Algunos parámetros farmacognósticos de Vernonanthura patens (Kunth) H. Rob.

(Asteraceae)
endémica de Ecuador

Some pharmacognostic parameters of native Vernonanthura patens (Kunth) H. Rob.

(Asteraceae) from Ecuador

MSc. Patricia Manzano Santana,I Dr. Tulio Orellana León,I Dra. C. Migdalia Miranda
Martínez,II Dr. C. Juan Abreu Payrol,II MSc. Omar Ruíz,I Dra. C. Esther L. Peralta GarcíaI

RESUMEN

Introducción: Vernonanthura patens (Kunth) H. Rob., arbusto originario de Sudamérica, crece

silvestre en el sur ecuatoriano; los pobladores del cantón Marcabelí, provincia del Oro, la conocen
como laritaco y utilizan las cocciones acuosas de las hojas para lavar y cicatrizar las heridas, calmar
el dolor de cabeza, como antiinflamatorio, calmar la tos y combatir ciertos tipos de cáncer. Las
investigaciones biológicas preliminares realizadas han demostrado una buena actividad antimalárica
y antileishmaniasis. No existen, sin embargo, antecedentes de otras investigaciones farmacológicas
ni químicas para la especie. Objetivo: determinar los parámetros físico-químicos de calidad de las
flores, hojas y ramas de la especie en estado de fructificación, y los metabolitos secundarios presentes
en estos órganos vegetales a través del tamizaje fitoquímico. Métodos: la planta se recolectó en
estado adulto, en época de floración, los órganos vegetales secados en estufa se molinaron hasta
tamaño de partícula 2 mm. Los índices numéricos se determinaron según la norma ramal de salud
pública 309 de 1992, y el tamizaje fitoquímico se realizó según metodología analítica
de Miranda y Cuéllar. Se utilizó estadística descriptiva básica para determinar el comportamiento
estadístico de los datos (medidas de tendencia central y dispersión). Para obtener diferencias
estadísticas significativas, se utilizó el análisis de varianza y la prueba a posteriori de Tukey. Se usó
el análisis multivariado de componentes principales para determinar, a través de un biplot, las
relaciones multivariadas entre los parámetros de estudio. Para este análisis se usó la versión 2010 de
InfoStat Softwware, del Grupo InfoStat FCA, de la Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina. Resultados: se encontraron diferencias significativas para algunos índices numéricos y en
los resultados del tamizaje fitoquímico entre los diferentes órganos vegetativos. Conclusiones: las
flores en términos generales presentan mayor porcentaje de sustancias solubles en agua y alcohol,
menor humedad residual y mayor abundancia en metabolitos secundarios que las hojas y tallos.

INTRODUCCIÓN Vernonanthura es uno de los géneros de la subfamilia Cichorioideae, descrito

por Robinson en 1992, que cuenta con 65 especies, distribuidas a través de México, las Antillas,
América Central y del Sur.1,2

Una de las especies de este género, Vernonanthura patens (Kunth) H. Rob., crece espontáneamente
en Ecuador y las decocciones de sus hojas son empleadas en la medicina folclórica para combatir el
paludismo, los dolores estomacales y de parto; las erupciones en la piel, las diarreas y como
antihelmíntico; en otras localidades se emplea para lavar heridas, aliviar el dolor de cabeza; como
antiinflamatorio, antitusivo y para tratar ciertos tipos de cáncer.3,4 También se informa su uso en
leishmaniasis5 y para combatir el pie de atleta.6 A pesar de los usos tradicionales, son muy escasos
los estudios químicos que se han realizado sobre esta especie, solo se referencia la ausencia de
lactonas sesquiterpénicas y la presencia de hidrocarburos sesquiterpenos en las partes
aéreas.7,8 Respecto a su actividad biológica, se reporta la actividad antimalárica de los extractos
acuosos contra Plasmodium falciparum9 y la ausencia de actividad antiprotozoaria frente a diferentes
cepas de leihmania,10pero ninguno de estos estudios se ha realizado a la especie que crece en Ecuador.

Teniendo en cuenta los antecedentes químicos informados para las partes aéreas de la especie y el
hecho de que las condiciones ecológico geográficas pueden producir cambios en la composición y
por ende en las propiedades de la especie, es que en este trabajo nos planteamos como objetivo,
determinar a través del tamizaje fitoquìmico los parámetros de calidad de diferentes órganos
vegetativos aéreos de la especie (flores, hojas y ramas) en estado de fructificación, así como los
metabolitos secundarios presentes. Este estudio constituye el primer reporte de estos parámetros para
la especie que crece en Ecuador.

MÉTODOS Se trabajó con flores, hojas y tallos de plantas adultas de Vernonanthura

patens (laritaco) en estado vegetativo de floración, recolectadas en horas de la mañana en el mes de
julio de 2011, en las ciudadelas 25 de Julio, Imbabura y 24 de Junio del cantón Marcabelí, provincia
del Oro, Ecuador.

Una muestra del material vegetal se tomó para la identificación botánica, que fue herborizada en el
Herbario Nacional del Ecuador QCNE Quito, conservando un testigo herbario (CIBE37) en el
laboratorio de Bioproductos del Centro de Investigaciones Biotecnológicas (CIBE). Escuela Superior
Politécnica del Litoral. Guayaquil, Ecuador (ESPOL), Guayaquil, Ecuador.

El material vegetal se secó en estufa con recirculación de aire a temperatura de 45 ºC por 48 h; a

continuación cada órgano vegetal por separado se pulverizó en un molino de cuchillas y se tamizó a
tamaño de partícula de 2 mm de diámetro, según lo recomendado en las normas internacionales.11,12
Los parámetros físico-químicos determinados fueron: humedad residual, cenizas totales, insolubles
en HCl y solubles en agua, así como sustancias solubles en agua y en alcohol. Para ello se siguieron
los procedimientos establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS) 13 y en las normas
ramales de salud pública (NRSP) 30914. Los resultados de los parámetros físico-químicos se
procesaron mediante estadística descriptiva básica, para determinar las medidas de tendencia central
y dispersión, así como el análisis de varianza y la prueba a posteriori de Tukey para obtener
diferencias significativas. Se utilizó además, el análisis multivariado de componentes principales,
para determina, a través de un biplot, las relaciones multivariadas entre los parámetros de estudio.
Para este análisis se utilizó el software InfoStat versión 2010, del Grupo InfoStat FCA, Universidad
Nacional de Córdova, Argentina. Se realizó también el tamizaje fitoquìmico a los 3 órganos vegetales,
el procedimiento seguido fue el propuesto por Miranda y Cuéllar.11

RESULTADOS En la tabla 1 se exponen los valores obtenidos en porcentaje, para los parámetros
físico-químicos estudiados en los diferentes órganos vegetales. En las figuras 1 y 2 se refleja el
análisis estadístico de los parámetros físico-químicos evaluados a los diferentes órganos vegetales
de V. patens.

Los resultados del tamizaje fitoquímico hecho a las partes aéreas de la especie en estado vegetativo
de floración se presentan en la tabla 2.Tabla 2. Resultados del tamizaje fitoquímico realizado a las
hojas, floresy tallos de Vernonanthura patens, en estado vegetativo de floración

Estado vegetativo floración

Metabolito
Hojas Tallos Flores
Extracto etéreo
Alcaloides - - -
Lactonas y coumarinas - - -
Triterpenos y esteroides + + +
Extracto alcohólico
Catequinas + + ++
Compuestos reductores - - +
Lactonas - ± +
 Triterpenos y esteroides + + +
Saponinas - - -
Fenoles y taninos +verde +verde +verde
Aminoácidos ± ± +
Quinonas - - -
Flavonoides - +amarillo +amarillo
Antocianidinas - - -
Alcaloides - - -
Resinas - - -
Extracto acuoso
Alcaloides - - -
Taninos +azul +vino +verde
Flavonoides +rojo +amarillo +rojo
Compuestos reductores - - +
Saponinas - - ++
Mucílagos - - -

DISCUSIÓN De los parámetros físico-químicos evaluados a los diferentes órganos de la especie

(tabla 1), se pudo determinar que el porcentaje de humedad residual se encontró en todos los casos
dentro de los límites que establecen las normas internacionales (8-14 %), lo cual garantiza una mayor
conservación de la droga.13

Las cenizas totales mostraron valores entre 6,4 y 11,0 %, por debajo de 12 % que se señala como
límite superior,14 lo cual está en dependencia de la composición en minerales del suelo donde se
desarrolla la especie. Las cenizas insolubles en ácido clorhídrico estuvieron en un rango entre 0,03 y
4,3, este último algo elevado para drogas vegetales.12

Las cenizas solubles en agua, indicativas de la presencia de metales alcalinos y alcalinos térreos, se
presentaron en un rango entre 1,1 y 2,8, aceptables para drogas vegetales.12 Por último, las sustancias
solubles determinadas en agua (por ser el disolvente empleado en medicina tradicional) y etanol, por
emplearse por lo general en las extracciones con disolventes para estudios químicos, presentaron
valores entre 3,1 y 6,1, así como 0,8 y 2,1, respectivamente.

Se observó que en las hojas se produce la mayor acumulación de humedad residual y de cenizas
totales e insolubles en ácido clorhídrico, y la menor acumulación de cenizas solubles en agua y de
sustancias solubles en etanol. Estos resultados podrían estar relacionados con diversos factores
ambientales, entre los cuales cabe destacar la composición del suelo, la pluviosidad, la luz y la
temperatura a la que están expuestas las plantas en el proceso de transporte de agua y nutrientes de la
raíz a las hojas.15 Eso cual hace a este órgano vegetal más susceptible a degradaciones enzimáticas y
microbianas e impone la necesidad de estudiar la composición de las cenizas insolubles para delimitar
la presencia de metales pesados.

De los órganos estudiados, las flores presentaron un menor contenido en cenizas insolubles en ácido
clorhídrico y un mayor contenido en sustancias solubles en agua y en etanol. En el estudio fitoquímico
realizado se detectó la posible presencia de catequinas, lactonas, triterpenos-esteroides, fenoles y
taninos, aminoácidos, saponinas y flavonoides; sin embargo, se observaron diferencias en las
intensidades y la coloración de la reacción respecto al órgano vegetal.

En el caso de las flores, las catequinas, lactonas, aminoácidos, compuestos reductores y saponinas,
parecen estar en mayor concentración. Para las hojas, las saponinas, lactonas y compuestos
reductores, resultaron negativos y para los tallos las saponinas y compuestos reductores. Estos
resultados pudieran justificar los mayores valores de sustancias solubles encontrados para las flores
con respecto a hojas y tallos.

Como conclusiones del trabajo, se determinaron los parámetros físico-químicos de los diferentes
órganos vegetales y se encontraron diferencias significativas entre estos; las flores, en términos
generales, son las que presentan mayor porcentaje de sustancias solubles en agua y alcohol, y menor
humedad residual. Como componentes de la especie en general, parecen existir compuestos fenólicos
y triterpenoides, los cuales son más abundantes en las flores. Estos resultados se informan por primera
vez para la especie y en particular para la que crece en Ecuador
http://bvs.sld.cu/revistas/pla/vol18_1_13/pla15113.htm

Los principales fitopatógenos y cepas del cacao (Theobroma cacao L.) se diferencian por los
perfiles de lípidos y / o péptidos / proteínas MALDI-MS

Resumen Los fitopatógenos son los principales agentes de la enfermedad que promueven el ataque
de las plantaciones de cacao en todos los países tropicales. La similitud de los síntomas causados por
diferentes fitopatógenos hace que la identificación de las personas sea un desafío. La identificación
correcta es importante en el monitoreo y la gestión de las pestañas. Se demostró que la espectrometría
de masas por ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-MS) en combinación con
análisis de datos multivariantes es capaz de diferenciar de manera rápida y confiable fitopatógenos
de cacao, principalmente Moniliophthora perniciosa, Phytophthora palmivora, P. capsici, P.
citrophthora, P. heveae, Ceratocystis cacaofunesta, C. paradoxa y C. fimbriata. MALDI-MS revela
perfiles únicos de péptidos / proteínas y lípidos que diferencian estos estafitopatógenos en el nivel de
genus, especies y escamas procedentes de diferentes tejidos o tejidos de cococoa recolectados en
varias plantaciones / lugares. Esta metodología rápida basada en biomarcadores moleculares también
se muestra suficientemente reproducible y selectiva y, por lo tanto, parece ser una herramienta
adecuada para guiar la aplicación correcta de enfoques de defensa sanitaria para plantaciones de cacao
infectadas. La comercialización internacional de plantas y productos de cacao también podría ser
monitoreada de manera eficiente por MALDI-MS. Podría, Por ejemplo, evitar la entrada de nuevos
fitopatógenos en un país, por ejemplo, como en el caso del hongo Moniliophthora roreri que está
presente en todas las plantaciones de cacao de los países que limitan con Brasil, pero que aún no ha
atacado las plantaciones brasileñas.

Introducción El chocolate es muy apreciado en todo el mundo, pero su suministro está

constantemente en riesgo por el clima extremo, las plagas y muchas enfermedades que atacan las
plantaciones de cacao (Theobroma cacao L.) [1]. Tales enfermedades son responsables de pérdidas
de hasta el 40% de la producción mundial de cacao. Las enfermedades más importantes desde el
punto de vista económico son causadas por fitopatógenos, conocidos como escoba de bruja, pudrición
de vaina helada, Phytophthora pod rot o Ceratocystis wilt [1, 2]. La escoba de las brujas es causada
por Moniliophthora perniciosafungus, que tiene un efecto patógeno muy elevado en el árbol de cocos
y en sus frutos, y puede presentar una acumulación de hasta el 90% de la producción [3]. La pudrición
de la vaina helada es causada por el hongo Moniliophthora roreri que se encuentra en todos los países
del noroeste de América del Sur, causando pérdidas significativas en la producción [4]. Phytophthora
pod podredumbre es causada por el género Phytophthora spp., Perteneciente a la cultura
delStraminipila.Países tropicales, las especies principales son P. palmivora, P. capsici, P.
citrophthora, P. megakarya y P. heveae, de las cuales P. citrophthora y P. palmivora son los más
frecuentes y agresivos [5]. Ceratocystis cacaofunesta es un hongo que causa la marchitez por
Ceratocystis, una enfermedad que causa la marchitez y la muerte de la planta de cacao.

En el advenimiento de un ataque a una plantación de cacao, la identificación confiable de especies

específicas de fitopatógenos es de gran importancia para orientar la correcta aplicación de enfoques
de defensa sanitaria, como el control biológico y la aplicación de fungicidas [7]. Tradicionalmente,
los agentes causales se identifican por los síntomas en las plantas y las frutas junto con los enfoques
morfológicos basados en el cultivo. Pero la similitud de los síntomas causados por diferentes
fitopatógenos hace que la identificación precisa de las cepas sea un gran desafío. Los métodos basados
en la cultura también requieren tiempos de cultivo relativamente largos que pueden variar de día a
semanas. También se necesitan altos niveles de experiencia taxonómica y capacitación profesional
para detectar los patrones morfológicos y, en ocasiones, olores específicos. Para identificar los
fitopatógenos del cacao, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es una metodología basada
en la secuenciación de ADN / ARN, se ha utilizado ampliamente [8-15]. Considerando que la PCR
proporciona una identificación mucho más precisa que las de las evaluaciones morfológicas, es
bastante lento y también requiere profesionales expertos [16]. Los datos de la secuencia basada en el
ADN han permitido apoyar sólidamente límites muy definidos definidos por características
morfológicas y diferencias ecológicas, pero la diferenciación de muchos grupos de hongos del género
Ceratocystis sigue siendo un tema de debate debido a sus morfologías bastante similares [15]. Más
recientemente, la espectrometría de masas (MS) se ha introducido como una nueva herramienta en la
identificación de microorganismos [17-19]. La EM se ha aceptado rápidamente en este campo, ya que
se descubrió que proporciona una identificación rápida, confiable y completa de muchos tipos de
microorganismos que superan la necesidad de procedimientos laboriosos. Para la ionización, se ha
demostrado que la desorción-ionización asistida por matriz (MALDI) proporciona la técnica más
reproducible y completa que se utiliza para bacterias [20-23], cianobacterias [24, 25], virus [26, 27],
protozoos [28, 29], levadura [23, 30, 31] y hongos en diferentes niveles taxonómicos [32-38]. La
identificación de MALDI-MS de microorganismos se basa en huellas digitales exclusivas de péptidos
/ proteínas y lípidos que se almacenan en bibliotecas de bases de datos y se comparan con las de las
incógnitas mediante análisis de datos multivariados. Con respecto a las cáscaras de células duras, los
hongos y los hongos han sido un desafío para la identificación de MALDI-MS, ya que requieren
muchos protocolos elaborados en colaboración con los componentes intracelulares [19]. Por lo tanto,
se han publicado relativamente pocos estudios sobre la toma de huellas dactilares MALDI-MS de
hongos, aunque se ha realizado algún progreso para especies como Fusarium [32, 33, 38], Candida
[34], Aspergillus [35, 38], Verticillium [36] y Trichoderma [37]. Aquí, usando fitopatógenos en cepas
individuales procedentes de diferentes hospedadores o tejidos vegetales que atacan las plantaciones
de cacao de Brasil como un caso de prueba, describimos un protocolo optimizado de MALDI-MS
para la identificación de microorganismos. Mostramos que la metodología parece ofrecer una
herramienta rápida, reproducible y selectiva basada en biomarcadores moleculares capaces de
distinguir fitopatógenos del cacao.

Materiales y métodos Productos químicos Los disolventes fueron acetonitrilo (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO), metanol (Burdik y Jackson, Muskegon, MI), cloroformo (Burdik y Jackson, Muskegon,
MI) y 2-propanol (Burdik y Jackson, Muskegon, MI) . Las soluciones fueron ácido trifluoracético
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y ácido fórmico (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). El agua ultrapura
utilizada para la preparación de extractos fue purificada por el sistema de agua Direct-Q (Millipore,
Bedford, MA). La matriz MALDI fue ácido α-ciano-4hidroxicinámico (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO), ácido sinapínico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 6-aza-2tiotamina (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO ), 2,6dihidroxiacetofenona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y ácido 2,5-dihidroxibenzoico
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Estándares de fosfolípidos, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-
fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3phospho-rac- (1-glicerol) (DMPG), 1,2-
dipalmitoil-snglycero Sal monosódica de 3-fosfato (DPPA) y sal sódica de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-
3-fosfo-L-serina (DPPS) se obtuvieron de Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL, EE.UU.).

Cepas y crecimiento de fitopatógenos Cultivos puros de Moniliophthora perniciosa, Phytophthora

palmivora, P. citrophthora, P. heveae, P. capsici, Ceratocystis cacaofunesta, C. paradoxa y C. Se
obtuvieron fimbriata de la colección de fitopatógenos del Centro de Investigación del Cacao
(CEPLAC / CEPEC) Ilhéus, Bahía, Brasil. Los aislados de M. perniciosa se cultivaron en medio de
agar de dextrosa de patata (PDA) en placas de Petri de 90 mm a 25 ° C durante 5 días. Los aislados
de especies Phytophthora se cultivaron en medio de agar zanahoria en placas de Petri de 90 mm a 25
° C durante 10 días. Ceratocystis especies aisladas se cultivaron en medio PDA en placas de Petri de
90 mm a 22 ° C durante 10 días.

Preparación de muestras y análisis MALDI-MS Procedimiento de extracción de péptidos /

proteínas En primer lugar, intentamos establecer un protocolo óptimo para la diferenciación rápida
de cepas de fitopatógenos probando cuatro métodos diferentes de extracción de péptido / proteína y
cuatro matrices MALDI, a saber, ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), ácido sinapínico (SA),
6- aza-2-thiothymine (ATT), y 2,6dihydroxyacetophenone (DHAP). El péptido / proteína muestras
de deformación individual. La eficacia de la extracción de péptidos / proteínas de cepas fitopatógenas
de cacao se probó usando estos diferentes métodos:

Método ACN / FA A. Las superficies de las colonias se rasparon usando un bisturí estéril, y el micelio
se suspendió en 100 μL de FA / ACN al 70% (1: 1, v / v) seguido de 1 minuto de agitación vorticial.
La mezcla se centrifugó a 13,000 xg durante 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a un microtubo.
Método ACN / TFA B. Las superficies de las colonias se rasparon usando un bisturí estéril, y el
micelio se suspendió en 50 μL 80% de TFA y se homogeneizó durante 30 min a 1000 rpm para
romper la pared celular del patógeno. Luego, se añadieron 100 μL de agua Milli-Q seguido de 150
μL de ACN. La mezcla se centrifugó a 13,000 xg durante 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a
un microtubo. Este método fue adaptado del método de extracción de aislamientos de Fusarium [17].
Método IPA / FA C. Las superficies de las colonias se rasparon usando un bisturí estéril, y el micelio
se suspendió en 50 μl al 70% de FA y se homogeneizó durante 30 minutos a 1000 rpm. Luego, se
añadieron 100 μL de agua Milli-Q seguido de 50 μL de IPA. La mezcla se centrifugó a 13,000 xg
durante 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a un microtubo. Método MeOH / FA D. Las
superficies de las colonias se rasparon usando un bisturí estéril, y los micelios se suspendieron en 50
μl al 70% de FA y se homogeneizaron durante 30 minutos a 1000 rpm. Luego se añadieron 100 μL
de agua Milli-Q seguido de 150 μL de MeOH. La mezcla se centrifugó a 13,000 xg durante 5 minutos
y el sobrenadante se transfirió a un microtubo.

Los sobrenadantes de cada uno de estos cuatro métodos se detectaron (1 μl de gotita) en una placa
MALDI (Bruker-Daltonik GmbH, Bremen, Alemania) y luego se secaron al aire. Luego, se observó
1 μL de solución de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) sobre la muestra seca y se
depositó 1 μL de extracto de proteína DH5-alfa Escherichia coli (Bruker-Daltonik GmbH) en el punto
de calibración de la placa para calibración externa.CHCAmatrixsolutionwaspreparedaconcentration
de50mgmL-1 en (1: 1) ACN / agua con 0.1% TFA, SAmatrix fue preparado a 30 mg mL-1 en (7: 3)
ACN / agua con 0.1% TFA, la matriz ATT fue preparada en 10 mg mL-1 en (1: 1) ACN / agua con
0.1% de TFA, y la matriz de DHPA se preparó a 10 mg mL-1 en (1: 1) ACN / agua con 0.1% de TFA.

Procedimiento de extracción de lípidos Procedimiento de extracción de lípidosSe usó el método

elegido por Bligh y Dyer [41]. Brevemente, las superficies de las colonias están grabadas usando
bisturí de agua,y el micela se suspendió en 150 μl de amicrotubo de aguaMilli-Qin. Luego, se
añadieron 190 μl de cloroformo y 375 μL de metanol y la mezcla se sometió a vortex durante 5
minutos a 1000 rpm. Luego, se añadieron 190 μL de cloroformo y 150 μL de agua Milli-Q y se
agitaron vorticialmente durante 1 minuto, y la mezcla se centrifugó a 14,000 × g durante 5 min para
inducir la separación de fases.La capa orgánica baja se recogió, concentró utilizando un aparato
Speed-Vac y se reconstituyó en 100 μL de una solución de cloroformo / metanol (1: 1). La mezcla
fue luego manchada (1 μl de gotita) sobre una placa MALDI y luego secada al aire. Luego, se preparó
1 μL de la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB), preparada para la concentración de 10 mg /
L-1 en MeOH, sobre la muestra seca. La calibración de MS se realizó usando una mezcla de
fosfolípidos compuesta por DOPE, DMPG, DPPA y DPPS para el análisis de lípidos.

Datos de MS MALDI-MS se realizó en un espectrómetro de masas Bruker Autoflex III MALDI-

TOF / TOF equipado con un 334nmsmartbeamlaser.Peptide / proteinprofileswecquired en el modo
lineal TOF y en el modo de ion positivo con una extracción retrasada de 260 ns a 20 kV de voltaje de
aceleración. Los perfiles lipídicos se adquirieron en el modo reflector TOF y en el modo ion positivo.
Cada espectro se recolectó manualmente como un promedio de 5000 disparos de láser (1000 disparos
de láser en cinco posiciones de puntos diferentes). La energía láser se estableció justo por encima del
umbral para la producción de iones. Se usó un rango de m / z2000-20,000 o m / z 600-1000 para las
huellas digitales de péptido / proteína o lípidos, respectivamente. Los espectros se adquirieron por
triplicado a través de la herramienta AutoExecute del software de adquisición Flexcontrol (versión
2.4, Bruker-Daltonik GmbH). El análisis de los datos MALDI se realizó a través de tres pasos
distintos: (1) preprocesamiento, (2) procesamiento y (3) análisis estadístico. Los espectros crudos se
preprocesaron en el software FlexAnalysis (BrukerDaltonik) después de la resta de referencia para la
eliminación de fondo, la alineación de la escala de espectros, la selección de iones con una relación
S / N superior a 3 y la normalización de las intensidades.

Análisis multivariante de datos de MALDI-MS El procesamiento de los datos se realizó antes del
análisis multivariable para los perfiles de lípidos y péptidos / proteínas MS utilizando el
MetaboAnalyst 3.0 (software de versión). Los archivos cargados comprendían una lista de picos de
iones (m / z) e intensidades. El procesamiento de datos aplicó una comprobación de integridad, una
comprobación de valor perdido, un filtro de datos y una normalización de la estadística forestal. Las
realinearon con una tolerancia de m / z 10 (10 Da) para péptido / proteínas y 0.4 Da para lípidos para
eliminar iones que aparecen en menos de la mitad del muestras en cada grupo. Se verificó la presencia
de valores o características faltantes con valores constantes (es decir, todos ceros) y se aplicaron
filtros de datos utilizando desviación estándar (SD) para eliminar variables cercanas a la línea de base
o detección limite como variables que son valores casi constantes. La normalización por suma se usó
para el ajuste por diferencias entre muestras y autoescalado (centrado en la media y dividido por la
desviación estándar de cada variable) para hacer que las características individuales sean
máscomparables.Absolutamente no se aplicaron los enfoques estadísticos supervisados y
supervisados. Análisis principal de PCA, análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales
(PLS-DA) , y se realizó un análisis de cloro jerárquico (HCA) en los datos utilizando MetaboAnalyst
para discriminar las cepas de muestras de fitopatógenos en base a sus huellas dactilares MALDI-TOF
MS. En el análisis jerárquico de conglomerados, el algoritmo de Ward y la distancia euclidiana se
usaron para la agrupación de muestras.

Resultados y discusión Optimización de extracción de péptidos / proteínas y matriz MALDI En

primer lugar, la extracción con el método A de ACN / FA, aplicado tradicionalmente a las bacterias,
se probó para todos los fitopatógenos (ver Material Suplementario Electrónico (ESM) Fig. S1). Sin
embargo, este método de extracción proporcionó pocos iones MALDI-MS en su mayoría de baja
abundancia. Por lo tanto, se probaron otros tres métodos. La mejor MALDI-MS según el número y
la abundancia de iones se obtuvo al aplicar el método ACN / TFA B independientemente de la matriz
MALDI utilizada, y por lo tanto se seleccionó para caracterizar todas las cepas fitopatógenas del
cacao. A continuación, se probaron cuatro matrices MALDI diferentes (CHCA, SA, ATT y DHAP)
comúnmente usadas para péptido / proteína. CHCA proporcionó por mucho el mejor espectro de
MALDI sobre el rango de interés masivo (2-10 kDa, ESM Fig. S2) y, por lo tanto, fue seleccionado
Identificación MALDI-MS basada en huellas digitales de péptidos / proteínas

La Figura 1a muestra los perfiles MALDI-MS muy característicos de tres géneros diferentes que
muestran cada uno un ion único y más abundante de m / z 4878 para Moniliophthoraperniciosa, m /
z 7234 para Ceratocystis cacaofunesta ym / z 5328 para Phytophthora palmivora. Por lo tanto, se
descubrió que la toma de huellas dactilares de MALDI-MS proporciona iones biomarcador distintivos
que pueden usarse para la diferenciación de género y especie. La diferenciación del género es
importante; sin embargo, se esperan diferencias más sutiles de fitopatógenos que pertenecen al mismo
género pero especies diferentes. La Figura 1b muestra el MALDI-MS de muestras del mismo género
Phytophthora pero diferentes especies, a saber, P. citrophthora, P. palmivora, P. capsici, y P. Heveae.
Afortunadamente, MALDI-MS también pudo tratar con estas especies proporcionando espectros
bastante distintos. Se detectaron iones comunes de m / z 3698, 6271 y 6374 para los cuatro.

La especie y estas funciones se parecen a la mitad de este gen, pero aparecieron una serie de iones
distintivos en los perfiles de péptido / proteína de cada especie. Esta diferenciación es relevante ya
que las especies de Phytophthora son muy difíciles de reconocer por morfología. Tenga en cuenta
que, además del cacao, las especies de Phytophthora también causan enfermedades graves en otros
cultivos como cítricos, tomate y papa, por lo que la aplicación de DMALDI-MSfinger también se
puede aplicar como método general para esta especie de fitopatógenos. Una pregunta importante en
términos de diferenciación fitopatógena sería la influencia del anfitrión y los lugares. La Figura 1c
muestra diferentes cepas de P. palmivora obtenidas de dos huéspedes diferentes, a saber, Theobroma
cacao y Carica papaya, recolectados en diferentes lugares. Para nuestra sorpresa, MALDI-MS fue
capaz de llevar a cabo tareas desafiantes, ya que proporcionaba pocos espectros para trenes aislados
del mismo host, pero contrastando los espectros de cepas de dos hosts diferentes. De hecho, se
recogieron perfiles MALDI-MS de péptido / proteína muy contrastantes para otros casos de
hospedadores indiferentes de especies diferentes, concretamente para cepas de aislados de P.capsici
de T.cacao o Hevea brasiliensis (ESMFig.S3), P.citrophthoraisolates fromT.cacagrowing en
diferentes lugares (ESM Fig. S4), y P. heveae aislamientos de suelo de diferentes lugares y rizosferas
(ESM Fig. S5). Otra cuestión importante en términos de diferenciación fitopatógena sería la
influencia del huésped en las especies y cepas. La Figura 2 muestra la MALDI-MS para casos tan
desafiantes, concretamente para tres especies diferentes del género Ceratocystis recogidas de
diferentes especies y / o cepas, a saber, cepas de C. paradoxa recogidas de Cocos nucifera (2A y 2B),
C. fimbriata recogidas de Eucalyptus spp. (2C y 2D), y Heveabrasiliensis (2E y 2F) y C.caca
deunestablecido deT.cacao (Tabla 1) .AsFig. 2 muestra claramente, muy similares a los espectros,
que muestran indicios de poca influencia de ondas y trenzas en los perfiles MALDI-MS. Esto podría
ser un resultado importante que confiere alta confianza para la identificación de género y especie
mediante MALDI-MS, es decir, se predice MALDI-MS similar independientemente de la
especificidad o cepa. Pero aquí se observó relativamente baja calidad de todos los espectros en la
figura 2, con pocos iones, lo que podría haber restringido la disección del huésped. El MALDI-MS
de baja calidad parece ser una peculiaridad del género Ceratocystis, que es bastante negro debido a
un pigmento oscuro, y dicho pigmento puede comprometer la ionización al absorber la
tetradiotradioterapia utilizada para la desorción e ionización en MALDI. Otro caso desafiante en el
que se probó la capacidad de las huellas dactilares de MALDIMS fue distinguir diferentes cepas de
la misma especie que crecen en diferentes partes de la planta. La composición molecular variable
podría tomarse las huellas dactilares ya que la misma especie podría exhibir propiedades biológicas
distintivas y agresividad en función de la parte de la planta. Aquí, también se ha encontrado que los
fitopatógenos producen diferentes metabolitos dependiendo de la parte de las plantas en las que ellos
crecen. La Figura 3 muestra la MALDI-MS de M. perniciosa recogida del tallo o la fruta de T. cacao.
Los dos espectros muestran un perfil similar con los principales iones de m / z 2857 y 4877
característicos de la especie M. perniciosa, pero también diferencias bastante contrastadas en las
abundancias para varios iones como los de m / z 2032, 2319, 2646 y 2783 probablemente resultante
de hongos que crecen en diferentes partes de la planta.

Huellas dactilares de lípidos En términos de identificación de microorganismos, MALDI-MSismore

es capaz de proporcionar huellas digitales de péptidos / proteínas, pero esta técnica de MS también
es una herramienta útil para el análisis de lípidos [39, 40]. Por lo tanto, probamos la capacidad de
MALDI-MS a través de la identificación de los lípidos para diferenciar los mismos casos probados
en términos de perfiles de péptidos / proteínas. De hecho, como se ilustra en la figura 4a yb, se
obtuvieron perfiles de lípidos bastante contrastantes y estas características permitieron la
caracterización del género (figura 4a) y de las especies (figura 4b). Incluso diferentes huéspedes y
cepas podrían separarse pero con diferencias menos pronunciadas en comparación con el análisis de
péptido / proteína (ESM, Figs. S6 y S7).

Análisis de datos multivariados Por lo tanto, se realizó un análisis de datos multivariados basado
en la herramienta quimiométrica proporcionada por HCA para confirmar el rendimiento del método
de MALDI-MS optimizado descrito aquí tanto para los perfiles de lípidos como de péptidos /
proteínas. HCA es un método no supervisado para buscar representaciones de los datos completos en
grupos bien separados llamados clusters. De hecho, como ya se sugirió la inspección visual, se
observaron similitudes pronunciadas entre cada muestra y distancias considerables entre cada grupo
a través del HCA cuando se aplicaron al péptido / proteínaMALDI-MSprofiles (Fig. 5). El tratamiento
con datos HCA confirmó que MALDI-MS es capaz para distinguir las cepas de fitopatógenos
probadas en términos de género, especie, huéspedes y partes de la planta. NotethatstrainsofC.
Citrophthoraareseparatedinto dos cúmulos más distantes desde que fueron recolectados en
plantaciones de cacao de regiones contrastantes, es decir, Recôncavo y el sur de Bahía. En estas
regiones, las plantaciones tienen diferentes clones de cacao con distinta tolerancia a los fitopatógenos.
Las cepas de P. palmivora también se separan en dos grupos diferentes debido a la influencia del
huésped, a saber, Theobroma cacao o Carica papaya. Se encontró que las cepas de P. heveae estaban
muy influenciadas por el huésped, las partes de la planta y los lugares, lo que provocó la separación
en tres grupos. Para las cepas de P. capsici, el hábitat tenía una influencia importante en la separación
del conglomerado pero las partes y lugares de la planta tenían una influencia menor. Las especies de
Ceratocystis mostraron un número diferente de conglomerados debido a la influencia del huésped,
las partes de la planta y el lugar. Las cepas de C. paradoxa se agruparon en un grupo dado que las
cepas pertenecen al mismo huésped, partes de plantas similares y la región de las plantaciones. Se
recolectaron cepas de C. fimbriata de dos hospedadores, a saber, Eucalyptus y Heveabrasiliensis, y
dos partes de la planta, tallo y tallo de la hoja, formando dos racimos. C.cacao funesta formó clusters
más similares ya que son largos para el mismo huésped, pero diferentes partes de la planta. dos
cúmulos más distantes desde que fueron recolectados en plantaciones de cacao de regiones
contrastantes, es decir, Recôncavo y el sur de Bahía. En estas regiones, las plantaciones tienen
diferentes clones de cacao con distinta tolerancia a los fitopatógenos. Las cepas de P. palmivora
también se separan en dos grupos diferentes debido a la influencia del huésped, a saber, Theobroma
cacao o Carica papaya. Se encontró que las cepas de P. heveae estaban muy influenciadas por el
huésped, las partes de la planta y los lugares, lo que provocó la separación en tres grupos. Para las
cepas de P. capsici, el hábitat tenía una influencia importante en la separación del conglomerado pero
las partes y lugares de la planta tenían una influencia menor. Las especies de Ceratocystis mostraron
un número diferente de conglomerados debido a la influencia del huésped, las partes de la planta y el
lugar. Las cepas de C. paradoxa se agruparon en un grupo dado que las cepas pertenecen al mismo
huésped, partes de plantas similares y la región de las plantaciones. Se recolectaron cepas de C.
fimbriata de dos hospedadores, a saber, Eucalyptus y Heveabrasiliensis, y dos partes de la planta,
tallo y tallo de la hoja, formando dos racimos. C.cacaofunesta formó clústers más similares ya que
son largos para el mismo huésped, pero diferentes partes de la planta. Cuando se aplicó al perfil
lipídico, el HCA también fue capaz de distinguir entre el género, la especie y las cepas (Fig. 6)
recogidos en diferentes lugares, pero se produjeron varias superposiciones con respecto a las partes
del huésped y la planta. La clasificación de los conglomerados según las especies y cepas también se
observó en la gráfica PLS-DA obtenida de péptidos / proteínas (ver ESM, figuras S8, S9, S10 y S11)
y lípidos (véase ESM, Figs.S12, S13, S14 , S15 y S16) .PLS-DA es un método supervisado que usa
técnicas de regresión multivariante para extraer mediante la combinación lineal de iones pico
(variables) la información que puede predecir la clase de cepas, especies y género (casos). Se
realizaron pruebas de permutación basadas en la precisión de predicción durante el entrenamiento y
en la distancia de separación para evaluar la discriminación de clase para el péptido / proteína (ESM
Fig. S17) y el lípido (ESM Fig. S18). Los datos se permutaron 2000 veces como Q2 y R2Y se
utilizaron como criterio de calidad de ajuste. Por lo general, se considera que Q2 es un buen modelo
de clasificación ya que este parámetro se basa en una evaluación del error entre las variables predichas
y conocidas. La prueba de permutación aplicada a los datos de péptido / proteína reveló un valor de
Q2 de 0.894 y R2Y de 0.915 (p <5 × 10-4), mientras que la prueba de permutación aplicada a los
datos de lípidos reveló un Q2 de 0.704 y R2Y de 0.789 (p <5 × 10-4) (ESM Fig. S19). Validación
cruzada (CV) de los modelos PLS-DA por leave-one-ou (LOO) o 10 veces lograron cinco
componentes para un rendimiento óptimo a partir de datos de péptidos / proteínas y lípidos (ESM Fig.
S17 y S18). La clasificación de bosque aleatorio, que es un algoritmo de aprendizaje supervisado
adecuado para el análisis de datos de alta dimensión, también se aplicó a la predicción de clase basada
en el voto mayoritario del error por la prueba OOB (out-of-bag). La Figura S20 en el ME muestra los
errores acumulativos de los análisis de la selva aleatorios para un conjunto de árboles de clasificación,
cada uno de los cuales se cultiva mediante la selección de características aleatorias de una muestra de
arranque en cada rama. El error OOB de cada clase, es decir, Moniliophthora perniciosa (12%),
Phytophthora palmivora (6%), P. capsici (16%), P. citrophthora (21%), P. heveae (8%), Ceratocystis
cacaofunesta ( 27%), C. paradoxa (0%) y C. fimbriata (31%), fue baja para los datos de péptido /
proteína que permiten la clasificación de la cepa con diferenciación del mismo, partes de la planta y
lugares. Los datos de OOBerror de lípidos para cada clase, Moniliophthora perniciosa (8 %),
Phytophthora palmivora (0%), P. capsici (5%), P. citrophthora (5%), P. heveae (8%), Ceratocystis
cacaofunesta (26%), C. paradoxa (7%) y C.fimbriata (0%), se atribuyó a la clasificación de especie o
género.

Conclusiones Utilizando los fitopatógenos más comunes que atacan las plantaciones de cacao en
Brasil como caso de prueba, y después de seleccionar dichos patógenos de tres géneros diferentes
pertenecientes a ocho especies diferentes y también de diferentes hospedadores, partes de plantas y
plantaciones / lugares, demostramos la capacidad de MALDIMS toma de huellas digitales basada en
uno o ambos perfiles de péptido / proteína y lípidos para diferenciar tales microorganismos. La
reproducibilidad y la selectividad de los datos también se confirmaron mediante análisis
quimiométricos de HCA. Se sabe que tales fitopatógenos representan un gran riesgo para las
plantaciones de cultivos en todo el mundo, y la metodología descrita en este documento podría por lo
tanto aplicarse con una velocidad y eficiencia insuperables para su control. Varios beneficios son
reconocidos inmediatamente. Una placa MALDI-MS puede acomodar hasta 498 muestras, y la
adquisición de datos, el tratamiento y la comparación de bancos de datos pueden automatizarse de
manera automática en un rendimiento de muestreo tan rápido como una muestra cada pocos segundos.
Para las plantaciones de cacao, por ejemplo, el monitoreo MALDI-MS podría ayudar a los
agricultores a aplicar un manejo sanitario adecuado de estos patógenos agresivos y comunes. Un caso
agudo, crítico y relevante para monitorear infestaciones de plantaciones de cacao podría ser el
relacionado con el hongo Moniliophthora roreri. Actualmente está presente en todos los países
productores de cacao que limitan con Brasil, pero aún no ha atacado los árboles brasileños. En los
países donde este patógeno ya está instalado, MALDIMS podría utilizarse para obtener su huella
digital y, si finalmente hongos tating. Para el comercio internacional de cultivos, la metodología
también podría ser útil, como por ejemplo en Brasil al importar cacao de África.

Agradecimientos Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CNPq) por
las becas 140743 / 2013-8 y la ayuda financiera general 447708 / 2014-7, la Agencia de Investigación
del Estado de Sao Paulo (FAPESP) para las becas 11 / 06191-7 y apoyo financiero general 12 / 07206-
0. Los autores agradecen especialmente a Virgínia Oliveira Damaceno, Ana Rosa Rocha Niella y
Elisangela Santos del Centro de Investigación del Cacao de CEPLAC por la preparación de patógenos
aislados.

Introducción

Ilex guayusa es un árbol emblemático de la región amazónica, ampliamente presente en la región

amazónica de Ecuador, Colombia, Perú y Bolivia. Según lo informado por muchos autores (1 - 8) I.
guayusa fue mencionado en varias investigaciones sobre colecciones arqueológicas precolombinas,
viejos manuales históricos y estudios etnobotánicos, legitimando la fama de esta especie como la
planta más importante en la vida cotidiana de los amazónicos Kichwa comunidades (5) y agricultores
locales de comunidades "colono" y "mestizos". A pesar de la amplia presencia de estudios
etnobotánicos sobre varios usos en la medicina popular (6), hay pocas investigaciones sobre la
fitoquímica y las actividades biológicas de I. guayusa, y esta falta compromete un entendimiento
completo sobre la concurrencia entre la medicina popular y las aplicaciones farmacéuticas. Además,
los estudios de profundización pueden proponer nuevas aplicaciones prometedoras como ingrediente
nutracéutico o cosmético. Nuestro objetivo fue compilar una revisión exhaustiva y actualizada de I.
guayusa que cubre principalmente la fitoquímica y la farmacología información, para sugerir nuevas
investigaciones y ofrecer un trabajo complementario a la investigación etnobotánica.

Resultados y discusión 2.1 Descripción botánica, información histórica y medicina popular Ilex
guayusa es un árbol de hoja perenne perteneciente a la familia Aquifoliaceae, nativa de la Amazonía.
La planta es dioica y alcanza entre 6 y 10 metros de altura. Las hojas son simples, pinnadas, glabras,
oblongas, elípticas con margen serrado; Tienen 7-20 cm de largo y 2.5-7 cm de ancho (4). I. guayusa
se distribuye de 200 a 2000 m sobre el nivel del mar a lo largo de los Andes y el piedemonte
amazónico contiguo (8). La información histórica sobre I. guayusa fue mencionada por Schultes (9).
Al describir un hallazgo arqueológico de una tumba excavada por un chamán en Bolivia (cultura
Tihuanacoide), el autor describió la presencia de hojas secas y prensadas, un mortero y una mano de
mortero. El hallazgo probablemente describe el uso de la especie como rapé durante las actividades
rituales y es factible que la especie haya sido utilizada durante al menos 1.500 años. Desde el siglo
XVI hasta la actualidad, muchos autores describieron la medicina popular y las actividades
comerciales relacionadas con I. guayusa. Incluso para los misioneros jesuitas en Ecuador, la especie
era una importante fuente de ingresos (1,3) y, actualmente, unas pocas empresas de la EAR están
vendiendo bebidas e infusiones obtenidas de I. guayusa. En cuanto a la información de medicina
popular, la Tabla 1 tiene varios usos tradicionales que incluyen la aplicación ritual y mágica. De
acuerdo con el concepto de "visión del mundo" de los grupos étnicos amazónicos, I. guayusa puede
usarse para múltiples marsopas, desde remedios de salud humana hasta la costumbre de limpiar el
estómago diariamente como una purificación ritual. I. El té de guayusa se considera una "bebida
mágica" y también se le da a los perros de caza, antes de una expedición de caza, para mejorar sus
habilidades y habilidades. Para los indígenas, la infusión también puede provocar un suave efecto
hipnótico en el que los "pequeños sueños" pueden inspirar o disuadir antes de la expedición de caza
Fitoquímica Las hojas contienen cafeína, teobromina, compuestos fenólicos y flavonoides como
componentes principales (10-13). También se mencionó la guanidina como un componente
importante de extractos de hojas de I. guayusa (14,15). Otra investigación realizada por Ruiz y Roque
(16), menciona un ensayo preliminar fitoquímico de extractos etanólicos, metanólicos y
hidroalcohólicos de I. guayusa, el estudio reveló la presencia de taninos, alcaloides, flavonoides,
glicósidos, compuestos fenólicos y quinonas. Un estudio realizado mediante cromatografía líquida
con espectrometría de masas en tándem (17) de a. El extracto de hojas de Guayusa detectó varios
aminoácidos (Tabla 2), que proporcionan una información interesante sobre el perfil y sabor
nutracéuticos. Desde el mismo autor (18), otra investigación sobre I. guayusa deja extractos,
utilizando gas y la cromatografía líquida y espectrometría de masas, reveló la presencia de dos
triterpenoides pentacíclicos, oleanólico (1,18 mg / g) y ácido ursólico (18,22 mg / g) respectivamente.
2.3 Actividad biológica El estimulante y el efecto protector de la cafeína y la teobromina se informan
extremadamente en la literatura (19-23). Según lo informado por Jara et al. (13), se extrajeron hojas
secas de I. guayusa con etanol (EtOH) y acetato de etilo (EtOAc). El contenido fenólico total se
determinó espectrofotométricamente de acuerdo con el método de fenol de Folin-Ciocalteu y se
calculó como equivalente de ácido gálico (GAE). El contenido total de flavonoides (TFC) se
determinó espectrofotométricamente, la actividad antioxidante se determinó usando el método de
barrido libre de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrilo) y el blanqueo de β-caroteno. Los resultados se
informan en la Tabla 3. De todos modos, la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides puede
indicar una protección contra el daño celular inducido por lesión oxidativa radical o especies reactivas
de oxígeno. Estas propiedades antioxidantes están asociadas con la presencia de compuestos fenólicos
y flavonoides. Aunque se informó la presencia de guanidina pero no se cuantificó, su presencia
explica el efecto hipoglucémico preliminar de extractos de hojas de I. guayusa en el modelo animal.
Guayusa puede reducir la hiperglucemia sin afectar el parámetro de la homeostasis de la glucosa en
ratones no diabéticos. El ácido oleanólico y ursólico se reconocen como compuestos bioactivos
antivirales y antiinflamatorios y también se informó la actividad de inhibición in vitro de estas
moléculas contra diversos tipos de células cancerosas (18). Finalmente, se probó la actividad
estrogénica de extractos etanólicos de hojas de I. guayusa en un modelo in vivo (ratas albinas
hembras) que aumentó notablemente los niveles séricos de estradiol y los ovarios y el peso del útero.
Este hallazgo es un dato preliminar pero prometedor para confirmar el uso tradicional de I. guayusa
contra la infertilidad femenina (24). En otro estudio, se observó que los extractos metanólicos e
hidroalcohólicos de I. guayusa tienen acción fungicida contra Candida albicans, los extractos
hidroalcohólicos también fueron efectivos contra Microsporum canis (16). Además, se realizó un
estudio toxicológico de extractos etanólicos y de agua utilizando un ensayo BrineShrimp (25), en
ambos casos la prueba mostró respectivamente baja (CL50 500-1000 μg / ml) y mediana de toxicidad
(CL50 250-499 μg / ml), en de acuerdo con el uso tradicional seguro, especialmente para el extracto
acuoso. Otra investigación realizada por la prueba de Ames y un estudio de aberración cromosómica
en linfocitos humanos no mostró efectos nocivos (26).

Oportunidades de biocomercio En la EAR, la infusión ritual, las bebidas y las bolsas de té obtenidas
de hojas de I. guayusa están ampliamente presentes en el mercado local, los restaurantes y las casas.
Además, hay algunas experiencias sobre el desarrollo de un mercado de Comercio Justo local e
internacional, basado en la sostenibilidad social enfoques y criterios ecológicos. En realidad, para
valorizar la biodiversidad amazónica ecuatoriana, los derivados de I. guayusa pueden ser una
alternativa sostenible para diseñar productos naturales, relevantes para las economías locales, tales
como: té (27), fitofármacos (12). Para mantener los mercados nacionales e internacionales, es
necesario diseñar una estrategia comercial bi-comercial que mejore el equilibrio entre la política de
conservación y las necesidades de los empresarios. Un estudio reciente realizado por Sidali y Garrido
Pérez (8), se centra en un modelo de turismo alimentario, basado en el caso Guayusa, como una
estrategia de desarrollo sostenible para las comunidades Kichwas en Napo (Ecuador). La
investigación cualitativa confirma que el turismo alimentario puede ser una estrategia viable y una
tendencia futura para la EAR. Además, la investigación identifica cuatro principios de la cosmovisión
de las comunidades Kichwa (visión del mundo) que son compatibles con la teoría occidental del
turismo de nicho, respectivamente: aprendizaje mutuo, empoderamiento, acceso regulado a la
propiedad intelectual y legislación comunitaria.

Materiales y métodos La presente revisión sistemática se logró adoptando las siguientes bases de
datos electrónicas: SciFinder, PubMed, Google Scholar, SciElo, Taylor & Francis y Scopus. Los
datos se extrajeron de forma independiente de tres revisores y las selecciones finales en papel se
completaron evitando la duplicación de datos. Se seleccionaron las siguientes palabras clave: Ilex
guayusa, guayusa. Los artículos seleccionados por los revisores estaban en inglés y el idioma español
y se excluyeron los datos de las patentes. Los criterios mencionados anteriormente permitieron
seleccionar 20 artículos elegibles; también consideramos algunos documentos clave adicionales para
introducción, discusión y capítulos de resultados. De todos modos, es necesario recordar que muchos
autores mencionaron cartas notables y fuentes históricas desde el siglo XVI hasta el siglo XIX.

Conclusiones A pesar de la presencia generalizada de bebidas y productos comerciales obtenidos de

I. guayusa, principalmente la investigación etnobotánica se ha realizado en las últimas décadas. Todas
las investigaciones fitoquímicas conocidas hasta hoy se desarrollaron exclusivamente en extractos de
hojas, sin estudios de profundización en otras partes de la planta. Una revisión reciente sobre el género
Ilex (31) informó amplia información sobre los componentes activos y sus actividades biológicas,
pero presentar información básica sobre I. guayusa con respecto a la presencia de cafeína. Para
muchas otras especies Ilex se han identificado muchas moléculas como triterpenoides, saponinas,
flavonoides, alcaloides, antocianinas y otros compuestos fenólicos que pueden explicar las
actividades biológicas mencionadas. La falta de una investigación fitoquímica profunda sobre I.
guayusa es innegable y la tendencia futura puede ser aumentar las investigaciones sobre la actividad
antidiabética y estrogénica antes mencionadas. Además, otros estudios sobre plantas que contienen
cafeína (32,33) informaron el efecto de los efectos de la edad foliar sobre los contenidos cuantitativos
de cafeína, teobromina, metilxantinas y total compuestos fenólicos, que muestran esencialmente una
cantidad decreciente de compuestos activos mencionados en hojas viejas. Además, se observó que la
presencia de cafeína parece ser específica del cultivar, específica del tejido y dependiente de la
estación. Con el fin de optimizar las formulaciones nutracéuticas y cosméticas basadas en extractos
de I. guayusa, todos estos hallazgos sugieren una investigación más profunda sobre la presencia de
cafeína y compuestos fenólicos que se enfocan en diferentes partes de la planta, diferentes edades de
plantas y temporadas de cosecha. Finalmente, I. guayusa representa una prometedora fuente de
compuesto bioactivo y una fuente alternativa de ingresos para los agricultores locales de la región
amazónica ecuatoriana.

El uso de plantas medicinales por poblaciones rurales de la provincia de Pastaza en la Amazonía

ecuatoriana

INTRODUCCIÓN La etnobotánica estudia la relación entre las personas y las plantas (Sánchez et
al., 2007). Un alto porcentaje de la población mundial utiliza plantas medicinales para la atención
primaria de salud, y esto aumenta el consumo de materias primas en plantas medicinales (Kandari et
al., 2012). Su uso es una alternativa para los países en desarrollo, principalmente en áreas pobres
(Cadena et al., 2013). El conocimiento del uso de plantas medicinales en diferentes lugares es parte
de la reafirmación de la identidad de estos pueblos (Arenas y Del Cairo 2009). En estudios
etnobotánicos, las especies utilizadas en medicina y alimentación se encuentran entre las que tienen
un alto número de informes (Castellanos 2011). Asimismo, los estudios sobre el conocimiento de
plantas medicinales, basados en grupos étnicos, son limitados, especialmente aquellos enfocados en
poblaciones mestizas, en comparación con aquellos que se enfocan en grupos indígenas. Por lo tanto,
estudios recientes se centran en la relación entre los factores socioculturales y socio-económicos para
adquirir el conocimiento tradicional (Beltrán et al., 2014), donde la etnografía analiza los disfraces
de cada población, que están relacionados con el uso de medicamentos plantas (Van Maanen 2011).
En Ecuador, se han registrado 408 estudios relacionados con áreas etnobotánicas. La región
amazónica muestra 107 estudios, principalmente en campos como la etnobotánica general y plantas
medicinales y comestibles (Ríos et al., 2007). El mayor número de especies utilizadas en Ecuador
proviene principalmente de dos familias (Asteraceae y Fabaceae) y los usos principales son
tratamiento de infecciones, heridas, lesiones, trastornos estomacales (De la Torre et al.2008). La
provincia de Pastaza, ubicada en la región amazónica ecuatoriana, es el hogar de los grupos étnicos
Achuar, Andowa, Huaorani, Kichwa, Shiwiar, Shuar y Zápara (Gobierno Autónomo Descentralizado
Provincial de Pastaza 2011). Además, hay una población mestiza en alto porcentaje proveniente de
otras provincias. Este hecho genera la necesidad de registrar las especies utilizadas como plantas
medicinales según las localidades y grupos étnicos dentro de cada una de ellas. El objetivo de esta
investigación fue identificar las especies de plantas utilizadas como medicina tradicional por los
agricultores en las localidades de Pastaza, Mera y Santa Clara en la provincia de Pastaza, Ecuador,
estableciendo su uso de acuerdo a las localidades, etnicidad y propósitos de uso de las plantas.
MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación Esta investigación fue desarrollada en la Amazonía
ecuatoriana, en las localidades de Mera, Pastaza y Santa Clara, provincia de Pastaza, en Ecuador. La
Tabla 1 muestra las características edafoclimáticas de estas localidades. Las características del
ecosistema dominante en la zona son bosques perennifolios costeros, lluviosos, bioclimáticos,
húmedos e hiperhúmedos ombrotipo ombrotipo, inferior termal tropical, macro relieve de la colina,
alivio de la meseta de la colina no inundada (Ministerio del Ambiente de Ecuador 2012). En el estudio
se utilizó una muestra del 30% de los agricultores de los pueblos de Madre Tierra (localidad de Mera),
Tarqui, Veracruz, Diez de Agosto y Fátima (localidad de Pastaza) y San José y Santa Clara (localidad
de Santa Clara). Estos agricultores fueron elegidos al azar y se realizaron entrevistas
semiestructuradas (Castellanos 2011), con el uso de un cuestionario (Kandari et al., 2012) basado en
Mott (1979), para identificar el origen étnico del agricultor y las plantas utilizadas en la agricultura
tradicional. Medicina. Este cuestionario incluyó el nombre de la persona, la fecha, la aldea, las áreas
dentro de la aldea, el área de la granja, el nivel académico y la etnia del agricultor. De acuerdo con la
información socioeconómica, la encuesta incluyó años de trabajo, actividad económica, ingresos,
producción agrícola y área por cultivo. Las variables consideradas en el uso de las plantas fueron
especies, parte de la planta y sus propósitos de uso. La encuesta también incluyó características de
ubicación, elevación, uso de la tierra, vegetación, lluvia y topografía. La encuesta fue supervisada por
expertos en los campos de la botánica y la agronomía de la Universidad Estatal de Amazon, ubicada
en la localidad de Pastaza, que se aplicó a 40 agricultores para su validación. Como resultado de esta
etapa, la encuesta fue rediseñada para mejorar su comprensión y, posteriormente, se aplicó a 213
agricultores, que se distribuyeron de la siguiente manera: En la localidad de Mera, se realizaron 58
encuestas en el pueblo de Madre Tierra (Campo Alegre, La Isla, Itayacu, Encañada, Madre Tierra,
Nueva Vida, Puerto Santana y La Y). En la localidad de Pastaza, se realizaron 70 encuestas en los
pueblos de Tarqui (Huagrayacu, Putuimi, Río Chico y Vía a Madre Tierra), Veracruz (Calvario, Las
Palmas, Santa Marianita, Bobonaza y Veracruz), Diez de Agosto (Jatun Pacha, San Carlos, San
Francisco, y vía Díez de Agosto) y Fátima (El Rosal, Fátima, Las Américas, Libertad y Murialdo).
En la localidad de Santa Clara, se realizaron 85 encuestas en el pueblo de San José (Cajabamba 1,
Cajabamba 2 y Mariscal Sucre) y Santa Clara (20 de abril, Jatun Atahualpa, Pueblo Unido, Rey del
Oriente, San Cristóbal, San Francisco de Llandia, San Francisco Punin, San Juan de Piatua, San Pedro
y Santa Clara). La Figura 1 muestra la ubicación de estos lugares. Los productores de cada localidad
tienen la siguiente distribución por etnias: 76% mestizo y 24% kichwa en Pastaza, 40% mestizo y
60% kichwa en Mera, y 47% mestizo y 53% kichwa en Santa Clara. El 69% de la población trabaja
en actividades agrícolas y ganaderas, y en su mayoría tienen un nivel de educación primaria o
secundaria. Los productores mestizos dedican su trabajo a cultivos únicos (monocultivo),
principalmente caña de azúcar, y los productores de Kichwa plantan sus cultivos en pequeños campos
"chacras", donde cultivan diversas especies. En los agricultores encuestados, las especies plantadas
fueron fotografiadas y, cuando fue necesario, se recolectaron muestras del material vegetal para
confirmar la identificación. Estas muestras fueron llevadas al herbario de la Universidad Estatal de
Amazonas para su identificación por los autores de este documento mediante el uso de descripciones
y fotografías encontradas en la literatura especializada (Burnieo 2006; Gentry 1996). Más tarde, se
buscaron sus nomenclaturas en el sitio web del Jardín Botánico de Missouri (TROPICOS 2015). Los
datos se analizaron utilizando el programa INFOSTAT (Di Rienzo et al., 2014). El análisis de las
tablas de contingencia se realizó para el informe de frecuencia de uso por especie y localidad, y para
la frecuencia de uso de la especie frente a la etnia del productor.

El análisis mostró diferencias significativas en el coeficiente Chi cuadrado. Se realizó un análisis de

proporciones utilizando el módulo de proporción de Excel, para determinar la especie que mostró
diferencias estadísticas en sus informes de uso. Esta investigación fue desarrollada de acuerdo con
las regulaciones legales de Ecuador.

RESULTADOS Se identificaron un total de 52 especies de plantas pertenecientes a 34 familias

botánicas en el área. Las familias de Solanaceae y Lamiaceae mostraron el mayor número de especies.
En el área de estudio, solo había agricultores michí y kichwa, que son los únicos habitantes de la zona
noroeste de la provincia de Pastaza, en las localidades mencionadas. Otros grupos étnicos se
establecen en las áreas sur y sudeste de esta provincia. La Tabla 2 muestra las especies reportadas por
familia botánica y su frecuencia de uso, según lo informado por cada localidad y por productor
Kichwa / mestizo. También muestra que la localidad de Santa Clara y el grupo étnico Kichwa usaron
la mayor cantidad de especies. También se describe la parte de la planta utilizada de cada especie y
su uso previsto, lo que demuestra que la parte más utilizada de la planta son las hojas, principalmente
para el tratamiento del dolor de estómago y resfriado, así como un analgésico. La Tabla 2 también
muestra el informe de otras investigaciones relacionadas con las especies identificadas. Los resultados
de las tablas de contingencia mostraron resultados significativos (valor cuadrado de chi de Pearson y
MV-G2), para la frecuencia de uso frente a la localidad y para la frecuencia de uso frente a la etnia
del productor (Tabla 3). Ilex guayusa Loes, Psidium guajava L., Banisteriopsis caapi (Spruce ex
Griseb.) C.V. Morton y Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry fueron las especies informadas con más
frecuencia, como se muestra en la Tabla 4

DISCUSIÓN La presencia de localidades con diferentes características edafoclimáticas y etnicidad

genera una variabilidad en el uso de especies vegetales para la medicina tradicional, siendo la
localidad y las etnias dos características que interactúan entre sí, lo que se demuestra a través de las
diferencias reportadas. La cantidad de especies reportadas es inferior a la reportada en otros estudios,
donde la comunidad Kichwa de San José de Payamino (provincia de Orellana) reportó 63 especies
(Doyle et al. 2014), y comunidades Saraguro y Shuar (provincias Loja y Zamora Chinchipe) )
reportaron 275 especies 68 diferentes usos terapéuticos (Tene et al. 2007), y un número mayor de
especies reportadas por los productores Kichwa, con 49 especies, (Lewis y Lewis 1995). Las especies
generales se usan para 26 tipos de dolencias. Las especies se utilizaron principalmente para el
tratamiento del dolor de estómago 16 spp. (31%), frío 7 spp. (13%), infecciones 6 spp. (12%), diarrea
y curación 4 spp. (8%) e inflamaciones 8 spp. (15%). Esta cantidad es inferior a la obtenida por Marles
et al. (1986) que, en estudios realizados en la Amazonía ecuatoriana (provincia de Napo) con
población Kichwa, identificó un total de 138 especies que se utilizan con 80 fines terapéuticos. A
diferencia de lo que encontramos, Marles et al. (1986), informó que las dolencias más tratadas con
especies de plantas fueron, infecciones parasitarias y fiebre con 64 spp. (53%), usos para aliviar el
dolor, 32 spp. (27%), tratamiento de infertilidad femenina 30 spp. (25%) y antivenenos 12 spp. (10%)
Para el tratamiento de dolencias, las partes de las plantas más utilizadas fueron hojas (30 especies,
58%), tallo 21 spp. (40%), fruta 5 spp. (10%) y flores 4 spp. (8%). En la comunidad de Saraguro
(provincia de Loja) se informó un alto uso de ramas y toda la planta en la medicina tradicional
(Armijos et al., 2014). Los productores de Mestizo y Kichwa difieren en el uso de plantas medicinales.
Los productores mestizos muestran un mayor uso de las especies más comúnmente conocidas, y
cultivan muchas de ellas. De estas especies, 11 de ellas muestran solo un informe de uso por parte de
los agricultores. Los productores de Kichwa usan principalmente especies no cultivadas, que se
encuentran en su entorno natural. Esto se confirmó después de encontrar 16 especies con un solo
informe de uso. Esto es corroborado por el análisis de tablas de contingencia y coincide con Turner
et al. (2011), quien afirma que el uso de especies en diferentes ecosistemas muestra diferencias,
dependiendo de las formas de vida y sus características climáticas. En cuanto a las familias botánicas,
Lamiaceae y Solanaceae tienen el mayor número de especies reportadas en uso medicinal, lo que
concuerda con Alberthasedade et al. (2010). En Ecuador, Ríos et al. (2007) informaron especies
utilizadas en medicina, incluyendo Artocarpus altilis, Brosimum utile, Brunfelsia chiricaspi, Carica
papaya, Citrus × lemon, Columnea nariniana, Cordia nodosa, Costus sp., Croton lechleri.
Cymbopogon citratus, Cyperus luzulae, Erythroxylum sp., Fimbristylis littoralis, Grias neuberthii,
Guadua angustifolia, Heisteria acuminatta, Ilex guayusa, Inga edulis var. edulis, Jacaranda glabra,
Mansoa alliacea, Maranta amazónica, Maytenus krukovii, Melissa officinalis, Mentha sp., Nicotiana
tabacum, Ocimum basilicum, Plantago mayor, Potalia amara, Psidium guajava, Sambucus nigra,
Scoparia dulcis, Smilax sp., Stachytarpheta cayennensis, Tabernaemontana sanano, Verbena
officinalis y Witheringia solanacea. La comparación con estudios de otros países muestra
características similares con respecto a los propósitos de los usos de las especies identificadas en esta
investigación con fines medicinales.

Esto indica que estas plantas se usan en otros lugares y tienen una amplia distribución. Solo Floscopa
peruviana no se informa en medicina humana por otros autores. Además, el propósito de los usos más
frecuentes fue el tratamiento de dolores de estómago, curación y resfriados, así como
antiinflamatorios y analgésicos. Esto muestra una cultura más preventiva de medicina curativa en los
productores encuestados, que también se observa en los otros estudios. Esto indica claramente la
existencia de conocimiento indígena entre los diferentes grupos étnicos que viven en diferentes
localidades de diferentes regiones. Es bastante común el porcentaje de especies que se usan
específicamente en un área, lo que no indica que la distribución de éstas se restrinja a un solo sector,
sino el conocimiento desarrollado sobre su uso.

CONCLUSIONES La variabilidad de las especies utilizadas en la medicina tradicional está

influenciada por factores de localidad y origen étnico del productor. Las familias de Solanaceae y
Lamiaceae reportan el mayor número de especies e Ilex guayusa es la especie más representativa
según se deduce del número de informes y el análisis estadístico. Las especies se usaron
principalmente para tratar dolores de estómago y resfríos, y como analgésicos. La mayoría de las
especies identificadas están presentes en otros estudios realizados en todo el mundo.

Género Ilex L .: Fitoquímica, Etnofarmacología y Farmacología

Introducción El género Ilex L. es el único género vivo de la familia de Aquifoliaceae, incluidas

alrededor de 600 especies, que se disemina principalmente en América del Norte y América del Sur,
en Asia tropical y templada y en Europa y Oceanía (Manen et al, 2010). Crece en formas de árboles,
escaladores y arbustos. China es uno de los principales países con recursos vegetales de Ilex L., de
los cuales 200 especies se distribuyen principalmente en el sur de China, por ejemplo, provincias de
Guangdong, Yunnan, Hunan y Zhejiang (Peng et al, 2013). Más de 40 especies y sus variedades se
utilizan con fines medicinales, en las cuales Ilex chinensis Sims, I. cornuta Lindl., I. rotunda Thunb.,
I. cornuta Lindl., I. pernyi Franch., Y I. pubescens Hook son recursos botánicos de medicamentos
crudos (Comité de Herbacología China, 2004) en China, y las tres primeras especies se registraron en
la Farmacopea China 2015 (Comité de Farmacopea de P R. China, 2015). Son remedios para eliminar
el calor, humedecer el pulmón, eliminar la flema y revitalizar el hígado y los pulmones en chino
tradicional medicina (TCM), y también se usan conjuntamente con otras hierbas en medicamentos de
patente chinos (Tabla 1). Además, varias especies se usan como tés que no son Camellia debido a que
pertenecen a especies que no son Camellia (Han et al, 2013). Por ejemplo, I. latifolia Thunb., I.
kudingcha C.J. Tseng (Kudingcha de hojas grandes), I. paraguariensis A. St.-Hil. (Yerba Mate) e I.
vomitoria Sol. ex Aiton (Yaupon) se bebe a diario para promover la salud humana y prevenir las
enfermedades cardiovasculares en la gente del sur de China y los países occidentales, especialmente
en el norte y el sur de América, p. Estados Unidos, Paraguay, Perú, Ecuador y Brasil durante miles
de años. En el siglo 21, ha habido grandes cambios en el espectro de enfermedades humanas: cada
vez más personas padecen enfermedades de la civilización moderna como enfermedades
cardiovasculares, cáncer y diabetes y un aumento excesivo de los costos médicos (Samocha et al,
2014). Las experiencias de terapia tradicional muestran que las especies en el género Ilex L. son
remedios potenciales para las enfermedades modernas. Aquí revisamos el género Ilex L. en
fitoquímica, etnofarmacología y farmacología (Figura 1).

Fitoquímica de plantas en Ilex L. Se han aislado e identificado más de 200 compuestos de las plantas
de Ilex L., incluidos triterpenoides, saponinas triterpenoides, flavonoides, esteroles, polifenoles,
ácidos carboxílicos y ésteres. Los componentes dominantes son triterpenoides y sus saponinas
responsables de la modulación de las actividades del metabolismo lipídico, antiobesidad,
antiinflamatorias y antimicrobianas (Tabla 2). En los últimos 30 años, los estudios de fitoquímica se
han llevado a cabo intensamente sobre I. chinensis, I. rotunda, I. cornuta, I. latifolia, I. purpurea, I.
asprella e I. pernyi.

Triterpenoides y saponinas triterpenoides Se han aislado e identificado un total de 180

triterpenoides y saponinas triterpenoides de las plantas de Ilex L. De acuerdo con la diversidad
química de carbocíclicos, los triterpenoides se clasifican en triterpenoides acíclicos, triterpeno
tricíclicos, triterpenoides tetracíclicos y triterpenoides pentacíclicos, en los que los triterpenoides
pentacíclicos son dominante que incluye triterpenoides pentacíclicos de lupano, triterpenoides
pentacíclicos de oleana y triterpenoides pentacíclicos de ursane. Están presentes principalmente en
las hojas, cortezas y cortezas de las raíces de las plantas en Ilex L. en lugar de otros géneros.

Triterpenoides pentacíclicos de lupane Se aislaron catorce triterpenoides pentacíclicos de lupane

de ocho especies (Tabla 2 y Figura 2). I. crenata (3 y 5-8) es la especie más intensamente estudiada,
seguida por I. cornuta (9 y 11-13). Los compuestos 3 y 5-8 solo se aislaron de las frutas.

Triterpenoides pentacíclicos de oleanane Se han aislado un total de 41 triterpenoides pentacíclicos

de oleana de las hojas, raíces y cortezas de las raíces de 11 especies en Ilex L. (Tabla 2 y Figura 3).
I. rotunda es la especie que contiene muchos triterpenoides pentacíclicos de oleanane (29-36, 42, 43
y 48). I. cornuta e I. asprella son los segundos que incluyen seis compuestos, respectivamente, 19, 20,
22, 28, 49 y 50 de I. cornuta y 15-17, 21, 27 y 45 de I. asprella. Cinco oleanane

Los triterpenoides pentacíclicos se han aislado de I. crenata (37-41) y cuatro de I. latifolia (23-25 y
51). Otros compuestos se muestran en la Tabla 2. Todos ellos están ausentes de las frutas.

Triterpenoides pentacíclicos de Ursane Hay 126 triterpenoides pentacíclicos de ursane en 17

especies de Ilex L. que es mucho más que otras clases químicas (Tabla 2 y Figura 4). Veinticinco
compuestos (56-59, 85-91, 102-104, 108, 120, 124, 133, 136, 138, 142, 144 y 148) se han aislado de
I. cornuta, 20 compuestos (145, 147). , 149-160 y 166-171) de I. crenata, 17 compuestos (69, 109-
111, 161-165 y 174-181) de I. rotunda, 17 compuestos (64-68, 92-97, 101 , 105, 110, 112, 113 y 135)
de I. pubscens, nueve compuestos (70-74 y 77-80) de I. kudingcha, ocho compuestos (76, 81-84, 103
y 104) de I. latifolia, ocho. compuestos (103, 106, 107, 113, 118, 119, 137, 141 y 143) de I. asprella,
y siete compuestos (103, 110, 121, 122, 139, 140 y 146) de I. chinensis. Se han aislado cinco
compuestos de I. paraguariensis (60-63 y 100), I. amara (123, 125 y 129-131) e I. hainanensis (64,
98, 99, 103 y 112), respectivamente.

Flavonoides Se aislaron doce flavonoides de las hojas o raíces de cinco en la especie Ilex L .: ocho
compuestos (186-193) de las hojas de I. centrochinensis, dos compuestos (198 y 199) de las hojas de
I. asprella, y compuesto 200 de las hojas de I. pernyi. El compuesto 193 es un flavonoide solo aislado
del género Ilex L. (Tabla 2 y Figura 5).

Lignanos Se aislaron trece fenoles principalmente de cinco plantas en especies Ilex L.: tres
compuestos (204, 206 y 209) de las raíces de I. pubescens. 224, 226 y 227 se han aislado de tres
especies de Ilex L .: I. centrochinensis, I. pubescens e I. rotunda, en las que se aisló huazhongilexin
(224) solo de este género. 230 fueron aisladas de las hojas de I. pernyi, y 231-236 fueron aisladas de
las raíces de I. pubescens (Tabla 2 y Figura 6). 2.4 Ácidos fenólicos y ácidos grasos

Veinte ácidos fenólicos y ácidos grasos fueron aislados de cuatro especies de Ilex L .: 202, 203, 205
y 207-209 fueron de raíces de I. pubescens, compuesto 210 de hojas de I. cornuta, compuesto 212 de
cortezas de raíz de I. rotunda, compuesto 213 de raíces de I. asprella, y compuesto 214 de hojas de I.
centrochinensis. Compuestos 215-217 de las cortezas de la raíz de I. rotunda, 220-222 de las raíces u
hojas de I. asprella, 218 y 219 de las raíces u hojas de I. cornuta, 223 y 225 de las raíces de I. pubescens
( Tabla 2 y Figura 7)

Esteroles Se aislaron cuatro esteroles (182-185) de cinco especies de Ilex L .: I. centrochinensis, I.

asprella, I. cornuta, I. pubescens e I. hainanensis (Tabla 2 y Figura 8).

Minerales Hasta ahora, los contenidos de ocho elementos (Fe, Ca, Mn, Mg, Na, K, Zn y Cu) en las
hojas de I. paraguariensis se determinaron mediante espectrofotómetro de absorción atómica (Vera et
al, 1997), también lo hicieron en las hojas de I. kudingcha (Zn, Cu, Mg, Fe, Ca, Mg, Sr, Co, Li, Rb,
K y Ni). Zhang (2002) encontró que I. kudingcha era más que otros en los contenidos de Zn, Mn, Cu,
Mg, K, Rb, Fe y Li.

Otros Tres compuestos de cumarina (194-196) de las raíces de I. pubescens. El compuesto 228 se
aisló de I. rotunda, 229 y 230 se aislaron de las hojas de I. pernyi (Tabla 2 y Figura 9)

Etnofarmacología de plantas en Ilex L. La especie Ilex L. se describió por primera vez en el

Compendio de Materia Médica (dinastía Ming), en el que I. chinensis e I. cornuta se registran en
morfología y eficiencia. Las hojas de I. chinensis pueden disipar el viento patogénico de los músculos,
y las de I. cornuta se usan para tratar la leucodermia después de hervidas (Li, 2003). En general, las
plantas medicinales del género Ilex L. son de naturaleza fría o fría y tienen poco sabor. Ilicis Chinensis
Folium (hojas secas de I. chinensis), Ilicis Cornutae Folium (hojas secas de I. cornuta) y Ilicis
Rotundae Cortex (corteza de raíz seca de I. routunda) se han utilizado ampliamente como medicinas
tradicionales en China y todo se registró en la Farmacopea China 2015 (Comité de Farmacopea de P
R. China, 2015). Ilicis Chinensis Folium, amargo y fresco, ingresa a los meridianos del pulmón, el
intestino y la vejiga urinaria, con funciones para enfriar el calor y disipar la estasis sanguínea. Ilicis
Cornutae Folium, amargo y fresco, ingresa a los meridianos en el pulmón y el riñón, con las funciones
de calor refrescante y nutre el riñón Yin. Ilicis Rotundae Cortex, amargo y frío, ingresa a los
meridianos en el pulmón, el intestino, el hígado y el estómago, con las funciones de enfriamiento y
alivio del dolor. Las hojas de I. kudingcha e I. latifolia son beneficiosas para la salud humana, como
para tratar el dolor de garganta, diuréticos, dolor de cabeza y pérdida de peso. Los frutos, raíces y
hojas de I. cornuta tienen un amplio espectro de bioactividades de antiinflamatorio, antimicrobiano y
antihipertensivo. En China, I. rotunda se usa como remedio para escaldaduras, quemaduras, control
de sangrado y medicina de unión. I. chinensis se ha utilizado en el tratamiento de enfermedades
bacterianas, amigdalitis, infecciones del tracto urinario y resfriado común. Las raíces de I. pubescens
se usaron para tratar enfermedades cardiovasculares e hipercolestemia (Tabla 3). Las hojas de
Kudingcha (I. latifolia e I. kudingcha), Yerba Mate (I. paraguariensis e I. brevicuspis), yaupon (I.
vomitoria), té Apalache (I. glabra), té guayusa (I. guayusa), etc. , se usan como tés en algunas culturas.
Se llaman tés que no son Camellia, término que describe a tales plantas como ausentes del género
Camellia L. (Theaceae) son bebidas no alcohólicas. Estudios farmacológicos modernos dilucidaron
que los tés que no son Camellia pueden prevenir enfermedades metabólicas crónicas al reducir la
hipoglucemia, hiperlipidemia y hipertensión. La especie más popular en Ilex L. de tés de no camelia
en China es Kudingcha de hoja grande botánicamente de I. latifolia e I. kudingcha. Las grandes hojas
de Kudingcha han disfrutado alrededor de 2000 años de consumo en el sur de China debido a varias
actividades biológicas: para calmar la sed, refrescar la mente, mejorar la vista y eliminar la flema.
Los triterpenoides, flavonoides y ácidos fenólicos son los principales metabolitos de Kudingcha de
hojas grandes que pueden proteger el sistema cardiovascular, la oxidación, el antitumoral y regular el
metabolismo de los lípidos. En América del Sur, la yerba mate (té de Paraguay) de I. paragariensis se
cultiva ampliamente en el sur de América del Sur (Paraguay, Argentina, Brasil y Uruguay). Se usa
medicinalmente y como una bebida de té natural y refrescante desde la época de los antiguos indios
de Brasil y Paraguay que "produjo euforia y alivio de la fatiga" (Linck et al, 2014). En Argentina,
Uruguay, Brasil y Paraguay, hay otra especie de "Mate": I. brevicuspis con un uso tradicional de
actividades coleréticas, de propulsión intestinal y antioxidantes (Filip y Ferraro, 2003). En la cuenca
superior del Amazonas de Colombia, Ecuador y Perú, I. guayusa puede alcanzar un promedio de 10
m de altura y presentar una multitud de tallos en 2 a 15 cm a la altura del pecho. La gente de Perú
consume las hojas de esta planta como bebidas similares al té por sus cualidades medicinales como
"sangre limpia" (para eliminar el exceso de azúcares de la sangre) para tratar la diabetes. También se
usa comúnmente para reducir el sangrado posparto mediante la limpieza de la vagina después de dar
a luz. En Ecuador, la gente también usa guayusa para enjuagarse la boca y limpiar las bebidas en sus
brazos, piernas y cara para evitar que la piel envejezca (Dueñas et al, 2016). En América del Norte,
especialmente el Estado de Texas, EE. UU., El té Yaupon (hojas de I. vomitoria) se consume para
"alcanzar la pureza ritual" debido a su alta capacidad antioxidante y sus efectos positivos sobre las
células de cáncer de colon (Wainwright and Putz , 2014). Una especie de acebo de hoja perenne, I.
glabra, también conocido como té apalache, tintura de hojas, evergreen winterberry, gallberry e
inkberry, es originaria de la llanura costera del este de América del Norte, desde Nueva Escocia hasta
Florida y Louisiana. Las hojas de I. glabra tostadas y secas fueron utilizadas por primera vez por los
nativos americanos para preparar una bebida similar al té negro (Jaiswal et al, 2014).

Farmacología de plantas en Ilex L. Las plantas de Ilex L. habían sido intensamente estudiadas en
uso medicinal antes de 2000, especialmente para I. chinensis, I. cornuta, I. asprella, I. pubescens, I.
pernyi e I. rotunda. Posteriormente se ha estudiado más en bebidas: I. latifolia, I. kudingcha,
I.hainanensis, I. paraguariensis, I. brevicuspis, I. vomitoria e I. glabra. Esas especies exhibieron un
amplio espectro de actos biológicos y farmacológicos Protección del sistema cardiovascular y
actividades del metabolismo lipídico.

Las especies de Ilex L. se han usado como fármacos hipolipidémicos tradicionales durante un largo
período. El consumo de estas hierbas mejora los parámetros de lípidos en suero en nivel dislipidémico
y proporciona una reducción del colesterol LDL que puede reducir el riesgo de enfermedades
cardiovasculares (De Morais et al, 2009). El extracto acuoso de I. pubescens e I. hainanesis puede
mejorar la contractilidad cardíaca, aumentar la contractilidad y la vasodilatación del miocardio,
reducir la precarga cardíaca, la poscarga y la reducción del oxígeno del miocardio (Li et al, 2013). La
fracción rica en triterpenoides de I. hainansis tiene la capacidad potencial de regular el metabolismo
lipídico y aliviar la resistencia a la insulina en ratas alimentadas con dieta alta en grasas (Cui et al,
2013). La Ilexsaponina B (65), una saponina triterpénica de I. pubescens e I. asprella, puede reducir
los niveles de colesterol y tener la inhibición potencial contra la actividad xantina oxidasa en ratones
dd-k alimentados con emulsión grasa (Zhou et al, 2013b). Las raíces de I. rotunda protegen el sistema
cardiovascular al reducir el flujo coronario y la frecuencia cardíaca, mejoran la tolerancia a la hipoxia
y muestran bioactividades contra la arritmia y la isquemia anti-miocardio (He et al, 1997; Peng et al,
2014). Las saponinas triterpenoides de I. cornuta pueden proteger a las células de cardiomiocitos
H9c2 contra la lesión inducida por H2O2 (Li et al, 2014b). El extracto metanólico de I. pubescens
puede prolongar tres veces el tiempo de hemorragia e inhibir la generación de malondialdehído
liberado durante la agregación plaquetaria inducida por trombina, en la cual los ilexósidos A-D y J
son responsables de las bioactividades antitrombóticas (Kothiyal et al, 2012) . Los extractos de I.
pubescens mostraron una actividad de agregación antiplaquetaria más significativa que la aspirina en
un 36.55% y 27.30% en una dosis de 10 μmol / L, respectivamente (Liu et al, 2008). Los bioensayos
in vitro mostraron que los tés que no son Camellia, especialmente Kudingcha y Yerba Mate, pueden
reducir potencialmente los factores de riesgo cardiovascular al regular el metabolismo de los lípidos
(Cardozo y Morand, 2016). Tanto I. kudingcha (Zheng et al, 2015) como I. paraguariensis (Bravo et
al, 2014) aparecen como potentes inhibidores contra la oxidación de lipoproteínas de baja densidad
(LDL). Los ratones hiperlipidémicos kunming podrían reducirse en los niveles de glucosa en sangre,
colesterol total plasmático y triglicéridos después de ser tratados con I. latifolia e I. paraguariensis
(Lu et al, 2012). Zheng et al (2015) también demostraron que Kudingcha puede reducir
significativamente la rata SD en el suero, el contenido de lípidos en el hígado y el peso húmedo de la
grasa hepática. Chen y Wang (2012) informaron que Kudingcha puede reducir significativamente los
contenidos de TC, TG y LDL2C en suero de ratones hiperlipidémicos. Los extractos acuosos de I.
paraguariensis (AEIp) tienen los efectos de la relajación dependiente del endotelio de la arteria
mesentérica, lo que lleva al endotelio vascular a liberar óxido nítrico (NO) u otros metabolitos en el
modelo de ratones hipercolesterolémicos, y también puede estimular la liberación de células
endoteliales el factor de relajación vascular, que produce el efecto antihipertensivo (Flores, 2006).
Los extractos de hojas de Kudingcha pueden disminuir significativamente la presión sanguínea en
perros anestesiados, y el índice de tejido adiposo subcutáneo abdominal en ratas y control obesos, lo
que indica que tiene actividades antihipertensivas (Feng et al, 2015).

Actividad antitumoral La especie de Ilex L. mostró las posibles bioactividades antitumorales. El

extracto acuoso de I. pubescens puede mejorar citotoxicidad de daunorrubicina en la sobreexpresión
de células de leucemia P-170 in vitro (Ding et al, 2012). De uso conjunto con verapamilo (VP), puede
aumentar significativamente la capacidad de destrucción de la daunorrubicina en las células K562 /
AO2 (Meng et al, 2007). I. pubescens puede servir como un sensibilizador de la radioterapia para el
carcinoma nasofaríngeo que alivia los efectos secundarios sobre la piel y el tracto gastrointestinal, la
mucosa faríngea en la clínica (Zhou et al, 2014). El ácido rotúrico (100), un triterpenoide pentacíclico
en I. routunda, I. purpurea, etc., tiene una actividad antitumoral en la progresión del ciclo celular y la
apoptosis. Puede inducir la apoptosis y la detención del ciclo celular G0 / G1 de las células HepG2
que pueden desarrollarse como un agente potencial contra el carcinoma hepatocelular (Chen et al,
2013). Los ácidos metálicos A (15) y C (17) de I. asprella pueden inhibir el crecimiento de las líneas
celulares RPMI-7951 y las células KB, mientras que el ácido fórmico B (16) no puede (Kashiwada
et al, 1993). Los extractos lipofílicos de hojas de I. chinensis mostraron fuertes actividades de
inhibición contra la activación y proliferación de linfocitos en la clínica (Li et al, 2012). Los extractos
acuosos y etanólicos de Yerba Mate pueden inhibir el desarrollo del epitelio colónico normal en la
línea celular de adenocarcinoma de HT29 en humanos, que puede usarse en la promoción de la salud
como un factor quimiopreventivo (Frant et al, 2012). Kudingcha a una concentración de 200 μg / ml
inhibió 75% de células cancerosas TCA8113 e indujo significativamente la apoptosis en células
TCA8113 regulando positivamente la expresión de Bax, caspasa-3 y caspasa-9, lo que demostró que
Kudingcha posee bioactividad contra el cáncer in vitro. Un estudio mostró que Kudingcha podría
reducir el tamaño del tumor en el ratón ICR que padece cáncer de mucosa bucal (Zhu et al, 2014). El
extracto de I. paraguariens tiene la actividad quimiopreventiva al exhibir un cierto grado de
citotoxicidad contra las células HepG2 y también al inhibir las topoisomerasas II (Ramirez-Mares et
al, 2004).

Actividades antioxidantes y antiinflamatorias El extracto acuoso de I. pubescens puede inhibir la

proliferación del tejido conectivo causada por las salinidades, confrontar la necrosis epitelial de la
mucosa e inhibir la infiltración inflamatoria (Arbiser et al, 2005). Los experimentos clínicos
demostraron que el extracto acuoso de I. pubescens puede mejorar la función renal en el estadio de
uremia o la azotemia de los pacientes (Haam y Fine, 1932). La fracción de acetato de etilo de I.
latifolia tiene una actividad de potencia antioxidante significativamente reductora de férricos,
actividad de eliminación de radicales DPPH y capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno.
Además, tiene inhibición contra la producción de NO en macrófagos RAW 264.7 células, y
citotoxicidad contra células HeLa de carcinoma de cuello uterino humano (Hu et al, 2014). Los ácidos
Dicaffeoylquinic (diCQAs) de Yerba Mate pueden inhibir la inflamación de macrófagos RAW 264.7
inducida por LPS mediante la supresión de las vías NO / iNOS y PGE2 / COX-2 mediante la
inhibición de la translocación del núcleo de las subunidades NF-κB, p50 y p65 (Puangpraphant,
2012). Los extractos acuosos de I. kudingcha pueden inhibir la rata con una dieta alta en grasas en la
peroxidación lipídica de los hepatocitos como la forma dependiente de la dosis dentro de un cierto
rango de concentración, en el cual las fracciones de polifenol y flavonoides fueron responsables de la
propiedad antioxidante (Sultana, 2011). Los flavonoides de I. centrochinensis tienen capacidades de
eliminación de radicales libres y antiinflamatorias, debido a que su grupo hidroxilo en la posición 4
'del anillo B juega un papel importante (Li et al, 2015). I. brevicuspis, que se disemina en Argentina,
tiene actividades de propulsión colerética, antioxidante e intestinal (Filip y Ferraro, 2003). La fracción
rica en saponinas de las raíces de I. pubescens exhibe un efecto supresor sobre el edema agudo de
patas inducido por histamina en ratas y puede elevar significativamente los niveles tisulares de
citoquinas antiinflamatorias de IL-4 e IL-10 (Wang et al, 2008a )

Actividades antidiabéticas y antiobesidad El consumo de Kudingcha y Yerba Mate ha mejorado

el control glucémico y el perfil lipídico de la diabetes mellitus tipo II (DM2) (Hao et al, 2013). Yerba
Mate tiene la capacidad de disminuir la diferenciación de los preadipocitos y reducir la acumulación
de lípidos en los adipocitos, lo que conduce a una baja tasa de crecimiento de tejido adiposo y menor
peso corporal en modelos animales de obesidad inducida por la dieta (Kang et al, 2012) . El grupo de
componentes activos (ACG) de I. kudingcha puede reducir significativamente los niveles elevados
de glucemia sérica y los lípidos de la T2DM inducida por alloxan (Song et al, 2012). La decocción
de raíces de I. asprella puede regular al alza los genes del metabolismo lipídico que causan estrés
crónico e hígado graso hiperlipidémico en ratas Wistar macho (Hu et al, 2012). La fracción rica en
triterpenoides de I. hainanensis puede aliviar la resistencia a la insulina asociada con la regulación de
la expresión de PPARα y CYP2E1 en el hígado de ratas macho Sprague-Dawley (SD) (Cui et al,
2013). Peduncularide, un éster glucósido de las hojas de I. rotunda e I. doniana, mostró una actividad
significativamente hipocolesterolémica en ratas albinas hiperlipidémicas (Zhao et al, 2015).

Actividad antimicrobiana Los extractos metanólicos y etanólicos de Yerba Mate mostraron

actividad antimicrobiana contra patógenos alimentarios como Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Salmonella enteritidis y Helicobacter pylori, lo que refuerza la importancia de Yerba
Mate como un nuevo antimicrobiano natural (Martin et al, 2013). El extracto acuoso de Yerba Mate
(1000 mg / ml) también muestra la actividad inhibidora contra una especie de hongo Malassezia furfur
(Filip et al, 2010). El extracto de polaridad de I. cornuta leaves contiene los compuestos activos contra
Candida albicans y C. glabrata hongos patógenos (Zgoda y Porter, 2001). El ácido rotúrico de I.
integra fruits tiene una actividad antibacteriana de amplio espectro (Haraguchi et al, 1999).
Otras actividades Actividad de propulsión intestinal Los bioensayos mostraron que los extractos
de I. brevicuspis podían aumentar significativamente el flujo biliar (BF) en ratas Wistar hembras en
los primeros 30 min y el porcentaje de BF en 120 min. También produjo un aumento en la actividad
de propulsión intestinal (Filip y Ferraro, 2003).

Actividad antifertilidad El extracto de I. cornuta tiene el anti-embarazo y anti-implantación en

inyección sc o ip. Puede terminar cada etapa del embarazo en la DMT2 inducida por alloxan excitando
el útero (Song et al, 2012). Las saponinas totales de Kudingcha son responsables de excitar el músculo
liso uterino de las ratas SD in vitro (He y Du, 2012). Sin embargo, I. guayusa, una medicina herbolaria
tradicional ecuatoriana, se usa para tratar la infertilidad femenina, y Contero et al (2015) verificaron
que los extractos etanólicos de hojas de I. guayusa tengan actividad estrogénica en ratas.

Actividad antimitótica Dos análogos de paclitaxel, 10-deacetylaxuyunnanine A y 7- (β-xylosyl) -10-

deacetyltaxol C de las cortezas del tallo de I. macrophylla, mostraron la actividad antimitótica
significativa y causaron la agrupación de microtúbulos (Roberge y otros, 2000).

Discusión y prospectiva Aunque 600 especies de Ilex L. se distribuyen en todo el mundo, solo se
utilizan más de 40 especies como medicamentos y tés, de los cuales solo se han estudiado unas 20
especies. Revela que las especies de Ilex L. deben estudiarse más en fitoquímica y farmacología. En
general, las partes medicinales de las plantas Ilex L. se derivaron de hojas, cortezas y cortezas de raíz.
Investigaciones recientes informaron que los frutos de algunas especies también pueden usarse como
medicinas para la salud humana, lo que nos ayuda a descubrir más componentes y sus bioactividades
potenciales de otras partes de este género. Los triterpenoides y las saponinas triterpenoides son los
principales constituyentes de las plantas en Ilex L. responsables de diversas actividades
farmacológicas. Además, flavonoides, glucósidos, ésteres de pentilo y otros compuestos también se
han aislado de especies de este género. Las diferentes clases de compuestos son responsables de
diferentes bioactividades, por ejemplo, terpenoides y saponinas triterpenoides para la protección del
sistema cardiovascular y la modulación de las actividades del metabolismo lipídico, bioactividades
antiinflamatorias, antiobesidad y antimicrobianas; flavonoides, polifenoles y glucósidos fenólicos
para las actividades anticancerígenas, antidiabéticas, antioxidantes, etc. Afortunadamente, muchas
especies de Ilex L. se han usado no solo como medicamentos tradicionales sino también como bebidas
medicinales no alcohólicas. con una larga historia en el este de Asia, sur y norte de América. Hasta
la fecha, Kudingcha (I. latifolia e I. kudingcha), té Yerba Mate (I. paraguariensis e I. brevicuspis), té
guayusa (I. guayusa), té yaupon (I. vomitoria) y té apalache (I. glabra ) se les ha prestado más atención
y consumo popular en el mercado mundial debido a sus sabores especiales y valores medicinales:
prevención de varias enfermedades modernas relacionadas con el estilo de vida, como la enfermedad
cardiovascular, la obesidad, la diabetes y las enfermedades del cáncer. Este consumo de bebidas
coincide con la teoría del tratamiento preventivo de enfermedades en TCM. Entonces, el género Ilex
L. juega un papel irremplazable en la prevención de enfermedades modernas en la clínica.

ILEX GUAYUSA LOES (AQUIFOLIACEAE): PLANTA NATIVA AMAZÓNICA Y

ANDINA

Introducción La Amazonía Andina está ubicada en los países de Colombia, Ecuador, Perú y Bolivia,
abarcando aproximadamente tres cuartas partes del territorio de Perú y Bolivia, la mitad de Ecuador
y un tercio de Colombia. La Amazonía Andina se caracteriza por su riqueza en biodiversidad para
alimentos, medicinas, cosméticos y materias primas para la producción industrial (1). Ilex guayusa es
una de las muchas especies de plantas en esta región, también conocida como guayusa, guañusa,
huayusa, aguayusa y wuayusa (2). Durante siglos, los aborígenes de esta región han empleado Ilex
guayusa como agente diurético, hipoglucemiante, estimulante y en ceremonias rituales, entre otros
(3). La producción de Ilex guayusa ha aumentado en la zona de la Amazonía Andina en los últimos
años con el objetivo de exportar, así como de intoducir a otros países debido a sus propiedades
medicinales y estimulantes (4-6). Otros atributos medicinales incluyen ayudar en la formación de
cicatrices y como un diaforético. Se puede usar para tratar el asma o como expectorante. Sus
propiedades antiinflamatorias son conocidas, por lo que puede usarse contra el reumatismo. También
se puede utilizar como enjuague bucal, contra la gastritis, como emético, digestivo y diurético. Se
sabe que reduce los dolores de cabeza y cuerpo, el dolor muscular y los síntomas de la gripe. Entre
sus diversos usos se encuentran el emenagogo, durante el período de lactancia, para tratar
enfermedades venéreas, por disipación y pérdida de peso. Además, se puede consumir como té de
hierbas. Es un agente fortificante de la sangre, un regulador de la presión sanguínea con propiedades
hipoglogénicas y antioxidantes. Otros efectos beneficiosos incluyen el supresor de la fatiga,
proporciona agilidad física y mental, estimulante, alucinógeno, tonner, energizante, restaurador y
afrodisíaco. Por último, ayuda en el sentido de conciencia en todo el cuerpo debido a su contenido de
una mezcla de teofilina, teobromina y cafeína (7-18).

Métodos Los métodos utilizados para buscar, recopilar y analizar información incluyen los siguientes
bancos de datos: Plantlist, Scopus, PubMed, IsiWeb, Sprink link, Francis & Taylor, SIB Portal de
recursos bioinformáticos y Sinab. Se incluyeron libros y artículos referentes a aspectos etnobotánicos
de Ilex guayusa o cualquier tema relacionado con taxonomía o fitoquímica. Además, también se
emplearon libros y artículos que describen la actividad biológica, las propiedades medicinales y la
toxicidad, entre otros. La recopilación de información se llevó a cabo entre enero de 2012 y junio de
2016.

Taxonomía Ilex guayusa Loes, Nova Acta Acad. Caes. Leop.-Carol. Alemán. Nat. Canalla. 78:
310.1901. La planta pertenece al reino Plantae, Phylum: Magnoliophyta, Clase: Magnoliopsida,
Orden: Celastrales, Familia: Aquifoliaceae, Género: Ilex, Especie: Ilex guayusa Loes. El árbol puede
crecer entre 4 y 15 m de altura, con un tronco ramificado de hasta 1 m de diámetro. Tiene hojas
dentadas oblongas / elípticas verde oliva coriáceas, glabras o subglabrosas en la hoja, así como en la
parte posterior de la hoja. Las hojas están dispuestas de una manera simple y alternativa. Tiene un
ápice acuminado con una base aguda. Las hojas pueden crecer entre 15 - 21 cm de largo y 5 - 8 cm
de ancho, con un peciolo corto de 1 cm. Las flores tienen un cáliz persistente y los pétalos que forman
la corola son obtusos. El número de estambres es el mismo que el de los pétalos, con anteras oblongas.
El ovario sésil, subglose usualmente 4-6 células (lóculos). La fruta es una baya verde globosa de casi
1 cm de ancho (3, 19-21). La planta está clasificada bajo el voucher No. HPUJ 011734 en el Herbario
de la Pontificia Universidad Javeriana. Además, el Herbario Nacional Colombiano y el Herbario del
Jardín Botánico de Bogotá han clasificado esta especie en los cupones COL 523700 y JBB 10344,
respectivamente.

Distribución geográfica Ilex guayusa es una planta nativa del Neotrópico, con distribución natural
en Colombia, Ecuador, Perú y Bolivia (22, 23). De acuerdo con los especímenes depositados en el
Herbario Nacional de Colombia y el Herbario de la Universidad del Valle, esta planta se encuentra
en los departamentos de Nariño y Putumayo, de Mocoa a Sibundoy (20, 24), en el área comprendida
entre los departamentos de Putumayo y Caquetá en Colombia (25). En Ecuador esta planta se
encuentra en las provincias de Sucumbíos, Napo, Pastaza, Morona Santiago y Zamora Chinchipe.
Además, se ha registrado en las provincias de Pichincha y Tungurahua (26). En Colombia se informó
Ilex guayusa en el Departamento de Amazonas frente al extremo sur de la Isla Guadual, donde
comúnmente se lo conoce como "detzacogque" para la comunidad de Miraña. Además, en el
Departamento de Caquetá, la comunidad indígena Tucana lo ha llamado "Yurugú". Además, se ha
encontrado frente a la Isla Mariname en bosques mal drenados. Asimismo, se encuentra en el camino
ambiental de Mogambo (Figura 1), en el Municipio de Viotá, Departamento de Cundinamarca. Por
último, también está establecido en el Centro Nacional de Investigaciones Agroindustriales de
Especies de Plantas Aromáticas Tropicales (Centro Nacional de Investigaciones para la
Agroindustrialización de Especies Vegetales Aromáticas Medicinales Tropicales: Cenivam) en
Bucaramanga, Santander Colombia (27, 28).

Distribución Altitudinal De acuerdo con muestras depositadas en el herbario COL, Ilex guayusa
crece en Colombia a 2,000 msnm. Esta especie se distribuye en altitudes entre 200 y 2,000 msnm
(25). Se ha recolectado desde Ecuador a 500 msnm y Perù a 220 msnm (22). Además, en Ecuador
esta distribución de especies varía desde el nivel del mar hasta 1.500 msnm (26). Gupta informó que
esta planta puede crecer entre 200 y 350 msnm (29).

Ecología Ilex guayusa se encuentra en la selva baja neotropical de Colombia y en los bosques sub-
andinos (30). Este árbol perenne es nativo de la región amazónica, donde crece en estado salvaje. Sin
embargo, también está presente en plantaciones en regiones andinas subtropicales (26). Esta especie
crece en bosques tropicales húmedos en la Amazonía colombiana, ecuatoriana y peruana, formando
parte de bosques secundarios (31). Esta planta fue reportada en asociación fitosociológica con
Tabebuia insignis-Mauritietum flexuosae, definida como una unidad de vegetación que abarca
bosques pequeños a medianos, con un área basal corta, alta densidad de arbustos en la espesura y un
alto porcentaje de palmera (32). Ilex guayusa es un árbol reportado en la literatura con flores monoicas
y propensas a la poligamia; con arbusto como fisonomía durante la etapa juvenil. Además, está semi
domesticado en plantaciones. Su estrategia de reproducción asexual consiste en brotes basales, brotes
y retoños. Los ciclos fenológicos no informan actividad de materia fértil. La distribución antrópica se
limita al corredor peruano-ecuatoriano y amazónico colombiano, por lo que sus principales
requerimientos biofísicos son el recurso suelo y agua en sus tres formas: agua de lluvia, suelo y vapor.
Los suelos donde crece Ilex guayusa tienen una característica arenosa de arena con pH ácido entre
4.34 y 5.01. Tiene baja capacidad catiónica, alto contenido de aluminio y metales pesados, siguiendo
el patrón de suelos ácidos con tendencia a empobrecerse dependiendo de la vegetación sostenida sin
incluir árboles (32). Teniendo en cuenta sus requisitos de luz, puede considerarse una especie forestal.
Está designado como heliófito duradero, ya que su regeneración natural se puede mantener a niveles
de luz bajos. De hecho, los sitios semi-oscuros son los más recomendados para su proliferación.
Originalmente las plántulas guayusa necesitan poca luz para cumplir con sus funciones. Además, en
un ambiente libre de exposición a la luz, tiende a ramificar y producir brotes, ya que la yema terminal
se ha visto afectada por la luz y crece ramas. La formación de tallos proyecta una sombra sobre los
brotes basales que se generan en tallos muertos o poco vigorosos, generando un "lecho de suelo"
hecho de hojas y troncos, que finalmente se descomponen y sirven como nutrientes para las plántulas.
No se han reportado fenofases reproductivas. Ilex guayusa no se encuentra dentro de la categoría de
conservación en el catálogo de plantas vasculares, como el libro rojo, propuesto por la Unión
Internacional para la Conservación de la Naturaleza y los Recursos Naturales, es decir, no es
vulnerable, no está en peligro o en peligro crítico, por lo tanto, no es una especie en riesgo (26, 33-
35). Durante muchos años algunos botánicos especularon que Ilex guayusa se reproducía de una
manera asexual, ya que había perdido su capacidad de floración y producción de fruta a través de
años de selección y propagación vegetativa por parte del hombre. Esta teoría se basó en la falta de
especimenes con órganos reproductivos, por lo que su clasificación taxonómica es cierta (21). En la
actualidad se reproduce asexualmente, a pesar de la presencia de semillas. Los tallos sin hojas se
plantan para la propagación (4).

Etnobotánica En 1683 el jesuita Juan Lorenzo Lucero informó que los nativos shuar (conocidos
como jíbaros por los conquistadores españoles) usaban Ilex guayusa en sus actos medicinales mágicos
de la siguiente manera: "Colocaron juntas estas hierbas demoníacas (Datura, Banisteriopsis caapi,
Psychotria viridis, Justicia pectoralis, Brugmansia, Nicotiana rustica y otras plantas alucinógenas)
además de guayusa y tabaco, también inventado por el diablo. Los cocieron de una manera en que el
poco jugo producido se convirtió en la quintaesencia, con la creencia de que los que bebían fueron
recompensados con el fruto de una maldición del diablo por la desgracia de muchos". Lucero
describió a los Shuar como gente bien dispuesta, con buena apariencia física, acostumbrada a tomar
varias veces al día una decocción llamada "guayusa"; mantenerse despierto varias noches sin perder
el conocimiento, cuando se temía una invasión de sus enemigos. En la visión indígena, el ritual de
guayasa tiene un significado de purificación y se usó como una "bebida bode". Se consumió en altas
concentraciones para soñar, prever el futuro y adivinar si la caza o la pesca serían exitosas (3, 7, 19,
21, 22, 25, 36-39). En 1756 Fray Juan de Santa Gertrudis Serra declaró: "El árbol frondoso más
hermoso que he visto nunca, tronco grueso, con hojas verdes pacíficas y deliciosas. Las hojas tienen
un sabor muy sabroso, similar al té, pero más fino y apetitoso. Cuando la bebida transpira y elimina
la flema, reprime el ardor de la sangre y elimina la pesadez, ayuda a la digestión con sensación de
saciedad, da solidez y elimina todo malhumor. Cuando se bebe con miel obtenida de apate, las
mujeres quedan embarazadas "(20, 24). Los registros de 1756 indican que los indios Putumayo
(Amaguajes y Parayaguajes), además de los blancos, han empleado hojas de Ilex guayusa como una
infusión estimulante. Se consumiría por las mañanas para aliviar el hambre, se argumentó que no
tenían hambre desde temprano en la mañana hasta el mediodía (20). En 1943, el Instituto Botánico
de la Universidad Central de Ecuador emitió un boletín que informaba que hojas Ilex guayusa eran
usadas por personas de la región oriental como una infusión para el desayuno con la creencia de que
esta planta "los levantaría". Además, tenía un poder fertilizante y podría estar relacionado con casarse
(20, 24, 25). En 1857, Richard Spruce observó el uso de guayusa entre los nativos Shuar (Jíbaro)
como un emético para limpiar diariamente el estómago, como un purgante, como un narcótico e
hipnótico. Asimismo, exonerar el cuerpo antes de las tareas diarias, con creencias de purificación
escatológica, como un enjuague bucal diario ceremonial (14, 18, 22, 25, 38, 40-42). Infusión de hoja
de sabor agradable en forma de té. Se utilizó para tratar todos los escalofríos, las enfermedades
venéreas y para que las mujeres quedaran embarazadas cuando estaban estériles muchos años atrás.
A mediados del siglo XIX, se usaba guayusa para personas envenenadas. Además, las hojas quemadas
y luego mezcladas con cebada y miel se emplearon para tratar la amenorrea; hojas cocidas para tratar
la diarrea y el dolor de estómago. Alrededor del tercer cuarto del siglo XIX, los botánicos encontraron
la presencia de cafeína en las hojas (38). El cultivo boliviano prehispánico posiblemente emplea hojas
como un enema (18, 43, 44). Los kallawayas de la provincia de Bautista Saavedra en Bolivia son
conocidos por ser herbolarios expertos. Con más de un milenio en la práctica de la medicina
tradicional, se caracterizan por curar enfermedades físicas y espirituales. Un particular distintivo de
esta cultura es realizar cirugía cerebral. Además, emplean más de 1.000 plantas, entre ellas Ilex
guayusa, una planta parecida a un acebo como anestésico. Este uso se ha descrito ya en 700 A.C. (45,
46). Kallawaya es reconocido por los pueblos andinos (Perú, Bolivia y Argentina) como "Los Señores
de la Bolsa de Medicina" (4, 47). Los nativos de algunas localidades del departamento de Nariño
(Colombia) usan Ilex guayusa como planta medicinal, en particular para regular los ciclos
menstruales. La corteza y la madera se usan como estimulantes medicinales.

Infusión de hojas contra escalofríos, como narcótico y bebida estimulante. Con hojas secas y ramas
se prepara una bebida similar a la del Paraguay (Ilex paraguayensis) (29, 48). Toda la planta fresca
cocinada y bebida con limón y naranja sirve como diurético, contra la anemia y la hechicería. Ilex
guayusa ingesta de hojas cocidas con Pilea microphylla L. fresca (preñadilla) y Lycaste gigantea Lindl
fresca. La fruta (simayuca) se usa para la fertilidad masculina. Mezclado con el jugo de dos Citrus
aurantium L (naranja amarga) sirve como un suplemento de vitaminas, junto con la piel de naranja
amarga quemada se utiliza como incienso en las ceremonias. Estas dos últimas preparaciones también
se emplean contra el escorbuto, el dolor de estómago, la presión arterial alta, como un desodorante, y
para el "mal de aire" (síndrome de filiación cultural-aire malo). Decocciones de Ilex guayusa con toda
Pilea microphylla L. (preñadilla), con Eucalyptus globulus Labill (eucalipto aromático) y Lycaste
gigantea Lindl. (simayuca), y el azúcar se puede tomar a diario como diurético, contra enfermedades
venéreas, para los pulmones y con fines de fertilidad (49). La administración oral de hojas secas de
Ilex guayusa se usa para tratar la intoxicación sanguínea y la diabetes (13, 50). Debido a su alto
contenido de cafeína (2%) se considera una planta energizante (10, 14). Además, Ilex guayusa está
contra la drogadicción, la resaca y para eliminar el mal sabor del consumo de ayahuasca (51). En
Ecuador, esta especie se usa con frecuencia como una bebida refrescante y tónica, con efectos
similares al té asiático o al mate argentino-paraguayo. Se puede comprar en la mayoría de las tiendas
de comestibles como hojas secas. Se dice que tiene propiedades de fertilidad. Además, se usa como
estimulante, tónico, estomacal, digestivo y emético (3, 52, 53). Ayuda a la digestión y se afirma que
limpia el estómago y los intestinos, ya que tiene características eméticas. Asimismo, tiene
propiedades expectorantes, ya que su ingesta produce una explosión cálida en todo el cuerpo, lo que
permite la expulsión de flemas de los pulmones como resultado de los resfriados (10, 29, 40). En
2003 se llevó a cabo una investigación descriptiva, analítica y comparativa en las ciudades de Quito
(Ecuador), Puyo (Ecuador) y Bogotá (Colombia), encontrando los siguientes usos contra: esterilidad,
diabetes, asma, como diurético, durante el embarazo y el período de lactancia, como un enjuague
bucal, contra el cansancio, el dolor muscular, la pérdida de peso, como narcótico / chamán,
afrodisíaco, purgativo / emético y refrescante. Los datos recopilados por el conocimiento tradicional
demuestran un uso principal (12.8%) como emético y estimulante. Las técnicas de aplicación incluyen
baños, lavado, ungüento, cataplasma, ingesta o inhalación entre otros, cada ocho a 24 h (9). Ilex
guayusa es la planta más utilizada y cultivada por los indios Kichwa en el Cantón Loreto región en
Ecuador. Es la planta más importante en la vida cotidiana, ya que su consumo cada mañana produce
múltiples efectos como la suerte para la pesca y la caza, además de proporcionar protección contra
las mordeduras de serpiente (54, 55). En Perú, sus hojas se emplean como un suplemento dietético,
para la protección de la próstata y el riñón, favoreciendo la expulsión de cálculos renales (56). Desde
el punto de vista de la medicina etno-veterinaria Ilex guayusa es utilizado por los indios Shuar y
Quichua en Ecuador como una planta psicoactiva para mejorar el rendimiento y las capacidades de
los perros de caza, aumentando su sentido del olfato. Este uso podría ser implementado por la policía
o perros guardianes para detectar explosivos, drogas ilegales, restos humanos y otras actividades de
valor (57).

Fitoquímica Algunos estudios con esta planta revelan su contenido de cafeína, triterpeno y
clorogénico (14, 18, 58-60). La identificación de los compuestos familiares se realizó mediante
análisis fitoquímicos preliminares que identifican los taninos y los flavonoides en los extractos
acuosos y de etanol de las hojas, respectivamente (61). La cuantificación de polifenol evidenció 0,49
y 0,18 mg de ácido tánico por gramo de muestra para los extractos acuoso y de etanol,
respectivamente. El contenido total de fenol presente en el extracto de metanol de la hoja fue de 116,8
g de ácido gálico por g de muestra (62). El fraccionamiento guiado por bioensayo de extracto total de
metanol por actividad antioxidante y antihiperglucemia identificó Uvaol, por GC-MS (63). Racidi y
sus colaboradores informaron en extracto de éter de hoja la presencia de alcaloides, esteroides,
terpenos y compuestos lactónicos o de cumarina. Además, en los extractos acuosos saponinas,
fenoles, taninos, azúcares reductores y alcaloides; y en el extracto de etanol fenoles, alcaloides,
azúcares reductores, esteroides, terpenos, flavonoides y quinonas. Estos autores describieron que el
conocimiento fitoquímico de Ilex guayusa es aún muy limitado y otros estudios podrían sugerir
nuevos usos medicinales para esta planta (19). Otros compuestos presentes son metilxantina, teo
bromo, teofilina, guanidina, esteroides, aceites esenciales, ácido isobutírico, ácido nicotínico, ácido
ascórbico, riboflavina, colina, piridoxina, triterpenos, ácido clorogénico y azúcares, entre otros (10,
13, 22, 64) . Asimismo, contenido de polifenoles 40.1 mg / g), L-teanina (1.3 mg / g), teobromina
(0.4 mg / g) y cafeína (32.8 mg / g) han sido reportados (65, 66). En 2013 investigadores de la Escuela
Superior Politécnica del Litoral, en Ecuador, realizaron desde Ilex guayusa un estudio físico-químico,
bromatológico, sensorial y microbiológico. El análisis fitoquímico reveló alcaloides, flavonoides,
azúcares reductores, fenoles, triterpenos, quinonas, grasas y aceites. El estudio bromatológico indicó
un contenido de proteína entre 0.6 y 1.3%, contenido de grasa total entre 1.6 y 4.0%, contenido total
de cenizas entre 5.5 y 6.9%, cenizas insolubles de ácido clorhídrico entre 0.7 y 0.8%, sustancias
solubles en agua entre 0.9 y 2.9%, carbohidratos (incluyendo monosacáridos a polisacáridos
estructurales) entre 78.4 y 83.6%. El valor de pH del té preparado como infusión oscila entre 6.3 y
6.5, índice de refracción entre 1.3391 y 1.3651. La infusión tenía un color verde anaranjado, con
aroma ligeramente fragante y sabor indefinido. El contenido de cafeína fue del 3.7%, lo que indica
que este valor depende del tiempo de cosecha y de los factores ecológicos, geográficos y edáficos
(10). Otro estudio encontró valores promedio de cafeína de 2.9% para diferentes extractos
hidroalcohólicos, donde la concentración de etanol varió entre 50 y 80%, 13.8% de contenido total
de sólidos, pH de 4.6 y densidad relativa de 1.01 g / ml (66). Se realizaron análisis cuantitativos de
polioles y carbohidratos de tipo mono y disacárido usando valores de LC-MS / MS entre 0.006, 0.039,
0.25, 9.8, 13.2 y 14.03 mg / g para sacarosa, maltosa, sorbitol, glucosa y fructosa; respectivamente
(67). El análisis GCMS reveló ácidos triterpenoides pentacíclicos tales como ácido oleanólico (ácido
3b-hidroxi-olean-12-en-28oico) y ácido betulínico (ácido 3b-3-hidroxi-lup-20 (29) en-28-oico),
seguido de Cuantificación de LC-MS / MS con valores de 1,18 y 18,22 mg / g; respectivamente (68).
Además, el contenido de 19 aminoácidos se cuantificó por LC-MS / MS con valores que varían entre
10 y 280 mg / g para glicina, asparagina, serina, ácido aspártico, glutamina, treonina, alanina, ácido
glutámico, prolina, lisina, valina, histidina, metionina, arginina, tirosina, isoleucina, leucina,
fenilalanina y triptófano (69). El concentrado líquido estandarizado del análisis proximal de guayusa
demostró 66.4% de contenido de humedad, 4.9% de ceniza, 7.0% de proteína, 3.5% de azúcares
totales, 0.4% de grasas totales y 3.8% de fibra dietética. El análisis secundario de GC de metabolitos
determinó los siguientes componentes: cafeína (36 mg / ml), teobromina (0.3 mg / ml), ácidos
clorogénicos (52 mg / ml), polifenoles totales (10 mg / ml), catequina (2 mg / ml) , isoflavonas (0,8
mg / ml), epicatequina (0,18 mg / ml), galato de epicatequina (0,19 mg / ml), galato de
epigalocatequina (0,09 mg / ml), epigalocathequina (1,1 mg / ml), kaempferol (trazas) y naringina
(rastreo) (64).

Actividades biológicas Estudios en ratones con Diabetes mellitus tipo I, inducidos por tratamiento
con estreptomicina (STZ) demostraron la administración de la infusión de Ilex guayusa disminuyó el
desarrollo de hiperglucemia, redujo la hemoglobina glucosilada, la polidipsia y la pérdida de peso
(70, 71). Sarango en 2008 informó que el extracto de metanol de hoja tenía un efecto inhibidor contra
a-glucosidasa con una IC50 de 411 μg / ml (72). Otros estudios in vitro que evaluaron extractos de
hoja de Ilex guayusa en hexano, acetato de etilo y etanol demostraron actividad hipoglucémica con
inhibición de α- y bglucosidasas, enzimas asociadas con el desarrollo de diabetes mellitus tipo I. Para
500 μg / ml de extractos de hexano, acetato de etilo y etanol, la aglucosidasa se inhibió a 98.4, 79.1
y 58.2%, respectivamente. Del mismo modo, para la inhibición de la b-glucosidasa fue de 35.0, 52.5
y 84.2% para cada extracto a 1,000 μg / mL. Los resultados sugieren que esta planta podría
considerarse un posible neutracéutico en la dieta de pacientes diabéticos (73). El Vademécum de la
planta medicinal colombiana describe el extracto de hoja de etanol de Ilex guayusa que presenta
estimulación del sistema nervioso central y del sistema nervioso simpático, posiblemente debido a un
alto contenido de cafeína. El consumo de infusión estimula el sistema cardíaco, aumenta el estado de
alerta y aumenta la capacidad para realizar tareas físicas (74). El té caliente bebido a una
concentración de 10 g / l tres veces al día se usa como tratamiento para la diabetes (75). En Trujillo,
en el norte de Perú, tradicionalmente es utilizado por el curandero como una planta antiinflamatoria
y antimicrobiana. Los resultados de la actividad antibacteriana demuestran que la hoja es acuosa y
los extractos de etanol tienen una actividad biológica contra Staphylococcus aureus presentando halos
de inhibición de 14 mm (50, 76). El metanol, el etanol y los extractos hidroalcohólicos a 25 mg / ml
presentaron actividad antifúngica con halos de 16 mm para el extracto de etanol y 24 mm para el
extracto de metanol contra Candida albicans. Además, se observó un halo de 32 mm para el extracto
hidroalcohólico contra Microsporum canis (11). El trabajo interinstitucional llevado a cabo por
Calderón y colaboradores con 311 especies, incluyendo Ilex guayusa, evaluó el efecto antiparasitario
contra la malaria, la enfermedad de Chagas y la leishmaniasis, encontrando que el extracto de etanol
foliar presentaba una IC50 de 47,> 50 y> 50 mg / ml contra Trypanozoma cruzi, Plasmodium
falciparum y Leishmania mexicana, respectivamente (77). El efecto estrógeno del extracto
hidroalcohólico de la hoja Ilex guayusa se evaluó en ovarios, útero y estradiol sérico mediante
administración oral a ratas albinas (Rattus novergicus). Las dosis usadas de 9, 18 y 36 mg / kg por
día presentaron tal efecto en ratas inmaduras. Estos resultados sugieren Ilex guayusa potencial uso
para la infertilidad en mujeres (78, 79). Los ensayos de DPPH y TEAC revelaron su probable uso
antioxidante con una CI50 de 11.8 y 14.9 [μg / ml], respectivamente, para los extractos de metanol
en hojas (62). Además, la capacidad de absorbancia del radical de oxígeno (ORAC) en medios
acuosos y lipofílicos informó valores de 658.9 y 0.3 μmol de TE (equivalente de Trolox) por gramo
de muestra para ORAChydro y ORAClipo, respectivamente (65). Investigadores del Departamento
de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia evaluaron la capacidad antioxidante in vitro e
in vivo en extractos de etanol y hojas acuosas. La absorción del radical anión superóxido de xantina
/ xantina oxidasa medida como inhibición de la reducción del nitroblue tetrazolio (NBT) fue de 64 y
57% para los extractos acuosos y de etanol, respectivamente. Además, la captación de radicales de
peroxilo se midió en la capacidad de absorción de radicales de Aroxyl ABAP / sistema de lisozima
encontrando valores de inhibición de 15 y 18% para extractos acuosos y de etanol, respectivamente.
La absorción de radicales hidroxilo generada en el sistema H2O2 / Fe + 3 / EDTA / ascorbato
demostró para el extracto acuoso una absorción del 42% y una captación del 18% para el extracto de
etanol. La peroxidación lipídica microsomal hepática utilizando el método no enzimático Fe + 2 /
EDTA / ascorbato / H2O2 determinó valores de porcentaje de inhibición del 93% para el extracto
acuoso y del 96% para el extracto de etanol (61). La elaboración del gel cosmético basado en Ilex
guayusa por investigadores ecuatorianos estableció un agente protector de la piel además de tener un
efecto lipolítico. Ilex guayusa in vivo efecto anticelulítico se evaluó en mujeres entre las edades de
30 y 50 años. Sus hallazgos evidenciaron una reducción en las medidas corporales y en la apariencia
de la piel de textura anaranjada conocida como celulitis, proporcional al tiempo de tratamiento. Este
efecto es probablemente debido al contenido de cafeína en la planta (66).

Toxicidad Ilex guayusa podría afectar el sistema nervioso si se consume con alimentos en grandes
cantidades (29, 52). En el Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia se
evaluó un modelo de hepatoxicidad in vivo utilizando ratas Wistar. Los animales afectados fueron
inducidos por la administración de CCl4, y como control positivo se usó Sylimarin (61). El estudio
histopatológico no reveló ningún signo de toxicidad considerable (80). El Vademécum de la planta
medicinal colombiana indicó que el consumo de bebidas de infusión o decocción de Ilex guayusa no
presentaba signos de toxicidad aguda (74). Las pruebas multidimensionales con extracto de etanol de
1,000, 500, 250 y 125 mg / kg no causaron letalidad en los animales. En adición las dosis de infusión
repetidas fueron seguras (74, 80). Debido a su alto contenido de cafeína, no se recomienda para
mujeres embarazadas. El consumo excesivo puede producir vómitos y alteraciones en el SNC (74).
En un trabajo de colaboración entre los EE. UU. Y Perù, los investigadores evaluaron la toxicidad del
extracto de alcohol y agua de 341 plantas, incluyendo Ilex guayusa usando la prueba de letalidad del
camarón de salmuera. Los resultados demostraron una LC50> 10.000 μg / ml para el extracto acuoso
y 300 μg / ml para el extracto de etanol (81). Indígenas Achuar de la Amazonía Ecuatoriana señalaron
que la mezcla de Ilex guayusa con otras plantas puede ser tóxica. Por ejemplo, su decocción con
Psidium guajava produce una bebida venenosa (12). Kapp y colaboradores evaluaron el concentrado
líquido estandarizado de guayusa usando pruebas de genotoxicidad in vitro, con prueba de mutación
inversa bacteriana (prueba de Ames). Además, se realizó un estudio de aberraciones cromosómicas
en linfocitos humanos. La prueba de Ames estableció un resultado negativo. Del mismo modo, no se
observaron aberraciones estructurales o numéricas para el estudio cromosómico. La toxicidad aguda
por administración oral con una dosis de 5.000 mg / kg en ratas hembras estableció una respuesta de
salivación, hipoactividad, respiración anormal, postura encorvada, heces disminuidas y suaves. Todos
los animales se recuperaron al tercer día de administración y continuaron saludables hasta el día 14
del estudio. La necropsia no mostró anomalías graves. Los resultados sugirieron que la dosis letal
media en ratas hembras era> 5,000 mg / kg. La prueba de toxicidad subcrónica de 90 días por
administración oral a 1.200, 2.500 y 5.000 mg / kg en ratas hembras y machos no reveló toxicidad
asociada con el concentrado líquido estandarizado de guayusa. En las mujeres se encontró un conteo
alto de neutrófilos y basófilos, dependiendo de la dosis administrada de Ilex guayusa. Además, se
observó una hipertrofia adaptativa distinta en las glándulas salivales, con un mayor impacto en las
mujeres, dependiendo de la dosis. Además, la química sanguínea se alteró con los siguientes valores
que aumentan en el suero sanguíneo: aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa sérica y
colesterol. Se observó una reducción del peso corporal y la eficiencia de los alimentos, disminución
de los valores de triglicéridos y disminución del peso de la almohadilla grasa. Sin embargo, no se
observaron efectos nocivos. Por lo tanto, este estudio no indicó efectos nocivos en el concentrado
líquido de guayusa en este sistema modelo (64).

Estudios fitoquímicos de fracciones y compuestos presentes en Vernonanthura Patens con

actividad biológica antimicótica y potencial como antineoplásico

Introducción La investigación fitoquímica está estrechamente relacionada con las necesidades de

encontrar productos farmacéuticos nuevos y efectivos. La búsqueda de sustancias vegetales que
puedan usarse para desarrollar nuevas drogas terapéuticas contra enfermedades reconocidas
catastróficas como el cáncer, la diabetes y el SIDA es uno de los principales temas en los que los
investigadores se han enfocado en todo el mundo. La maravillosa diversidad de plantas de América
del Sur y más específicamente de la región amazónica tiene alrededor del 30-50% de la biodiversidad
mundial, ya que es una fuente importante para este tipo de estudio. Además de los importantes
recursos no descubiertos de estas regiones, el conocimiento ancestral de los pueblos indígenas es otra
fuente relevante y complementaria para los programas de biodescubrimiento. Los curanderos
tradicionales guardan siglos de conocimiento acumulado sobre los recursos medicinales naturales de
esta región. Estos antiguos "médicos" son la clave para descubrir nuevas drogas que podrían
beneficiar a millones de personas en todo el mundo. La selva amazónica ha aportado docenas de
sustancias a la medicina occidental. Entre los más conocidos están el "curare"; un componente clave
de los anestésicos modernos y la quinina, la primera contribución de la "medicina natural" para tratar
la malaria1. El estudio de nuevas especies de plantas y la elucidación estructural de sus moléculas
bioactivas son los objetivos más importantes de la investigación fitoquímica que se encuentra en
constante desarrollo tecnológico.

El cribado fitoquímico inicial y el posterior aislamiento, purificación e identificación de la estructura

de las moléculas han supuesto un gran avance con el desarrollo de nuevos métodos de cromatografía
y espectroscopia. El establecimiento de bioensayos nuevos y más efectivos es también uno de los
aspectos esenciales que respaldan los programas de biodescubrimiento en la actualidad. Este capítulo
contiene los principales resultados del estudio fitoquímico de hojas de Vernonanthura patens que, de
acuerdo con el conocimiento ancestral, se han utilizado para tratar diferentes enfermedades en
humanos.

Clasificación botánica, características generales y conocimiento etnobotánico de

Vernonanthura patens. Vernonanthura patens es una planta silvestre ampliamente distribuida en
toda América. Crece de 0 a 2200 metros sobre el nivel del mar en la región costera ecuatoriana. La
medicina popular utiliza sus hojas cocidas para combatir la malaria, el tratamiento de posparto y para
curar heridas infectadas de animales mediante el lavado con una mezcla de plantas que incluye hojas
de V. patens (Blair, 2005). También se usa contra dolores de cabeza, para limpiar y curar heridas
(Kvist et al., 2006); tratamiento de la leishmaniasis (Gachet et al., 2010); preparación de antiveneno
(Tene et al., 2007) y como cataplasma de hojas para combatir el pie de atleta (Valadeau et al., 2009).
Su utilidad para tratar ciertos tipos de cáncer también ha sido referida por curanderos indígenas. Sin
embargo, hay pocos estudios químicos sobre esta especie
Vernonanthura patens (Kunth) H. Rob. Clasificación botánica y características generales Especies V.
patens pertenece a la familia Asteraceae, citando 60 sinónimos y un basiónimo (Vernonia patens
Kunth) (ARS-GRIN, 2009). Referido a Vernonia patens HBK en la lista de especies lignocelulósicas
investigadas en Ecuador, es una fuente de materia prima para la elaboración de pasta y papel (Acuña,
2000). También es comercialmente importante en la industria apícola, y está clasificada como una de
las plantas de abejas melíferas más importantes de Tundo, Olmedo y Loja (Camacho, 2001) por su
excelente producción y disponibilidad de néctar y polen (Ramirez et al., 2001) . En la provincia
ecuatoriana de Zamora es una de las cuatro especies ecológicamente importantes que pertenecen a las
familias típicas de bosques alterados que se han regenerado (Camacho, 2001; REMACH, 2004).
Ahora está registrado como especie arbórea representativa de bosques secundarios en la zona costera
ecuatoriana (Aguirre, 2001). La especie tiene los siguientes sinónimos (Blair, 2005):

Distribución geográfica V. patens es originaria de América y se puede encontrar en Belice, Costa

Rica, Brasil, Venezuela, Panamá, Bolivia, México y Ecuador según los datos del Missouri Botanical
Garden.

Hábitat V.patens crece silvestre en el bosque interandino ubicado en el sur de Ecuador; su altura
máxima es de 3-6 metros y su distribución altitudinal está entre 0 y 2000 metros sobre el nivel del
mar (Tobías, 1996; León, 2006). Esta especie ha sido identificada en la comunidad vegetal de bosques
secos al suroeste de Ecuador3. Esta especie a veces se cultiva o se mantiene en granjas después de su
aparición espontánea. En general, se puede encontrar cerca de la pista forestal y en el borde de los
ríos. Floración y fructificación ocurre entre mayo y octubre.

Información botánica V. patens (Figura 1), es un pequeño arbusto ramificado, crece hasta seis
metros de altura con tallos surcados y tricomas ferruginosos. Las hojas alternas son pecioladas,
estrechamente lanceoladas, pecioladas con tricomas ferruginosos, de 4-11 mm de largo; las hojas son
enteramente o débilmente dentadas, la base redondeada con un ápice puntiagudo o acuminado tiene
7-15 cm de largo y 1.3-1.2 cm de ancho, la superficie adaxial es brillante y la abaxial es pubescente
o puberulenta, subcoriácea, penninervada. La inflorescencia es paniculada, terminal, ramificada
extendida con las terminaciones escorpioideas, provista de hojas y brácteas, capiteladas sésiles y muy
poco pediceladas, con numerosas flores acampanadas, 8 mm de largo, 4-5 series de brácteas
imbricadas, tomentosas y de color marrón oscuro , corola glabra, alrededor de 5 mm de largo, achenes
débilmente pubescentes, pelos de pappus con bordes irregulares en forma de capas que tienen
aproximadamente 7 mm de largo. Una descripción detallada de las características botánicas de esta
especie ha sido publicada por Blair (2005).

Información etnomédica En Ecuador, los habitantes del suroeste de Loja y la región de Marcabelí
en la provincia de El Oro reconocen tanto su poder curativo como su acción analgésica. Usan las
hojas de V. patens para lavar heridas y aliviar dolores de cabeza. También se emplea como
antiinflamatorio para calmar la tos y contra ciertos tipos de cáncer. Además, se describe una práctica
veterinaria, ya que puede curar heridas infectadas lavándolas con una mezcla de plantas que incluye
hojas de esta especie (Blair, 2005). Otros usos interesantes también han sido reportados.

Gacheta et al. (2010) informaron su utilidad para el tratamiento con leishmanianis; Tene et al (2007),
que indica su uso en la preparación de antiveneno, y el uso de hojas de "laritaco" en cataplasmas para
combatir el pie de atleta, es referido por Valadeau et al. (2009). Se han registrado diferentes usos de
V. patens en otros países de América del Sur. En la comunidad boliviana de Tacama, el jugo del tallo
de la planta se aplica contra la conjuntivitis (Tacana, 1999) y en Colombia las infusiones acuosas de
las partes aéreas mezcladas con "panela" 4, el vino blanco y el romero se usan contra la malaria.
También se usa para aliviar el dolor debido al parto y para purgar (Blair, 2005).
 Actividad biológica y química Existen muy pocos estudios biológicos y químicos de la especie V.
patens. Los únicos resultados publicados hasta ahora se refieren a la actividad antipalúdica contra
Plasmodium falciparum, cepa Itg2 (Blair, 2005), actividad anti Leishmania (Valadeau et al., 2009)
de las hojas de esta especie y ninguna actividad antiprotozoaria contra diferentes cepas de Leishmania
(Fournet, 1994). Sobre la composición química de la especie, informa la ausencia de lactonas
sesquiterpénicas y sesquiterpenos presentes en las partes aéreas (Mabry, 1975; Jakupovic, 1986).
Existen algunas referencias sobre el género Vernonanthura que muestran la presencia de compuestos
de diterpenos (Portillo et al., 2005; Valadeau et al., 2009), flavonoides (Borkosky et al., 2009;
Mendonça et al., 2009), triterpenos (Tolstikova). et al., 2006, Gallo et al., 2009), saponinas (Borkosky
et al., 2009) y lactonas sesquiterpénicas. Además, se han descrito diferentes actividades biológicas
asumiendo que ciertos grupos químicos podrían ser responsables de las propiedades terapéuticas
atribuidas a las especies de este género (Pollora et al., 2003, 2004; Portillo et al., 2005; Bardon et al.,
2007). ) Estos fueron los principales factores que llevaron al Laboratorio Bioproductos Centro de
Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador a realizar un estudio químico-farmacológico de
Vernonanthura patens hojas de plantas que crecen en áreas ecuatorianas. Dichas investigaciones son
parte del Programa Biodiscovery desarrollado por este centro.

Detección fitoquímica Como un paso inicial de la investigación de detección fitoquímica, permite

determinar cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos presentes en una
planta. Esta selección puede guiar la posterior extracción y / o fraccionamiento de extractos para el
aislamiento de grupos de interés. La rutina de cribado fitoquímico se realiza por extracción con
disolventes adecuados de polaridad creciente y la aplicación de reacciones de color (Miranda y
Cuellar, 2001). Estas reacciones se caracterizan por su selectividad hacia tipos o grupos de
compuestos, su simplicidad, corto tiempo y la capacidad de detectar pequeñas cantidades de
compuestos usando un mínimo de equipo de laboratorio. Los resultados se registran por la presencia
(+) o ausencia (-) de las reacciones de color.

El esquema general de los pasos seguidos para realizar el examen fitoquímico de las hojas de V.
patens se presenta en la Figura 2, mientras que el análisis de los extractos obtenidos en diferentes
polaridades se muestra esquemáticamente en la Figura 3. Esta metodología ha sido referida
anteriormente (Miranda & Cuellar , 2000; Manzano et al., 2009).

El material vegetal de hojas adultas de Vernonanthura patens (laritaco) se utilizó de plantas en estado
vegetativo que crecían en las ciudadelas "25 de julio", "Imbabura" y "24 de junio" y todas pertenecen
al Cantón Marcabelí, provincia El Oro. , Ecuador. Las hojas fueron recolectadas a primera hora de la
mañana en diferentes fechas durante los meses de diciembre a febrero de 2009 y 2010. Se realizó
identificación botánica y se prepararon especímenes de voucher de las hierbas y se depositaron en el
Herbario Nacional de Ecuador (QCNE) y una muestra duplicada (CIBE37) ) se mantuvo como testigo
de hierbas en el laboratorio de los Bioproductos CIBE-ESPOL. Anterior

el consentimiento fue obtenido y autorizado por las agencias correspondientes del gobierno. El trabajo
de campo y la recopilación de datos se realizaron de acuerdo con los principios y directrices
institucionales, nacionales e internacionales para el uso y la conservación de la biodiversidad vegetal.
Para llevar a cabo el cribado fitoquímico, la extracción y el fraccionamiento, las muestras de hojas se
secaron usando un secador automático (45 ° C, 8 horas) y luego se pulverizaron en un mezclador y
se tamizaron. La fracción que permaneció en el tamiz de 2 mm de diámetro se recogió y se mantuvo
en bolsas de polietileno de baja densidad a 24 ° C. El resultado del cribado fitoquímico se presenta
en la Tabla 2. Esto revela una concentración de moderada a baja de aceites esenciales, alcaloides,
compuestos reductores, fenoles, taninos, flavonoides, quinonas, saponinas, triterpenos y esteroides.
Algunos de estos compuestos químicos se han asociado a propiedades antibacterianas, antifúngicas,
antiprotozoarias y citotóxicas y, por lo tanto, tienen un potencial uso terapéutico (Nweze et al., 2004;
Reuben et al., 2008; Vital et al., 2010).

Extractos de plantas, fracciones y compuestos El material vegetal seco (67 g de hojas de V. patens)
se sometió a extracciones sucesivas con metanol de grado HPLC por maceración en un recipiente
cerrado y en ausencia de luz. El tiempo de extracción fue de ocho días y se llevó a cabo hasta el
agotamiento total del material vegetal; agitador y un evaporador rotativo se utilizaron para la
recuperación del disolvente.

El extracto se evaporó a sequedad, produciendo 7 g (10,44%) de extracto de metanol. El residuo de

metanol se sometió a fraccionamiento por cromatografía en columna sucesiva (CC) empaquetada con
sílice activada de malla 60 a 200; la elución se realizó con disolventes de polaridad creciente usando
mezclas de hexano y acetato de etilo (10, 9: 1, 8: 2, 3: 7, 10) (Tabla 3). Los extractos se analizaron
mediante cromatografía de capa fina (TLC) sobre cromatofolios de gel de sílice 60 F254 (Merck) con
indicador fluorescente y un sistema disolvente hexano / acetato de etilo (9: 1). Las placas se
observaron bajo luz UV a longitudes de onda de 254 y 366 nm.

Se obtuvieron seis fracciones (Figura 6): Fr 1 hexano (79 mg), Fr 2 Hex / EtOAc 90:10 (1370 mg),
Fr 3 Hex / EtOAc 80:20 (0,60 mg), Fr 4 Hex / EtOAc 30:70 ( 0,41 mg), Fr 5 EtOAc (0,21 mg),
fracción 6 de EtOAc / MeOH 70:30 (1760 m g) y tres compuestos puros de la fracción de EtOAc 10
y 20% (Figura 7): 57 mg del compuesto [1], 20 mg del compuesto [2] y 90 mg del compuesto [3].
Las fracciones aisladas con diferentes disolventes del extracto metanólico de hojas de V. patens por
cromatografía en columna, no se han referido a esta especie, dando como resultado una gran masa en
la fracción de hexano (79 mg) en comparación con otras fracciones extraídas. Sin embargo, los
extractos de metanol, acetato de etilo y hexano de otras especies de plantas mostraron una actividad
antimicrobiana relevante (Ramya et al., 2008).

. Bioensayos Los ensayos para evaluar la bioactividad de productos naturales han tenido una
impresionante historia de desarrollo y son una de las claves para descubrir nuevos compuestos
bioactivos naturales. En este estudio, se realizó una evaluación preliminar cualitativa de la capacidad
antifúngica de fracciones y compuestos puros aislados para seleccionar los más activos. Los
seleccionados fueron reevaluados para cuantificar su capacidad para inhibir el crecimiento fúngico.
El método de difusión (Avello et al., 2009) en papa dextrosa agar (PDA) se utilizó para determinar la
actividad antifúngica de fracciones y compuestos puros aislados de hojas de V. patens a 100 y 200
μg mL-1. Las diluciones se hicieron con dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%.

Se utilizaron cepas de Fusarium oxysporum y Penicillium notatum, aisladas de frutos infectados de

Pinus radiata y Citrus sinense y mantenidos en la colección de hongos de la Universidad de
Concepción. Se realizaron orificios de 5 mm Ø en el agar con un taladro de corcho estéril y se llenaron
con 20 μL de cada concentración de fracciones y compuestos puros. DMSO 10% se usó como control
negativo en cada placa. Se colocó un disco (5 mm Ø) de hongo ya cultivado en el centro de placas de
Petri y se incubó a 22 ° C. Las evaluaciones se realizaron durante dos semanas. El diseño experimental
se aleatorizó completamente y cada ensayo se realizó por triplicado. Se realizaron estadísticas
descriptivas de los datos experimentales para representar y señalar sus características más
importantes. La actividad antifúngica más relevante se observó en la fracción 1 (100% de hexano) y
los compuestos puros 1 y 3 en las dos concentraciones ensayadas. La fracción de hexano inhibió el
crecimiento de ambas especies de hongos probadas. La mayor inhibición ejercida contra Penicillium
notatum (80.2%) y Fusarium oxysporum (81.5%) ocurrió cuando se usó 200 μg mL-1 de esta fracción.
Las diferencias estadísticas (P≤0,05) con controles negativos indicaron que el DMSO no influyó en
los resultados de la evaluación biológica. Los compuestos puros mostraron propiedades de inhibición
selectiva y cierta dependencia de la concentración en su actividad antifúngica. El compuesto 1 mostró
una tasa de inhibición de 50 y 90% (100 y 200 μg mL1 respectivamente) contra Penicillium notatum
mientras que el compuesto 3 fue capaz de inhibir 80 y 100% del crecimiento de Fusarium oxysporum
para cada concentración ensayada. La detección de actividad antifúngica de fracciones y compuestos
puros de V. patens se ha llevado a cabo por primera vez. El potencial de estos resultados es relevante.

Identificación estructural y análisis cuantitativo de las fracciones y compuestos aislados

Caracterización química de la fracción con actividad antifúngica Se analizó la fracción aislada con
actividad antifúngica para su identificación estructural mediante cromatografía de gases y
espectrometría de masas (GC-MS) utilizando un cromatógrafo de gases Agilent 7890A con un
detector Agilent 5975 (Avondale, PA.USA). con una columna HP-5MS de 5 m de longitud (0.25 mm
de diámetro y 0.25 cm de diámetro interior). Se usó helio como gas portador; las condiciones
analíticas fueron: temperatura inicial: 100 ° C (aumento de 8 ° C por minuto hasta una temperatura
final de 250 º C); temperatura de entrada y detector de masa: 250 oC y 300 ° C respectivamente. El
detector de masas se usó en modo de exploración ("exploración") con un rango de 100 a 400 amu.
De acuerdo con esta técnica y las condiciones analíticas descritas, este cromatograma se obtuvo y se
muestra en la Figura 8. Utilizando la computadora de la biblioteca y teniendo en cuenta los
compuestos que excedieron el 90% de confianza, se pudieron asignar estructuras de 33 componentes
(Tabla 4). ) Los compuestos identificados son en su mayoría hidrocarburos, un resultado lógico dado
el disolvente utilizado. Hubo una abundancia relativa de posibles sesquiterpenos bicíclicos (picos 1-
5) y del triterpeno escualeno acíclico (pico 30). Para los sesquiterpenos existen antecedentes de
actividad antimicrobiana (Gregori et al., 2005) y para el escualeno se informa de actividad
antioxidante, antitumoral y actividades antimicrobianas, además de su efecto beneficioso para
prevenir enfermedades cardiovasculares al reducir el colesterol y los triglicéridos (Garcia et al., 2010).

Por esta razón, es posible suponer que la actividad antifúngica de V. patens contra F. oxysporum y
P. notatum que se ha determinado podría estar relacionada con la presencia de escualeno a pesar de
no ser el componente principal de la fracción probada. Los compuestos restantes, individual o
colectivamente, también podrían estar involucrados en la bioactividad demostrada. Los resultados
descritos aquí no han sido reportados previamente para V. patens.

Identificación estructural de compuestos aislados Las estructuras de los tres compuestos aislados
de la fracción soluble en hexano mediante cromatografía en columna se identificaron por sus patrones
espectroscópicos en comparación con las referencias. Estos compuestos puros se identificaron como
Lupeol (compuesto 1), acetil Lupeol (compuesto 2) y Epi Lupeol (compuesto 3) (Figura 9). La
espectroscopia se realizó en el Laboratorio de Química Orgánica de la Universidad de Lund. Se
registraron 1H RMN (500 MHz) y 13C NMR (125 MHz) a temperatura ambiente con un
espectrómetro Bruker DRX500 con una cabeza de sonda inversa multinuclear de 5 mm equipada con
una bobina de gradiente blindada. Los espectros se registraron en CDCl3 y las señales del disolvente
(7,26 y 77,0 ppm, respectivamente) se usaron como referencia. Los desplazamientos químicos (δ) se
dan en ppm y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Los experimentos COSY, HMQC y HMBC
se registraron con mejoras de gradiente utilizando pulsos de gradiente en forma de seno. Para la
espectroscopia de correlación heteronuclear 2D, los retardos de reenfoque se optimizaron para 1JCH
= 145 Hz y nJCH = 10 Hz. Los datos brutos se transformaron y los espectros se evaluaron con el
software estándar Bruker XWIN-NMR (rev 010101).

Los resultados que se muestran en este capítulo no están publicados y no han sido registrados
previamente para la especie V. patens. A pesar de que las estructuras dilucidadas de los compuestos
puros se han encontrado en otras especies vegetales, reconocen su diversa actividad biológica que
incluye la acción antineoplásica contra ciertos tipos de cáncer (Gallo y Sarachine, 2009).
7. Observaciones finales La selección fitoquímica de V. patens ha demostrado la presencia de aceites
esenciales, alcaloides, compuestos reductores, fenoles, taninos, flavonoides, quinonas, saponinas,
triterpenos y esteroides, algunos de los cuales se han asociado previamente a actividades biológicas
importantes. Las fracciones y los compuestos puros de esta especie se examinaron por primera vez
para determinar la actividad antifúngica. La fracción de hexano y dos compuestos puros identificados
adicionalmente como Lupeol y Epilupeol, fueron activos contra dos importantes patógenos fúngicos
a alta velocidad (80-100%). La fracción de hexano redujo el crecimiento de Fusarium oxysporum en
80% y Epilupeol inhibió por completo el crecimiento de Fusarium oxysporum. Treinta y tres
compuestos químicos en la fracción de hexano de hojas de V. patens se determinaron, de los cuales
deben ser hidrocarburos. La actividad antifúngica de esta fracción puede estar relacionada con la
presencia de escualeno y / o la actividad combinada de otros compuestos identificados. Se debe
realizar más investigación para determinar la bioactividad específica de los compuestos identificados.
Se elucidaron las estructuras químicas de tres compuestos aislados, que corresponden a Lupeol, Acetil
Lupeol y Epi Lupeol. Estos compuestos son reconocidos por sus actividades biológicas significativas
y diversas, incluidas las acciones antimicrobianas y antineoplásicas. Los resultados de este estudio
muestran que V. patens puede considerarse como un candidato potencial importante para una e
investigaciones biológicas y justificar su inclusión en el programa de biodescubrimiento de CIBE.

Flavonoles, proantocianidinas y cambios de actividad antioxidante durante tostado de cacao

(Theobroma cacao L.) según la temperatura y el tiempo de procesamiento

Una serie de estudios han demostrado que el consumo de cacao y los productos de chocolate tienen
efectos positivos para la salud de los humanos. Se supone que estos efectos sobre la salud están
asociados con la presencia de polifenoles, entre los que se encuentran los flavonoides monoméricos
3-oles, (+) - catequina y (?) - epicatequina, así como oligomérica y procianidinas poliméricas o
proanthocyanidin, que muestran alto capacidad antioxidante (Adamson et al., 1999).

Las proantocianidinas que se encuentran en el cacao son taninos, que varían en tamaño desde
monómeros hasta polímeros de cadena larga (Ortega et al., 2010), y su tamaño se describe por el
grado de polimerización (Gu, House, Wu, Ou, y Prior, 2006). Los estudios in vitro han confirmado
que las proantocianidinas exhiben varias propiedades biológicas, asociadas con la actividad
antioxidante (Adamson et al., 1999; Counet & Collin, 2003; Lee, Kim, Lee, & Lee, 2003; Othman,
Ismail, Ghani, y Adenan, 2007), como el capacidad de eliminar radicales superóxido y radicales
hidroxilo, reducir los radicales peroxilo lípidos e inhibir la peroxidación lipídica (Kanner, Frankel, y
Granet, 1994; Salah et al., 1995; Vinson y Hontz, 1995). Recientemente, estos compuestos han atraído
un aumento atención en los campos de la nutrición y la salud ya que están asociados con actividad
antiinflamatoria y antiaterosclerótica, presión arterial y modulación de la función inmune y activación
plaquetaria (Ramiro et al., 2005; Katz, Doughty, y Ali, 2011; Latif, 2013). Para obtener chocolate,
las semillas de cacao deben ser sometidas a un proceso de post-cosecha de varios pasos, por el cual
los frijoles pueden ser convertido en cacao y, finalmente, en productos industriales finales.

El procesamiento de cacao para chocolate afecta drásticamente los polifenoles cantidad y calidad de
granos de cacao (Caligiani, Cirlini, Palla, Ravaglia, y Arlorio, 2007; Di Mattia et al., 2013; Gu et al.,
2006; Payne, Hurst, Miller, Rank y Stuart, 2010; Wollgast & Anklam, 2000). El tostado es la
operación tecnológica más importante en el procesamiento de granos de cacao, ya que provoca la
formación de características color marrón, aroma suave y textura de frijoles tostados (Krysiak, 2006).
La tostadura también afecta la capacidad de los polifenoles para interactuar con proteínas, causando
una disminución en la astringencia (Misnawi, Jamilah y Nazamid, 2005).
Las revisiones bibliográficas sugieren que el impacto del tueste en la calidad Los índices deben
estudiarse teniendo en cuenta el impacto de los parámetros del proceso; de hecho, el grado de tostado
de cacao depende tanto del tiempo de tostión como de la temperatura, con temperaturas que van desde
120 a 150 ° C y tiempos de tostado que varían desde De 5 a 120 minutos, dependiendo de la
temperatura (Krysiak, 2006, 2011).

Se ha informado durante mucho tiempo que, durante la torrefacción, flavonoides monoméricos

(compuestos de catequina y epicatequina) reducen en concentración (Caligiani et al., 2007; Kothe,
Zimmermann, y Galensa, 2013; Payne et al., 2010). Payne et al. (2010) y Kothe et al. (2013) estudiado
la evolución de las proantocianidinas monoméricas, diméricas y triméricas como una función de la
temperatura de tostado sin considerar el efecto de los tiempos de tostado. Otros autores determinaron
el antioxidante actividad de extractos metanólicos de cacao afectados por el tostado (Arlorio et al.,
2008; Suazo, Davidov-Pardo, y Arozarena, 2014) pero estos estudios dieron resultados
contradictorios, aunque el mismo temperatura de tostado y ensayo de actividad antioxidante.

El objetivo de este trabajo es estudiar la evolución de los monómeros y flavonoides condensados

(proantocianidinas), así como cambios en actividad antioxidante durante el proceso de tostado de
cacao, como una función de la temperatura y el tiempo de tostado, para identificar las combinaciones
de tiempo y temperatura que maximizan el polifenol contenido y actividad antioxidante de los granos
tostados.

Materiales y métodos Frijoles de cacao fermentados y secos (Theobroma cacao L.) (criollo criollo)
fueron comprados a la empresa peruana '' Cacaotera '' en Roma, Italia). Los reactivos de grado
analítico fueron proporcionados por Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania).

Proceso de tostado Los granos de cacao fueron tostados a tres temperaturas seleccionadas (125, 135
y 145? C) para diferentes tiempos (ver Tabla 1) hasta que alcanzaron aproximadamente 1.8 g 100 g
de contenido de humedad. El proceso de tostado se llevó a cabo en un sistema eléctrico ventilado
horno, modelo Air-o-steam COMBI 6GN 1/1, (Electrolux, Stockholm, Suecia) manteniendo la
velocidad del flujo de aire (1 m s? 1) y la humedad relativa (0,4%) constante. Aproximadamente 35
g de granos de cacao, con uniforme tamaño, se colocaron en una sola capa en una placa de aluminio
y se colocaron en el horno precalentado. Debido a la capacidad de calor del horno, el conjunto la
temperatura disminuyó solo 4 ° C después de la carga del producto y fue reestabilizado después de
40 s; por lo tanto, la temperatura dentro del horno podría ser considerado constante durante el
procesamiento. Porciones de asado cacao se tomaron del horno después de límites de tiempo
determinados Tabla 1) y llevado a temperatura ambiente (20 ± 2? C) antes análisis. El proceso de
tostado se llevó a cabo por duplicado.

Pérdida de peso y humedad La pérdida de peso de todas las muestras de cacao se determinó usando
un equilibrio técnico (± 0.01 g). Las muestras se molieron en un molino de café (Super Junior '' S '',
Moulinex, Paris, F) para obtener un tamaño medio de partícula de aproximadamente 500 lm antes del
análisis. El contenido de humedad de las muestras de cacao se determinó gravimétricamente mediante
un analizador de humedad (Sartorius MA150, Goettingen, Alemania) según Di Mattia et al. (2013).

Análisis químico Extracción de muestra

Las muestras de tierra (4 g) fueron desgrasadas tres veces extrayendo con 25 ml de hexano y, cada
vez, el sobrenadante se descargó y los sólidos libres de lípidos se secaron bajo flujo de nitrógeno. La
extracción de la muestra se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito por Adamson et al.
(1999). 1 g de material seco y desgrasado fue extraído con 5 ml de acetona / agua / ácido acético 70:
29.5: 0.5 ácido (v / v / v) mezclándolo durante 1 minuto en una mezcla de vórtice y mediante
sonicación a 20 ° C durante 10 min en un baño ultrasónico. La mezcla fue finalmente se centrifugó
(2086 μg durante 10 minutos) y finalmente se filtró a través de filtros de celulosa. Se utilizó el extracto
de cacao filtrado (CE) para todos los análisis químicos.

Determinación de Flavonoles Los análisis cromatográficos se realizaron en un 1200 Agilent Serie

HPLC (Agilent Technologies, Milano, Italia) equipada con un Desgasificador G1322, una bomba
cuaternaria G1311A, una columna G136A termostato, un sistema de inyección de inyector
automático y una matriz de diodos detector. El sistema fue controlado con Agilent ChemStation para
Windows (Agilent Technologies). Determinación fenólica se llevó a cabo de acuerdo con Zuo, Chen
y Deng (2002). La muestra (20 l) se inyectó en una columna de fase inversa C18, Kinetex 5 lm C18
100A 250? 4,6 mm (Phenomenex, Bolonia, Italia); la columna estaba equipada con una Columna de
Guardia de Seguridad C18 4x 3.0 mm (diámetro interior). Separación de compuestos fenólicos se
llevó a cabo a un caudal de 1 ml / min con un gradiente no lineal de A (solución de ácido acético al
1%) a B (metanol). Elución de gradiente fue como sigue: de 5% a 25% B de 0 a 5 minutos, de 25% a
63% B de 5 a 45 min, de 63% a 5% B de 45 a 50 min, isocrático de 50 a 53 min. El rango de
adquisición DAD se estableció desde 200 a 400 nm Las curvas de calibración se hicieron con
epicatequina, catequina, galato de catequina, gallocatequina y epigalocatequina y los resultados se
expresaron en mg por gdw de sólidos de cacao.

Determinación de proanthocyanidins La determinación de proanthocyanidin se llevó a cabo de

acuerdo con Di Mattia et al. (2013). La muestra (20 ll) se inyectó en un Phenomenex Columna de
sílice Luna de 5 lm en fase normal, 100A, 250 mm? 4,6 mm (diámetro interior), a 25 ° C; la columna
era equipado con cartuchos SecurityGuard Silica 4? 3.0 mm (dentro diámetro). La separación de
proantocianidinas se llevó a cabo a velocidad de flujo de 1 ml / min con un gradiente lineal de A
(diclorometano) a B (metanol) y un nivel constante de C del 4% (ácido acético y agua, 1: 1 v / v)
según Counet y Collin (2003). Gradiente la elución fue la siguiente: del 14% al 28% de B de 0 a 30
minutos, desde 28% a 50% B de 30 a 60 min, de 50% a 86% B de 60 a 65 min, isocrático de 65 a 70
min. Separación de los compuestos se realizó previamente según los tiempos de retención mediante
HPLC-UV análisis y luego los compuestos fueron recolectados de acuerdo a Counet y Collin (2003)
y sometidos a espectrometría de masas (MS) para su identificación.

Los análisis de EM de las fracciones de HPLC (P1-P10) se llevaron a cabo por medio de un
espectrómetro de masas triple cuadrupolo API 2000 de AB-Sciex (Toronto, ON, Canadá) equipado
con un TurboIon- Fuente de pulverización. Los espectros fueron adquiridos inyectando cada solución
a un flujo de 10 ll min ^ {1} con una bomba de jeringa; todos los analitos fueron detectado en
ionización negativa con un voltaje capilar de? 4500 V, nebulizador de gas (aire) a 0,21 N mm? 2, gas
de cortina (nitrógeno) a 0,21 N mm \ cdot 2. El potencial de desclasamiento se estableció en? 22 V
para m / z <1000 amu; ? 80 V para m / z> 1000 amu. Para los experimentos de MS / MS, el gas de
colisión se estableció en 3 (en una escala de 0-6) y la colisión la energía era? 20 eV. Los espectros
fueron adquiridos utilizando AB-Sciex Software Analista 1.5.

La cuantificación de proantocianidinas individuales se llevó a cabo por análisis de HPLC. Dado que
las proantocianidinas muestran una absorción similar coeficientes (Counet y Collin, 2003), una curva
de calibración, realizada con (?) - epicatequina, se utilizó para su cuantificación y la los resultados
para cada clase de proanthocyanidin se expresaron como mg epicatechin equivalentes por gdw de
sólidos de cacao. Índice fenólico total La cantidad de fenoles solubles totales se determinó de acuerdo
al método propuesto por Singleton y Rossi (1965). 20ll de la muestra diluida se pipetearon en una
placa de 96 pocillos. 100 ll de Reactivo de Folin-Ciocalteu, diluido 1:10 con agua, y 75 l de Se añadió
solución de carbonato de sodio al 10% (p / v) a cada pocillo. y la placa se mantuvo durante 2 horas a
temperatura ambiente en la oscuridad. El desarrollo del color a 740 nm se determinó utilizando un
Nano- Espectrofotómetro Quant (Tecan, Segrate, Italia). Los valores de TPI fueron calculado por una
curva de calibración, obtenida con concentraciones crecientes de ácido gálico, y los resultados se
expresaron en mg de gálico equivalentes de ácido (GAE) por g de peso seco.

Ensayos de actividad antioxidante La capacidad antioxidante total se evaluó mediante reducción

férrica parámetro de potencia antioxidante (FRAP) y la captura total de radicales ensayos de
parámetros antioxidantes (TRAP), respectivamente, para la medición de reducir y romper la actividad
antioxidante. El poder reductor fue monitoreado por el ensayo FRAP (Benzie & Strain, 1996). La
reducción del complejo Fe3 + -TPTZ a la la forma ferrosa, a pH bajo, fue monitoreada a 595 nm por
un Sunrise lector de placas de absorbancia (Tecan). Brevemente, 160 l de reactivo FRAP, preparado
diariamente, se mezclaron con 30 l de agua y 10 l de agua diluida muestra; la absorbancia a 595 nm
se registró después de 30 minutos incubación a 37 ° C mediante un espectrofotómetro Tecan
NanoQuant. Los valores de FRAP se calcularon utilizando una curva de calibración obtenida con
concentraciones crecientes de Fe2 +. Los resultados de FRAP fueron expresado como lmol de Fe2 +
por.

Análisis estadístico Los datos presentados son los promedios de al menos tres independientes
mediciones tomadas de dos repeticiones diferentes de cada muestra tipo e informado como media y
desviación estándar relativa RSD. Una forma de ANOVA se aplicó a los datos experimentales para
determinar la importancia de los efectos (temperatura de tostado y tostado hora). El análisis de
componentes principales (PCA) se aplicó para describir el conjunto de datos proanthocyanidin y para
detectar los más importantes variables para determinar la estructura de datos (solo variables con se
usó una carga> 0.70 en PC).

La epicatequina / catequina y las proantocianidinas totales cambian a lo largo tiempo se modelaron,

donde C0, CE, Ct son iniciales, equilibrio y tiempo t epicatequina / catequina o concentraciones de
proanthocyanidin; a es el parámetro de forma yb (s) es un parámetro de velocidad. El efecto de la
temperatura en la tasa de pérdida de proanthocyanidins fue evaluado por medio de la ecuación de
Arrhenius: K ¼ K0? eð? Ea = RÞ ð2Þ donde K es la velocidad de reacción, K0 el factor
preexponencial, Ea es el energía de activación aparente y R la constante de gas universal. Ya que el
inverso del parámetro de velocidad de Eq. (1) (b? 1), teniendo la dimensión de s? 1, se utilizó como
velocidad de reacción, Ea podría considerarse como energía de activación en lugar de un factor de
dependencia térmica. La regresión no lineal se realizó para calcular Eq. (1) parámetros por el
algoritmo de "búsqueda de patrones de Rosenbrock" y para calcular Eq. (2) parámetros que utilizan
el algoritmo '' Levenberg-Marquadt ''. La bondad del ajuste fue evaluada por el coeficiente de
determinación (R2) Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el Software STATISTICA
(StatSoft ™, Tulsa, OK).

Resultados Granos de cacao tostados a tres temperaturas, desde 125 ° C hasta 145? C, se llevó a cabo
para diferentes tiempos (Tabla 1) hasta alcanzar a 1.8 g 100 g de contenido de humedad residual,
alrededor de 2 g de 100 g de agua el contenido de humedad óptimo para la molienda de granos de
cacao y grasa extracción (Krysiak, Adamski, y Zyzelewicz, 2013). Los tiempos de tostado de 62 y 46
minutos a 125 ° C determinaron el final contenidos de humedad de 1.9 y 2.3 g 100 g \ leq 1,
respectivamente; estos valores no fueron diferentes de los alcanzados por asado para 30 y 25 min a
135 ° C, respectivamente, y durante 18 y 13 min a 145 ° C, respectivamente. El contenido de
flavonoles se determinó en el control y en muestras tostadas a las tres temperaturas por diferentes
tiempos (Tabla 1). El contenido de epicatequina de la muestra de control está dentro del rango
reportado por Payne et al. (2010) para frijoles fermentados secos pero el contenido de catequinas fue
mucho más alto que los reportados por estos autores y otros (Caligiani et al., 2007; Kothe et al., 2013)
mientras que es más similar al reportado por Gu et al. (2006) para cacao en polvo natural. El contenido
de epicatequina en el cacao es muy afectado por los procesos de fermentación y secado, que podrían
determinar una variación de 6 veces de epicatequina en fermentado seco granos de cacao (Kim &
Keeney, 1984; Wollgast & Anklam, 2000) pero hay pocos datos disponibles sobre el contenido de
catequina como afectado por fermentación y secado. Una reducción general de catequina y
epicatequina al tostar fue observado (Tabla 1), de acuerdo con los resultados reportados por Payne et
al. (2010) y Kothe et al. (2013). Por otra parte, los contenidos del contenido de galocatequina y
epigalocatequina aumentado durante las primeras etapas de tostado, y eventualmente disminuido en
las últimas etapas con el alcance del contenido de epigalocatequina su valor máximo más rápido que
gallocatechin. La epicatequina a la proporción de catequinas, que se ha propuesto como un útil y
indicador sensible para el historial de procesamiento de los granos de cacao (Payne et al., 2010),
disminuyeron durante el tiempo de tostado (Fig. 1), por lo tanto lo que sugiere que la degradación de
la epicatequina es más rápida que la de la catequina, posiblemente debido a la isomerización de (?)
epicatequina a (+) catequina (Caligiani et al., 2007). La evolución de epicatequina a relación de
catequina sobre el tiempo de tostado a tres temperaturas diferentes, como se muestra en la Fig. 1, fue
bien descrito por la función acumulativa del modelo probabilístico Weibull, con R2 de 0.998, 0.996
y 0.984 para 125, 135 y 145? C, respectivamente.

La elevación de la temperatura de tostado aumentó la tasa general de disminución de epicatequina /

catequina, como se describe por la disminución de el parámetro de velocidad (b) y el parámetro de
forma (a), (Tabla 2). El parámetro de forma (a) es un índice de comportamiento que depende del
mecanismo de proceso y, cuanto mayor es su valor, más lento es el proceso en la fase inicial (Cunha,
Oliveira, y Oliveira, 1998; Sacchetti, Pittia, y Pinnavaia, 2005). Los valores estimados de b? 1 y
temperaturas absolutas de tostación (K) para calcular los parámetros de la ecuación de Arrhenius
(Tabla 2) yb? 1 dieron como resultado estrictamente (R2 = 0.982) dependiente de la temperatura,
como se muestra en Plano de Arrhenius (Fig. 1 inserto). En procesos destinados a imitar la
torrefacción convencional (Tabla 1), siendo el contenido de humedad igual, el contenido de la
proporción epicatequina / catequina estaba inversamente relacionado con la temperatura de tostado
(Fig. 1). Esta El resultado sugiere que los procesos HTST inducen una mayor epicatequina
epimerización que hace LTLT. Cuando los tiempos de tostado eran iguales, la temperatura
negativamente afectó la relación epicatequina / catequina, por lo tanto confirmando los resultados de
Kothe et al. (2013), quien sugirió una mayor (?) - epicatequina a (+) - epimerización de catequina a
mayor temperaturas de tostado.

El contenido de proantocianidinas monoméricas y poliméricas se determinó en el control y en

muestras tostadas a las tres temperaturas para diferentes tiempos (Tabla 1). El contenido P1 de
muestra de control, cuando se expresa en gdw de sólidos de cacao no grasos, fue igual a 6,88 mg gdw
? 1; este valor es más alto que los reportados por Di Mattia et al. (2013) quienes informaron valores
de 2.5-6 mg gdw ? 1 para frijoles fermentados secos. El análisis de PCA se aplicó para describir el
conjunto de datos y para determinar las variables más importantes que influyen en la estructura de
datos. Los resultados mostraron que el primer componente principal explica casi el 85% de la
variabilidad total y que un segundo componente solo podría explicar el 9% de la variabilidad. Todas
las proantocianidinas pero P10 mostró una carga superior a 0.7 en la primera PC. Las puntuaciones
de todas las muestras mostraron un aumento a lo largo de la primera PC, donde las proantocianidinas
P1-P9 tuvieron una carga negativa, durante tiempo de procesamiento (datos no mostrados). P10, que
disminuyó en el fases iniciales de tostado hasta que desapareció por completo y más aumentado al
final del procesamiento (Tabla 1), no mostró una cargando más de 0.7 en la primera o en la segunda
PC (datos no mostrados).

La abundancia relativa de cada fracción de proanthocyanidin individual, en muestras tostadas a las

tres temperaturas, se calculó como una función del tiempo de tostado a partir de los datos que se
muestran en la Tabla 2. Tostado el tiempo rige los aumentos de la abundancia relativa de P1 y P2
que, en estudios previos, eran menos oxidables que otras proanthocyanidins (Di Mattia et al., 2013).
Cuando solo las concentraciones de P1 y P2 fueron analizados, sin cambios de su abundancia relativa
se observaron entre frijoles sin tostar y frijoles tostados para 30 min (datos no mostrados). Esto no
está de acuerdo con Kothe et al. (2013) que observó una disminución de la abundancia relativa de
flavanoles monoméricos a favor de dímeros. La abundancia relativa de P3, P4 y P5 (calculada a partir
de datos reportados en la Tabla 2) disminuyó durante la torrefacción. La abundancia relativa de
proantocianidinas de alto peso molecular (P6-P10) disminuyó en las primeras etapas de tostado, pero
aumentó a largo plazo tiempo de tostado, como resultado de la polimerización de proantocianidinas
con menor peso molecular. Contenido de humedad final siendo igual, el contenido de
proantocianidinas de alto peso molecular (P6-P10) es más alta en los procesos de larga duración a
baja temperatura (LTLT) que en tiempos cortos de alta temperatura (HTST). El contenido total de
proantocianidinas, que es un índice útil para evaluar el historial de procesamiento del cacao (Di Mattia
et al., 2013), se calculó sobre la base de los datos informados en la Tabla 2. El total contenido de
proantocianidinas de la muestra de control, cuando se expresa como gdw de sólidos de cacao no
grasos, era igual a 22,4 mg gdw ? 1; este valor es más alto que el reportado por Di Mattia et al. (2013)
quien informó valores 9-15 mg gdw? 1. El contenido total de proantocianidinas inequívocamente
disminuyó con el tratamiento térmico (Fig. 2) de acuerdo con el resultados de Di Mattia et al. (2013).
La evolución del contenido total de proantocianidinas sobre el tostado el tiempo a tres temperaturas
diferentes, que se muestra en la Fig. 2, estaba bien descrito por la función acumulativa de la
probabilística Weibull respectivamente.

Las temperaturas de tostado aumentaron la tasa total de proantocianidinas totales pérdida, como se
describe por la disminución de la tasa el parámetro (b) y disminuyó el parámetro de forma (a) (Tabla
2). Los valores estimados de b? 1 y las temperaturas absolutas de tostación (K) se usaron para calcular
los parámetros de la ecuación de Arrhenius (Tabla 2) y b? 1 resultó estrictamente (R2 = 0.982)
dependiente de la temperatura, como se muestra en el diagrama de Arrhenius (Fig. 2 insertar). En
procesos destinados a imitar la torrefacción convencional (Tabla 1), el contenido de humedad es igual,
el contenido total de proanthocyanidins estaba inversamente relacionado con las temperaturas de
tostado (Fig. 2), de manera similar a la relación epicatequina / catequina. Estos resultados confirman
que HTST los procesos preservan mejor el contenido de polifenoles que LTLT unos (Mrkic', Cocci,
Dalla Rosa y Sacchetti, 2006). La actividad antioxidante se determinó en la misma muestra extractos
utilizados para el análisis de polifenoles por medio de la reacción con el reactivo Folin-Ciocalteu
(método TPI), la reducción de Fe3 + (método FRAP) y la actividad de ruptura de cadena, como se
determinó por el método TRAP. Estos métodos difieren en varios aspectos, tales como el mecanismo
de acción (reacción radical o redox) y las condiciones ambientales (polaridad del solvente y pH). El
TPI se basa en la capacidad de los compuestos fenólicos para reducir el reactivo Folin-Ciocalteu en
condiciones básicas y, por lo tanto, ha sido ampliamente utilizado como un método para la estimación
del total compuestos fenólicos; no obstante, teniendo en cuenta que los polifenoles muestran
diferentes reactividades con el reactivo Folin-Ciocalteu (Naczk & Shahidi, 2004) y que el mecanismo
se basa en una oxidación / reacción de reducción, TPI también se puede considerar un antioxidante
método (Prior, Wu y Schaich, 2005).

En la Fig. 3A, el TPI de los granos de cacao sometidos a tostación en diferentes las temperaturas se
muestran como una función del tiempo de proceso. El valor inicial de TPI, que corresponde a la
muestra de control, fue mayor que los reportados por Di Mattia et al. (2013) y se sometió a
importantes cambios (p <0.05) al tostar. Al final del tiempo de asado, las muestras mostraron valores
de TPI más bajos que los frijoles crudos y este resultado está de acuerdo con Arlorio et al. (2008) y
Suazo et al. (2014).
Una evolución no lineal de TPI durante el tueste, con un general disminución en las primeras fases
del proceso de tostado, seguido de una ligero aumento en las últimas fases, se observó. La
disminución inicial de los valores de TPI podría explicarse por la reducción de flavonoides y
proanthocyanidins. El ligero aumento de TPI observado en el último las fases de tostado podrían
explicarse por la formación de proantocianidinas con alto peso molecular y mayor poder reductor (Di
Mattia et al., 2013), así como a la formación de reductones como una consecuencia de las reacciones
de pardeamiento no enzimáticas (entre que es la reacción de Maillard), que ocurren durante la
tostadura (Di Mattia et al., 2011; Sacchetti, Di Mattia, Pittia, y Mastrocola, 2009; Summa et al., 2006).

El contenido de humedad es igual, la temperatura promedio de tostado (135 ° C) determinó los valores
más altos de TPI y la temperatura más alta determinó los valores más bajos de TPI. Otros estudios
demostraron esa formación de color al tostar es máxima a 135 ° C (Ioannone, 2014; Krysiak et al.,
2013), lo que confirma que la formación de compuestos coloreados, como consecuencia de la reacción
de Maillard (MR), podría haber contribuido al aumento del valor de TPI. La dependencia de la
temperatura de la disminución de TPI fue diferente de que se observó para la pérdida de
proanthocyanidins (Fig. 1), lo que confirma que el TPI no puede usarse indiscriminadamente para
medir el total contenido de polifenoles de los granos de cacao. En la figura 3B, el FRAP de granos de
cacao sometidos a tostación en diferentes temperaturas se informa como una función del tiempo de
proceso. El valor inicial de FRAP, que corresponde a la muestra de control, fue mayor que los
reportados por Di Mattia et al. (2013) y experimentó cambios significativos (p <0.05) al tostarse. Los
resultados logrado mediante el ensayo FRAP (Fig. 3) fueron similares a los obtenido por el TPI,
porque tanto los ensayos miden la reducción poder de los extractos de cacao El contenido de humedad
es igual, la temperatura promedio de tostado (135 ° C) determinó la temperatura más altaLos valores
de FRAP mientras que las otras temperaturas mostraron diferentes efectos en FRAP, dependiendo de
la duración del proceso de tostado. Las propiedades antirradical de los granos de cacao sometidos a
asado fueron evaluados por el método TRAP, que funciona mediante un mecanismo basado en una
reacción de transferencia de hidrógeno (Prior et al., 2005). Resultados, expresado como capacidad
antioxidante de TE, se ilustran en la Fig. 3C.

Los resultados obtenidos por medio del ensayo TRAP fueron diferentes de los obtenidos por los otros
dos métodos, ya que el aumento de la actividad antioxidante observada durante el tostado fue mucho
más evidente cuando se utilizó el ensayo TRAP. Este hecho podría ser explicado teniendo en cuenta
que los productos MR formaron durante proceso de tostado muestran una alta actividad de ruptura de
cadena a pesar de que no tenía alto potencial reductor (Nicoli, Toniolo, y Anese, 2004). El contenido
de humedad es igual, menor temperatura de tostado (125 ° C) condujo a los valores de TRAP más
altos y los procesos de tostado LTLT maximizó la actividad rompedora de cadenas. Sin embargo
cuando los contenidos de humedad fueron iguales, los valores de TRAP se observaron a 125 ° C no
fueron significativamente más altos que los de 135 ° C y esta temperatura generalmente se prefiere a
125 ° C ya que maximiza el color formación y causa una menor pérdida de polifenoles (Fig. 2) y una
menor formación de compuestos potencialmente tóxicos inducidos por MR, como furans, (Ioannone,
2014) que el segundo. El proceso HTST llevado a cabo a 145 ° C maximiza los polifenoles retención
y este resultado es importante ya que la biodisponibilidad y función de los monómeros y dímeros de
proantocianidina en humanos metabolismo han sido ampliamente investigados y su bio-eficacia es
generalmente aceptado.

Por otro lado, el metabolismo de los alimentos avanzados MRP con actividad antioxidante in vitro no
ha sido completamente dilucidado y todavía es una pregunta abierta si melanoidina aislada las
estructuras son biodisponibles, se someten a biotransformación metabólica, y, posteriormente, causa
efectos fisiológicos in vivo.
Conclusión Las diferentes condiciones de procesamiento aplicadas durante la torrefacción causaron
diferencias dramáticas en flavonoles, contenido de proantocianidina y actividad antioxidante. En
particular, altas temperaturas cortas el tiempo de asado (HTST) preserva mejor el contenido de
polifenoles que hace baja temperatura-tiempo (LTLT), mientras que esta tendencia no se observó
actividad antioxidante que generalmente se maximiza por procesos LTLT. Desde la biodisponibilidad
de polifenol y la función en humanos de metabolismo ha sido ampliamente investigado y su bio-
eficacia es generalmente aceptados, los procesos HTST son recomendables para preservar las
propiedades funcionales del cacao al tostar; sin embargo, otros índices de calidad también deberían
tenerse en cuenta en Para cumplir con los requisitos del mercado.

CARACTERIZACIÓN DE LA MORFOLOGÍA DE HOJA, FLOR Y POD ENTRE LAS

VARIEDADES DE CACAO VIETNAMITA (THEOBROMA CACAO L.)

Los árboles de cacao (Theobroma cacao L.) se han cultivado recientemente en algunas áreas de
Vietnam, demostrando ser un cultivo potencial para el crecimiento económico. Los árboles de cacao
están bien adaptados al sur de Vietnam debido a las condiciones climáticas y del suelo adecuadas,
especialmente en las áreas de las tierras altas y las provincias del delta del Mekong (Phuoc, 2009).
Los cultivos vietnamitas de cacao se originaron a partir de dos grupos, incluido el grupo doméstico
injertado por cultivares Trinitario en Vietnam (variedades CT y TD) y el grupo importado de cacao
compuesto por variedades internacionales SCV, ICS, SCA, POUND, MAN, PA, LCTEEN, IMC,
UIT , APA, AMAZ, NA, MO, SIAL, EET, IFC. Estas variedades importadas vinieron de Perú, Costa
Rica y Malasia. Uyen & Sum (Uyen & Sum, 1996) y Phuoc (Phuoc, 2009) identificaron las 63
variedades como pertenecientes al grupo Trinitario. Sin embargo, la diversidad de híbridos también
causa algunas dificultades en la investigación taxonómica. Actualmente, los árboles de cacao
cultivados se han categorizado en tres grupos principales. El primer grupo de la mayoría es Criollo,
que tiene un frijol con buen sabor pero es susceptible a enfermedades. El segundo grupo es Forastero,
que tiene un alto rendimiento y es altamente tolerante a las enfermedades, aunque el aroma del frijol
es débil. El tercer grupo es Trinitario, que es el grupo híbrido de ambos Criollo y Forastero, por lo
que ha heredado el alto

Rasgos de calidad de ambos grupos (Hardy, 1960; Wood & Lass, 1985; Laurent et al., 1994; Bekele
et al., 2006; Hamon et al., 2003; Sounigo et al, 2005; Bekele et al., 2006; ; Motamayor et al., 2008;
Jain y Priyadarshan, 2009, Efombagn et al., 2009). La organización floral de T. cacao se conserva
básicamente en todo el género Theobroma. Se han realizado estudios sobre divergencia morfológica
en flores, frutos y hojas para identificar y clasificar diferentes variedades de cacao (Cuatrecasae, 1964;
Braudeau, 1969, Soria y Enríquez, 1981; Engels, 1983, N'Goran et al., 1994; Lachenaud et al., 1999;
Bekele et al., 2006, Jahan et al., 2014). Los estudios sobre la divergencia morfológica revelaron la
clasificación de dos grupos morfológicos: el primer grupo incluye las variedades Criollo y el segundo
grupo es de las variedades Forastero (Engels, 1983). Este resultado fue confirmado posteriormente
por N'Goran (N'Goran, 1994) que aplicó las investigaciones morfológicas a las características de los
caracteres de la semilla (frijol) y de la fruta (fruta). Enríquez y Soria (Soria y Enríquez, 1981) también
clasificaron la diversidad de las variedades de cacao mediante la descripción de varios rasgos
anatómicos como la flor, la fruta y la hoja. Las flores completamente desarrolladas tienen 5 sépalos
libres, 5 pétalos libres, 10 estambres (5 estaminados fértiles y 5 no fértiles) y un ovario de 5 carpelos
unidos (Majer et al., 1994). Los pétalos son estrechos en la base, pero se extienden en bolsas en forma
de copa. Por lo general son de color rosa y blanco, pero el preciso la coloración y el patrón pueden
variar levemente y pueden indicar un cierto genotipo.

Los estambres están dispuestos en dos verticilos; el exterior consta de cinco estaminodios no fértiles
y el interior consta de cinco estambres fértiles. Los estambres tienen dos anteras que se encuentran
en la bolsa del pétalo correspondiente. El estilo es dos veces más largo que el ovario y consta de cinco
partes alrededor de un eje (Wood & Lass, 1985). El estilo fusionado tiene la apariencia de ser único,
pero se divide en la punta en cinco estigmas (Wood y Lass, 1985; Majer et al., 1994). Lachenaud
(Lachenaud et al., 1999) introdujo la identificación de grandes variedades de cultivares de cacao en
función de sus características morfológicas (lígula, sépalo). Además, los tipos y poblaciones de
variedades de cacao también se definen por la apariencia fenotípica de las frutas de cacao (vainas)
(Efombagn et al., 2009). Esto corresponde con estudios previos de Cuatrecasae (Cuatrecasae, 1964);
Uyen y Sum (Uyen y Sum, 1996); Lachenaud (Lachenaud et al., 1999); Bartley (Bartley, 2005);
Phuoc (Phuoc, 2009); Santos (Santos et al., 2012) y García (Garcia et al., 2014). Estos estudios
también examinaron la taxonomía de las variedades de cacao mediante la evaluación de los rasgos
morfológicos de diferentes órganos como los órganos reproductivos del cacao (lígula, ovario y forma
del fruto) u órganos de la planta (forma de la hoja y anatomía de la hoja). Además, la investigación
preexistente se basaba en poblaciones no naturales, que estaban representadas por la morfología de
sus grupos geográficos (su país de origen, que anteriormente se distinguían por factores geográficos),
su país de origen (Lachenaud et al., 1999; Bartley , 2005; Lachenaud et al., 2007; Swanson et al.,
2008; Santos et al., 2012; Garcia et al., 2014). Además, Ha (Ha et al., 2015a) solo analizó los rasgos
anatómicos (forma del fruto y tamaño de la hoja) de las catorce principales variedades de cacao en
Vietnam y los clasificó en 2 grupos: el grupo híbrido Criollo y el grupo híbrido Forastero.

La evaluación de las catorce variedades de cacao en Vietnam se llevó a cabo para aclarar las
relaciones genéticas con algunos resultados relacionados con las caracterizaciones de la forma de las
vainas (Ha et al., 2015b). Por lo tanto, este estudio aclara las características morfológicas de las
poblaciones naturales de T. cacao en Vietnam, que hasta ahora era muy limitada. El programa
vietnamita de cultivo de cacao es importante para el desarrollo futuro de la industria del cacao en
Vietnam. Por lo tanto, este estudio se centró en el examen de las características morfológicas de las
63 variedades de cacao actualmente cultivadas en el sur de Vietnam, basadas en órganos de plantas y
órganos reproductores. Hasta donde conocemos, no hay publicaciones internacionales sobre la
diversidad morfológica de las variedades vietnamitas de cacao. En consecuencia, este informe
proporciona información vital sobre la colección de morfología de Vietnam, que a su vez puede
ayudar al desarrollo de técnicas mejoradas de cultivo de cacao.

Materiales y métodos En este estudio se recolectaron 63 variedades de cacao de cinco regiones

típicas de cacao en el sur de Vietnam, incluyendo la provincia de Dak Lak, la provincia de Dong Nai,
la provincia de Ben Tre, la Universidad de Nong Lam, la ciudad de Ho Chi Minh y la ciudad de Can
Tho (Figura 1). La Tabla 1 presenta una descripción general de las variedades analizadas por código
de nombre, código de instituto y sitios de muestreo.

Temporada de cosecha de cacao: en Vietnam dos cosechas de cacao se cosechan en mayo-julio y

octubre-diciembre anualmente. Las muestras para el presente estudio (flores, hojas y frutos) se
recolectaron en ambos períodos.

Toma de muestras: se realizó un examen de todos los árboles de cacao durante los dos períodos
principales de floración. Tres árboles fueron identificados y utilizados durante ambas temporadas de
cosecha (6 árboles en total por accesión) para la recolección de flores y brotes. Los órganos
reproductivos se empacaron en pequeñas botellas de vidrio y se colocaron en cajas frías antes de la
observación.

Flor de cacao: Diez flores recién florecidas por accesión se recogieron al azar de troncos y ramas
según lo descrito por Lachenaud (Lachenaud et al., 1999). En cada flor solo se midió una de las partes
florales a estudiar. En cada accesión estudiada, la forma de la lígula fue la más representativa en una
muestra de seis lígulas de estructura observadas bajo un microscopio binocular (Microscopio zoom
estereoscópico Motic SMZ-168). Se tomaron tres medidas para cada flor: longitud del capullo (punta
distal de los sépalos a la base del receptáculo), ancho de la flor en su punto más ancho y la longitud
del pedúnculo (desde la base del capullo hasta el árbol). Las mediciones se calibraron a partir de las
imágenes usando una regla (software Paint, herramienta de regla de Adobe Photoshop), las medidas
del botón floral se convirtieron en milímetros.

Brote de cacao (sin abrir): por accesión, se seleccionaron al azar cinco brotes de 5-6 cm de largo y
3-4 cm de ancho al azar de los troncos de los árboles. El número de anteras dentro del ovario se
contabilizó bajo un microscopio binocular (microscopio zoom estereoscópico Motic SMZ-168). Este
estudio preliminar mostró que todos los descriptores eran utilizables para la caracterización clonal y
que diez flores por clon proporcionaban una precisión relativa suficiente en los medios.

Hoja de cacao: se observaron diez ramas de hojas jóvenes en una accesión. Las muestras tomadas
de las hojas maduras de cacao se organizaron según la forma y el tamaño.

Fruta de cacao (vaina): por accesión, se recolectaron tres frutos al azar para el examen. La fruta fue
recolectada cuando estaba madura (amarillo-verde o amarillo-rojo)

Observación de la estructura de la flor: las partículas de la flor se recogieron probando los brotes
de cacao con pinzas y agujas. La lígula, la longitud del sépalo, la altura y el diámetro del óvulo, el
estambre, el spitilo y la antera se observaron utilizando el microscopio zoom estereoscópico Motic
SMZ-168 y la cámara Olympus CX41- C5050. Se recolectaron granos de polen de la antera. La
microscopía electrónica de barrido de granos de polen se tomó usando un Tabletop Microscope TM-
1000 (Hitachi High Technology). Los tallos y las nervaduras centrales fueron teñidos por Carmin
alune '0.1N y vertd'iod 0.01N antes de la observación anatómica (Nguyen, 2006). Los datos (ancho y
alto de la hoja, longitud del sépalo, altura del óvulo y diámetro) se analizaron estadísticamente
utilizando el programa de software SPSS 20 y la diferencia entre medias se determinó mediante la
prueba de rango múltiple de Duncan (DMRT). Las hipótesis nulas se controlaron con la prueba de
Duncan, que puede considerarse como una extensión de la prueba F, utilizada en el análisis de
varianza univariable.

Forma y color de la semilla: la fruta de cacao se cortó con una tendencia vertical para la observación
de la forma de la semilla.

Resultados Se registraron 63 características morfológicas y los resultados se presentan en las Tablas

2 y 3. Los datos de la muestra que incluyen la hoja, la lígula, los rasgos del fruto se definieron de
acuerdo con la identificación.

Caracteres de la hoja: Este estudio se centró en los órganos de la planta, incluidos el tallo y la hoja.
Su anatomía se observó bajo un microscopio binocular. Durante la observación se observó que el
color de las hojas de cacao era de color verde oscuro en las plantas maduras de cacao, mientras que
las plantas inmaduras se presentaban en dos colores diferentes: rojo púrpura (TD3, TD6, TD10, TD15,
ICS1, TD31, TD17) y amarillo verde (datos no mostrados). Las leavas tenían forma elíptica.

Anatomía de la hoja: para las 63 variedades de cacao recolectadas, la nervadura central en la sección
transversal tenía una estructura cóncava-convexa. El sistema vascular de la nervadura central de T.
cacao era colateral, rodeado por un sistema de esclerénquima. La glándula es visible en el medio del
nervio central (Fig. 2).
Forma del fruto: Se determinó que las 63 variedades recolectadas de cacao eran Amelonado (forma
ovalada, piel lisa, colidón violeta oscuro), Angoleta (forma alargada, áspero, estrecho, colytedon
púrpura oscuro, forma en el fondo) y Cundeamor (forma alargada, áspera). colytedon de color púrpura
oscuro) formas de fruta (Fig. 3).

Forma de la semilla: Las 63 variedades recolectadas de cacao mostraron solo una forma de semilla
ovalada (datos no mostrados) con colytedon violeta en colytedon joven y café oscuro en el período
maduro.

Descripción de la flor Lígula: Los datos recopilados mostraron la diversidad entre las variedades
vietnamitas de cacao en relación con sus características de descripción de la flor morfológica. La
variación de las formas de la lígula incluye cinco variaciones, a saber, ovalada, ancha, deltoidea,
elíptica y sublancelada (Fig. 4). Estambre y óvulo: El estaminodio, estambre y óvulo se observaron
con un binocular. En todas las 63 muestras, el estadío era de color púrpura oscuro y el óvulo era
blanco (Fig. 5). Ante: La disposición de las anteras (Fig. 6) era diferente, con TD11 con una antera
trilobulada, mientras que el resto tenía anteras bilobuladas. Forma del polen: se observó que los
granos de polen del órgano reproductor, en las 63 variedades, tenían una forma redonda. Por lo
general, los granos de polen se pueden utilizar para clasificar la diversidad de especies pero no en
este estudio (Fig. 7).

Discusión Este estudio ilustra la diversidad anatómica de las hojas y las flores del vietnamita
Theobroma cacao L. basado en la comparación morfológica. aracterísticas de la hoja: según Bartley
(Bartley, 2005), el color de las hojas frescas (jóvenes, en desarrollo) se considera un rasgo distintivo
de la taxonomía. Por ejemplo, el grupo Criollo y ciertas poblaciones amazónicas tienen sombras
verdes claras. Nuestro resultado mostró que 56 variedades en Vietnam fueron identificadas con tonos
verdes y por lo tanto podrían clasificarse en el grupo Criollo. Las otras 7 variedades tienen hojas rojas,
por lo que es probable que provengan del grupo Forastero. Enríquez y Soria (Soria y Enríquez, 1981)
indicaron que hay 3 fenotipos de follaje de cacao que incluyen patrones lanceolados, elípticos y
ovales. En cuanto a nuestro análisis, se observó que 63 variedades vietnamitas tenían una forma
elíptica. Otra clasificación de follaje también es mencionada por Bartley (Bartley, 2005) con respecto
a la forma de la hoja, a saber, formas esféricas y cilíndricas. Sin embargo, ninguno de los autores fue
capaz de aclarar en qué grupo podrían clasificarse estas formas de follaje. Por lo tanto, es difícil
discriminar las poblaciones de cacao en función del color de la hoja debido a la expresión de las
características de progenie entre Criollo y Forastero.

Anatomía del follaje y el tallo: una sección transversal muestra que la estructura de la hoja y el tallo
tiene la mayor similitud entre 63 variedades. Esto podría deberse a la independencia del sistema
vascular de las plantas con cambios ambientales (Easu, 1964). Rasgos frutales: la forma y el color
de los frutos se considera la característica más significativa para separar los genotipos individuales
de la diversidad de las especies.

Forma de la fruta: hay muchos estudios sobre las características de las frutas de cacao. Se ha
propuesto que existen cuatro formas distinguibles en fruta de cacao, a saber, Amelonado, Calabacillo,
Angoleta y Cundeamor (Pound, 1932; Chessman, 1944; Cuatrecasae, 1964; Bartley, 2005).
Amelonado se usa para describir frutas que son ovoides sin un punto prominente, mientras que
Cundermor / Cundeamor se usa para frutas cilíndricas alargadas con un pronunciado cuello de botella
y una punta afilada. Calabacillo indica frutos redondos pero ningún punto, mientras que Angoleta se
especifica como frutos largos sin cuello de botella y extremos puntiagudos (Soria y Enríquez, 1981;
Bartley, 2005). Según Cuatrecasae (1964), Braudeau (1969) y Bartley (2005), Amelonado y
Callabacillo se atribuyen a frutas que pertenecen al grupo Forastero que tiene un alto rendimiento,
mientras que los títulos de Angoleta y Cundeamor pertenecen a las dos formas de fruta del criollo
grupo. El resultado del análisis de forma en este estudio identificó tres formas de fruta de cacao,
incluyendo Amelonado, Angoleta y Cundeamor (Tabla 3). Este resultado confirmó la variación de
las variedades de cacao examinadas que se originaron en el grupo híbrido Trinitario. Phuoc (Phuoc,
2009) mostró que el origen Trinitario TD tiene características que combinan las características de
Criollo y Forastero. Por ejemplo, las variedades TD1 son una progenie híbrida de PA35 x NA32
(Phuoc, 2009; Ha et al., 2015b), dos descendencias: PA y NA presentaron las características criollas
de la fruta verde alargada y el colytedon oval (Bartley, 2005).

Color de la fruta: la coloración de la fruta de cacao es una característica notable para la clasificación.
Durante la maduración, el fruto verde del cacao se convertirá en amarillo y el fruto rojo en naranja
(Soria y Enriquez, 1981). Un informe anterior de Bartley (Bartley, 2005) reveló que el color de la
fruta roja podría ser representativo para el grupo Criollo y, como resultado, la descendencia de este
grupo ha heredado este rasgo. Además, Cuatrecasae (1964) y Braudeau (1969) también acordaron
que el grupo Criollo tiene hojas rojas. Nuestros datos informan claramente que hay 2 colores
diferentes entre los frutos del cacao vietnamita. El tono naranja se encontró en 8 variedades y el tono
amarillo se encontró en las 55 variedades restantes. Para ser más detallado, las variedades TD (TD10,
TD15, TD17 y TD31) tienen frutos rojos y hojas jóvenes rojas. Estos rasgos pueden probar que estas
variedades pertenecen al grupo criollo. Por lo tanto, los productores de plantas deberían tener en
cuenta estos rasgos, ya que el grupo Criollo está notablemente favorecido debido a su calificación de
semilla (Lachenaud et al., 2007; Beleke et al., 2006, Jain & Priyadarshan, 2009). Por ejemplo, TD3
tiene las características Criollo, que produce los granos con sabor decente, pero el tamaño de la fruta
es pequeño (Ha et al., 2015b). Esta desventaja podría mejorarse mediante hibridación con TD9
(grupo Forastero), que produce frutos más grandes. La selección de progenies híbridas debería
abordarse más fácilmente debido a las características distinguibles entre el grupo Criollo y Forastero.

Forma y color de la semilla: Nuestro examen demostró que la forma y el color de las semillas no
eran significativamente diferentes entre las muestras. Estudios previos han demostrado que el color
de la semilla de cacao era blanco, púrpura pálido, púrpura intermedio y púrpura oscuro, y las semillas
de cacao variaban de casi esféricas a cilíndricas (Soria y Enríquez, 1981; Bartley, 2005). Por lo tanto,
la clasificación basada en la forma y el color es difícil en nuestra investigación ya que todas las
muestras tienen una forma esférica y un color púrpura oscuro.

Descripción de la flor Lígula: Estudios previos mostraron que la lígula de cacao tiene un tono
amarillo y varía en forma (Soria y Enriquez, 1981; Lachenaud et al., 1999). Nuestro resultado es
coherente con esos estudios como la lígula examinada de 63 variedades diversificadas en forma (Fig.
4) y el color era amarillento. Los resultados obtenidos mostraron cinco formas de lígula (ovalada,
ancha, deltoidea, elíptica y sublancelada). Por lo tanto, esta característica podría ser una característica
útil para una clasificación posterior. Color del estambre y el óvulo: Nuestro estudio mostró que 63
variedades examinadas de estamenoides eran de color púrpura oscuro, mientras que sus estambres
eran rosáceos. Estos resultados son similares a los de Soria y Enríquez (Soria y Enríquez, 1981) que
muestran que la mayoría de los elementos florales adquieren un pigmento rosado a excepción de la
lígula que tiene un pigmento amarillo. Además, Bartley (Bartley, 2005) también describió la variación
de la coloración que va del rosa al rojo muy oscuro o violeta. En cuanto al color del óvulo, todas las
muestras de óvulos fueron blanquecinas, lo que también fue registrado por Soria y Enriquez (Soria y
Enriquez, 1981).

Antera: El examen de anteras indicó que la mayoría de las accesiones de cacao tienen una estructura
de antera dilobed, con la excepción de TD11 que tiene una estructura de antera trilobulada. El TD11
tiene una mayor cantidad de anteras lo que significa que tiene más granos de polen. Cuantos más
granos de polen, más fruta se forma en el árbol de cacao. Esta información es importante para apoyar
a los criadores de cacao en su actividad. Granos de polen: los granos de polen son uno de los
elementos más importantes en los estudios sobre las flores, pero los resultados son limitados. Con el
objetivo de tener un informe detallado sobre la morfología de las variedades de cacao en Vietnam,
este trabajo se centró en la investigación de variaciones en la forma del grano de polen. Los resultados
mostraron que solo hay una forma redonda de grano de polen entre 63 muestras de cacao recolectadas.
Este estudio no se centró en la cantidad de granos de polen debido a los diferentes tamaños de bulbo
de cacao recogido en las 2 temporadas de cacao. Por lo tanto, un examen del número de granos

Tamaño de la hoja, longitud del sépalo, longitud y diámetro del óvulo: nuestro trabajo mostró que no
hubo diferencias significativas en la medición de todos los datos estudiados (datos no mostrados)
entre las 63 variedades de cacao examinadas. Esto puede explicar que estos clones de cacao se hayan
clasificado en la subespecie Theobroma cocoa L. Además, el trabajo se realizó en una temporada de
mayo a julio. Un examen de la otra temporada (de octubre a diciembre) podría ser objeto de más
investigaciones. Con base en nuestro análisis morfológico, centrándose principalmente en la forma
de la fruta, las 63 variedades se dividen en dos grupos: Criollo-Trinitario y Forastero-Trinitario. El
primer grupo, Criollo-Trinitario, aparece con características típicas que incluyen el color del fruto
siendo naranja (TD17, TD31, TD3, TD5, TD6, TD10, TD15, ICS1) o su forma que tiene un genotipo
de Amelonado (TD1, TD6, TD10, TD12, TD14, CT7, TD15, AMAZ1515, SCA6, SCA9, NA33,
NA149, NA32). El último grupo, Forastero-Trinitario, tiene una forma de fruta Angoleta y / o
Cundeamor y un color de fruta amarilla. El Forastero-Trinitario representa el resto de las variedades.
Las características de la forma de la lígula, los colores de las hojas jóvenes y las formas de las frutas
de las variedades vietnamitas Theobroma cacao L. se resumieron en la Tabla 2. Esta tabla muestra
las principales similitudes y diferencias entre las características de las variedades examinadas. Este
resultado se corresponde con investigaciones previas sobre los rasgos morfológicos y anatómicos de
los árboles de cacao.

Conclusión En este estudio se investigaron varias características morfológicas del cacao, como la
forma de la lígula, el número de anteras, el polen, el estambre y el óvulo, la vaina, la semilla, el color
de la hoja y la anatomía de la hoja. El examen de los órganos reproductivos mostró una diversidad de
características morfológicas (cinco formas de lígulas, dos colores de hojas jóvenes, la estructura única
del nervio central y el tallo secundario entre las 63 variedades de cacao examinadas).
Significativamente, se identificaron tres tipos de formas de fruta (Angoleta, Amelonado y
Cundeamor) en las variedades vietnamitas de cacao, cada una de diferente color. Por lo tanto, las
variedades vietnamitas de cooca pueden dividirse en dos grupos: Criollo-Trinitario y Forastero-
Trinitario. La accesión TD11 mostró resultados interesantes con una anteversión trilobulada. Este
estudio contribuye significativamente al desarrollo y la conservación de la biodiversidad entre el
cacao vietnamita. Este trabajo proporciona una importante contribución a la caracterización
morfológica de los patrones polimórficos de varios órganos de las especies de Theobroma en el sur
de Vietnam, lo que puede ayudar a los mejoradores en el futuro en los intentos de cruce
interespecífico.

studios de los compuestos volátiles presentes en hojas, tallos y flores de Vernonanthura patens
(Kunth) H. Ro

Introducción Asteraceae (Asteraceae), reúne más de 23,500 especies repartidas en alrededor de 1600
géneros, por lo que la familia de angiospermas es rica y la diversidad biológica [1] [2]. Los miembros
de esta familia se distribuyen desde las regiones polares hasta los trópicos, conquistando todos los
hábitats disponibles, desde los desiertos secos hasta los pantanos y desde los bosques hasta los picos
de las montañas. En muchas regiones, esta familia alcanza hasta el 10% de la flora vernácula y
contiene algunos géneros con un gran número de especies, como Vernonia (Vernonanthura), con más
de 1000 especies [3]. Muchas especies tienen látex y esencia de aceites esenciales y pueden o no ser
resinosos. Vernonanthura patens es una Asteraceae que crece silvestre en Ecuador y es empleada por
personas de la costa ecuatoriana para curar varias enfermedades. Manzano et al. han informado que
los extractos alcohólicos de las hojas muestran actividad antileishmanial "in vitro" contra Leihsmania
amazonensis [4]. Los estudios realizados sobre la composición química de las especies de la costa
ecuatoriana han reportado la presencia de algunos compuestos terpénicos (principalmente
triterpenoides pentacíclicos), diterpenoides y sesquiterpenoides [5]. Los últimos son parte de la
fracción volátil de la especie y no aceites esenciales que se presentan en condiciones apreciables por
lo que este trabajo se lleva a cabo para estudiar los componentes volátiles obtenidos por
microextracción en fase sólida (SPME) a temperatura constante (50˚ C) con una fibra de
dimetilsiloxano de 100 micras. 2. Materiales y métodos Se utilizaron hojas, flores y tallos de la
especie en etapa fenológica de floración, recolectados alrededor del Centro de Investigación en
Biotecnología de Ecuador ubicado en el Km 30.5 a través de la provincia perimetral de Guayas-
Ecuador. Se tomó una muestra del material vegetal para la identificación botánica que fue botanizada
en el Herbario Nacional de Ecuador (QCNE), Quito, con el código CIBE37a. Los compuestos
volátiles se obtuvieron por microextracción en fase sólida (SPME) a temperatura constante de 50 ° C
con una fibra de dimetilsiloxano de 100 micras. La composición química de los compuestos volátiles
se analizó en un cromatógrafo de gases conectado a un espectrómetro de masas (GC-MS) Agilent
Technologies, equipado con una columna capilar J & W GC de 30 × 250 micrones x 0,25. Las
condiciones fueron las siguientes: temperatura inicial en el horno a 60ºC durante 1 minuto a 260ºC
con un incremento de 5ºC por minuto; seguido por un aumento de 15 ° C por minuto a 300 ° C por 1
minuto. Las temperaturas para el inyector y el detector fueron de 150 ° C y 280 ° C, respectivamente,
en modo dividido. Los compuestos volátiles se asignaron por comparación de sus espectros con
compuestos de referencia existentes en la biblioteca Wiley and Nist novena edición 2011 instalados
en la computadora. 3. Resultados y Discusión Los cromatogramas de los compuestos volátiles de
hojas, tallos y flores de V. patens se muestran en la Figura 1; el cromatograma de los compuestos
volátiles de las hojas fue el más complejo y el cromatograma de las flores fue menos complejo. Es
digno de mención que la mayoría de los componentes principales están en el rango de tiempos de
retención entre 15 y 20 minutos. Entre 20 y 25 minutos, solo las hojas tenían componentes con
abundancia relativa. Además, la presencia de un compuesto con gran abundancia relativa corresponde
al sesquiterpeno cariofileno con un tiempo de retención de 18.2 minutos aproximadamente. Este
compuesto ha sido identificado para las hojas de las especies ecuatorianas [5] y Vernonia ssp [6]. La
Tabla 1 muestra los monoterpenos aislados de diferentes órganos de plantas. Se aprecia que las hojas
tuvieron un mayor número de compuestos monoterpenos, con un total de siete mientras que en los
tallos se identificaron tres. En las flores, estos compuestos no pudieron ser detectados, o estuvieron
ausentes. Los compuestos de monoterpeno se eluyeron de la columna entre los minutos 5, 5 y 8, 5 de
la ejecución. Tiempo de retención de los compuestos encontrados en hojas y vapores era el mismo,
pero las abundancias relativas en vapor eran más altas. Para las hojas, el monoterpeno mayoritario
era α-pineno, mientras que en los tallos era D-limoneno. Los compuestos sesquiterpénicos se eluyeron
de la columna entre 16,3 y 22,2 minutos. 19 compuestos fueron identificados en las hojas, 6 en los
tallos y 3 en las flores. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Sesquiterpenos presentes en los
tallos y las flores, se encuentran también en las hojas, con la excepción del zingibereno que solo está
presente en los tallos. Para aquellos sesquiterpenos, la variabilidad es alta y la más abundante es la
cariofena, con una abundancia relativa del 23.42%. Sin embargo, en los tallos el sesquiterpeno más
abundante fue el α-bergamotene con un 34.51% de abundancia relativa y en las flores fue el α-
humulene con un 19.57% de abundancia relativa. El compuesto de cariofileno y su óxido informan
propiedades de interés farmacológico como antiinflamatorio, antitumoral, antibacteriano,
espasmolítico, antiséptico, antiparasitario contra Trypanosoma cruzi y Leishmania brasi-de liensis [7]
[8]; β Ocimene como un poderoso agente de la garrapata [9]; compuesto de \ alpha - bergamoteno
como antibacteriano y antioxidante [10]; la actividad insecticida se informa para linalool [11]; y β-
cariofileno y α-humuleno presentan actividad antifumigante [12]. Desafortunadamente, no hay
ningún estudio sobre los volátiles de V. patens reportados en la literatura para comparación. Estos
resultados confirman la riqueza en compuestos terpénicos de V. patens de la costa ecuatoriana, para
lo cual Manzano et al. [13] [14] identificaron a los triterpenoides pentacíclicos como los principales
constituyentes de la especie. Los resultados se informan por primera vez en las especies que crecen
en Ecuador. 4. Conclusión La fracción de compuestos volátiles de hojas, tallos y flores de V. patens
es rica en compuestos sesquiterpénicos, que son mucho más abundantes en las hojas de la especie
junto con el monoterpeno. Se identificó un total de 20 sesquiterpenoides y 7 monoterpenoides en las
muestras estudiadas

Avances en estudios de Vernonanthura patens (Kunth) H. Rob. Creciendo en Ecuador

La familia Asteracea (Asteraceae) incluye más de 23,000 especies y es el grupo de angiospermas con
la biodiversidad más rica existente en el mundo. Vernonia (Vernonanthura) es el gen más
representativo entre las 1000 especies [1 - 4]. Varios componentes químicos han sido reportados para
el género: lactonas sesquiterpénicas de tipo glaucólido, hirsutinolida, vernomargolida,
eudesmanolida, cardinanolida y elephantopus, informadas para la mayoría de las especies, con
algunas excepciones [5-11]. Además, se han aislado e identificado diterpenos derivados de ent-
kaurano y kaurano, triterpenoides pentacíclicos de oleanane y ursane, fitoesteroles y flavonoides [12-
15], mientras que las actividades farmacológicas antimicrobianas y molusquicidas han sido las más
investigadas [15-17] . Dentro del género Vernonia, Vernonanthura patens ha sido una de las especies
menos estudiadas. Es un arbusto que crece en forma silvestre en el Ecuador y es ampliamente
utilizado por personas en áreas rurales, que atribuyen varias propiedades medicinales entre ellas:
analgésico, antiinflamatorio, anticanceroso y antileishmanial. Sin embargo, el uso medicinal, los
estudios sobre la composición química y las actividades farmacológicas hasta 2010 fueron muy
pocos. La primera información recolectada sobre la composición química de la especie informó la
ausencia de lactonas sesquiterpénicas [18], que constituyeron un marcador químico de género. Sin
embargo, en 1986, se estudiaron las partes aéreas, se aislaron y se identificaron 10 lactonas de una
especie, contradicciones existentes sobre la composición [19]. Jakupovic y Schmedia-Hirschmann,
con respecto a la actividad biológica, existe menos información. El primero fue el efecto demostrado
por un extracto de metanol de las hojas contra Artemia salina, la inercia del tumor del disco de papa
producido por la introducción de Agrobacterium tumefaciens y la falta de citotoxicidad contra las
líneas celulares V79 [20]. La actividad antipalúdica de inst Plasmodium falciparum se ha informado
[21], mientras que otros autores han informado que un extracto acuoso de hojas, obtuvo actividad
antileishmanial contra cepas de Leishmania amazonensis con una CI50> 100 μg / ml, siendo estos los
únicos informes encontrados para la especie [22 ]

1.1. Estudios en la especie V. patens en la costa ecuatoriana

En un capítulo anterior de este libro, se han publicado los resultados para el fraccionamiento de un
extracto de metanol de la especie, el estudio de fracciones como antifúngico contra cepas de Fusarium
oxysporum y Penicilium notatum, y la caracterización química por cromatografía de gases /
espectrometría de masas de la fracción que mostró esa actividad. La fracción de hexano presentó
actividad antifúngica contra estas cepas, y 33 compuestos fueron posibles de identificar. Tres
triterpenoides pentacíclicos (lupeol, epilupeol y acetato de lupeol), presentados como componentes
principales, también fueron aislados y caracterizados por fracciones [23] A diferencia de otras
especies de Vernonanthura y los propios V. patens que viven en otras regiones de Sudamérica, la que
crece en Ecuador presenta como componentes principales triterpenoides pentacíclicos y no
sesquiterpén lactonas. Estos resultados obligaron a realizar una caracterización genética de los genes
del plástido rbcL y matK de la fracción de ADN del cloroplasto de hoja, y confirmaron que la especie
era V. patens [24, 25] Este grupo de investigación ha continuado con estudios para verificar la
identidad de se destacan las especies, obteniéndose la identificación de 53 compuestos de hojas de un
extracto metanólico dentro de los compuestos terpénicos (sesquiterpenoides y triterpenoides
oxigenados), hidrocarburos alifáticos, ácidos grasos, y sus ésteres metílicos y etílicos y azúcares [26,
27]. En otros estudios, se aislaron dos tipos de ceras de hojas y fracciones de grasa de tallos y flores
y se identificaron 29 ácidos grasos y 8 triterpenoides como componentes de las fracciones lipídicas
de estos órganos, que no se habían informado anteriormente (tablas 1 y 2) [28]. La Figura 1 presenta
algunas de las estructuras químicas identificadas en esta especie. En cuanto a los estudios biológicos,
se realizó la evaluación antileishmanial del extracto etanólico de las hojas y tallos, demostrando el
uso tradicional de las hojas de la especie como antileishmanial. El extracto de etanol de tallos fue
altamente tóxico. El extracto de hojas mostró un mayor índice de selectividad que la pentamidina,
que se utiliza como fármaco de referencia [29].

Materiales y métodos Las hojas, flores y tallos de la especie en la etapa fenológica de la floración
fueron utilizados y recolectados alrededor del Centro de Investigación en Biotecnología de Ecuador
ubicado en el Km. 30.5 vía el perímetro de la provincia de Guayas, Ecuador. Una muestra del material
vegetal fue tomada para botánica identificación, que fue botanizada en el Herbario Nacional de
Ecuador (QCNE), Quito, con la clave CIBE37a.

Extracción La extracción de las partes aéreas de la especie (hojas, flores y tallos) se realizó en agua
y etanol por triplicado en un baño ultrasónico VWR de 35 KHz de potencia [30]. En todos los casos,
se extrajeron 10 g de muestra en el solvente (agua o etanol), en los siguientes intervalos de tiempo:
5, 15, 30, 45 y 60 min.

Determinación de la actividad antioxidante La determinación de la actividad antioxidante se

realizó en base a la estabilidad del radical 1,1difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) a los extractos
alcohólicos y acuosos obtenidos a partir de las partes aéreas. Se tomaron un total de 800 μl de DPPH
0,1 N y 200 μl de los extractos, y se midió la absorbancia a 517 nm después de 30 min usando 200 μl
de etanol y 800 μl de DPPH como control. Las determinaciones se realizaron por triplicado.

Determinación de polifenoles totales El contenido total de polifenoles se midió mediante el método

de Folin-Ciocalteu en un espectrofotómetro (BioTek), a 760 nm usando monohidrato de ácido gálico
(CAS 149-91-7) como patrón de la curva de calibración. Los resultados se expresaron en miligramos
de ácido gálico por gramo de muestra (mg de GA / g de muestra). Se mezclaron un total de 250 μl de
muestra y 350 μl de Folin-Ciocalteu 1N; 5 min después, se añadieron 350 μl de 20% de carbonato de
sodio. Después de la incubación de 90 minutos a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 760
nm. Las determinaciones se realizaron por triplicado.

Perfil cromatográfico de los extractos por HPLC Se realizaron perfiles cromatográficos mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en todos los extractos obtenidos en diferentes
tiempos de extracción para determinar si el tiempo de extracción produce cambios químicos en los
extractos. El análisis por HPLC se realizó con Perkin Elmer Series 2000 HPLC con sistema operativo
TotalCrom Software. Los compuestos fenólicos se detectaron a 280 nm con un caudal de 1 ml / min.
La columna C18 se usó a una temperatura de 30 ° C. Las separaciones se llevaron a cabo en un sistema
de bombeo variando la proporción de ácido acético al 2,5% (v / v) en agua (fase móvil A) y metanol
al 70% en agua (fase móvil B). El programa de elución de gradiente de disolvente fue el siguiente:
10% a 26% de B (v / v) en 10 min, a 70% de B a los 20 min, y finalmente a 90% de B a los 25 a 31
min. El volumen de inyección para todas las muestras fue de 10μL.
Análisis estadístico Se utilizó un diseño factorial de 2 × 3 × 5 que involucra los factores categóricos:
solvente de extracción (agua y alcohol), órgano de la planta (hojas, flores y tallos) y tiempo de
extracción (5, 15, 30, 45 y 60 min) , con actividad antioxidante y contenido total de polifenoles como
variables de respuesta.

Actividad antileishmanial Esta prueba se realizó con extractos acuosos obtenidos como se describe.

Extracción acuosa La extracción se llevó a cabo por decocción de materiales vegetales en una
proporción del 10% en agua durante 20 minutos. El extracto acuoso se evaporó a 87ºC y 400 mmHg.
Finalmente, el extracto concentrado se liofilizó a 120 × 10-3 mbar y 47ºC bajo cero.

El fármaco de referencia Pentamidina (Richet, Buenos Aires, Argentina) diluido en agua destilada
estéril se utilizó para L. amazonensis. L. amazonensis (MHOM / 77BR / LTB0016) fue amablemente
proporcionado por el Departamento de Inmunología de la Fundación Oswaldo Cruz (FIOCRUZ),
Brasil. Los parásitos se aislaron rutinariamente de las lesiones de ratón y se mantuvieron como
promastigotes a 26ºC en medio de Schneider (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) Que contenía suero
fetal bovino inactivado por calor (HFBS) al 10% (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) , 100 mg de
estreptomicina / ml y 100 U de penicilina / ml. Los parásitos no se usaron después del décimo pasaje.

Actividad antileishmanial La actividad de los extractos contra amastigotes intracelulares se evaluó

como se describió previamente. Los macrófagos peritoneales se recogieron y plaquearon a 106 \ mu
g / ml en LabTek de 24 pocillos (Costarâ, EE. UU.) Y se incubaron a 37ºC bajo una atmósfera de 5%
de CO _ {2} durante 2 h. Las células no adherentes se eliminaron mediante lavado con solución salina
tamponada con fosfato precalentada (PBS). Los promastigotes de Stationaryphase L. amazonensis se
añadieron a una relación 4: 1 de parásitos / macrófagos, y los cultivos se incubaron durante 4 h
adicionales. Las monocapas celulares se lavaron tres veces con PBS precalentado para eliminar los
parásitos libres. Luego se añadieron 999 ml de medio completo RPMI y se añadieron 1 ml de los
diferentes productos disueltos en DMSO por duplicado durante 48 h adicionales. Los cultivos se
fijaron en metanol absoluto, se tiñeron con Giemsa y se examinaron con un microscopio óptico. El
número de amastigotes intracelulares se determinó contando los amastigotes en 100 macrófagos por
cada muestra. Además, se calculó el porcentaje de macrófagos infectados. Los resultados se
expresaron como porcentaje de reducción de la tasa de infección en comparación con la de los
controles, donde las tasas de infección se obtuvieron al multiplicar el porcentaje de macrófagos
infectados por el número de amastigotos por macrófagos infectados [31]. El valor de IC50 se
determinó a partir de la regresión lineal de las curvas de concentración-respuesta. Se determinó la
CI50 de los extractos para la viabilidad de los macrófagos peritoneales de ratón. Se recogieron
veintidós macrófagos de cavidades peritoneales de ratones BALB / c normales en medio RPMI 1640
helado (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) Suplementado con antibióticos y se sembraron a 30.000
células / pocillo. Las células se incubaron durante 2 horas a 37ºC en 5% de CO2. Las células no
adherentes se eliminaron mediante lavado con PBS, y luego se añadió 1 μl de solución de producto a
200 μl de medio que contenía 10% de HFBS y antibióticos. Los macrófagos tratados con 1 μl de
DMSO se incluyeron como controles. La citotoxicidad se determinó usando el ensayo colorimétrico
con 3- [4,5 bromuro de dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, EE.
UU.). Las soluciones de MTT se prepararon a 5 mg / ml en solución salina, se filtraron y se
esterilizaron en el momento del uso, y se añadieron 15 μl a cada pocillo. Después de incubar durante
3 h adicionales, los cristales de formazano se disolvieron mediante la adición de 100 μl de DMSO.
La densidad óptica se determinó utilizando un EMS Reader MF Versión 2.4-0, a una longitud de onda
de prueba de 560 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm [32]. La CI50 se obtuvo
ajustando un modelo Emax sigmoidal a las curvas dosis-respuesta. Los índices de selectividad se
calcularon dividiendo la IC50 para el macrófago peritoneal de ratones BALB / c por la IC50 para
amastigotes de L. amazonensis. La IC50 de los extractos para la viabilidad de los macrófagos
peritoneales de ratón se determinó [31].

3. Resultados y discusiones Determinación de la actividad antioxidante

Se determinó el porcentaje de actividad antioxidante por el método de DPPH de los extractos acuosos
y alcohólicos de diferentes órganos de la planta, que se obtuvieron en diferentes momentos de la
extracción ultrasónica, y se observaron diferencias en el tiempo de extracción. El mayor porcentaje
de actividad antioxidante se obtuvo empleando un tiempo de extracción de 5 minutos para los
extractos acuosos de hojas y flores. Sin embargo, el mayor porcentaje de actividad se obtuvo a los 15
min de extracción para el extracto acuoso de tallos. Los extractos alcohólicos de hojas y tallos no
mostraron actividad en ningún momento de extracción; en cambio, se observó una mayor actividad a
los 45 y 60 min de extracción en flores de V. patens sin diferencias de significación entre estos
tiempos (p> 0.05) (Tabla 3, Figura 2).

Solo hay un antecedente de actividad antioxidante para el género Vernonia, para la especie Vernonia
tweedieana, sin estudios previos para V. patens [33].

Determinación de polifenoles totales

La parte de la planta, el tiempo de extracción y el disolvente empleado tienen influencia en el

contenido de polifenoles. No se pudo cuantificar polifenoles cuando se usó etanol como solvente,
posiblemente porque este solvente elimina otros compuestos químicos coloreados como clorofila,
caroteno y otros pigmentos que interfieren con la determinación espectrofotométrica de los
polifenoles en el extracto. Cuando se usa agua como solvente, existe una relación directa entre el
tiempo de extracción y la concentración de polifenoles; es decir, cuanto mayor es la extracción, mayor
es la concentración independiente del órgano de la planta utilizado (Figura 3). En todos los casos, el
mayor porcentaje de polifenoles totales se obtuvo a los 45 min de extracción acuosa sin diferencias
significativas (p> 0.05) con 60 min de extracción. En este momento de la extracción (45 min), las
hojas de la especie exhibieron el mayor porcentaje de polifenoles, seguido de flores. Los tallos
exhibieron el porcentaje más bajo de polifenol (Tabla 4). Existen varios informes sobre la presencia
de compuestos fenólicos en los diferentes órganos de la planta para el género Vernonanthura
(Vernonia). Los flavonoides han sido designados como constituyentes de género [34]. Los
flavonoides, taninos y fenólicos se informan para las hojas de V. cinerea [35], mientras que otros
autores han informado de la presencia de flavonoides [14]. Para las flores de la misma especie, los
flavonoides, los taninos y los compuestos fenólicos se han identificado bien [35]. Se han detectado
flavonoides y taninos para las hojas de Vernonia amigdalina, [36, 37].

Se han reportado compuestos fenólicos, taninos y flavonoides entre otros compuestos en las hojas,
tallos y flores de la especie V. patens de la costa ecuatoriana [38]. Esto puede explicar el contenido
total de polifenoles encontrados en diferentes órganos de plantas estudiados, aunque en una
proporción no muy alta.

Perfil cromatográfico de los extractos por HPLC Teniendo en cuenta que el método de extracción
con ultrasonido a veces causa cambios en la composición química de los extractos, se realizó un perfil
cromatográfico a los extractos acuosos obtenidos a los 5 y 45 min de extracción. Se observan algunos
cambios en el perfil cromatográfico del extracto acuoso de las hojas a los 45 min (Figura 4),
especialmente en la línea base, aunque la intensidad pico cromatográfica más alta observada a
aproximadamente 56,9 minutos no tiene variación.
Los cambios del perfil cromatográfico son menores en el extracto acuoso de las flores; también se
observa un pico cromatográfico mayor alrededor de 56,6 minutos (Figura 5). Sin embargo, el extracto
acuoso de los tallos no sufrió cambios en el perfil cromatográfico a los diferentes tiempos de
extracción analizados (5, 15 y 45 min). El tiempo de retención del pico principal se encontró a 56,9
minutos (Figura 6). Solo se realizó el estudio de extractos alcohólicos de flores porque fue el único
que mostró actividad antioxidante. Se observaron cambios mínimos en el perfil cromatográfico de
extracción de 5 y 45 minutos, que pueden deberse a la transmisión de las ondas ultrasónicas en el
disolvente de etanol, que son más bajas que cuando se usa agua [38, 39]. También se observó un pico
cromatográfico alrededor de 57 min en este extracto (Figura 7). Los resultados nos llevan a creer que
en todos los órganos vegetales de la especie obtenida con agua y el extracto alcohólico de las flores,
existe un componente principal o una mezcla de los mismos, que se eluyó en un tiempo de retención
similar por HPLC, en las condiciones estudiadas, que puede o no ser responsable de la actividad
antioxidante encontrada para estos compuestos. Sin embargo, es importante señalar que no se
encontró ninguna correlación entre el contenido de polifenoles de los extractos y la actividad
antioxidante. En todos los casos, cuanto mayor es el porcentaje de actividad antioxidante, menor es
el porcentaje de polifenoles totales (Figura 8). Estos resultados indican que la actividad antioxidante
de los extractos acuosos de la especie no se debe únicamente a la presencia de compuestos
polifenólicos que permanecen para determinar la composición química de estos extractos para
determinar qué uno o más compuestos son influyentes en esta actividad.

Evaluación de actividad antileishmanial

Los extractos acuosos de hojas y tallos mostraron actividad y selectividad contra L. amazonensis
(Tabla 5). La actividad y selectividad presentes en el extracto acuoso de los tallos mostraron una
comportamiento diferente al reportado para el extracto de etanol de este órgano vegetal [28]. La
evaluación se informó como no detectable porque causaba una toxicidad mínima en las
concentraciones probadas, destruyendo la monocapa celular. Los resultados obtenidos para el extracto
acuoso respaldan el uso tradicional de la especie y son altamente relevantes ya que estos extractos
mejorarían la utilidad de una posible fuente de bajo costo para el desarrollo de un medicamento a
base de hierbas eficaz para el tratamiento contra Leishmani IC50, medio inhibidor máximo
concentración, se expresa como la concentración de extracto (mg / ml) que inhibe el 50% del
crecimiento del parásito. CC50, concentración citotóxica mediana, se expresa como la concentración
de extracto (mg / ml) que causa el 50% de la mortalidad del parásito. X ¯ (S), media (desviación
estándar). SI, índice de selectividad: macrófagos CC50 / IC50 Leishmania. SI ≤ 5 más selectivo para
la célula, SI ≥5 más selectivo para el parásito.

Conclusión El ultrasonido del tiempo de extracción influye en la concentración de compuestos

polifenólicos en todos los órganos analizados, cuando se usa agua como disolvente. Los extractos de
etanol no pueden determinar la concentración de compuestos fenólicos debido a la posible
interferencia de compuestos coloreados extraídos con este solvente. Los extractos acuosos de las
hojas y las flores y el extracto alcohólico de las flores mostraron una mayor actividad antioxidante
que los extractos acuosos de los tallos. La actividad antioxidante en los extractos alcohólicos de hojas
y tallos no se observó. Los perfiles cromatográficos HPLC de todos los extractos probados mostraron
un pico cromatográfico mayoritario entre 56 y 57 minutos, que podría corresponder a una mezcla de
compuestos responsable de la actividad antioxidante encontrada. No se encontró correlación entre la
actividad antioxidante y el contenido de polifenoles, por lo que presumiblemente no son los únicos
responsables de la actividad antioxidante encontrada. Los extractos acuosos de las hojas y tallos de
la especie V. patens mostraron una mayor actividad y selectividad que los extractos alcohólicos,
contra L. amazonensis, lo que corrobora el uso tradicional de la especie.
Factores de transcripción: su papel en la regulación de la embriogénesis somática en
Theobroma cacao L. y otras especies

Theobroma cacao L. (cacao) es un árbol tropical que crece naturalmente en la selva tropical de la
Amazonía y en los valles del Orinoco, donde se ha identificado su origen [1]. Después de ser
cosechado y poscosechado, el cacao es el ingrediente principal del chocolate, así como de la manteca
de cacao, que se extrae y se usa en la preparación del chocolate y en la industria cosmética. Además,
los flavanoles de cacao son productos promisorios porque son antioxidantes naturales y se ha
demostrado que contribuyen a la salud humana (por ejemplo, la salud cardiovascular) [2]. Este cultivo
es compatible con los ingresos de numerosos pequeños propietarios (casi el 70% de los granos de
cacao suministrados al mundo proviene actualmente de pequeñas granjas en África Occidental) y
también forma parte del negocio del chocolate [3, 4]. Por lo tanto, tiene un impacto social y
económico importante en el mundo. Muchas de las plantaciones de cacao existentes son viejas e
improductivas, y algunas de las variedades o genotipos que son altamente productivas en el campo
son susceptibles a plagas y enfermedades [5]. Una de las formas de aumentar la productividad es
reemplazar los árboles viejos por medio de técnicas tradicionales, como injertos y esquejes
enraizados. La micropropagación a través de la embriogénesis somática (EE) es otra alternativa. La
propagación del cacao vía SE se ha desarrollado desde 1958, pero todavía hay muchos detalles en la
técnica que requieren mejoras [6]. El SE en T. cacao sigue siendo un desafío para la producción de
plantas comercialmente porque el cacao es una planta recalcitrante cuando se lo somete al cultivo de
tejidos. Muchos protocolos SE han dado buenos resultados, pero la tasa de producción de los
embriones primarios es muy baja o está ausente [7-11]. Los principales cuellos de botella que deben
resolverse son (1) producción inferior o nula de embriones primarios en algunos genotipos, (2)
embriones con morfologías anormales que inducen maduración y germinación deficientes y, como
consecuencia, (3) baja tasa de conversión de esos embriones en las plantas. Por lo tanto, la calidad en
la maduración y la germinación de los embriones somáticos, así como las plantas sanas (con buena
morfología) son indicadores de que las plantas sobrevivirán durante el proceso de aclimatación.
Algunas explicaciones para esto podrían ser que todo el proceso depende en gran medida del
genotipo; también existe la necesidad de obtener embriones de otra fuente de tejido, así como la
necesidad de obtener más información sobre la fisiología, la genética y la biología molecular del
proceso de SE del cacao para tratar de superar el problema de la recalcitrancia. Este tipo de
información aún es incipiente. Para obtener una tasa de éxito más alta para este proceso, la comunidad
científica necesita obtener más conocimiento sobre cómo funcionan esos mecanismos y establecer un
vínculo entre todos los mecanismos para comprender mejor su interacción y / o sus interferencias [11,
12]. Además, la morfogénesis es un aspecto fundamental en la biología del desarrollo. Un organismo
puede desarrollar su estructura y forma a lo largo de toda su vida. La morfogénesis controla la
distribución espacial de las células durante el desarrollo del embrión y desempeña un papel importante
en embriones zigóticos y somáticos. Las hormonas, las condiciones ambientales y el estrés mecánico
o químico en la naturaleza estimulan la morfogénesis. También puede ser estimulado bajo
condiciones artificiales (por ejemplo, cultivo "in vitro") por los mismos mecanismos, y este evento
es un determinante clave en el proceso SE [12]. SE como un evento morfogenético está modulado
por una serie de factores intrínsecos de la célula tales como factores de transcripción, remodelación
de la cromatina, ARN pequeños, metilación o acetilación del ADN y elementos transponibles [13].
La morfogénesis también está modulada por factores extrínsecos como el medio ambiente y otros
factores bióticos o abióticos, así como por la fenología de la planta donante [14]. Estos factores
actuarán al modular la actividad celular a un desarrollo específico en una dirección específica o
mediante la reprogramación celular con la restauración de sus características de totipotencia. Otro
tema importante en la morfogénesis es la capacidad de integrar el crecimiento y la diferenciación
mediada por la división celular continua (mitosis en las células somáticas), en la cual varios factores
de transcripción están involucrados. Esta revisión presenta un estudio de la literatura sobre factores
de transcripción como mediadores en el proceso de SE en algunas plantas (por ejemplo, Arabidopsis
thaliana como planta modelo) y especialmente en T. cacao. Para comprender mejor cómo funcionan
los factores de transcripción en SE, decidimos dividir esta revisión en dos secciones: (1) iniciación y
desarrollo de embriones y (2) transición a la maduración del embrión.

factores de transcripción implicados en la iniciación y el desarrollo de la embriogénesis

somática

El reino vegetal tiene dos rutas diferentes de morfogénesis en plantas superiores para la reproducción
asexual (sin fusión de los gametos), como la organogénesis y la SE. Estos eventos pueden ocurrir in
vitro o in vivo (naturaleza) y son un ejemplo de totipotencia que puede explotarse para la propagación
masiva de plantas in vitro porque, en teoría, cualquier célula o tejido en la planta puede generar una
nueva planta con el mismo genotipo como el padre materno Los embriones somáticos pueden
desarrollar estructuras bipolares sin conexión vascular con el tejido de la madre. En ese caso, los
embriones producidos deberían estar libres de contaminación por microorganismos (patógenos) [15].
Las células somáticas en las plantas tienen plasticidad. Ambas células individuales (células
determinadas embrionariamente) o un grupo de células que necesitan estimulación para la expresión
de SE (células no determinadas embrionariamente) bajo las condiciones de cultivo especiales pueden
regenerar nuevas plantas de forma idéntica a la planta madre por SE. Es importante mencionar que
hay dos maneras diferentes de producir embriones por SE: (1) SE indirecto con formación previa de
callos y estimulación del callo para producir embriones y (2) SE directo, que no necesita una
formación previa de callos el tejido de la madre. En el último caso, los embriones se producen a partir
del tejido directamente, a veces desde el protodermo o desde las capas del mesófilo [16]. Durante el
paso de inducción, la expresión genética diferencial da como resultado la síntesis de nuevos ARNm
y proteínas que eventualmente activan el nuevo programa de desarrollo en las células. Los nuevos
patrones de expresión estimulan una cascada de desencadenantes genéticos que activan o desactivan
la expresión de genes específicos controlados por los factores de transcripción [17]. Por definición,
los factores de transcripción son proteínas que pueden controlar la transcripción de la información
genética del ADN al ARNm, uniéndose a dominios específicos de la secuencia de ADN, que pueden
ser secuencias potenciadoras (reguladoras) o promotoras del ADN. De esta forma, TF puede estimular
o reprimir la transcripción de genes particulares [17]. Las células no determinadas de forma
embrionaria necesitan ser estimuladas por agentes estresantes como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D). 2,4-D es el agente estresante más utilizado para la estimulación de SE en una diversidad de
plantas, y existe una relación entre la concentración de 2,4-D y el nivel de estrés en el tejido. Si el
estrés el nivel excede la tolerancia celular (para los reguladores de crecimiento externos e internos),
las células pueden morir [18]. Además, 2,4-D es una potente auxina sintética que en altas
concentraciones puede causar variaciones somaclonales no deseadas [19]. Cuando el tejido se somete
a un tratamiento de estrés, la actividad de las proteína quinasas activadas por mitógenos (MAPK)
puede promover los factores de transcripción para activar las cascadas de fosforilación que unen las
respuestas de estrés oxidativo a la señalización de auxina, regulación del ciclo celular y control del
crecimiento en eucariotas. Esto significa que si la célula después del tratamiento con el factor
estresante aún está viva, la célula probablemente esté adaptada para la nueva expresión del programa,
que en este caso será SE [18]. Actualmente, es necesario buscar otras fuentes de estrés para evitar
variaciones o mutaciones somaclonales. Para que SE suceda, es necesario desactivar el antiguo
programa de expresión génica y estimular un nuevo programa de ADN para expresar el SE y
comenzar el desarrollo de un nuevo programa morfogénico. Además de la expresión génica
diferencial, existen diversas vías de transducción de señales para la activación o represión de
numerosos conjuntos de genes que aún no se han identificado, y la mayoría de ellos están mediados
por factores de transcripción [13]. El gen SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE
(SERK) ha sido identificado como un gen candidato potencial en la inducción de SE. Numerosas
investigaciones mencionaron que este gen se identificó en cultivos celulares competentes de Daucus
carota expresados en células vacuoladas [20]. Además, el gen SERK se expresa durante la etapa
temprana de SE, como la etapa globular y en el desarrollo embrionario. Los genes homólogos se
informaron en el inicio SE en varios estudios como A. thaliana (AtSERK1), Cocos nucifera
(CnSERK), Citrus unshiu (CuSERK1), Dactylis glomerata (DgSERK), Helianthus annuus
(HaSERK), Medicago truncatula (MtSERK), Oryza sativa (OsSERK), Solanum tuberosum
(StSERK1), T. cacao (TcSERK), Triticum aestivum (TaSERK) y Vitis vinifera (VvSERK) [21].
Cuando este gen se sobreexpresó, condujo a un aumento de tres o cuatro veces en la competencia
embriogénica [20]. En las investigaciones de Daucus carota y Arabidopsis, cuando SERK está
sobreexpresado en la superficie de la célula, puede reconocer las señales moleculares que intermedian
la unión a proteínas extracelulares en las regiones LRR de la proteína SERK. La unión a SERK induce
una cascada de señalización dentro de la célula que incluye componentes de la vía de señalización de
brasinoesteroides como BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 1 (BRI1) y su co-receptor BRI1-
ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 (BAK1) / SERK3 [22]. Estas señales pueden identificar
diferentes objetivos y mediar alteraciones moleculares a través de la remodelación de la cromatina
para mejorar la expresión de genes en las primeras etapas de SE [por ejemplo, Cotyledon frondoso
(LEC) y Baby Boom (BBM)] llevando a las células o tejido a la transición de embriogénesis [20 ,
22]. Como se mencionó anteriormente, SERK media la respuesta de patrones de expresión génica
variados, y es probablemente la clave para que las células somáticas se conviertan en embriones
somáticos como una transición en el SE proceso [21]. En cacao, TcSERK es un gen funcional que
desempeña un papel importante durante la embriogénesis del cacao, principalmente en callo
competente para SE y en embriones somáticos en etapa globular si se mantienen cultivos repetitivos
en el mismo medio [23]. Este medio suele ser el medio de crecimiento de callos primario (PCG) [20,
22]. Aunque la iniciación de SE ha sido estudiada en diferentes plantas, la biología del proceso aún
no está clara, y por lo tanto se convierte en una investigación empírica. Algunas publicaciones han
informado sobre la interacción de los genes de limpieza (incluidos los posibles factores de
transcripción) que están en constante actividad en la división celular y la formación de la pared celular
en las diversas etapas de iniciación y diferenciación del embrión [19]. Existen dudas sobre cómo una
célula diferenciada puede adquirir totipotencia y convertirse en una célula madre con la capacidad de
producir un nuevo individuo. Otra pregunta es por qué las células totipotentes o embriogénicas están
restringidas a algunos tejidos tales como explantes, células y genotipos cuando se someten a
condiciones in vitro. En el paso de iniciación de SE, hay dos detalles de mayor importancia: genotipos
recalcitrantes y una selección adecuada de explantes. Esto se puede resolver, en parte, optimizando
las condiciones de crecimiento, pero no en todos los casos [17]. Por el contrario, la apomixis ocurre
en algunas plantas que tienen capacidad de producir embriones (por ejemplo, Kalanchoë,
Bryophyllum). Estas plantas pueden generar plantas fácilmente nuevas con brotes y raíces en el ápice.
Los factores de transcripción regulan numerosos genes (regulación hacia arriba o hacia abajo) que
son importantes en el proceso de iniciación SE. Por ejemplo, durante la etapa de iniciación de SE de
alfalfa, hay dos genes que codifican histonas, H3-1 y H3-11, que se activan específicamente en
condiciones de cultivo mediante tratamientos con auxinas. Lo más probable es que H3-1 y H3-11
mejoren la transcripción de algunos genes SE mediante la reorganización de la cromatina, lo que
permite la transcripción de ARN específicamente para SE [15]. SE también requiere auxina para el
establecimiento del meristema apical del brote (SAM) que está mediado por el factor de transcripción
homeodominio WUSCHEL (WUS), que es esencial para la iniciación de células madre y al mismo
tiempo para la floración y el mantenimiento de meristemas [24]. Es posible que WUS desempeñe un
papel importante en la generación de las células madre para el inicio SE. La transcripción WUS, por
sí misma, está regulada por los receptores de la vía de señalización CLAVATA [24]. En Arabidopsis,
BABY BOOM (BBM) es un miembro de la familia AP2 de factores de transcripción, y al mismo
tiempo, AP2 es parte de la superfamilia AP2 / ERF. BBM puede inducir la formación de embriones
somáticos sin reguladores del crecimiento de las plantas. En cacao, la expresión del gen TcBBM en
embriones somáticos fue alta durante el desarrollo embrionario y comparable con la expresión de
TcBBM en embriones zigóticos [25]. Cuando la TcBBM se sobreexpresa en el tejido somático, los
explantes generan embriones en una cantidad acelerada, pero los embriones se mantienen en la etapa
globular. Por el contrario, cuando este gen se expresa en niveles moderados, la producción de
embriones es aceptable y adquieren etapas globulares, cardíacas y de torpedo.

La sobreexpresión de TcBBM parece inhibir el desarrollo embrionario posterior [25]. Otros factores
de transcripción de la familia AP2 son GmBBM1, GmAIL5 y GmPLT2 que se encontraron en
cultivos SE de soja (Glycine max L.). GmAIL5 y GmPLT2 fueron homólogas a Arabidopsis
AINTEGUMENTA-like5 (AIL5) y PLETHORA2 (PLT2), respectivamente [26]. Estos factores de
transcripción particulares están implicados en el mantenimiento de la división de células madre
durante el inicio del callo embriogénico, y AP2 supervisa el mantenimiento del nicho de células madre
del meristemo de brotes. Todos los miembros de la familia de factores de transcripción mencionados
anteriormente funcionan en diversos procesos, como el crecimiento de las plantas, la reproducción y
las interacciones ambientales [26]. Además, es importante mencionar que PLETHORA (PLT1 y
PLT2), que controlan el mantenimiento y las células madre de la raíz, funciona de forma redundante
con BBM y PLT3 / AIL6 en el meristemo de la raíz y la diferenciación embrionaria. Además, los
genes similares a AINTEGUMENTA (AIL) están implicados en el estado competente de división de
las células [26]. Cuando un gen relacionado con WUS, el ACTIVADOR DE CRECIMIENTO
VEGETAL (PGA), se sobreexpresa, induce EA de alta frecuencia en tejidos de Arabidopsis u otros
materiales vegetales de una manera independiente de la hormona [27]. La sugerencia es que el gen
WUS / PGA modula SE mediante la promoción de la transición embriogénica de las células somáticas
o en el mantenimiento de la competencia embriogénica en las células [27]. Aunque la regulación de
la expresión de WUS por auxinas durante SE no se conoce bien, el establecimiento de gradientes de
auxina se correlaciona con su expresión. Los gradientes de auxina también parecen activar los genes
de la familia PIN1 para la localización polar dentro del callo embrionario. Esto podría indicar que el
establecimiento de gradientes de auxina y el transporte de auxinas polares mediado por PIN1 son
importantes para la inducción de WUS y para SE [28]. PIN-FORMED (PIN) es una familia de
proteínas transmembrana específicas de plantas que transportan las moléculas de señal de la planta
(fitohormonas, especialmente auxinas) como sustrato. El transporte polar de célula a célula de la
auxina está mediado por la entrada de PIN y las proteínas portadoras de salida, y es muy importante
en el control crítico del proceso de desarrollo [29]. En Arabidopsis, hay ocho miembros de la familia
de genes PIN (AtPIN1 a AtPIN8). Cada miembro tiene un patrón de expresión específico de tejido, y
el eflujo y la afluencia están localizados asimétricamente, así como el transporte de la auxina en las
células. Cuando PIN1 está mutado, el gradiente de auxina endógena falla, lo que lleva al desarrollo
anormal de la formación de brotes, raíces, embriones e inflorescencia [29]. Cuando SE se activa en
las células competentes de la planta, se detectan las transcripciones del FACTOR 1 DE
ELONGACIÓN EUKARYÓTICA (CEM1) y CEM6 cuando las células están en mitosis, en división
formando la etapa globular y cardíaca, y en la nueva síntesis proteica para genes de limpieza en la
celda [30]. El cDNA CEM6 codifica una proteína rica en glicina que contiene hidrofo secuencias
señal bic como dominio, que estimula la expresión embrionaria temprana y juega un papel importante
como proteína de la pared celular en la embriogénesis [17, 18]. Otros genes como la ADN
topoisomerasa I codifican una enzima clave que participa en el ciclo celular, y se detecta una gran
cantidad de esta enzima en la etapa de torpedo de los embriones somáticos en las zanahorias [31].
Esta acumulación de la topoisomerasa informada muestra que se produce una reprogramación de la
expresión génica en la transición de formas embrionarias globulares a formas más maduras. En esa
etapa, tanto los eventos de división como los de diferenciación dan lugar a los tejidos y órganos de la
futura planta adulta [31]. Otros genes identificados en los eventos tempranos de la morfogénesis en
SE de Zea mays son las globulinas GLB102, GLB103 y GLB201. Los niveles de transcripción para
GLB102 y GLB201 aumentan durante las primeras etapas de SE. Estas proteínas están reguladas por
el ácido abscísico [32]. Otra enzima clave implicada en la biosíntesis de auxinas endógenas en los
embriones es la familia YUCCA (YUC), necesaria para establecer la parte basal del embrión [33]. La
inducción de la mutación YUC (yuc1, yuc4, yuc10 y yuc11) perjudicó la distribución local de auxinas
y dio como resultado embriones con anormalidades severas del desarrollo tales como la ausencia de
hipocotilo o meristema de la raíz. Estos resultados se asemejan a los de las mutaciones de los genes
PIN, lo que indica que la presencia de la biosíntesis de auxinas o el transporte polar es necesaria para
el desarrollo normal de los embriones somáticos [33]. Mientras tanto en Arabidopsis, la biosíntesis
de etileno disminuye durante la producción de embriones somáticos (porque en alta concentración de
precursor de etileno, SE inhibe), mientras que en otras culturas como Medicago truncatula, el etileno
promueve la formación de SE [34, 35]. En Medicago truncatula, el perfil de transcripción de callos
embriogénicos producidos a partir de protoplastos de mesófilo indica una regulación positiva de la
biosíntesis de etileno, lo que demuestra que esta fitohormona es necesaria para SE en esta especie. La
superfamilia AP2 / ERF y la subfamilia ERF de factores de transcripción desempeñan un papel
importante en esta especie. M. truncatula SOMATIC EMBRYO RELACIONADO FACTOR1
(MtSERF1) es inducida por etileno y se expresa en la formación de callos y en embriones somáticos
globulares [35], pero en Arabidopsis, una fuerte inhibición del gen ERF022 de la familia ERF se
asocia con la inducción de SE . Los resultados sugieren que este gen puede controlar el gen 1-
aminociclopropano-1-carboxilato sintasa 7 (ACS7) implicado en la biosíntesis de etileno y los genes
ERF1 y ETR1, que participan en la señalización del etileno. El impacto negativo del etileno en la
inducción de SE en Arabidopsis probablemente se deba a su papel en la modulación de genes
relacionados con auxinas que controlan la transición embriogénica en células somáticas [36]. ERF022
interactúa con el gen LEAFY COTYLEDON2 (LEC2), y es posible que ambos estén implicados en
la diafonía de auxina-etileno que opera en la inducción de SE en Arabidopsis [36].

LEC1 así como BBM1 también juegan un papel importante en el inicio de SE y el desarrollo posterior.
En Arabidopsis, LEC1 es un importante regulador del desarrollo embrionario que activa la
transcripción génica necesaria para la morfogénesis embrionaria y la diferenciación celular. Además,
LEC1 y LEAFY COTYLEDON 1-LIKE (L1L) codifican homólogos de la subunidad HemeActivated
Proteins 3 (HAP3) del factor CCAAT-box-binding. En consecuencia, se cree que LEC1 y L1L son
factores de transcripción clave en la regulación del desarrollo de embriones somáticos hasta que se
requiere la etapa de cotiledón en Arabidopsis y L1L para el desarrollo normal del embrión [12]. LEC1
también se ha conocido como un regulador de la expresión de ABI3 y FUS3 [37]. TcL1L, que se
encuentra en el genoma del cacao, se expresa en embriones somáticos jóvenes inmaduros, pero no en
embriones maduros [38].

3 factores de transcripción implicados en la transición de la embriogénesis somática a la maduración

La transición de la inducción de embriones al desarrollo y la maduración comparte algunos factores

de transcripción, pero funcionan de diferentes maneras. LEC es un miembro de la familia de factores
de transcripción del factor nuclear Y (NF-Y) y es parte de una gran familia de proteínas que contienen
el dominio B3 involucradas en una amplia variedad de funciones, que incluye LEC1, LEC2 y FUS3.
Durante el proceso de iniciación, LEC es importante para mantener la expresión SE y para producir
embriones globulares, pero también funciona en la formación del suspensor y para especificar la
identidad de los cotiledones. En la última etapa de la embriogénesis, LEC funciona en la maduración,
incluida la adquisición de la tolerancia a la desecación y la acumulación de reservas de
almacenamiento [39]. En Arabidopsis, así como en el cacao, LEC2 media la activación de la vía YUC
de la biosíntesis de auxinas, ya que se demostró un aumento significativo del contenido de ácido
indol-3-acético en el tejido explantado que estaba en transición embriogénica [40]. LEC2 se expresa
en el desarrollo de embriones zigóticos durante las etapas temprana y tardía en Arabidopsis. Al mismo
tiempo, juega un papel en el mantenimiento del suspensor y los cotiledones y en la tolerancia a la
desecación para inhibir una germinación prematura. Los embriones cigóticos lec2 mutados crecen
con una anatomía suspensora anormal y cotiledones anormales con tricomas. La activación del
meristemo apical del brote es precoz, y los embriones tienen cotiledones altamente pigmentados con
una acumulación prominente de antocianinas y muestran una acumulación reducida de compuestos
de almacenamiento de semillas [41]. LEC2 puede conducir un efecto de cascada sobre otros factores
de transcripción que pueden controlar diferentes etapas de desarrollo y / o diferentes vías metabólicas
en las células. LEC2 también puede encenderse o apagarse otros genes de forma directa o indirecta.
Por ejemplo, WRINKLED1 (AtWRI1) es otro factor clave de transcripción crucial para el desarrollo
de embriones. Es un objetivo directo de AtLEC2 que es necesario para regular la biosíntesis de ácidos
grasos normales. Por otro lado, TcLEC2 está dirigido por 2,4-D en SE. La aplicación exógena de
auxinas, tales como 2,4-D, y / y citoquininas son necesarias para inducir SE. En el cacao, TcLEC2 se
regula positivamente durante la etapa de inducción cuando el 2,4-D se aplica exógenamente [41, 42].
Además, la sobreexpresión de AtLEC2 en embriones zigóticos inmaduros transgénicos puede inducir
SE directo, con baja formación de callos y sin aplicaciones hormonales. En el genoma de Arabidopsis,
87 genes se anotaron previamente como dominio B3 y se clasificaron en cinco familias diferentes,
como el factor de respuesta de auxina (ARF), 3 insensibles al ácido abscísico (ABI3) y ABI3-VP1
(RAV) en meristemas reproductivos [ 42]. En el tabaco, LEC2 es responsable de algunos de los
mecanismos en SE. La expresión ectópica de LEC2 induce la acumulación de proteínas embrionarias
específicas como proteínas de almacenamiento de semillas, proteínas de embriogénesis tardía
abundante (LEA), enzimas biosintéticas de ácidos grasos, productos de genes relacionados con la
biosíntesis de esteroides y genes reguladores clave del desarrollo embrionario [43] . En T. cacao, se
han identificado tres familias en el dominio B3, como HIS, ABI3 y RAV [42]. Estos grupos de genes
de cacao tienen similitudes con la subfamilia ABI3 de Arabidopsis. Comparando las secuencias entre
A. thaliana y T. cacao (genotipo Criollo B97-61 / B2), tres genes de cacao que se identificaron como
Tc04g004970, Tc01g024700 y Tc06g015590 son ortólogos en Arabidopsis para AtFUS3, AtABI3 y
AtLEC2, respectivamente. En particular, TcLEC2 y AtLEC2 indican fuertemente
funciona similitudes. TcLEC2 actúa en la sobreexpresión de los genes AGL15 y WRI1 también en
el cacao [41]. En T. cacao se informaron varios factores de transcripción que juegan un papel
importante en la maduración que compara embriones somáticos con embriones zigóticos en un
análisis genómico completo. TcLEC1, TcLEC2, TcWRI1, TcAGL15 y TcFUS3 muestran un
aumento espectacular de los valores de expresión en embriones somáticos maduros en comparación
con los embriones zigóticos maduros. La expresión de esos genes es más alta en la etapa madura de
embriones zigóticos y somáticos cuando se comparan con la etapa de torpedo menos madura de
ambos tipos de embriones [40]. Además, la expresión constitutiva de TcAGL15 aumenta la
competencia de la formación de embriones somáticos a partir de los meristemos apicales del tallo, y
TcWRI1, además de participar en el desarrollo embrionario, también está implicada en la regulación
de la biosíntesis de ácidos grasos [40]. Otros genes que se expresan de forma diferente entre
embriones zigóticos y somáticos son TcBBM y TcABI5, que muestran una ligera disminución en la
expresión desde la etapa de torpedo hasta la etapa madura en embriones zigóticos, mientras que la
expresión de esos mismos genes es mayor en torpedos y en etapa madura de embriones somáticos
[40] El mismo análisis de todo el genoma muestra la importancia del etileno durante el proceso de
SE en el cacao [40]. Veintiséis factores de transcripción en el metabolismo del etileno y la respuesta
de etileno se informaron. Diecinueve de esos factores de transcripción exhiben niveles de expresión
más altos en embriones somáticos en comparación con embriones zigóticos. Esos genes pertenecen a
la familia ERF / AP2, que controlan la síntesis de proteínas implicadas en las respuestas fisiológicas
y de desarrollo [40, 41]. El etileno, como hormona de respuesta al estrés en las plantas, y su
acumulación en el sistema de cultivo, afecta el desarrollo embrionario. La proteína F-box 1 de unión
a TcEIN3, (TcEBF1, Tc09g011440), TETETILENO INSENSIBLE 3 (TcEIN3, Tc09g033150) y
TcIndole-3-acetato beta-glucosiltransferasa 2 (TcUGT1, Tc02g020270) se expresan en las vías de
señalización de etileno [40]. 41]. Probablemente, la vía de señalización de etileno está regulada
positivamente en embriones somáticos de cacao. Complementando la importancia del etileno en SE,
en el mismo trabajo, los autores explican cómo el etileno también está involucrado en la regulación
positiva de la biosíntesis de flavanol incrementando la expresión de genes implicados en la biosíntesis
de flavonoides en embriones somáticos de cacao en relación con embriones zigóticos. Estos
flavonoides están asociados con respuestas de estrés y controlan el crecimiento y desarrollo cuando
el tejido (para SE) está expuesto a hormonas auxinas, confirmando la existencia de modulación de la
respuesta de auxina con interacción por estrés entre auxinas y niveles de etileno en los cultivos [40].

4. Conclusión

En resumen, hay muchos factores de transcripción identificados en la planta modelo Arabidopsis

thaliana que pueden ayudarnos a comprender el paisaje de la regulación de la expresión génica en SE
en T. cacao. La identificación de los factores de transcripción en el cacao es poco conocida, y es
importante investigar más en profundidad cuáles son los mecanismos dentro de la célula somática del
cacao y cómo los factores de transcripción regulan el proceso de SE. El papel que desempeña el
etileno en la regulación de un gran número de genes implicados en la función celular es consistente
con la hipótesis de que la respuesta al estrés mediado por etileno en SE juega un papel significativo
en el desarrollo anormal de embriones somáticos de cacao.