Professional Documents
Culture Documents
NPM : 10060315008
Kelas : Farmasi A
Komposisi eluen konstan berarti kondisi keseimbangan dalam kolom dan kecepatan yang
sebenarnya dari senyawa bergerak melalui kolom yang konstan; analit-eluen dan analit-
stasioner-fase Interaksi juga konstan di seluruh run. Hal ini membuat pemisahan isokratik lebih
mudah diprediksi, meskipun kekuatan pemisahan (jumlah senyawa yang dapat diselesaikan)
tidak terlalu tinggi. Kapasitas puncak rendah dan komponen senyawa tertahan lama pada
kolom, puncak yang dihasilkan lebih luas.
Pemisahan gradien secara signifikan meningkatkan kekuatan pemisahan sistem terutama karena
peningkatan dramatis dari efisiensi jelas (penurunan puncak lebar). Kondisi di mana ekor zona
kromatografi selalu di bawah pengaruh komposisi eluen kuat mengarah pada penurunan lebar
puncak. Lebar puncak bervariasi tergantung pada tingkat variasi komposisi eluen (kemiringan
lereng). Ketika metode gradien digunakan, kolom harus diizinkan untuk menyeimbangkan pada
kondisi fase gerak-tahap awal sebelum injeksi sampel berikutnya dan awal gradien berikutnya
run. Ini akan dikaitkan dengan lereng yang berbeda dari retensi terhadap komposisi organik
untuk setiap analit dalam campuran. Ketika metode gradient digunakan, kolom harus diizinkan
untuk menyeimbangkan pada kondisi ponsel-tahap awal sebelum injeksi sampel berikutnya dan
awal gradien berikutnya run. Ini akan dikaitkan dengan lereng yang berbeda dari retensi
terhadap komposisi organik untuk setiap analit dalam campuran. Ketika metode gradien
digunakan, kolom harus diizinkan untuk menyeimbangkan pada kondisi fase gerak-tahap awal
sebelum injeksi sampel berikutnya dan awal gradien berikutnya run.
Pemilihan teknik isokratik atau gradien tergantung pada jumlah komponen aktif yang akan
dipisahkan. Dalam memutuskan apakah gradien atau isokratik akan cukup, gradient awal run
dilakukan, dan rasio antara total waktu gradien dan perbedaan waktu gradien antara komponen
pertama dan terakhir yang terhitung. Rasio dihitung adalah <0,25, isokratik memadai; ketika
rasio> 0,25, gradien akan bermanfaat
- Preparasi sampel
Selama pengembangan metode awal, persiapan dari larutan harus dilakukan sampai ditentukan
bahwa komponen aktif stabil pada suhu kamar dan tidak menurun dalam kondisi laboratorium
normal. Larutan sampel harus disaring; umumnya direkomendasikan penggunaan 0,22 atau
0,45 m pori-ukuran filter untuk menghilangkan partikulat. Filtrasi adalah pencegahan sekaligus
alat pemeliharaan untuk analisis HPLC. Persiapan sampel merupakan langkah penting dari
pengembangan metode . Efektivitas filter jarum suntik sangat ditentukan oleh kemampuan
mereka untuk menghilangkan kontaminan / tidak larut komponen tanpa pencucian artefak yang
tidak diinginkan (yaitu, diekstrak) ke filtrat. Jika ada puncak tambahan yang diamati pada
sampel disaring, maka pengencer harus disaring untuk menentukan apakah komponen yg dapat
meluluhkan datang dari jarum suntik filter
- Metode optimasi
Kondisi eksperimental harus dioptimalkan untuk mendapatkan pemisahan dan sensitivitas yang
diinginkan setelah mendapatkan pemisahan yang tepat. Stabilitas menunjukkan kondisi uji
eksperimental akan dicapai melalui direncanakan / pemeriksaan sistemik pada parameter
termasuk pH (jika ion), komponen fase gerak dan rasio, gradien, tingkat, suhu, jumlah sampel,
volume yang Injection dan jenis pelarut.
- metode validasi
Validasi prosedur analitis adalah proses yang didirikan, oleh penelitian laboratorium, yang
menunjukan bahwa karakteristik kinerja prosedur memenuhi persyaratan untuk digunakan.
Proses metode validasi untuk prosedur analitis dimulai dengan pengumpulan terencana dan
sistematis oleh pemohon dari data validasi untuk mendukung prosedur analitis. Semua metode
analisis yang dimaksudkan untuk digunakan untuk menganalisa sampel klinis apapun akan
perlu divalidasi. Validasi metode analisis dilakukan sesuai pedoman ICH
Parameter validasi
berikut ini adalah khas analitis prestasi karakteristik yang dapat diuji selama metode validasi:
· Ketepatan
Kedekatan nilai diukur dengan nilai benar atau diterima. Akurasi menunjukkan deviasi antara
nilai rata-rata ditemukan dan nilai sebenarnya. Ini harus dianalisis terhadap larutan standar dan
kosong untuk memastikan bahwa tidak ada gangguan. presisi Menengah adalah variasi dalam
laboratorium seperti hari yang berbeda, dengan instrumen yang berbeda, dan oleh analis yang
berbeda. presisi ini kemudian dinyatakan sebagai r elative standar deviasi.
· Ketelitian
tingkat kesepakatan antara hasil tes individu diperoleh ketika metode ini diterapkan ke beberapa
sampel dari sampel homogen. Presisi adalah ukuran reproduksibilitas metode analisis secara
keseluruhan
· Pengulangan
Variasi yang dialami oleh seorang analis tunggal pada satu instrumen. Selama validasi,
pengulangan dilakukan dengan menganalisis beberapa ulangan dari sampel komposit uji
dengan menggunakan metode analisis
· Presisi menengah
Variasi dalam laboratorium seperti hari yang berbeda, dengan instrumen yang berbeda, dan
oleh analis yang berbeda. presisi ini kemudian dinyatakan sebagai r elative standar deviasi.
· Linearitas
kemampuan prosedur analitis untuk mendapatkan respon yang berbanding lurus dengan
konsentrasi (jumlah) dari analit dalam sampel. Jika metode ini linear, hasil tes secara langsung
atau dengan transformasi matematis didefinisikan dengan baik sebanding dengan konsentrasi
analit dalam sampel dalam kisaran tertentu. Linearitas biasanya dinyatakan sebagai batas
kepercayaan sekitar kemiringan garis regresi
· Batas deteksi
jumlah terendah analit dalam sampel yang dapat dideteksi tetapi tidak harus kuantitatif menilai
sebagai nilai yang pasti
· Batas kuantisasi
jumlah terendah analit dalam sampel yang dapat secara kuantitatif ditentukan dengan presisi
dan akurasi yang cocok. Untuk prosedur al analitik seperti HPLC yang menunjukkan suara
awal, LOQ
umumnya diperkirakan dari penentuan S / N rasio (10: 1) dan biasanya dikonfirmasi dengan
menyuntikkan standar yang memberikan ini S / N ratio dan memiliki persen relatif dapat
diterima standar deviasi juga.
· Spesifisitas
kemampuan untuk menilai tegas analit di hadapan komponen yang dapat diharapkan untuk
hadir seperti kotoran, produk degradasi, dan eksipien. langkah-langkah kekhususan hanya
komponen yang diinginkan tanpa gangguan dari spesies lain yang mungkin hadir; pemisahan
tidak selalu diperlukan.
Efisiensi kolom
Ukuran band penyebaran puncaknya. Lebih kecil band menyebar, lebih tinggi adalah jumlah
pelat teoritis, menunjukkan baik kolom dan kinerja sistem. Kolom dengan N mulai dari 5.000
hingga 100.000 Pelat / meter yang ideal untuk sistem yang baik. Efisiensi dihitung dengan
menggunakan rumus
Puncak faktor asimetri (As) dapat digunakan sebagai kriteria kinerja kolom. Puncak asimetri
diukur pada 10% dari tinggi puncak penuh, dibagi dengan sesuai setengah lebar depan.
(Gambar-3) Faktor asimetri dihitung oleh. Faktor asimetri = B / A . dimana B = setengah lebar
Puncak, A = depan setengah lebar kolom Baik menghasilkan puncak dengan Sebagai nilai 0,95
1%
· Kekokohan
ukuran kemampuan suatu metode analisis untuk tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil tapi
disengaja dalam parameter metode (misalnya pH, komposisi fase gerak, suhu dan pengaturan
instrumental) dan memberikan indikasi kehandalan selama penggunaan
· Kesesuaian sistem penentuan
evaluasi komponen system analisis menunjukkan bahwa kinerja sistem memenuhi standar yang
dibutuhkan oleh metode. Parameter ini dapat dihitung secara eksperimen untuk memberikan
laporan pengujian kesesuaian sistem kuantitatif: jumlah pelat teoritis (efisiensi), faktor
kapasitas, pemisahan (retensi relatif), resolusi, tailing faktor, relatif standar deviasi (presisi). Ini
diukur pada puncak atau puncak waktu retensi dikenal dan lebar puncak
· Studi degradasi paksa
digunakan untuk mengevaluasi kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur bahan aktif
dan produk degradasi, tanpa gangguan, dengan menghasilkan potensi produk degradasi. Selama
validasi metode, zat obat yang terkena asam, basa, panas, cahaya dan agen oksidasi untuk
menghasilkan sekitar 10% sampai 30% degradasi zat aktif Studi ini juga dapat membantu dalam
pengembangan formulasi, manufaktur, dan kemasan untuk meningkatkan produk obat
Kesimpulan
Ulasan ini menjelaskan teknik umum HPLC pengembangan metode dan validasi metode
dioptimalkan. Pendekatan umum untuk pengembangan metode untuk pemisahan senyawa
farmasi dibahas. Pengetahuan tentang pKa, pH dan kelarutan senyawa utama adalah sangat
penting sebelum pengembangan metode HPLC. Pengetahuan tentang pH dapat membantu
untuk membedakan sifat terionisasi dari kotoran lainnya (yaitu, produk sampingan sintetis,
metabolit, produk degradasi, dll) dalam campuran. Pemilihan penyangga dan komposisi fase
gerak (organik dan pH) memainkan peran dramatis pada selektivitas pemisahan. Optimasi akhir
dapat dilakukan dengan mengubah suhu, kemiringan lereng, dan laju aliran serta jenis dan
konsentrasi pengubah ponsel-fase. Metode dioptimalkan divalidasi dengan berbagai parameter