INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

PRÁCTICA: “SEPARACIÓN DE GRUPOS USANDO

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSIÓN”.

GRUPO: 4IV1

SECCIÓN: 2
OBJETIVOS

 Determinar algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatográfico

 Efectuar la desalación de la albumina utilizando la técnica de cromatografía
por exclusión

FUNDAMENTO

La cromatografía de exclusión, es una de las técnicas más sencillas de las

empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de
cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles
que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con
enlaces cruzados, agarosa, poliacrilamida, etc. Todos estos geles (fase
estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de un material
esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado.

Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de

una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el
diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a
través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por
lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas
capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria;
en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen
en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular.

Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa
molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.
RESULTADOS

Determinación del volumen vacío (vo) de la columna.

Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna

Volumen de elución (mL) A615

3 0.001
6 0.001
9 0.001
12 0.001
15 1.094
18 0.353
21 0.057
24 0.024
27 0.014
30 0.009

Perfil de elucion de elucion de

la dextrana azul
1.4
1.2
1
0.8
A615

0.6
0.4
0.2
0
-0.2 0 10 20 30 40 50 60
Volumen de elucion (mL

Grafica 1. Perfil de elución de la dextrana azul.

a) ¿Cuál fue el volumen total de la columna?

VT= Volumen total (mL).

Vo= Volumen vacìo (mL).
V T= V o + V g + V i
Vg= Volumen del gel (mL).
Vi= Volumen interno (mL).

VT= π . r2 . h

VT= 3.1416 . (1cm)2 . 16.55 = 51.9935 mL

b) Cual fue el volumen vacío (Vo) de la columna? ¿Qué importancia tiene

determinarla?

Perfil de elucion de elucion de la

dextrana azul
1.4
1.2 15 mL
1
0.8
A615

0.6
0.4
0.2
0
-0.2 0 10 20 30 40 50 60
Volumen de elucion (mL)

c) Determine el volumen que ocupar en la columna el líquido que se encuentra en

el interior de la estructura del gel (Vi) y el volumen del gel solo (Vg)

Volumen del gel (Vg)

5mL----------2.5mL
10mL----------- x x= 5mL
Volumen interno (Vi)

VT= Vo + Vg + Vi --------- Vi= VT - Vo - Vg

Vi= 51.9935 mL - 15 mL - 5mL = 31.9935mL

Separación de la proteína del sulfato de amonio.

Tabla 2. Separación del Sulfato de amonio y la albúmina.

Volumen de Masa del Masa del tubo con (NH4)2SO4

A280
elución (ml) tubo vacío (g) precipitado seco (g) (mg)
3 0.011 9.8779 - -
6 0.010 8.6227 - -
9 0.015 8.5103 - -
12 0.016 7.9093 - -
15 0.387 8.5823 - -
18 0.422 8.5641 - -
21 0.217 8.5674 - -
24 0.086 6.7058 6.7099 0.0041
27 0.066 8.5637 8.5734 0.0097
30 0.050 8.6042 8.6269 0.0227
33 0.035 6.3918 6.4678 0.0760
36 0.013 8.5175 8.5840 0.0665
39 0.012 6.1380 6.1477 0.0097
42 0.007 8.4404 8.4473 0.0069
45 0.004 7.5400 7.5546 0.0146
48 0.004 8.5101 - -
51 - 8.5065 - -
54 - 8.5418 - -
57 - 7.5020 - -
60 - 5.2109 - -
63 - 8.4910 - -
66 - 7.5522 - -
69 - 8.5262 - -
71 - 8.5564 - -
74 - 7.5565 - -
 Perfil de elucion de la albumina y el sulfato
de amonio
0.5 0.09

mg de sulfato de amonio
0.45 0.08
0.4
0.07
0.35
0.06
0.3
0.25 0.05
A280

A 280
0.2 0.04
masa
0.15
0.03
0.1
0.02
0.05
0 0.01
0 10 20 30 40 50 60
-0.05 0
Volumen de elución (mL)

Grafica 2. Perfil de elución de la albúmina y el sulfato de amonio

a) ¿Qué sustancia eluyo primero y cual después?

La albumina eluyo antes que el sulfato de amonio debido a que su peso

molecular es mayor.

b) ¿Qué es un gel? Que características debe tener el que es cromatográficamente

útil?

Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar.

Los geles utilizados como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos e
insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una red
tridimensional. Los geles normalmente utilizados son de tres tipos:
dextrano, agarosa y poliacrilamida. En esta práctica se utilizará el gel
dextrano. El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado
y formado en pequeñas bolitas) se comercializa con el nombre de
SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro,
proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200 000
daltons. Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta G-
200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua del
c) Mencione por lo menos tres aplicaciones, diferentes a la usada en la práctica,
que puede tener esta técnica

 Se emplea para la determinación de pesos moleculares de

proteínas.
 Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las
enzimas.
 Purificación de macromoléculas.

d) Escriba las estructuras químicas de Saphadex, del Bio-Gel A y del Bio-Gel P,

indicando donde y de qué forma se da el entrecruzamiento en cada caso y el tipo
de enlace que se presenta.

 Sephadex: Son cadenas de dextranos entrecruzadas con epiclorhidrina.

Variando estos enlaces, se ven alteradas las propiedades del gel.

 Bio-Gel A: Es un polímero lineal de D-galactosa y 3,6-anhidro-1-galactosa

y forma un gel que se mantiene compacto sin necesidad de
entrecruzamientos, por medio de puentes de hidrogeno.
  Bio-Gel P: Gel de poliacrilamida que se prepara entrecruzando acrilamida
con N,N’-metilén-bis-acrilamida.

Discusiòn.

Para realizar esta práctica correctamente se usó una columna de vidrio

verticalmente, introduciendo un disco de lana de vidrio y una de tafeta y se
resuspendió con Sephadex G-25 sedimentado en regulador, el regular la velocidad
de elución es muy importante, así que se realizó cuidadosamente y con las
indicaciones de la profesora.

Se determinó el volumen vacío de la columna, introduciendo la dextrana haciendo

tres lavados con Tris-EDTA colectando así los primeros 3 ml hasta tener los 14
tubos con el mismo volumen, a los cuales les fueron tomadas sus absorbancias a
una longitud de onda de 615nm y el tubo que presento mayor absorbancia fue
tomado como el Vo que fue de 21ml.

Posteriormente anotamos el peso de los 25 tubos que serían ocupados para la

separación de sulfato de amonio de la proteína, añadiendo 0.5ml de la solución
albumina en sulfato de amonio ya introduciendo la mezcla comenzamos a colectar
el volumen de 3ml haciendo de igual forma tres lavados con Tris-EDTA
posteriormente colectamos el volumen a los 25 tubos ya rotulados correctamente
con anticipación.

Con ello pudimos determinar la absorbancia de la albumina a 280nm y añadimos

el BaCl2 1M para poder observar algún precipitado en un numero de tubos que en
este caso se obtuvieron en tres de ellos reportados en la tabla 3 y los sometimos a
una centrifugación a 2000rpm por el tiempo establecido y con esto realizamos los
cálculos adecuados para conocer la masa del sulfato de bario, y poder realizar un
perfil de elución que nos haría de gran ayuda posteriormente y conocer los
resultados mediante gráficos ya reportados en esta práctica. Donde nos hizo
comprobar se hubo una separación de grupos, existieron variaciones que pudieron
ser por motivo de no agregar a tiempo y forma en dos ocasiones el regulador a la
columna y el volumen que está por debajo que el empaquetamiento de la columna
de vidrio afecto en una mínima parte para los resultados de la práctica.

Conclusión.

 Se logró separar la albumina y el sulfato de amonio de manera correcta

durante la práctica
 Es importante mantener la fase móvil a la altura adecuada para evitar que
se seque y afecte en el procedimiento y los resultados
 El perfil de elución nos ayuda a comprobar que hubo una separación y
algunas interferencias durante el método.
 Se logró conocer los valores de Vo, Vg y Vi mediante los cálculos
correspondientes, teniendo conocimiento de estos previamente.
 El gel debe tener las características necesarias para poder realizar esta
práctica del laboratorio

Referencias.

 Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A.,

1988. Handbooks of Amersham Pharmacia Biotech: Ion Exchange
Chromatography, Affinity Chromatography, Hydrophobic Interaction
Chromatography, Reversed Phase Chromatography, Sweden, 2002.
 https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/6.pdf (en línea) fecha de consulta 1-06-
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