1.

Domenii de aplicare si performantele culturilor in vitro

Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns

afirmativ, sunt utilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria
alimentară, industria uşoară, etc. În agricultură, în general şi în horticultură în
special, culturile de ţesuturi şi celule sunt folosite pentru multiplicarea unor specii,
soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea
germoplasmei horticole, pentru obţinerea de metaboliţi secundari.
Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim:
-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase
pornind de la cantităţi mici de material vegetal. Teoretic, se asigură o multiplicare
exponenţială, prin care în circa 6 luni se pot obţine 1 milion de plante;
-se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme, material mai
viguros, precoce şi productiv;
-necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin
cultura pe verticală pe 3-5 nivele suprapuse;
-obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante
de ţesuturi generative (cu n cromozomi);
-dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro,
hibrizi care în condiţii normale sunt imposibil de obţinut;
-selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători;
-se evită efectul sezonier de pepinieră;
-se pot obţine seminţe artificiale;
-se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;
-asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii
normale de cultură;
 -asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor
comenzi ferme de multiplicare.
Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura in vitro
şi care, deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional.
Există însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru
înmulţirea în masă a plantelor, cum ar fi:
-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate
indispensabile activităţilor de micropropagare, care sunt costisitoare;
-necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea
in vitro;
-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor
unităţilor de producţie;
-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu
răspund la metodele cunoscute de multiplicare;
-există riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea
autenticităţii soiurilor;
-riscul apariţiei germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor
tipuri care se comportă bine la acest tip de cultură, cu riscul sărăcirii bazei de
germoplasmă pentru unele specii.

2. Baza materiala si conditiile de lucru pentru cultura in vitro

Încăperile destinate cultivării in vitro a explantelor vegetale trebuie să fie:

luminoase, lipsite de igrasie, să prezinte instalaţii de iluminare, canalizare, curent
electric, toate în perfectă stare de funcţionare. Orice defecţiune poate perturba
desfăşurarea normală a lucrărilor efectuate în acest laborator.
 În toate compartimentele laboratorului trebuie asigurată o curăţenie perfectă,
praful şi murdăria constituind surse de infecţii. Toate operaţiunile, cum ar fi:
repartizarea mediilor de cultură, prelevarea, dimensionarea şi inocularea explantelor
vegetale se realizează în condiţii aseptice.
O condiţie esenţială în reuşita unei culturi in vitro constă în realizarea unei
asepsii perfecte, atât a materialului biologic cât şi a mediului de cultură. În cazul în
care această asepsie nu este asigurată, în mediul de cultură pot apărea infecţii
microbiene şi fungice în circa 2-5 zile de la inoculare, ceea ce duce la modificarea
proprietăţilor substratului de cultură, eliberarea de toxine, modificarea pH-ului şi
astfel dezvoltarea explantelor este inhibată.
Laboratorul de culturi in vitro trebuie să cuprindă mai multe încăperi, grupate
în funcţie de lucrările care se execută în ele, în două zone:
-zona nesterilă –
-zona sterilă – este constituită dintr-o cameră sau incintă sterilă.
Dimensionarea încăperilor şi dotarea lor cu aparatură depinde de specificul
muncii prestate (cercetare, producţie sau miniproducţie).

A. Zona nesterilă
1.Spălătorul
Destinaţie: este încăperea în care are loc spălarea sticlăriei şi recipientelor
destinate culturilor in vitro.
.
Modul de spălare:
-se pregăteşte sticlăria care urmează a fi spălată;
-se elimină resturile de mediu şi resturile vegetale din vasele de cultură;
-mediile de cultură cu agar se colectează şi se aruncă la gunoi;
 Se consideră sticlăria curată atunci când la suprafaţa acesteia nu mai aderă
nici o picătură de apă.

2.Camera pentru sterilizare

Destinaţie: este locul în care se efectuează sterilizarea mediilor de cultură, a
apei distilate şi a vaselor de cultură.
Organizare:
-trebuie să fie prevăzută cu pardosea din ciment şi instalaţie de canalizare, sa
fie racordată la reţeaua de gaze, conectată la curent electric şi să posede o sursă de
apă;
-este dotată cu autoclave pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a apei
distilate;
-este dotată cu etuve pentru sterilizarea sticlăriei.

3.Camera pentru prepararea mediilor de cultură

Destinaţie: este încăperea în care se realizează prepararea mediilor de cultură.

Organizare:
-trebuie să fie spaţioasă şi iluminată corespunzător;
-trebuie să fie dotată cu instalaţii de canalizare, curent electric, gaz, apă
curentă;
4.Camera de creştere
Destinaţie: este destinată păstrării inoculilor în condiţii optime în vederea
creşterii şi dezvoltării acestora.
Organizare:
-trebuie să fie perfect curată, faianţată, bine izolată de mediul extern, dotată
cu instalaţie de curent electric, sistem de climatizare;
 -nivelul temperaturii trebuie să fie, în general, între 22-24oC; în funcţie de
specie, scopul urmărit şi tipul de cultură aceasta poate varia între 15-30oC;
-umiditatea din camera de creştere trebuie să fie cuprinsă între 70-75%;
reducerea umidităţii sub aceste valori poate determina deshidratarea mediului de
cultură cu consecinţe grave asupra plantelor;
-pentru culturile pe mediu lichid, în camera de creştere trebuie sa existe unui
sistem de agitare, pentru asigurarea oxigenării ţesuturilor explantului inoculat.

B. Zona sterilă

Camera sterilă
Destinaţie: în această încăpere se execută repartizarea mediului de cultură
precum şi prelevarea, sterilizarea şi inocularea explantelor sau subcultivarea
materialului biologic crescut in vitro.
Organizare:
-trebuie să fie cât mai izolată de restul încăperilor din zona nesterilă pentru a
preîntâmpina vehicularea germenilor;
-hota cu flux de aer steril trebuie să posede sistem propriu de iluminare şi
posibilitatea ataşării a 1-2 becuri de gaz;
-înainte de începerea lucrului cu cel puţin 20 minute hota se porneşte pentru
a se realiza sterilizarea incintei de lucru; în acelaşi timp se pune în funcţiune lampa
UV şi se pulverizează alcool în interiorul hotei;
-înainte de începerea lucrului personalul se va spăla pe mâini în antecameră,
iar în camera sterilă se va clăti cu alcool şi va purta echipamentul specific: halat alb,
boneta şi mască pe figură.
 Dotarile necesare:
Sticlăria
Se utilizează toate tipurile de recipiente de sticlă, folosite într-un laborator de
chimie-biologie. Este bine ca vasele să fie din sticlă termorezistentă de tip Pyrex sau
din silicat de bor.
Într-un laborator sunt necesare pipete, cilindri gradaţi, baloane cotate, pahare
Berzelius, pahare Erlenmayer, pâlnii, vase Petri, sticle şi borcane pentru reactivi.

Instrumentar
În lucrările de culturi in vitro se lucrează cu instrumentar de tip chirurgical:
-pense de diferite forme şi mărimi;
-foarfeci;
-bisturie, cuţite, lame de ras;
-ace, anse, seringi.

Substanţe necesare
În laboratorul de culturi in vitro se utilizează o serie de substanţe:
-săruri anorganice;
-compuşi organici;
-reactivi de uz comun;
-substanţe indispensabile pentru sterilizarea materialului vegetal;
-alte materiale chimice: detergenţi, săpunuri, praf de curăţat, alcool, amestec cromic.

3. Mediile nutritive pentru cultura in vitro

Explantele vegetale pentru a putea trăi, după desprinderea de planta donator, au
nevoie de condiţii speciale de cultură, să fie protejate de agenţii patogeni (asepsie
totală) şi să aibă ca sursă de hrană o soluţie nutritivă complexă, formată din apă,
săruri minerale, substanţe organice şi fitohormoni. Pentru menţinerea explantelor la
suprafaţă şi pentru ca acestea să nu fie asfixiate, mediul de cultură se solidifică cu
un agent de solidificare. Soluţia nutritivă complexă lichidă sau solidă se numeşte
mediu de cultură sau substrat de cultură. Acest mediu de cultură trebuie sa fie steril
şi cu o compoziţie complexă deoarece explantul nu are capacitate de a se hrăni
autotrof, el trăieşte heterotrof pe baza substanţelor existente în mediu. În funcţie de
scopul urmărit, evoluţia explantului poate fi dirijată prin modificarea compoziţiei
mediului, obţinându-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea
organogenezei.
Compoziţia mediului de cultură este specifică pentru fiecare specie, soi şi fază de
dezvoltare, cerinţele fiind diferite şi în funcţie de explantul folosit, momentul de
prelevare şi zona din care s-a prelevat, chiar în cadrul aceluiaşi soi.
Compoziţia mediului s-a stabilit atât prin tatonări repetate cu diferite substanţe, cât
şi prin studii ale sevei brute şi elaborate la diferite specii, studii privind absorbţia şi
desorbţia, schimbul ionic care există între plantă şi mediul înconjurător. În prezent
se cunosc destul de bine modificările pe care le suferă plantele când elementele
chimice sunt în exces sau în deficit. Trebuie evitate pe cât posibil aceste stări de stres
pentru plante atât la cultura în câmp, cât mai ales la culturile in vitro.

A. Compuşii anorganici şi rolul lor

Apa
Apa reprezintă componentul esenţial al vieţii, al materiei vii. Este utilizată în tot
„fluxul tehnologic” de producere a plantelor in vitro, de la spălarea materialului
vegetal şi a vaselor de cultură, până la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte
componente şi elemente de diluţie până la concentraţia dorită. Pierderea apei din
ţesuturi provoacă perturbări metabolice direct proporţionale cu cantitatea de apă
pierdută. Stresul hidric este suportat de plante dacă este de scurtă durată şi dacă nu
se atinge nivelul de veştejire. În această ultimă fază plantele sunt capabile de
rehidratarea ţesuturilor puse în condiţii favorabile de umiditate, dacă deficitul de apă
se menţine plantele mor.
La culturile in vitro există momente când explantele pot să-şi piardă turgescenţa prin
pierderea apei, momente în care trebuie acordată atenţia cuvenită, pentru asigurarea
succesului culturii.
Sterilizarea materialului vegetal este o etapă critică din acest punct de vedere,
deoarece soluţiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenţilor patogeni.

Sărurile anorganice
Substanţele anorganice sunt introduse în mediu sub formă de săruri. Cele mai
utilizate sunt: azotaţii, fosfaţii, clorurile şi sulfaţii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo,
Zn, Cu, Na, etc. Absorbţia elementelor din mediu se face sub formă de ioni, utilizarea
uneia sau alteia din săruri este în funcţie de cerinţele fiecărei specii şi de faza de
vegetaţie.

Diferenţele ce există între diferite reţete de mediu, constau în raportul dintre diferiţi
ioni. Rolul fiziologic al fiecărui element depinde de forma chimică în care se găseşte
în mediu, de concentraţia lui, de natura explantului. În prezent se cunosc principalele
reţete utilizate pentru speciile cultivate care se pretează la cultura in vitro.
B. Compuşii organici

Sursele de carbon
Viaţa in vitro este aproape în exclusivitate heterotrofă, în special în primele faze ale
existenţei, până la formarea unui număr suficient de mare de frunze pe fiecare
plantulă sau lăstar. Datorită acestei nutriţii heterotrofe mediul de cultură trebuie să
conţină un compus care să asigure carbonul organic necesar în metabolism.
Principalele surse de carbon sunt glucidele.
Aminoacizii
Sunt utilizaţi ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule şi ţesuturi,
faşă de azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaugă în mediu sub formă de
compuşi simpli sau complecşi. Principalii aminoacizi utilizaţi sunt: glicina,
asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina, glutamina etc.

Vitaminele
Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu şi
ţesuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro ţesuturile şi
plantulele răspund favorabil la adaosul exogen de vitamine în cantităţi mici.
Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la temperaturi ridicate, uneori
cu ocazia autoclavării, dar s-a observat că şi substanţele reziduale au rol favorabil
asupra culturii.
Principalele vitamine utilizate în mediile de cultură sunt:
-tiamina -piridoxina;
-riboflavina
-acidul;
-biotina
-acidul folic
-acidul para-aminobenzoic,
-acidul ascorbic (vitamina C;
Vitamian e si inozitolul
Fitoregulatorii
Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanţele regulatoare de creştere sunt substanţe
organice utilizate în cantităţi mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele
fiziologice de creştere şi dezvoltare. Există fitohormoni endogeni, sintetizaţi de
plante şi fitohormoni exogeni sau de sinteză.
Ţesuturile in vitro nu sunt capabile să-şi sintetizeze întreaga cantitate de care au
nevoie, fiind necesară adăugarea lor în mediul de cultură pentru a asigura o bună
creştere a explantelor. Cei mai folosiţi fitohormoni în culturile in vitro sunt auxinele,
citochininele şi giberelinele.
Auxinele – sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogeneză alături de
citochinine.
Citochininele sunt substanţe ce se găsesc în cantităţi relativ ridicate în fructe,
seminţe, etc., iar ca structură au la bază adenina şi un nucleu purinic.
Giberelinele sunt substanţe care acţionează la nivelul întregii plante şi nu asupra
celulei, cu rol în stimularea creşterii, înfloririi şi fructificării. Cea mai utilizată
giberelină este acidul giberelic (GA3) fiind şi cea mai activă.
Etilena a fost recunoscută ca fitoregulator mult mai târziu şi este utilizată puţin în
culturile in vitro.
Acidul abscisic este implicat în procesele de latenţă a mugurilor şi seminţelor.
Agenţii de solidificare
Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid,
utilizarea mediului lichid fiind limitată doar la unele experienţe şi la cultura de
suspensii celulare. Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul obţinut din alge
Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu diferă în funcţie de consistenţa dorită,
între 0,5-1%.
Cu rol similar în solidificarea mediului de cultură se mai folosesc:
-agaroza are un înalt grad de purificare şi se foloseşte mai ales pentru cultura
protoplaştilor şi în prepararea gelului pentru electroforeză;
-acidul alginic se foloseşte pentru cultura protoplaştilor, suspensiilor celulare şi
pentru încapsularea embrionilor somatici în vederea obţinerii seminţelor artificiale;
C. Alte substanţe utilizate

Adenina are rol regulator în mediul de cultură, favorizează formarea mugurilor

adventivi, stimulează creşterea şi alungirea apexurilor cât şi rata de multiplicare.
Compuşii fenolici stimulează creşterea calusului, favorizează înrădăcinarea,
creşterea lăstarilor şi a ratei de multiplicare.
Substanţele antioxidante
Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbţia şi blocarea
fenolilor, împiedicând astfel oxidarea lor cu brunificarea şi moartea explantului.
Cărbunele activ este un cărbune vegetal, bine mărunţit ce se adaugă mediului, cu
scopul de a absorbi şi bloca substanţele toxice din mediu.

4.1.1.2 Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultură

Metabolismul unui ţesut vegetal poate fi modificat integral în funcţie de consistenţa

mediului de cultură. Rădăcini de cicoare cultivate pe hârtie de filtru îmbibată cu
mediu lichid pot produce doar lăstari vegetativi, în timp ce cultivate pe mediu
solidificat cu agar pot genera muguri florali. Alegerea tipului de mediu de cultură,
lichid sau solid, prezintă o importanţă deosebită.
Un alt factor important pentru mediul de cultură şi implicit pentru plăntuţele
regenerate in vitro este pH-ul. În practică, ajustarea pH-ului se face la 5,5-5,8 în
timpul preparării mediului de cultură.

FACTORII FIZICI CARE INFLUENŢEAZĂ CULTURILE DE ŢESUTURI

Principalii factori ai mediului înconjurător sunt lumina şi temperatura. Umiditatea
relativă este irelevantă atâta timp cât în interiorul vaselor de cultură aceasta atinge
valori de aproximativ 100%.

4. Fazele tehnologice ale culturilor in vitro

Faza 0, materialul biologic, faza 1 initierea si stabilizarea culturii
in vitro, faza 2 multiplicarea in vitro, faza 3 inradacinarea in vitro,
faza 4 aclimatizarea vitroplantelor
. Initierea culturii
Se realizeaza prelevarea de meristeme de pe lastarii recoltati anterior din plantele
donatoare de explante. Acestea pot fi meristeme apicale sau secundare. Explantele
se dezinfecteaza in hipoclorit de calciu, se spala cu apa distilata.
Initierea culturii se realizeaza in mediu steril, la hota de flux de aer laminar pe un
mediu de cultura agarizat si aseptizat termic la 1200 C prin autoclavare.
3. Multiplicarea materialului
Este continuarea fazei de initiere, deoarece minilastarii obtinuti sunt trecuti pe
medii de cultura pentru multiplicare. Mediul de cultura difera in functie de specie
si de tipul microlastarilor. Ca si faza de initiere toate operatiunile se realizeaza in
mediu steril, la hota de flux de aer laminar. Se realizeaza 6 pana la 9 subculturi,
fiecare subcultura avand o perioada de finalizare de 30-35 zile.
4. Inradacinarea in vitro
Este cea de-a treia faza a tehnologiei de inmultire in vitro si presupune trecerea
minilastarilor obtinuti in faza de multiplicare pe medii de cultura, care are ca scop
stimularii rizogenezei adventive a minilastarilor.
5. Aclimatizarea
Este una din cele mai importante etape din tehnologie, intrucat trecerea plantutelor
dintr-un mediu controlat tehnologic, la un mediu natural, ecologic, provoaca un
stres tehnologic. Aclimatizarea se poate realiza intr-un substrat mineral (perliflor,
nisip) sau organic (turba sau amestecuri de pamant sterilizate), pe mese de
fortificare (pentru grupuri mari de plante) sau in poturi (pentru plante individuale).
6. Fortificarea
Consta in trecerea plantutelor in poturi de dimensiuni mai mari sau la sol pentru o
dezvoltare accelerata a acestora.
7. Alegerea amestecurilor nutritive pentru aclimatizare si/sau fortificare respecta
regulile de baza ale producerii materialului de plantare horticol destinat infiintarii
culturilor ecologice.

Micropropagarea sau inmultirea in vitro este ramura biotehnologiei vegetale care

reprezinta un ansamblu de metode de inmultire a plantelor prin utilizarea culturilor
in vitro de celule, tesuturi si organe vegetale.

Metode neconventionale de obtinere a compusilor bioactivi:

 Micropropagarea
 Cultivarea in vitro a celulelor vegetale (cultura de calus)
 Cultivarea celulelor vegetale in bioreactoare similar cu microorganismele
 Cultivarea in vitro a rădăcinilor
 Biotransformarea
 Imobilizarea celulelor vegetale pe substraturi solide
 Obţinerea compuşilor bioactivi în culturi de celule în suspensie
 1.Obţinerea inoculului de calus pentru cultura în suspensie
 2. Cultivarea calusului în mediu lichid pe agitator şi stimularea
capacitatii biosintetice pentru metabolitul dorit
Cultivarea celulelor vegetale la scara industrial : bioreactor discontinuu si continuu,
chemostatul, turbidistatul, bioreactoare cu aer comprimat,