una columna capilar (de 0,23 mm de
diámetro interno), requiere la utilización de agujas extremadamente finas
(suelen utilizarse agujas de sílice fundida de 0,15 mm de diámetro) que, en
consecuencia, son incapaces de perforar un septum; la característica básica
de un inyector “on-column” (figura 4), es la utilización de un sistema de
válvulas y tubos de guía que permitan la introducción en el sistema de una
aguja extremadamente fina (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

Figura 4. Esquema de un inyector “on-column”

c) Temperatura del inyector: debe ser de 10° a 50° mayor a la temperatura de
la columna.
 Horno: La temperatura de la columna es una variable importante que para un trabajo
preciso ha de regularse a las décimas de grado, por ello la columna normalmente se
 introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura óptima de la columna
depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido.
En la práctica, con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de
ebullición promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elución razonables (2 a
30 min). Para muestras con un amplio intervalo de ebullición, a menudo es
conveniente emplear una programación de temperatura, con lo que se aumenta la
temperatura de la columna bien de forma continua bien por etapas, al mismo tiempo
que tiene lugar la separación. Las columnas cromatográficas se enrollan y sujetan
en una canasta que se monta en el interior de un horno. El horno de la columna debe
poder ser calentado y enfriado rápidamente. Esto requiere de un sistema de flujo de
aire adecuado y bien diseñado. En la mayoría de los diseños el chorro de aire pasa
a través de las resistencias de calentamiento, después por medio de deflectores que
conforman la pared interior del horno, pasan por la columna y de vuelta al ventilador
para recalentarse y recircular. Los hornos se construyen usualmente con acero
inoxidable delgado. Para la programación de temperatura es deseable disponer de
un intervalo de velocidades de programación desde 0. 1 hasta 50ºC/min. Debe ser
posible sostener la temperatura en cualquier momento dentro del programa durante
un tiempo. En general, la resolución óptima se asocia con una menor temperatura;
sin embargo, la consecuencia de una reducción de temperatura es un aumento en
el tiempo de elución, y por tanto del tiempo que se necesita para completar un
análisis. Las temperaturas iniciales subambientales son útiles cuando se trabaja con
columnas capilares. Las temperaturas se deben mantener alrededor de la
temperatura (Cromatografía de gases, n.d.).
 Columnas: Una columna para cromatografía de gases, está formada por un tubo,
que puede ser de diversos materiales (preferiblemente inertes), dentro del cual se
encuentra la fase estacionaria. Esta puede ser un sólido activo (cromatografía gas
sólido), o con mayor frecuencia un líquido depositado sobre las partículas de un
sólido portador (columnas empaquetadas o de relleno) o sobre las propias paredes
del tubo (columnas tubulares abiertas) (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).
a) Clases
- Columnas empaquetadas
Las columnas empaquetadas consisten, como ya se ha mencionado, en un
tubo (normalmente de vidrio o acero inoxidable) con un diámetro interno que
varía entre 2 y 5 mm y de una longitud que oscila entre 1 y 15 m, arrollado de
 una forma adecuada para poderse introducir en el interior del horno del
cromatógrafo (figura 20). En el interior del tubo, se dispone la fase estacionaria
bajo la forma de un líquido soportado sobre un material adecuado finamente
pulverizado; el diámetro de las partículas del relleno debe ser, al menos, 10
veces inferior al diámetro del tubo, con el fin de conseguir una buena
uniformidad en su distribución. El relleno, se encuentra confinado en el interior
del tubo por medio de tapones del algún material poroso (generalmente lana
de vidrio o lana de cuarzo) situados en los extremos. La longitud, y
consecuentemente la eficacia, de las columnas empaquetadas se encuentra
limitada fundamentalmente por la caída de presión del gas portador entre
cabeza y salida de columna (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

Figura 5. Columnas empaquetadas para cromatografía de gases

- Columnas tubulares abiertas
Las columnas tubulares abiertas (conocidas normalmente como columnas
capilares) fueron descritas inicialmente por Golay en 1957, y se encuentran
entre las más ampliamente utilizadas debido a la gran eficacia de separación
que proporcionan. Básicamente, una columna tubular está formada por un
tubo (normalmente de vidrio o sílice fundida) de un diámetro comprendido
entre 0,2 y 0,8 mm, en cuya pared interna se dispone la fase estacionaria.
(CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.). Según sea la forma en que se dispone
la fase estacionaria sobre la pared del tubo, se distinguen básicamente dos
tipos de columnas (figura 6):
Columnas WCOT (Wall Coated Open Tubular). En este tipo de columnas (que
son las de uso más frecuente), la fase estacionaria se encuentra depositada
formando una película líquida directamente sobre las paredes del tubo.
 Columnas PLOT (Porous Layer Open Tubular. En estas columnas la pared
interna del tubo está recubierta por una capa de un soporte adsorbente; si a
su vez el soporte está impregnado con una fase estacionaria líquida, las
columnas son denominadas SCOT (Support Coated Open Tubular.

Figura 6. Tipos de columnas tubulares abiertas

b) Fases estacionarias: La fase estacionaria tiene en cromatografía de gases
un papel fundamental, ya que la fase móvil es cromatográficamente inerte y
las separaciones son debidas exclusivamente a las interacciones específicas
que se dan entre los componentes de la muestra y la fase estacionaria. Como
en casi todos los casos, las propiedades deseables de una fase estacionaria
son con frecuencia contradictorias, por lo que no existe la fase estacionaria
ideal. (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.). Las propiedades que debería
cumplir una fase estacionaria son:
- Debería tener un rango de temperaturas de utilización lo más amplio
posible (idealmente entre -60 y 400 EC).
- Debe tener una presión de vapor lo más baja posible.
- Debe ser térmicamente estable.
- Debe ser químicamente inerte.
- Debe tener baja viscosidad en las condiciones de trabajo.
- Debe mojar bien el soporte, presentando además una adherencia
suficiente como para que no sea arrastrada por la fase móvil.

Además de cumplir estos requisitos generales, la fase estacionaria debe ser

selectiva frente a los compuestos a separar. Evidentemente, no existe ninguna
fase estacionaria que cumpla todos los requisitos anteriores, aunque para
realizar separaciones a temperaturas elevadas, la utilización de polímeros
“líquidos” de elevado peso molecular ofrece resultados bastante buenos
(CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).
 A nivel molecular, la retención de un soluto por parte de la fase estacionaria
puede ser debida a cualquier tipo de fuerzas intermoleculares:

- Fuerzas de dispersión (fuerzas de London). Este tipo de fuerzas son

debidas a los campos eléctricos producidas por dipolos instantáneos
debidos al movimiento relativo de núcleos y electrones. Las fuerzas de
dispersión son las únicas que actúan entre fases estacionarias y
solutos no polares.
- Fuerzas de inducción (fuerzas de Debye). Este tipo de fuerzas son
debidas a la interacción electrostática que se produce entre dipolos
permanentes y dipolos instantáneos, formados en moléculas no
polares aunque polarizables, inducidos por los primeros.
- Fuerzas de orientación (fuerzas de Keesom). Son debidas a la
interacción entre dipolos permanentes, tanto de la fase estacionaria
como del soluto.
- Fuerzas donador-aceptor. Son debidas a interacciones químicas de
carácter débil (un ejemplo puede ser el enlace de hidrógeno), en las
que se produce una transferencia no completa de electrones por parte
del donador hacia el aceptor.

Para compuestos no polares, las únicas fuerzas de interacción entre el soluto

y la fase estacionaria son las dispersivas; este tipo de fuerzas no son selectivas,
y en las separaciones basadas en este tipo de fuerzas los solutos emergen de
la columna, por lo general, en orden correspondiente a sus puntos de ebullición.
Para compuestos polares, las interacciones de mayor importancia son las
debidas a fuerzas de inducción y orientación y en algunos casos a interacciones
electrónicas específicas de tipo donador-aceptor; este tipo de fuerzas
dependen del momento dipolar y de las polarizabilidades tanto de la fase
estacionaria como del soluto (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

 Detector: Una vez que los componentes de la muestra han sido separados por la
columna, se hace preciso el disponer a la salida de ésta de un sistema de detección,
capaz de señalar la elución de un componente de la muestra y ofrecer, al mismo
tiempo, una señal proporcional a la cantidad de substancia que pasa a través de él.
Los detectores utilizados en cromatografía de gases son de tipo diferencial, no
ofrecen señal cuando pasa por ellos sólamente el gas portador y responden ante
alguna propiedad que pueda variar cuando éste se encuentra mezclado con alguna
substancia eluida de la columna. Los detectores usados en cromatografía de gases,
pueden dividirse de forma genérica en detectores universales y detectores
específicos; los primeros ofrecen la ventaja de responder prácticamente ante
cualquier compuesto que pueda eluir de la columna, no obstante, esta misma
propiedad puede convertirse en un serio inconveniente cuando se procede al análisis
de mezclas muy complejas; en este último caso, la utilización de detectores
específicos resulta muy ventajosa ya que, al responder únicamente frente a un grupo
limitado de compuestos, los cromatogramas que ofrecen resultan muy simplificados
(CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).
a) Detector de conductividad térmica: Este tipo de detector responde a la
diferencia de conductividad térmica existente entre el gas portador puro y el
gas portador mezclado con alguna otra substancia; la magnitud de la
respuesta dependerá de la diferencia de conductividad térmica entre el
compuesto que eluye de la columna y el gas portador. Este detector es
universal y no es destructivo; por lo general se utiliza para el análisis de gases
permanentes, hidrocarburos ligeros y otros tipos de compuestos que ofrecen
una respuesta pobre en otros tipos de detectores. Su sensibilidad oscila entre
10-6 y 10-8 g, con un rango dinámico lineal de aproximadamente cuatro
órdenes de magnitud (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

Figura 7. Esquema de un detector de conductividad térmica.

b) Detector de ionización de llama: Este tipo de detector es en la práctica de
respuesta universal, ya que es selectivo hacia los compuestos que presenten
enlaces C-H, por lo que son muy pocos los compuestos que no dan señal en
él. En un detector de ionización de llama, el gas procedente de la columna se
 mezcla con hidrógeno y esta mezcla se quema en una cámara con exceso de
aire. El mecanismo de generación de iones en este detector es complejo y
no del todo conocido, ya que la energía de la llama es demasiado baja para
explicar la generación de iones; generalmente, se cree que éstos son
generados por medio de un proceso de ionización química, en el que la
energía liberada por reacciones fuertemente exotérmicas es retenida por las
moléculas orgánicas, generándose iones a partir de las moléculas excitadas.
Los detectores de ionización de llama ofrecen una elevada sensibilidad, gran
estabilidad y un rango dinámico lineal excepcionalmente elevado; todo ello,
junto con una gran sencillez de utilización ha hecho que este tipo de
detectores, como ya se ha mencionado, sean con mucho los de mayor
utilización (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

Figura 8. Sección de un detector de ionización de llama

c) Detector de captura electrónica: El detector de captura electrónica ocupa
probablemente el segundo lugar entre los detectores de más alta utilización,
debiéndose este hecho a su excepcional sensibilidad (el detector de captura
electrónica es probablemente el dispositivo analítico más sensible que se
conoce). Este hecho junto a su selectividad hacia compuestos de enorme
interés (fundamentalmente en los campos de medio ambiente y toxicología),
hacen que sea enormemente utilizado para la detección y cuantificación de
trazas. En un detector de captura electrónica (figura 9), se utiliza una fuente
de radiación β- para bombardear el gas portador que pasa a través de una
cámara de ionización, generándose de esta forma un plasma de iones
positivos, radicales libres y electrones térmicos (CROMATOGRAFÍA DE
GASES, n.d.).
 Figura 9. Detector de captura electrónica de tipo concéntrico
d) Detector de nitrógeno-fósforo: El detector de nitrógeno-fósforo (también
conocido como detector termoiónico o detector de llama alcalina), está basado
en el hecho de que la adición de una sal de metales alcalinos a la llama de un
detector de ionización aumente la respuesta de éste hacia determinados
elementos (fósforo, nitrógeno, azufre, etc.). La selectividad de este tipo de
detectores es muy dependiente de parámetros tales como la temperatura, la
forma y el tamaño de la llama, la composición de la sal alcalina, geometría del
detector, etc.; debido a esta dependencia de muchos parámetros
experimentales, el manejo de este tipo de detector es difícil, la optimización
de la respuesta es tediosa y su estabilidad, debido a pérdidas por vaporización
de la sal alcalina, es muy escasa (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

Figura 10. Detector de nitrógeno-fósforo

e) Detector fotométrico de llama: El detector fotométrico de llama (FPD), utiliza
una llama de hidrógeno para excitar a un estado electrónico elevado
fragmentos de moléculas que contengan átomos de azufre o fósforo. Estos
 dos elementos son excitados de forma óptima por la llama de hidrógeno, y
cuando retornan a su estado fundamental emiten las líneas características de
sus espectros; las líneas analíticas de interés son seleccionadas por medio
de un filtro (392 nm para determinar azufre y 526 nm para fósforo) y la
intensidad de las radiación emitida es medida por medio de un
fotomultiplicador (figura 11) (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

Figura 11, Esquema de un detector fotométrico de llama

f) Detector de fotoionización: Los detectores de fotoionización están basados
en la utilización de los fotones generados en una lámpara de descarga para
ionizar los compuestos orgánicos que emergen, junto con el gas portador, de
una columna cromatográfica. Este tipo de detectores, utilizan para generar la
radiación un tubo de descarga que contiene una mezcla de gases a baja
presión; éstos son excitados por medio de una diferencia de potencial elevada
que se mantiene entre dos electrodos. La variación en las proporciones de la
mezcla de gases de la lámpara, permite obtener radiación ultravioleta de
diferentes energías, aunque la más utilizada es la lámpara de 10,2 Ev.
Prácticamente la totalidad de los compuestos orgánicos dan algún tipo de
respuesta con estos detectores. La sensibilidad del detector de fotoionización
es dependiente del potencial de ionización del compuesto de que se trate; la
respuesta del detector frente a los compuestos orgánicos sigue el orden
general: Compuestos aromáticos > alquenos > alcanos > alcoholes > ésteres
> aldehidos > cetonas (CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).
 Figura 12. Detector de fotoionización
g) Detector de conductividad electrolítica: La utilización del detector de
conductividad, está basada en la medida de las variaciones de la
conductividad que presenta una disolución de electrolitos; estos electrolitos
se forman por disolución en agua de los productos de las substancias eluidas;
por supuesto, solo las substancias que contengan grupos capaces de
comportarse como electrolitos serán detectables por este medio. La
descomposición de las substancias eluidas se lleva a cabo por medio de
pirólisis o de reacciones catalizadas en un horno de flujo de bajo volumen,
formado normalmente por un tubo de níquel o cuarzo de pequeño diámetro
mantenido a una temperatura de 500 a 1.000 EC. Los líquidos de base
utilizados en estos detectores están formados normalmente por alcoholes
(metanol, isopropanol, etc.) solos o mezclados con agua; la utilización de este
tipo de disolventes en lugar de agua permite mejorar notablemente la
sensibilidad, la selectividad y el rango dinámico lineal del detector
(CROMATOGRAFÍA DE GASES, n.d.).

Figura 13. Diagrama de funcionamiento de un detector de conductividad

  Gas Portador: Los gases portadores cuya única función es la de transportar el
analito a través de la fase estacionaria, deben ser químicamente inertes y no
reaccionar ni con los analitos a determinar ni con la fase estacionaria de la columna.
Comúnmente se utiliza el helio, el nitrógeno y el hidrógeno. La elección del gas
portador queda determinada no sólo por el tipo de detector a utilizar sino por la
eficiencia de la separación, así como por su velocidad. En este sentido el hidrógeno
al tener la más baja viscosidad de todos los gases propuestos proporciona una alta
movilidad originando tiempos de análisis cortos. Sin embargo es el helio el que
proporciona en la mayoría de los casos las mejores resoluciones, y es el más usado.
Otro punto a tener presente en la elección del gas portador, es su pureza. Impurezas
como hidrocarburos originan ruido en la línea base disminuyendo la sensibilidad y
los límites de detección de la separación. De igual modo, trazas de agua y oxígeno
pueden descomponer la fase estacionaria y con ello la destrucción prematura de la
columna. Con el suministro del gas se encuentran asociados los materiales
necesarios para la correcta incorporación de los gases al cromatógrafo (reguladores
de presión, manómetros y caudalímetros) (Cromatografía de gases, n.d.).

4. Describir el procedimiento y ejemplos realizados.

Para realizar una separación mediante cromatografía de gases, se inyecta una pequeña
cantidad de la muestra a separar en una corriente de un gas inerte a elevada
temperatura; esta corriente de gas, atraviesa una columna cromatográfica que separará
los componentes de la mezcla por medio de un mecanismo de partición (cromatografía
gas líquido), de adsorción (cromatografía gas sólido) o, en muchos casos, por medio
de una mezcla de ambos. Los componentes separados, emergerá de la columna a
intervalos discretos y pasarán a través de algún sistema de detección adecuado, o bien
serán dirigidos hacia un dispositivo de recogida de muestras.

5. Dar 6 ejemplos de aplicación de esta técnica en el área de

microbiología, mencionando el analito, matriz, columna utilizada, gas
portador y detector.
 COLUMNA GAS
EJEMPLO ANALITO MATRIZ UTILIZADA PORTAD DETECTOR
OR
Cromatógrafo
“Caracterización ésteres metílicos Hexano Columna Helio de gases
de de ácidos grasos Restek Rtx-5 99.999 % Hewlett-
microorganismo celulares de de 30m, 0.25 Packard 5890
s cromatografía microorganismos mm DI y II plus con
de gases recubrimiento detector de
acoplada a 0.50 µm espectrometrí
masas” a de masas
HP 5970

“Aplicación de la ésteres metílicos Hexano Columna Nitrógeno Cromatógrafo

Cromatografía de ácidos grasos heliflex RSL de gases
de Gases en la celulares de las 150 de 30m, Hewlett-
Identificación de bacterias 0.25 mm DI y Packard 5890
Enterobacter recubrimiento II plus con un
cloacae, 0.25 µm detector de
Enterobacter ionización de
aerogenes y flama
Eneterobacter
agglometans”

“Un
procedimiento ésteres metílicos Hexano Columna CP Nitrógreno Cromatógrafo
rápido para la de ácidos grasos SIL 5 de gases
identificación de celulares de las (0,22 mm de Intersmat IGC
bacterias del bacterias diámetro 121
ácido láctico interno) equipado con
basadas en el un detector de
análisis ionización de
cromatográfico llama
de gases de los
ácidos grasos
celulares”
 COLUMNA GAS
EJEMPLO ANALITO MATRIZ UTILIZADA PORTAD DETECTOR
OR

“La ésteres metílicos Hexano Columna Nitrógeno Cromatógrafo

cromatografía de 22 ácidos DB1 de 60 de gases
gas-líquido con grasos de metros de Perkin-Elmer
espectrometría levaduras longitud y modelo 6800,
de masas en la 0,25 micras con detector de
identificación de de diámetro. ionización de
levaduras” llama y con
detector de
masas fue un
modelo Finnian
Voyager GC
8000 Top
“Aplicación de
mediadores Hidrógeno Columna de Nitrógeno Cromatógrafo
redox solubles e producido por acero de gases
inmovilizados Clostridium inoxidable Shimadzu GC-
para beijerinckii 8A, con
incrementar la Detector
producción de Térmico de
hidrógeno por Conductividad
Clostridium
beijerinckii”
“Análisis de
ácidos grasos ésteres metílicos Hexano Columna Cromatógrafo
de cepas de de ácidos grasos capilar SRB- de gases
Mycobacterium celulares de las 1 SUPELCO JOEL, modelo
habana y bacterias (30 m de JMS DX-300
Mycobacterium largo, 0,32
simiae” mm d.)
6. Ventajas y desventajas de esta técnica de análisis.

a) Ventajas
- Análisis rápido (minutos)
- Eficiente, provee alta resolución
- Sensible, detecta fácilmente pmm y frecuentemente ppb
- No destructivo, acoplamiento en línea (espectrometría de masas)
- Análisis cuantitativo con alta exactitud (RSD 1-5%)
- Requiere un volumen de muestra pequeño (µL)
- Confiable y relativamente simple
- Bajo costo

b) Desventajas
- Está limitada a muestras volátiles
- No se puede utilizar en muestras térmicamente débiles
- Es difícil para muestras grandes (preparativas)
- Requiere espectroscopía (MS) para confirmar la identidad de una señal
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC)

1. Fundamento de la Cromatografía Liquida.

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes
de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil.
La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe 2SiCl. La fase móvil actúa de
portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los
componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de
los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la
separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los diferentes detectores
dependerá de la naturaleza de los compuestos a determinar.
2. Indicar del equipo utilizado:
 Marca: Agilent
 Modelo: 1100
 Software: Chemstation
3. Tipos de Cromatografía:
 Cromatografía en Fase Reversa – ejemplo
La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a su
polaridad. El principio de la cromatografía en fase reversa es la fase estacionaria es
de partículas de sílica químicamente modificadas con hidrocarburos saturados,
insaturados o aromáticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria en
una matriz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografías se emplean mezclas
de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y
alcoles alifáticos.
En la separación de aminoácidos y péptidos mediante fase reversa la resina más
comúnmente empleada posee una cadena lineal de 18 carbonos y se denomina
como C18.
|SiO2|-(CH2)17-CH3
Dado que la resolución de los aminoácidos mediante RPC requiere de sistemas de
HPLC, es frecuente referirse al sistema como C18-HPLC.

La muestra se aplica a la columna en solución acuosa acidificada con ácido

trifluoroacético, un ácido orgánico volátil y que se requiere muy puro. Para mejorar
 la solubilidad de los péptidos formados por aminoácidos muy apolares se añade al
solvente un 10 a 20% de acetonitrilo. Aunque se han reportado otros sistemas de
solventes, este último sigue siendo el más empleado a pesar de la toxicidad del
acetonitrilo.
A fin de eluír de la columna los aminoácidos más apolares es necesario aumentar la
concentración de acetonitrilo en el sistema. Esto se hace en forma gradual durante
la elución, lo cual permite una gran resolución en la separación de las moléculas.
El sistema C18-HPLC completo requiere una mezcladora de solventes, un inyector,
y una bomba que inyecta líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica
requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se
requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite
la aplicación de la muestra.
A la salida de la columna se coloca un detector (generalmente de absorción
ultravioleta o de fluorescencia) y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de
la columna, se requiere un colector. En el análisis y la cuantificación de aminoácidos,
la recuperación de la muestra es innecesaria; pero cuando se separan péptidos
producto de la fragmentación de una proteína para propósitos de secuenciación, el
colector es indispensable.
En los sistemas modernos la formación del gradiente de acetonitrilo y el análisis de
la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo;
lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar la naturaleza los picos
eluídos y cuantificar su contenido.
 Cromatografía en Fase Normal – ejemplo
La cromatografía de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer
tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por
separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase
estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés
es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase
estacionaria. La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad
del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar
(en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención. La fuerza
deinteracción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés,
sino también en factores estéricos de forma que los isómeros estructurales a menudo
se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares en la
 fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los
disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.

4. Describir los componentes de un Cromatógrafo Liquido

 Reservorio de la fase móvil
Los reservorios utilizados para las fases móviles van desde el sencillo frasco de
disolvente hasta los sistemas más complejos capaces de filtrar, desgasificar,
mantener una atmósfera inerte, termostatizar, agitar, etc. Su boca ha de ser lo más
estrecha posible para evitar la evaporación del disolvente, especialmente cuando se
emplean mezclas en las que no todos los componentes son igualmente volátiles, ya
que puede alterarse la composición de la fase móvil. El vidrio suele ser el material
más utilizado. El reservorio ha de taparse, para evitar la entrada de polvo. A través
del tapón discurre el tubo (generalmente de teflón) que conduce la fase móvil al
sistema de bombeo. Este tubo suele tener en su extremo un filtro de titanio de 10 µm
de poro, que evita el paso hacia el equipo cromatográfico de partículas sólidas que
pueda contener la fase móvil. Los equipos modernos de HPLC suelen incorporar 2-
4 reservorios (con una capacidad típica de 1.000 ml cada uno) que permiten la
preparación automatizada de mezclas de disolventes como fase móvil o la formación
de los correspondientes gradientes.
Suelen estar provistos de un sistema para eliminar los gases disueltos (que pueden
generar nefastos efectos sobre la bomba, la columna o el detector). Lo más habitual
suele ser el bombeo de un gas inerte (típicamente Helio) en forma de pequeñas
burbujas para desplazar el aire, y en algunos casos se emplean desgasificadores
automatizados en línea. En la Tabla 19.1 se resumen las principales precauciones
que deben adoptarse con respecto a la fase móvil para el correcto funcionamiento
del sistema de HPLC.
 Desgasificador: Tipos
Elimina los gases disueltos para prevenir la formación de burbujas. Especialmente
importante en bombas de mezcla de baja presión.
Sistemas de desgasificación:
- Helio
- Vacío
- Ultrasonidos
 Bombas: Tipos
La misión de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de
la fase móvil a través de la columna, sin que el flujo sea influido por la presión en
cabeza de columna, ya que ésta puede variar por obstrucción de las líneas de
conducción, del filtro de la cabeza de la columna, etc.
- Bombas neumáticas:
Bombas de desplazamiento directo.
Bombas amplificadoras de aire.
- Bombas de motor eléctrico:
Bombas de jeringa.
Bombas alternantes (pistón o membrana).
 Inyector
Un inyector ideal debe tener las siguientes características:
- Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrecha posible.
- Ser de fácil manejo.
- Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra
inyectada como en el ensanchamiento que origina en la banda
cromatográfica.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de

válvula.

Inyectores de jeringa

En este tipo de inyectores, la introducción de la muestra en la columna se realiza por

medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatográfico a través de una
membrana ("septum"), lo que permite depositar la muestra en la cabeza de la
columna. Las ventajas de este tipo de inyector, radican en su facilidad de
construcción y en que permiten sacar todo el partido a la eficacia ofrecida por la
columna; por el contrario, son inyectores que presentan una gran falta de
reproducibilidad, tienen una presión de trabajo limitada y son de gran dificultad de
manejo.

Inyectores de válvula
 Este sistema de inyección consiste en una válvula de seis vías, dos de las cuales
están conectadas entre sí por medio de una espira ("loop"). Esta espira es un tubo
de volumen conocido, cuya misión es la de contener la muestra antes de efectuarse
la inyección. La introducción de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos
etapas; la primera se realiza a presión atmosférica, y consiste en cargar la muestra
en la espira con ayuda de una jeringa; en la segunda, mediante un giro de la válvula,
se hace pasar el eluyente a través de la espira hacia la columna. La inyección
mediante válvulas es con mucho la más utilizada, ya que reúne prácticamente todas
las características exigibles a un inyector.

 Horno
Permite mantener la temperatura de la columna en el rango 20-100 ºC. En algunos
casos, el controlador de temperatura del detector se puede utilizar como controlador
de temperatura del horno.
 Columnas:
a) Precolumna
Las precolumnas se disponen antes de la columna HPLC, aumentando la vida de
la columna cromatográfica. La precolumna retiene las partículas sólidas y otros
contaminantes presentes en la fase móvil, así como otros componentes de la
muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Además, la sílice
que constituye el relleno base de la mayoría de las columnas— puede disolverse
lentamente en la fase móvil. Wehrli demostró que «la cantidad de sílice disuelta,
en partes por millón, era aproximadamente equivalente al tanto por ciento de agua
en el eluyente». Al incorporar la precolumna, la fase móvil, queda saturada en
sílice y ya no es capaz de disolver la sílice de la columna. Además, es importante
considerar que a valores bajos de pH puede hidrolizarse el enlace siloxano en
fases enlazadas.
b) Material de la columna
Las columnas de HPLC son tubos rectos de acero que miden entre 3 y 30 cm de
longitud. Su diámetro entre 2 y 5 mm. La fase estacionaria se mantiene entre dos
discos porosos situados en los extremos de la columna.
En HPLC se emplean dos tipos de relleno para las columnas:
- Relleno pelicular: se utilizan bolitas de vidrio o polímero no porosas esféricas
de diámetro entre 30-40 µm. Sobre su superficie se deposita una capa
 delgada de partículas muy pequeñas (2-5 µm) gel de sílice, alúmina o un
cambiador iónico que actúan como fase estacionaria. Si la fase estacionaria
es líquida se coloca una fina película de líquido sobre las esferas no porosas.
- Partículas porosas: se trata de micropartículas porosas con tamaños entre 3-
10 µm de sílice, alúmina o cambiadores iónicos, que actúan como fases
estacionarias. También pueden recubrirse con películas orgánicas líquidas
retenidas por adsorción.
Son más fáciles de empaquetar, pero menos eficaces que las segundas. Además,
pueden emplearse fases enlazadas, que son generalmente partículas de gel de
sílice modificadas químicamente. Estas resultan mucho más estables que los
líquidos retenidos físicamente.
c) Tipos de fases estacionarias
Las fases estacionarias más utilizadas en cromatografía de adsorción son la sílice
y la alúmina, cuya principal característica común reside en la elevada actividad
superficial. Los parámetros que permiten orientar sobre la actividad de estas fases
estacionarias son:
- La superficie específica
- El tamaño de poro de la partícula
Ambos datos dan una orientación de cuantos puntos activos existen en la
superficie del relleno y sobre si estos puntos activos están al alcance de las
moléculas de soluto (una superficie específica alta con un tamaño de poro
pequeño da lugar a que gran parte de los puntos activos se encuentren en zonas
del poro inaccesibles para el soluto).
 Detector: Tipos
Un detector para cromatografía es un dispositivo que permite medir, a la salida de la
columna, una propiedad física del eluyente, que deberá depender de la composición
de éste. La detección en cromatografía se realiza, habitualmente, en continuo,
aunque es posible la utilización de colectores de fracciones para la identificación y
cuantificación de pequeñas fracciones del eluyente.
Detector de índice de refracción
El detector de índice de refracción, es el detector de uso corriente de respuesta más
universal. El índice de refracción es una característica física definida de todos los
compuestos. La detección se basa en equilibrar el detector, a caudal constante, con
fase móvil pura y medir el cambio de índice de refracción cuando aparece la muestra
eluida junto con la fase móvil. Resulta obvio que cuanto mayor sea la diferencia entre
los índices de refracción de la muestra y de la fase móvil, mayor será el desequilibrio,
por tanto, la máxima sensibilidad se obtendrá cuando exista una diferencia máxima
entre los respectivos índices de refracción. Sin embargo, aparecen ocasionalmente
algunos problemas al efectuar la elección de un sistema de fase móvil, que sea
compatible con el tipo de separación y con los componentes del instrumento, para
que su índice de refracción sea diferente del de la muestra. Por otra parte, en
mezclas complejas, los índices de refracción de los componentes de la mezcla
pueden cubrir un amplio intervalo de valores y algunos de ellos pueden ser muy
cercanos al de la fase móvil, con lo que resultan invisibles para el detector.
Detectores de ultravioleta/visible
Cuando se hace pasar una radiación electromagnética a través de compuestos que
presentan determinados grupos funcionales, éstos experimentan una excitación
electrónica a causa de la absorción de energía, a una longitud de onda que será
específica para cada grupo funcional. Esta energía, provoca el paso de un electrón
desde el estado fundamental hasta un nivel de energía superior. La absorción de
energía, se traduce en una disminución de la intensidad del haz luminoso que se ha
hecho pasar a través de la muestra, pudiéndose medir esta disminución de
intensidad haciendo incidir el haz sobre una fotocélula. En los detectores de
absorción ultravioleta, la línea de base representa la máxima transmisión de luz, y
cualquier desviación de ella indicará pérdida o absorción de radiación. La utilización
de la absorción de luz ultravioleta o visible para el control de una corriente líquida y
analizar los distintos componentes que lleva en disolución, es una extensión natural
de la espectrofotometría. Al contrario de lo que ocurre con el índice de refracción, la
absorción UV o visible es un parámetro específico para cada compuesto, ya que éste
debe presentar una absorción adecuada en alguna región del espectro o, en su caso,
debe combinarse con un reactivo adecuado para formar un derivado que presente
absorción.
Detectores de fluorescencia
El fenómeno de fluorescencia tiene lugar cuando compuestos que poseen
determinados grupos funcionales específicos, se excitan con la energía de ciertas
longitudes de onda y emiten radiación de mayor longitud de onda que la absorbida.
En fluorescencia, la radiación emitida se mide normalmente, con objeto de evitar
interferencias, en dirección perpendicular a la de incidencia del haz de excitación.
 Naturalmente la posibilidad real de detectar por fluorescencia grupos químicos
específicos, es función de las longitudes de onda seleccionadas, tanto la de
excitación como la de emisión. Los detectores de fluorescencia representan el tercer
tipo de detectores más comúnmente utilizados en la moderna CL. Para los
compuestos que presentan fluorescencia natural, así como para los que pueden
convertirse en fluorescentes por medio de una derivatización simple, es el tipo de
detección más sensible que se puede aplicar de rutina a la CL; normalmente la
sensibilidad del detector de fluorescencia es 1.000 veces mayor que la del detector
UV, para compuestos con absorción UV intensa, y la sensibilidad del detector UV es,
por su parte, 1.000 veces mayor que la del detector de índice de refracción.
Detectores electroquímicos
Este tipo de detectores, están basados en la oxidación del analito eluido mediante
un electrodo adecuado, registrándose la intensidad de la corriente, mantenida
mediante la electrólisis de los analitos, a lo largo del cromatograma. La detección en
este caso está basada en el conocido polarógrafo de gota de mercurio; este
instrumento consta de un par de electrodos a los que se aplica un potencial de
oxidación (potencial de semionda) suficiente para crear una corriente de difusión.
Puesto que la cantidad de corriente es una medida directa de la concentración de
analito en un momento dado, el proceso es cuantitativo.
5. Características de la fase móvil
Las fases móviles se caracterizan por los su capacidad de desplazamiento y
selectividad. En fase normal los disolventes polares eluyen más rápidamente (tienen
mayor capacidad de desplazamiento) mientras que en fase inversa es al revés. La
selectividad se basa en las interacciones específicas entre el soluto y la fase móvil.
Puede emplearse elución isocrática o en gradiente.
6. Elución:
 Isocrática: la composición de la fase móvil permanece constante durante la
separación
 Por gradientes: la composición se va modificando durante la separación. Para
trabajar en esta modalidad el cromatógrafo debe disponer de un sistema de
programación de gradiente, que permita la mezcla reproducible de disolventes en
distintas proporciones durante la separación cromatográfica.
7. Ventajas y desventajas de esta técnica de análisis.
Su alta resolución permite obtener y separar mezclas muy complejas; como algunos
fluidos biológicos como la orina humana. Las muestras naturales son difíciles de
manejar, pero con CII y programación de fase inmóvil la resolución es notable.
Los métodos de HPLC proporcionan muy buena información de tipo cualitativo,
efectuando análisis con precisión del 1%.
Los detectores proporcionan buena sensibilidad y según el tipo de muestra suelen
medir hasta los 10 ng (nanogramos), otros más especializados pueden detectar
cantidades muy pequeñas.
Entre las ventajas de esta técnica, la más importante es la diversidad de sus
aplicaciones tantos a compuestos orgánicos como inorgánicos, etc. Las únicas
muestras no susceptibles de poderse analizar con facilidad son las gaseosas. Mediante
los instrumentos cromatográficos, la identificación de cada señal de la muestra a
análisis se realiza comparando los tiempos de retención con valores previamente
determinados y la cuantificación se obtiene mediante las áreas integradas de las
señales de acuerdo con el método analítico seleccionado.
Teniendo en cuenta sus limitaciones, el instrumental es costoso y representa inversión
para los laboratorios. Otra limitación es la necesidad de que el personal que utiliza estos
métodos tenga experiencia para poder obtener provecho, lo cual requiere de 6 a 12
meses de experiencias para llegar a ser operador eficiente. La HPLC no es un buen
método de identificación, en general la cromatografía es básicamente una técnica de
separación de gran resolución, pero que no nos identifica el compuesto que da la señal
obtenida en el cromatograma.
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