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1 CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2 (PCV2) Y NUEVAS HERRAMIENTAS PARA SU

2 PREVENCIÓN Y CONTROL
3
4 PORCINE CIRCUVIRUS TYPE 2 (PCV2) AND NEW TOOLS FOR PREVENTION AND
5 CONTROL
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7 Aura Villamil1*, Carolina Baeza1, Stephanie Andrades, y Álvaro Ruiz2. Formatted: Centered

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1
9 Doctorado en Ciencias Veterinarias, Departamento de Patología y Medicina Preventiva,
10 Universidad de Concepción, Dirección……,Av. Vicente Méndez 595, Chillán, Chile.
2
11 Departamento de Patología y Medicina Preventiva, Universidad de Concepción, Dirección
12 …,Av. Vicente Médez 595, Chillán, Chile.
13 *Autor para correspondencia: E-mail: avillamil@udec.cl
14
15 RESUMEN Formatted: Centered

16 El Circovirus porcino tipo 2 es considerado uno de los patógenos más importantes en los sistemas
17 de producción porcina a nivel mundial, generando en los animales un síndrome de
18 inmunosupresión multisistémico, que se reflejado en grandes pérdidas económicas. Su patogenia,
19 deriva genética y formas de prevención y control, han sido temas relevantes de investigación en
20 los últimos años. Los programas de vacunación masiva de lechones han logrado controlar la
21 enfermedad y las lesiones asociadas,; sin embargo, la diseminación global y los cambios de
22 prevalencia de los serotipos descritos, plantean generan preocupación en el sector productivo. Se Formatted: Highlight

23 plantean entonces herramientas para el desarrollo de vacunas, basadas en nuevas estrategias para
24 la producción de proteínas quiméricas a partir de organismos vivos, que puedan ser utilizadas
25 como subunidades activas, siendo más estables, seguras y con bajos menores costos de
26 producción.
27
28 Palabras clave: PMWS, ADN, patogenia, vacunas. Formatted: Highlight

29
30 ABSTRACT Formatted: Centered
 2

31
32 Porcine circovirus type 2 is considered one of the most important pathogens in swine production
33 systems worldwide, where animals develop a multisystemic syndrome of immunosuppression
34 which implies large economic losses. Its pathogenesis, genetic drift as well as prevention and
35 control, have been relevant research topics in recent years. Vaccination programs have managed
36 to control the disease and associated injuries; however, global dissemination and changes in
37 prevalence of the serotypes raise concern in the productive sector. Tools for the development of
38 vaccines are now based on new strategies for the production of chimeric proteins from living
39 organisms, which can be used as active subunits, being more stable, safe and with low production
40 costs.
41
42 Key words: PMWS (postweaning multisystemic wasting syndrome), ADN, pathogeny, vaccines. Commented [r1]: La primera vez que se menciona se debe
explicar la abreviatura.
43

44 INTRODUCCIÓN

45 A nivel mundial, uUna de las carnes más consumidas a nivel mundial es la de cerdo, lo que ha
46 llevado a que este subsector pecuario sea uno de los de mayor crecimiento. En las últimas
47 décadas, una serie de importantes mejoras en la crianza de cerdos han transformado la producción
48 porcina comercial en una industria de alto nivel y elevado rendimiento. Este sistema productivo
49 se maneja de forma intensiva, idealmente, en granjas multisitios, que requieren un eficiente
50 manejo sanitario y de alta bioseguridad.

51 Entre las enfermedades porcinas de alto costo y difícil control, está el Síndrome multisistémico
52 postdestete (PMWS, por sus siglas en inglés,) postweaning multisystemic wasting syndrome) y Commented [r2]: La primera vez que se menciona se debe
explicar la abreviatura.
53 las enfermedades asociadas a Circovirus porcino, cuyo agente causal es el Circovirus Porcino
54 tipo 2, presente en todo el mundo durante la última década, con una rápida propagación y alto
55 impacto económico, debido a la disminución en los parámetros productivos que genera. Si bienV
56 varios autores han recopilado información resaltando la patogenia e impacto económico de este
57 virus en la industria porcina, pero esta revisión es la primera en integrar los desarrollos
58 biotecnológicos en el área de vacunas recombinantes.

59 SÍNDROME MULTISISTÉMICO POSTDESTETE (PMWS)

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60 El síndrome multisistémico postdestete (PMWS, por sus siglas en inglés de Postweaning

Commented [r3]: Si se trató en 2009 ya no es emergente.
61 multisystemic wasting syndrome) es una enfermedad viral y epizoótica, emergente de gran
62 impacto a nivel mundial (Tucker, 2009), que ha evolucionado de epidémica a endémica (Rose et
Formatted: Not Highlight
63 al., 2012). Se caracteriza por ser lenta y progresiva (Harding et al.,y Clark, 19978 año no coincide
64 con literatura citada), con un periodo de incubación relativamente largo (18 a 25 días), afecta a
65 cerdos entre las 6 y 15 semanas de edad (Harding y Clark, 1997; Tucker, 2009); aunque se ha
Formatted: Highlight
66 descrito también, en animales de 4 a 20 semanas (Harding et al., 2008). La evaluación
67 presentación de la enfermedad y sus signos clínicos se evalúan tanto a nivel individual como
68 grupal (Tucker, 2009) ya que aunque tiene alta prevalencia, la severidad y duración del síndrome
Commented [r4]: Si es una revisión se espera citas de
69 varía según el tamaño y condiciones de cada plantel (Harding y Clark, 1997; Madson y publicaciones recientrs, de los últimos 8-10 años.
Formatted: Highlight
70 Opriessnig, 2011; Oliver et al., 2016; Ober, 2017). La morbilidad y letalidad depende de cada
71 grupo de producción específico de animales, con rangos que varían entre 4-30% y 4-20%,
72 respectivamente (Segalés y Domingo, 2002). La mayoría de los cerdos de producción comercial
73 se suelen infectar con el virus en algún momento de sus vidas, pero sólo cierta cantidad de
74 animales (10%) desarrollan PMWS, presentando lesiones en múltiples órganos y manifestaciones
75 clínicas como pérdida de peso, disnea, ictericia, diarrea intermitente y linfonódulos (LN)
76 visiblemente aumentados de tamaño (Harding y Clark, 1997; Krakowka et al., 2004; Tucker,
77 2009). La carga viral es la principal diferencia entre la infección clínica y la infección subclínica,
Commented [r5]: Sugiero esa palabra.
78 y ya dado que su ciclo de replicación es relativamente largo, es probable que el virus necesite un
79 tiempo de incubación prolongado para alcanzar altos títulos de carga viral tanto en suero como en
80 tejidos (Segalés, 2012).

81 El Circovirus Porcino tipo 2 (PCV2) es el agente responsable y necesario para causar el PMWS, Commented [r6]: Explicar abreviatura la primera vez que
se menciona.
82 aunque por sí solo no es suficiente para desencadenar los signos clínicos de este cuadro
83 patológico (Allan y Ellis, 2000). Bajo ciertas condiciones específicas, los cerdos infectados
84 severamente con PCV2 pueden desarrollar infecciones secundarias (Segalés et al., 2004) con
85 bacterias como Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae y Salmonella Formatted: Font: Italic

86 spp., o con virus responsables de enfermedades como la peste porcina clásica, el Síndrome Formatted: Font: Italic
Formatted: Font: Italic
87 respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), la enfermedad de Aujeszky (Grau-Roma y Segalés,et
Commented [r7]: Nombres científicos con cursiva.
88 al., 2007), Parvovirus porcino (PPV) (Allan y Ellis, 2000), virus de la influenza porcina y virus Aplicare todo el manuscrito.

89 de la peste porcina africana (Roth, 1999). No está en literatura citada Por lo tanto, la falta de Commented [AM8]: Referencia agreagada
Formatted: Not Highlight
90 efectividad de una terapia antibiótica y la concurrencia de otras enfermedades secundarias
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91 (Segalés y Domingo, 2002) son características de la inmunosupresión en animales afectados por

92 el PMWS (Segalés et al., 2004).

93 Para el diagnóstico de PMWS se presentan varios factores en forma conjunta: i) pérdida de peso
94 y retardo en el crecimiento como signos clínicos, ii) lesiones histológicas que indiquen indican
95 problemas en los órganos o tejidos linfoides, e y iii) infección con PCV2 dentro de las lesiones
96 características (Madson y Opriessnig, 2011). A nivel grupal, se presenta una alteración del estatus
97 sanitario por aumentos excesivos de animales muertos y pérdida de peso post-destete en
98 comparación con el nivel histórico del plantel, además de una identificación de caso de PMWS
99 en por lo menos uno de los animales con los signos mencionados (Segalés et al., 2004).

100 PCV2 se correlaciona con otros síndromes que, colectivamente, reciben el nombre de PCVAD
101 (término aprobado por la Asociación Americana de Veterinarios de Cerdos, por sus siglas en
102 inglés de Enfermedades asociadas a Circovirus Porcino) (Chae, 2012), incluyendo enfermedades
103 tanto clínicas como subclínicas (Madson y Opriessnig, 2011) como por ejemplo el complejo de
104 enfermedad respiratoria porcina (PRDC), enteritis, problemas reproductivos, Síndrome dermatitis
105 nefropatía porcina (PDNS) (Segalés et al., 1998) y casos de neumonía necrotizante (PNP)
106 (Segalés et al., 2005; Opriessnig et al., 2007). Adicionalmente, el PCV2 puede replicarse en
107 embriones llegando a desencadenar su muerte, por lo que se asocia también a casos de abortos,
108 momificaciones y fallas reproductivas relacionadas a problemas en la implantación, con retornos
109 irregulares al estro. Por lo tanto, es indispensable el diagnóstico diferencial según hallazgos
110 histopatológicos en tejidos linfoides , es indispensable (Madson y Opriessnig, 2011; Segalés,
111 2012).

112 Durante los primeros años de la epidemia se estimó los costos de la enfermedad en $57 millones
113 de dólares por año en el Reino Unido, y entre $760 a $1.200 millones de dólares a lo largo de la
114 Unión Europea, con base en el número de cerdos muertos y no enviados a matadero (Armstrong y
115 Bishop, 2004), sin tener en cuentaconsiderar las pérdidas y costos implicados por los animales
116 que mantienen infecciones subclínicas.

117 Epidemiología
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118 Circovirus Porcino (PCV), denominado así por el clínico Dr. John Harding y el patólogo Dr.
119 Edward G. Clark, se describió en el Instituto Robert Kochk hace casi 40 años, como principal
120 contaminante de la línea celular de riñón porcino PK15 (ATCC-CCL-33) (Tischer et al., 1982),
121 aunque datos epidemiológicos plantean que ha sido un agente ubicuo en la población porcina
122 alrededor del mundo durante los últimos 50 años (Rose et al., 2012). Circovirus Porcino
123 pertenece al género Circovirus, familia Circoviridae, siendo uno de los virus sin envoltura más
124 pequeño, con una cápside icosaédrica de diámetro aproximado de 12 a 23 nm (Rodríguez-Cariño
125 y Segalés, 2009). Posee ADN circular de cadena sencilla con una longitud de 1767-1768
126 nucleótidos en sentido negativo, covalentemente cerrado y capaz de replicarse en células de
127 mamíferos sin efecto citopático (Tischer et al., 1982; Tucker, 2009).

128 Inicialmente, se describieron dos tipos de virus: PCV tipo 1 (PCV1), que no genera ninguna
129 enfermedad en los cerdos infectados; y PCV tipo 2 (PCV2), Se ha demostrado que los cerdos
130 infectados con este virus identificado inicialmente (conocido en la actualidad como PCV tipo 1)
131 no presentan ningún tipo de enfermedad, a diferencia de PCV tipo 2 (PCV2), virus descrito con Commented [r9]:
Commented [r10R9]: Redacción.
132 características similares a PCV1, pero asociado a varios cuadros patológicos (Harding y Clark,
133 1997; Tucker, 2009). Tanto PCV1 comoy PCV2 tienen dos marcos abiertos de lectura (ORF, por
134 sus siglas en inglés de Open Reading Frame) antisentido que flanquean el origen de replicación
135 (Finsterbusch y Mankertz, 2009) en direcciones opuestas: ORF1, denominado gen rep, que
136 codifica dos proteínas de 37 kDa asociadas a la replicación (Rep y Rep´), producidas a partir del
137 mismo transcripto pero con splicing diferente (Finsterbusch y Mankertz, 2009); y ORF2,
138 denominado gen cap, que codifica la proteína de cápside (Cap) de 27,8 kDa, y presenta mayor
139 importancia inmunogénica (Cheung, 2012). En los cultivos celulares llevados a cabo en células
140 PK-15, se ha identificado además, una tercera proteína dentro de un ORF3 que está relacionada
141 con la patogenicidad del virus durante la infección (Liu et al., 2006).

142 Se sugiere que PCV1 y PCV2 podrían tener un origen en común hace aproximadamente 100 años
143 (Olvera et al., 2007), siguiendo trayectorias evolutivas independientes desde aquella época (Firth
144 et al., 2009). PCV2 ha sido clasificado según su genotipo, caracterizándose por presentar una de
145 las mayores tasas evolutivas dentro de los virus DNA. Si bien, se asume que la infección por
146 PCV2 es ubicua en el mundo (Segalés et al., 201305), año no coincide con literatura citada han Formatted: Not Highlight

147 existido cambios importantes de prevalencia. Antes de 2003, PCV2a y PCV2b estaban presentes Formatted: Not Highlight
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148 en Europa y China, mientras que en Estados Unidos y Canadá existía solamente PCV2a (Chae y
149 Choi, 2010). Aparentemente, Europa y Norteamérica han sido las áreas de mayor diseminación
150 del virus alrededor del mundo; siendo detectado en Cuba recién en el año 2005incluso, se
151 sospecha que el genotipo PCV2b fue introducido en Norteamérica desde Europa; aunque en Commented [r11]: redacción

152 Cuba, por ejemplo, PCV2 se evidenció ¿detectó? recién en el año 2005 (Segalés et al., 20133).
153 Hacia finales de la década del año 2000, el PCV2b fue el de mayor prevalencia en el continente
154 americano, Año no coincide con literatura citada El predominio de PCV2a, en el continente
155 americano, fue reemplazado PCV2b en la década del año 2000, evidenciando un aumento notable Commented [r12]: redacción

156 en suslos niveles de virulencia (Franzo, G. et al., 2016, Constans, M. et al., 2015). Un tercer
157 subtipo identificado en Dinamarca en los años 1980´s (Dupont et al., 2008) se ha denominado
158 PCV2c, e incluso un cuarto subtipo, que inicialmente fue descrito solamente en China y
159 denominado mPCV2b (mutante), se caracterizó como PCV2d (Ge et al., 2012), el cual ha
160 aumentado gradualmente su prevalencia en áreas de mayor producción porcina como Estados
161 Unidos, Europa, China, Korea y Sur América, siendo el más predominante en la actualidad
162 (Franzo, G. et al., 2016, Kwon, T. et al., 2017). Finalmente, un quinto subtipo, PCV2e, se ha
163 descrito tanto en granjas europeas como de América del sur, (Gagnon et al., 2010; Olvera et al.,
164 2007; Dupont et al., 2008; Segalés et al., 20133 año no coincide con literatura citada). Con esta Formatted: Not Highlight

165 amplia distribución, y variedad de genotipos, no es descartable la posibilidad de una infección Formatted: Not Highlight

166 concurrente con más de un genotipo en un mismo plantel (Karuppannan y Opriessnig, 2017).
167 Adicionalmente, un nuevo virus PCV3, ha sido descrito recientemente en cerdos, asociado a
168 cuadros de inflamación multisistémica, fallas reproductivas, PDNS y dermatitis porcina tanto en
169 China (Shen, et al. 2017; Ku et al., 2017) como en Estados Unidos (Palinski et al., 2016). Revisar Commented [AM13]: Revisado
Formatted: Not Highlight
170 en bibliografia

171 Aunque la primera evidencia, de una infección con PCV2 data de 1962, en Alemania, y el primer
172 diagnóstico de la enfermedad se remonta a los años 80´s (Jacobsen et al., 2009); ), el PMWS se
173 describió en el año 1991 en Saskatchewan, provincia ubicada al oeste de Canadá, como una
174 nueva enfermedad esporádica cuya patología clínica se caracterizaba por emaciación e ictericia,
175 así como pérdida de peso, palidez, complicaciones respiratorias y, ocasionalmente, diarrea en
176 cerdos de recría y engorda (Segalés et al., 2005). Los primeros brotes de la enfermedad en el
177 Reino Unido se reportaron en Irlanda del Norte en 1997 (Kennedy et al., 19982000) año no
178 coincide con literatura citada y hacia el sur de Inglaterra a finales de 1999 (Done et al., 2001).
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179 Desde entonces, la enfermedad ha evolucionado de tal forma que se han reportado cambios en la
180 presentación y severidad del síndrome, observándose un aumento de la prevalencia entre 2002 y
181 2003. Desde el año 2003, se ha observado una drástica variación en el genoma del virus a nivel
182 global, con un aumento en la severidad de los signos clínicos de PCVAD (Cortey et al., 2011b).

183 PCV2 representa una estrategia de vida persistente ya que la infección es a largo plazo, rara vez
184 causa una enfermedad aguda, y es genéticamente estable. Después de la infección, el genoma
185 viral utiliza factores celulares del hospedador para convertir su ssADN (single stranded ADN) a
186 su forma replicativa dsADN (doble stranded ADN), que sirve como templado intermediario para
187 la replicación viral. Las enzimas celulares expresadas durante la fase S favorecen su replicación
188 (Tischer et al., 1987), siendo entonces las células más eficientes, aquellas que mantienen un alta
189 actividad mitótica, con su DNA polimerasa activa, como las PK-15 (Darwich y Mateu, 2012). El
190 PCV se replica por el modelo de círculo rodante (Cheung, 2012); además, utiliza
191 glicosaminoglicanos como receptores de unión para que los mRNA de rep y cap sean transcritos
192 y posteriormente, las proteínas son sintetizadas e importadas desde el citoplasma. En las células
193 PK-15, la cápside es la primera proteína detectable producida después de la infección, y se
194 localiza en el área perinuclear de la célula uniéndose a receptores específicos; luego de 12 horas
195 de inoculación, tanto la proteína Cap como la proteína Rep pueden ser detectables en el núcleo.
196 Finalmente, después de 36 horas, los títulos virales se estabilizan indicando que el virus completó
197 su replicación. Basado en lo anterior, y ya que todas las proteínas codificadas por PCV se
198 encuentran localizadas principalmente en el núcleo, se sugiere que la replicación del ADN y la
199 encapsidación del genoma circular de cadena sencilla ocurre en el núcleo y no en los
200 compartimientos citoplasmáticos (Finsterbusch y Mankertz, 2009).

201 Transmisión

202 PCV2 puede ser transmitido por las heces y orina, además de secreciones respiratorias y orales
203 (Patterson et al., 2011), tanto de animales clínicamente afectados, así como de animales
204 infectados pero aparentemente saludables. Sin embargo, su ruta principal de contagio es el
205 contacto oro-nasal, siendo la carga ambiental del virus, un indicador importante del estatus
206 sanitario de cada plantel (Beach y Meng, 2012). PCV2 puede ser transmitido también de manera
207 vertical a través de la placenta, siendo capaz de atravesarla e infectar los fetos en el útero,
208 generando lechones con cuadros de PMWS durante el periodo postnatal (Madson y Opriessnig,
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209 2011). La infección fetal que tiene lugar en los oocitos y embriones se da debido a la unión del
210 virus a la zona pelúcida de los oocitos de cerdo; así, el tracto reproductivo es una fuente de
211 contaminación microambiental potente, previo a la fecundación (Madson y Opriessnig, 2011).
212 Esta infección fetal con PCV2 ocurre antes de la mineralización ósea del feto, resultando en la
213 muerte embrionaria temprana con reabsorción fetal en donde, si la camada no es muy grande y
214 hay pérdida de todos los fetos, la hembra puede volver a su ciclo estral con normalidad (Madson
215 y Opriessnig, 2011). Las camadas que se ven afectadas están compuestas habitualmente por un
216 número alto de fetos no viables, ya sean momificados o nacidos muertos, con lo que de manera
217 frecuente, la única indicación de una infección en el útero son los elevados casos de pérdidas y
218 momificaciones (Madson y Opriessnig, 2011). Después del parto, tanto el calostro como la leche
219 pueden contener PCV2, según lo reportado por primera vez por Shibata et al. (2003),
220 demostrando la presencia de PCV2 en muestras de calostro obtenidas 24 horas después del
221 nacimiento en hembras seronegativas, inoculadas experimentalmente con PCV2 en el día 93 de
222 gestación, diseminación que se mantiene en la leche materna hasta por lo menos 27 días después
223 del parto (Madson y Opriessnig, 2011).

224 Patogenia y lesiones

225 La interacción inicial que se da entre el patógeno y el hospedero es crucial para determinar el
226 desarrollo de la infección. No está claro, por qué algunos animales son capaces de eliminar
227 eficientemente la infección viral, mientras que otros no desarrollan una respuesta inmune efectiva
228 y presentan signos clínicos de la enfermedad; por el contrario, sí hay evidencia de los desórdenes
229 inmunes inducidos por PCV2, generándose una pérdida de conexión entre el sistema inmune
230 innato y adquirido (Beach y Meng, 2012).

231 PCV2 es capaz de sobrepasar los mecanismos degradativos normales de las células monocíticas y
232 permanecer indetectable por el sistema inmune. In vivo, se ha demostrado que al recibir una señal
233 inmunológica apropiada, la replicación y liberación de PCV2 en los monocitos y macrófagos se
234 estimula, teniendo como resultado la acumulación del antígeno viral. En las lesiones
235 histopatológicas de los cerdos afectados con PMWS, los antígenos de PCV2 y su ADN son
236 normalmente encontrados en el citoplasma de las células monocíticas en varios estados de
237 diferenciación, así como en otros tipos celulares, dependiendo del estado de avance de la
238 enfermedad. Las células epiteliales y endoteliales son el primer tipo celular permisivo para la
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239 replicación de PCV2, infectando posteriormente otros tipos celulares como macrófagos, células
240 dendríticas y linfocitos activados (Harding et al., 2008).

241 Dentro de los signos clínicos relevantes en los cuadros de PMWS se incluyen palidez, fiebre, y
242 una pérdida progresiva de peso, junto a desórdenes respiratorios y digestivos, entre otros;
243 adicionalmente, el aumento de tamaño de los LN es una de las principales características
244 observadas en los animales afectados por PCV2. En el análisis histopatológico de los LN es
245 característico observar una disminución del tejido linfoide, junto a una infiltración difusa de
246 células histiocíticas, lo cual indica que la respuesta inmune está altamente involucrada (Allan y
247 Ellis, 2000). Una posible explicación para esta disminución linfoide puede ser la infección y
248 destrucción de precursores de linfocitos en la médula ósea y/o timo (Darwich et al., 2012),
249 evidenciando una disminución simultánea de linfocitos en otros tejidos.

250 Diagnóstico

251 El diagnóstico de las enfermedades asociadas a PCV2 debe basarse no sólo en la detección del
252 virus y/o de anticuerpos, sino en una valoración inicial tanto de los signos clínicos cuando
253 comienza su manifestación (Segalés, 2012), como de las alteraciones en los parámetros
254 productivos que tenga el plantel (Segalés y Domingo, 2002; Opriessnig et al., 2007). Parámetros
255 como tiempo de infección, cantidad de animales con viremia y número de fetos o animales
256 infectados, deben ser evaluados, teniendo claro que no es común que las hembras preñadas
257 presenten signos clínicos, aparte de ser seropositivas y presentar o no viremia, lo que no siempre
258 se correlaciona con una infección fetal en los casos reproductivos (Madson y Opriessnig, 2011).

259 Hay pautas establecidas para realizar un diagnóstico a nivel de plantel, con base en dos
260 elementos: primero, un aumento significativo en la mortalidad post-destete asociada a la
261 presencia de signos clínicos compatibles con PCV2-AD, con respecto al historial de la granja; y
262 en segundo lugar, un diagnóstico individual de PCV2-AD en al menos 1 de 3 cerdos en
263 necropsia, simultáneo al aumento de la mortalidad mencionada (Tucker, 2009; Segalés, 2012; Commented [r14]: En orden cronológico.

264 Tucker, 2009). En los casos de diagnóstico clínico a nivel individual, el enfoque aceptado Commented [r15]: En orden cronológico.

265 actualmente se basa en las observaciones realizadas por Sorden (2000), que incluyen: signos
266 clínicos como pérdidas de lechones al momento del destete, hallazgos patológicos como
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267 emaciación, pneumonía intersticial y linfodenopatía y, finalmente, una demostración de la

268 presencia de PCV2 en lesiones patológicas (Sorden, 2000).

269 El diagnóstico debe incluir entonces la observación de los signos clínicos y la presencia de
270 antígeno en las lesiones de más de un tejido linfoide, o un tejido linfoide y algún otro órgano
271 como pulmón, hígado, riñón e intestino, o, en dos órganos sistémicos. Para ello, se ha
272 desarrollado un sistema de puntaje de 0 a 9 para estimar la severidad de la enfermedad con base
273 en la extensión de tejido linfático involucrado en los siete tejidos linfoides que son evaluados
274 para este propósito: linfonódulos traqueo bronquiales, LN mesentérico, LN mediastínico, LN
275 superficial inguinal, LN iliaco externo, tonsilas y bazo (Cortey et al., 2011a).

276 La inmunohistoquímica (IHQ) y la hibridación in situ (HIS) (Sorden, 2000) son consideradas las
277 técnicas estándar de oro para la detección de antígenos de PCV2 o de ADN en tejidos y fetos
278 sospechosos,; siendo en este último caso, el miocardio el tejido más apropiado para la detección
279 del virus, ya que contiene antígeno tanto en el citoplasma como en el núcleo de células infectadas
280 (Madson y Opriessnig, 2011).

281 Debido a la ubicuidad del virus, se utilizan actualmente otras vías para un diagnóstico efectivo
282 que no implique la eutanasia de los animales, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
283 y la PCR en tiempo real como método cuantitativo para el diagnóstico de PCV2 según umbrales
284 determinados en suero como indicativos de PCVAD, valores que varían entre diferentes autores
285 con rangos que oscilan entre 104,7 y 107,43 copias virales mL-1 (Segalés et al., 2005; Harding et al.,
286 2008; Grau-Roma et al., 2011; Segalés, 2012). La carga viral de PCV2 en sangre se usa para
287 categorizar a los cerdos como infectados subclínicamente con PCV2 (<106 copias ADN mL-1),
288 sospechosos (106- 107 copias ADN mL-1) o positivos para PCVAD (>107 copias ADN mL-1)
289 (Opriessnig et al., 2009b). Así, aunque la PCR no resulta ser una técnica suficiente para
290 diagnosticar la enfermedad en el animal, sí es una herramienta valiosa para determinar el estatus
291 sanitario de un plantel (Grau-Roma et al., 2011). La serología es también un método conveniente
292 para detectar la exposición a PCV2 en un lote grande de cerdos, con ensayos que incluyen
293 inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa en monocapa, ensayo de inmunoabsorción ligado a
294 enzima (Elisa) y seroneutralización viral. La mayoría de los planteles son seropositivos y es muy
295 probable que las madres transfieran el virus y los anticuerpos a su progenie a través del calostro.
296 Es importante resaltar entonces, que los niveles de anticuerpos de la madre y aquellos
 11

297 transferidos a la progenie pueden variar incluso entre individuos del mismo rebaño, así como
298 entre diferentes planteles. Tres semanas es el promedio aproximado de vida media para que los
299 anticuerpos maternos se mantengan en los lechones, pero pueden durar hasta las 18 semanas de
300 vida, dependiendo de los títulos iniciales (Opriessnig et al., 2009b). Esta variabilidad del tiempo
301 de permanencia y mantenimiento de los anticuerpos maternos en la progenie, hace que sea tan
302 difícil predecir las infecciones por PCV2 en las poblaciones porcinas (Madson y Opriessnig,
303 2011).

304 Al realizar el diagnóstico, es necesario determinar si la enfermedad en un plantel es

305 significativamente importante como problema o si es una enfermedad esporádica. Un problema
306 importante se refiere a un aumento en la mortalidad que sea mayor o igual a la media de los datos
307 históricos más 1.,66 veces la desviación estándar. Cuando no hay datos históricos de mortalidad, Commented [r16]: Los decimales en español con coma.
En inglés se usa el punto.
308 se define entonces como un aumento en la mortalidad que exceda el 50% de los niveles
309 nacionales o regionales. Sin embargo, si menos del 50% de los cerdos se diagnostican con
310 PCVAD y presentan aumento en la mortalidad, o si hay más de 50% de los cerdos diagnosticados
311 pero no aumenta la mortalidad, entonces se considera un problema esporádico (Segalés, 2012).

312 Prevención y control

313 El control del PMWS es difícil y depende en gran medida del flujo de animales dentro de cada
314 plantel, así como del estatus sanitario y del reconocimiento temprano del cuadro para la oportuna
315 segregación de los cerdos afectados. La implementación estricta de un sistema ‘todo dentro/ todo
316 fuera’ favorece la reducción de la presión infectiva, siempre que se acompañe de un buen sistema
317 de desinfección de áreas, división de grupos por edades y eutanasia de los animales enfermos,
318 para prevenir la transmisión viral a cerdos susceptibles (Harding et al., 2008). En los planteles
319 afectados, la mortalidad se puede disminuir a través de la implementación de planes de manejo
320 como los principios de Madec (2008) Revisar con bibliografía, los cuales recapitulan la forma Commented [AM17]: revisado

321 correcta para manejar una granja y que, con el tiempo, han pasado a la historia como el sistema
322 más consistente que permite, en ausencia de otras posibilidades y en el desconocimiento de la
323 etiología del proceso, tratar de controlar la enfermedad (Madec, 2008). Revisar con bibliografía

324 Actualmente, los sistemas de sanidad porcina se basan en programas de vacunación masiva de
325 lechones en las granjas afectadas, que han favorecido el control paralelo de la enfermedad, así
 12

326 como la prevención de lesiones (Chae 2012; Segalés, 2012). Teniendo en cuenta que la eficacia
327 de las vacunas dependen de los niveles de anticuerpos presentes al momento de su aplicación, se
328 manejan dos opciones como estrategias de vacunación: (i) vacunación de las hembras para una
329 transferencia pasiva de anticuerpos maternos, y (ii) vacunación de lechones para inducir una
330 respuesta inmune activa. La efectividad de la vacunación de las hembras puede ser complicada
331 por varios factores: primero, la protección que confieren los anticuerpos derivados de la madre
332 (ADM) es solamente parcial contra PCV2; segundo, estos anticuerpos contra PCV2 tienen una
333 vida corta (2 a 8 semanas) y varían considerablemente incluso entre animales del mismo grupo,
334 sin perdurar hasta las 7-15 semanas de vida que es el periodo de alto riesgo para el cuadro de
335 PMWS; y tercero, aunque los ADM poseen la capacidad de neutralización viral, ésto por sí solo,
336 no es suficiente, ya que tanto la inmunidad humoral como la inmunidad celular son esenciales
337 para poder combatir la infección contra PCV2 (Segalés, 2012).

338 La vacunación de las hembras reproductoras es importante para prevenir las infecciones
339 intrauterinas y las fallas reproductivas asociadas a PCV2 (Madson y Opriessnig, 2011), sirviendo
340 además para disminuir la cantidad de virus diseminado tanto en el calostro como en la leche
341 materna; sin embargo, no elimina completamente esta vía como fuente de infección para los
342 lechones recién nacidos (Gerber et al., 2011) ya que, si bien reduce la carga viral sistémica, la
343 protección que se obtiene es parcial (Opriessnig et al., 2008; Gerber et al., 2011). Commented [r18]: Redacción. La cita de 2008debería ir
antes de la de 2011.

344 Se cree entonces, que el rol de la enfermedad subclínica pudo haber estado subestimado durante
345 los últimos años, ya que se ha observado un efecto benéfico de las vacunas contra PCV2, en los
346 planteles con escasos problemas relacionados con PMWS, logrando un aumento significativo en
347 su productividad desde el uso comercial de vacunas contra este virus (Fraile et al., 2012).

348 La primera vacuna comercial contra PCV2 se usó inicialmente en Francia y Alemania en el año
349 2004, y en los últimos años, se ha reportado la eficacia de un total de cinco tipos de vacunas
350 comerciales bajo condiciones experimentales (Opriessnig et al., 2008; Fort et al., 2009;
351 Opriessnig et al., 2009a; Opriessnig et al., 2010; Hemann et al., 2012) y bajo condiciones de
352 campo (Segalés et al., 2009; Fraile et al., 2012). Actualmente, de estas vacunas autorizadas, a
353 nivel mundial, se mantienen solamente cuatro en el mercado Cita. Formatted: Highlight
 13

354 En un principio, Circovac® (Merial) fue introducida en el mercado para su uso sólo en hembras
355 reproductoras (dosis de 2 mL), aunque posteriormente, se aprobó también su uso en lechones,
356 utilizando una dosis más reducida (0,5 mL) (Fraile et al., 2012). Esta vacuna está compuesta por
357 un virus inactivado de PCV2a y está indicada actualmente tanto para lechones sanos mayores a
358 tres semanas de edad como para hembras sanas en edad reproductiva;: la vacunación de lechones
359 requiere una única inyección intramuscular, mientras que la vacunación de hembras requiere dos
360 inyecciones: una inmunización inicial y un refuerzo 3 semanas después (Beach y Meng, 2012).
361 Por otro lado, se encuentran también aquellas vacunas basadas en la expresión de la cápside, ya
362 que se ha descrito el potencial de esta proteína para inducir una respuesta inmune protectora
363 (Blanchard et al., 2003). Entre estas vacunas se encuentran Ingelvac CircoFLEX® (Boehringer
364 Ingelheim) y Circumvent® PCV (MSD Salud Animal) (Beach y Meng, 2012). Adicionalmente,
365 Fostera™ PCV (Zoetic) fue introducida recientemente en el mercado, y a diferencia de las
366 anteriores, consiste en un virus quimérico atenuado e inactivado, en donde el gen cap de PCV2a
367 se clonó en un esqueleto genómico de PCV1 no patogénico (Beach y Meng, 2012). Esta última,
368 se trata de una reformulación de la antigua vacuna Suvaxyn® PCV One Dose™ (FortDodge
369 Animal Health Care Inc.) y está indicada para lechones mayores a tres semanas, en la forma de
370 monodosis intramuscular para prevenir tanto la viremia como la infección.

371 VACUNAS RECOMBINANTES

372 Existen además, las vacunas que utilizan vectores vivos, las cuales tienen el potencial de inducir
373 una respuesta inmune fuerte frente a PCV2 sin el riesgo de una posible infección. Sin embargo,
374 existen algunas preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente contra el vector y su
375 interferencia con la vacunación, además del potencial de reversión a un estado virulento (Beach y
376 Meng, 2012). Teniendo en cuenta que el genoma de PCV2 tolera la inserción de por lo menos 27
377 aminoácidos en el extremo C-terminal de la proteína de la cápside, se ha propuesto la utilización
378 de vacunas basadas en el genotipo de PCV2b debido a su alta y continua prevalencia en campo
379 (Beach y Meng, 2012).

380 Con esta base, los diferentes sistemas de expresión in vitro se han centrado en la producción de la
381 proteína de la cápside como subunidad inmunogénica de PCV2, usando tanto vectores
382 bacterianos (Escherichia coli), así como vectores de virus recombinantes (baculovirus, virus de la
383 pseudorabia) (Fan et al., 2007). Aunque estos sistemas de expresión son simples y permiten altos
 14

384 rendimientos, tienen como principales limitaciones,: su alto costo, largo tiempo de producción y
385 el hecho de que las modificaciones postraduccionales no ocurren de forma correcta en todo tipo
386 de células. En contraste, los sistemas de expresión en levaduras proporcionan un mecanismo
387 alternativo para la expresión de antígenos, siendo una de las células hospedero más empleadas
388 para la producción de proteínas heterólogas, ya que permiten alta estabilidad y una efectiva
389 actividad biológica para la generación de una respuesta inmune efectiva (Toledo et al., 2008).

390 La levadura, al ser eucariota, tiene ventajas comparativas, ya que las proteínas producidas tienden
391 a ser procesadas con el plegamiento apropiado y las modificaciones químicas necesarias; incluso,
392 hay varios reportes que confirman que la levadura es capaz de mantener el auto-ensamblaje de
393 proteínas virales (Farnos et al., 2009). La proteína Cap de PCV2 derivada de levadura, se auto-
394 ensambla en partículas tipo virus que son similares morfológica y antigénicamente a las
395 partículas tipo virus derivadas de células de insecto. Adicionalmente, los cultivos de levaduras
396 son fáciles de mantener, lo cual hace que el proceso sea más eficaz, rápido y económico que otros
397 sistemas eucariotas de expresión, tales como insectos o cultivos celulares de mamíferos. Debido a
398 que las levaduras son organismo no patogénicos, no invasivos y considerados seguros, son una
399 herramienta llamativa para la entrega de antígenos y moléculas terapéuticas (Farnos et al., 2009).

400 Dentro de las levaduras, Pichia pastoris (P. pastoris) es una alternativa eficaz para la producción
401 de proteínas. Es una célula eucariota capaz de llevar a cabo muchas de las modificaciones
402 postraduccionales que realizan los eucariotas superiores; además, presenta reproducción sexual y
403 tiene la ventaja de ser más estable en su estado vegetativo haploide, lo cual facilita la selección de
404 características fenotípicas en los mutantes. Entre las ventajas para la utilización de P. pastoris Commented [r19]: Nombres científicos con cursiva.
Formatted: Font: Italic
405 como vector de expresión se encuentran: (i) el bajo costo de los medios, equipo e infraestructura
406 de los cultivos de las levaduras, (ii) el sistema de expresión de proteínas diseñado es inducido por
407 adición de metanol y generalmente es integrado al cromosoma de la levadura para ganar
408 estabilidad en la construcción genética, (iii) realiza modificaciones postraduccionales como
409 procesamiento proteolítico, doblamiento, formación de puentes disulfuro y glicosilación, (iv)
410 tienen la posibilidad de secretar de forma directa la proteína clonada, lo que significa, en términos
411 prácticos, un paso de pre-purificación y, finalmente, (v) no produce endotoxinas y por lo mismo,
412 se considera bastante seguro ((Poutou et al., 2005).
 15

413 Al ser metilotrófica, P. pastoris es capaz de utilizar el metanol como única fuente de energía, Formatted: Font: Italic

414 pudiendo usarse esto para la activación de la expresión de un gen en particular, llegando a ser uno
415 de los hospederos preferidos para la expresión de genes foráneos. Para la producción de proteínas
Formatted: Font: Italic
416 heterólogas en P. pastoris, se emplea el esquema de tres fases en cultivos de alta densidad. En la
417 primera fase, la levadura recombinante se cultiva en medios salinos suplementados con un azúcar
418 no fermentable como el glicerol (cultivo discontinuo), y una vez que éste es consumido, se inicia
419 la segunda fase de transición en la que se suministra glicerol, en cantidades que mantengan el
420 crecimiento exponencial limitado por sustrato. En la tercera fase, se adiciona metanol en
421 concentraciones limitadas, favoreciendo la expresión de la proteína recombinante. La prioridad
422 de utilización de las diferentes fuentes de carbono la tiene entonces el glicerol sobre el metanol
423 (Lekcharoensuk et al., 2004).

424 El gen de la proteína de interés puede ser insertado bajo el control del promotor aox1 lo cual
425 permite que los genes foráneos puedan ser mantenidos en un modo apagado o encendido, y así
426 inducir la producción de la proteína adicionando metanol. Esto, dado que la levadura P. pastoris Formatted: Font: Italic

427 tiene dos genes alcohol oxidasa (aox1 y aox2), que presentan un promotor fuerte inducible de
428 manera postranscripcional con metanol, y reprimidos con glucosa. El metanol es oxidado, en
429 presencia de oxígeno, por la enzima alcohol oxidasa, produciendo formaldehído y peróxido de
430 hidrógeno, pero este último es tóxico para la célula y por tanto es retenido en el peroxisoma hasta
431 que la catalasa lo convierte en agua y oxígeno (Poutou et al., 2005). Ya que P. pastoris no
432 presenta plásmidos, para llevar a cabo la recombinación homóloga con el genoma de la levadura,
433 se utilizan vectores que contienen el gen aox y el gen que codifica para la proteína de interés.
434 Además, se integra también el gen de histidina deshidrogenasa (his4) como marcador de
435 selección y complementación autotrófica; de esta forma, se producen mutantes diferentes
436 dependiendo del sitio de integración (aox1 o his respectivamente) (Kobayashi et al., 2000).

437 Estudios recientes, se han centrado entonces en la producción de proteínas de interés

438 farmacéutico bajo este sistema de expresión en P.pastoris, buscando obtener subunidades activas
439 que puedan ser empleadas en vacunas recombinantes contra PCV2 (Tu et al., 2013; Silva et al.,
440 2014; Chen et al., 2016). Teniendo en cuenta que los programas de vacunación representan hasta
441 un 50% de los costos de medicación asociados a la producción porcina, el desafío se centra en la
442 obtención de proteínas, a bajo costo, que puedan ser usadas en nuevas vacunas, que garanticen
 16

443 una elevada eficacia y protección contra PCV2 y permitan así, disminuir el impacto económico
444 en los planteles de producción.

445

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