Impacto Biorre

UNIVERDIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y

AGROPECUARIAS
ZONA: Poza Rica - Tuxpan
CARRERA DE BIOLOGÍA
“Biorremediación en microcosmos de sedimentos

contaminados por hidrocarburos mediante la técnica de
bioaumentación”
TESIS
Que para obtener el titulo de:
LICENCIADO EN BIOLOGÍA
PRESENTA:
ITZA SUGEY GARCÍA BAUTISTA
DIRECTOR:
DR. PABLO SAN MARTÍN DEL ÁNGEL
ASESOR:
DR. ROSA IDALIA HERNÁNDEZ HERRERA
Tuxpan, Ver. Diciembre de 2013
i
ii
AGRADECIMIENTOS
Rosa idalia Hernández herrera Antes que nada quiero agradecer a Dios por la
culminación de este trabajo, por darme fuerza y voluntad para concluir una etapa
más en mi vida y por haber puesto en mi camino personas ejemplares que me
ayudaron en todo momento.
Sin duda este trabajo no se hubiera podido realizar sin la ayuda, del Doctor Pablo
San Martin del Ángel y de la Doctora Rosa Idalia Hernández Herrera, por lo que
agradezco su ayuda y dedicación en todo momento, también les agradezco que
hayan compartido conmigo conocimientos, consejos y anécdotas.
También le agradezco a la M.V.Z. Diana Laura Díaz Inocencio quien me permitió y
ayudo a realizar los análisis de HTP, así como también le agradezco a la Ing.
Roció Rodríguez Cabrera y al Biol. José Maruri García por apoyarme en los
análisis fisicoquímicos del sedimento.
A la beca de servicio social otorgada por el Desarrollo Académico e Innovación
educativa de la Universidad Veracruzana.
iii
DEDICATORIA
La conclusión de este trabajo ha requerido de apoyo, confianza, motivos, aliento y
de un amor incondicional que solo encuentro en casa, por eso este trabajo se lo
dedico infinitamente a mis padres y a mis hermanos, quienes están conmigo en
todo momento, y que una vez más me ayudado a lograr otra meta en mi vida.
Este trabajo también es dedicado a mis abuelitos que me acompañaron en
momentos difíciles, y a mis tíos Caín y Norma, que han cuidado de mí siempre
que lo he necesitado.
Sin duda también se lo dedico a mis amigos Eder, Marta y Josué, por estar
conmigo en esta etapa y por no abandonarme nunca a pesar de todo, logrando
con sus aventuras que estos años fueran fabulosos.
Y como especial dedicatoria a Ernesto quien con sus consejos y regaños me ha
inspirado a ser mejor cada día y a enfrentar los problemas de la mejor manera.
iv
ÍNDICE
CONTENIDO pág.
RESUMEN IX
I.- INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….. 1-2
II.- ANTECEDENTES…………………………………………………………… 3
2.1. Industria petrolera en México y generación de residuos peligrosos…. 3-4
2.2. Hidrocarburos derivados del petróleo …………………………………… 4-6

2.3. El impacto de los hidrocarburos en el ambiente………………………... 7
2.4. Impacto de los hidrocarburos en sedimentos costeros………………… 8-9
2.5. Tecnologías de remediación de sedimentos contaminados………….. 9-10
2.6. Tecnologías de biorremediación…………………………………………. 11-13
2.7. Bioaumentación……………………………………………………………. 13-15
2.8. Importancia de la biorremediación en microcosmos…………………… 16
2.9. Bacterias utilizadas en procesos de biorremediación…………………. 17
2.10. Antecedentes de biorremediación por bioaumentación en 18-20
microcosmos………………………………………………………………………
III.- OBJETIVOS…………………………………………………………………. 21
IV.- AREA DE ESTUDIO……………………………………………………….. 22-23
V.- MATERIALES Y METODOS………………………………………………. 24
5.1. Elección y prospección del área de estudio……………………………... 24

5.2. Toma de muestras………………………………………………………….. 24
5.3. Análisis físicos y químicos del sedimento……………………………….. 25
5.4. Determinación de Hidrocarburos Totales del Petróleo…………………. 25
5.5. Preparación del sedimento para la extracción de hidrocarburos……… 26
5.6. Extracción de hidrocarburos………………………………………………. 27-28
v
5.7. Aislamiento de bacterias………………………………………………….. 29
5.8. Cultivo bacteriano………………………………………………………….. 30
5.9. Purificación de las cepas bacterianas…………………………………… 30
5.10. Prueba de degradación y selección de cepas bacterianas…………... 31
5.11.- Incremento de la biomasa bacteriana…………………………………. 32
5.12.- Implementación del sistema de biorremediación por 33
bioaumentación…………………………………………………………………..
5.13.- Monitoreo de parámetros fisicoquímicos en el proceso de 34
biorremediación…………………………………………………………………
VI.- RESULTADOS……………………………………………………………… 35
6.1.- Análisis fisicoquímico del sedimento contaminado……………………. 35-38

6.2.- Aislamiento de bacterias………………………………………………….. 39
6.3.- Cultivo de Bacterias……………………………………………………….. 40
6.4.- Purificación de bacterias………………………………………………….. 41-42
6.5.- Prueba de degradación…………………………………………………… 43
6.6.- Aumentación de masa bacteriana………………………………………. 43
6.7.- Monitoreo de factores químicos y físicos durante la prueba de 44-46
biorremediación…………………………………………………………………...
6.8.- Concentración inicial de HTPs en sedimento…………………………... 47
6.9.- Hidrocarburos totales del petróleo a los 30,60 y 90 48-50
días……………………………………………………………………………….
VII.- DISCUCION……………………………………………………………....... 51-56
VIII.- CONCLUSIONES………………………………………........................... 57
IX.- BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………... 58-71
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
CONTENIDO Pág.
Figura 1. Localización geográfica del ejido Emiliano Zapata 23
Figura 2. Composición textural del sedimento contaminado 36
Figura 3. Aislamiento bacteriano que demuestra el crecimiento de cepas 39
Figura 4. Bacterias Gram negativas, observadas a 100x 40
Figura 5. Confirmación de un solo morfotipo bacteriano 42
Figura 6. Frascos con mayor degradación de hidrocarburos 46
Figura 7. Promedio de pH en ambos tratamientos 47
Figura 8. Temperatura promedio del tratamiento de biorremediación y el 48
tratamiento testigo
Figura 9. Promedio del porcentaje de humedad en ambos tratamientos 49
Figura 10. Porcentajes de degradación de HTPs a los 30, 60 y 90 días 52
Figura 11. Diferencia estadística de los valores finales en ambas pruebas 53
vii
ÍNDICE DE CUADROS
CONTENIDO Pág.
Cuadro 1. Composición química del medio B-H 29
Cuadro 2. Resultados del análisis físico del sedimento 35
Cuadro 3. Resultado del análisis químico del sedimento 38
Cuadro 4. Avance de las resiembras en el aislamiento de las 41
colonias bacterianas
Cuadro 5. Cuantificación de hidrocarburos a los 30 días 51
viii
RESUMEN
En este trabajo se aplicó un sistema de biorremediación por bioaumentación en
microcosmos, con la finalidad de evaluar la remoción de hidrocarburos totales del
petróleo (HTP) presentes en sedimentos obtenidos de un estero de la localidad de
Emiliano Zapata, Tuxpan, Ver. Para la realización de este trabajo se aislaron en
medio Bushnell-Hass, bacterias hidrocarburoliticas exógenas, las cuales se
cultivaron y purificaron en agar soya tripticaseína (AST). La capacidad de las
bacterias para remover HTP, se confirmó mediante una prueba de degradación. Al
obtener las cepas con mayor capacidad para degradar HTP, se aumentó la
biomasa bacteriana en caldo de soya tripticaseína (CST). La biomasa obtenida se
aplicó a 6 microcosmos los cuales estaban compuestos por 300 g de sedimento,
100 ml de CST y una concentración de bacterias al 4.5 x 1014 células por libra. Los
microcosmos se incubaron en un Shaking Water Bath, durante 90 días a una
temperatura de 30°C y a 100 rpm. La constante agitación permitió mayor contacto
entre las bacterias y el contaminante. Al concluir el experimento se logró una
remoción de HTP de 80.54%. La mayor remoción de HTP se logró en los primeros
30 días al obtener un valor de 57.52%. Mientras que la menor remoción fue
durante el periodo de 31 a 60 días con un porcentaje de 9.2% en comparación a la
remoción total.
Palabras clave: Biorremediación, Bioaumentación, Microcosmos y Determinación
de HTP
ix
I.- INTRODUCCIÓN
El Golfo de México se caracteriza por sus grandes riquezas naturales, como son
las zonas costeras que cuentan con una gran diversidad de hábitats como bahías,
deltas, lagunas, estuarios, humedales, suelos y sedimentos (Caso et al., 2004),
otras de sus riquezas son los depósitos de hidrocarburo y gas natural, lo cual le da
un gran valor industrial basado en actividades como la explotación, refinación y
transporte (Arparrilla, 2007).
Sin embargo, estas actividades de desempeñan un papel fundamental en la
estructuración y organización de algunos espacios costeros (Sánchez, 1999),
originando modificaciones que repercuten al medio ambiente, un ejemplo es la
contaminación y modificación de suelos y sedimentos (Vela, 2007), a causa de los
derrames de hidrocarburos los cuales van de 1.7 a 8.8 millones de toneladas
métricas al año y generalmente son ocasionados por la explotación, el transporte y
el almacenamiento de combustibles(Santizo-Sáenz, 2009), aunque en ocasiones
también se debe a las acciones delictivas contra oleoductos y gasoductos
(Benavides- López de Mesa et al., 2006).
En la actualidad estos derrames se han convertido en un problema ambiental
importante que acarrea consecuencias como: la reducción o inhibición del
desarrollo de la cobertura vegetal en el lugar, cambios en la dinámica poblacional
de la fauna, de la biota microbiana y contaminación por infiltración a cuerpos de
agua subterráneos (Ñustez-Cuartas, 2012). Ante este suceso surge la necesidad
de recuperar los ecosistemas contaminados y la biorremediación se convierte en
1
una alternativa, que consiste en el uso de microorganismos como plantas, hongos,
bacterias naturales o modificadas genéticamente para neutralizar sustancias
tóxicas, transformándolas en sustancias menos tóxicas o inocuas para el ambiente
y la salud humana (Benavides - López de Mesa et al., Op cit. 2006).
Las bacterias son los organismos más empleados en este proceso ya que
permiten tratar grandes volúmenes de contaminantes con un impacto ambiental
mínimo y costos muy bajos, a diferencia de otros procedimientos de
descontaminación y las técnicas más usadas para la biorremediación de
sedimentos son la bioestimulación y la bioaumentación, esta última consiste en
usar cultivos de microorganismos con alta capacidad de oxidación con el propósito
de eliminar sustancias indeseables, donde se asegura que estén presentes los
microorganismos específicos capaces de degradar al compuesto contaminante no
deseado hasta sus moléculas básicas (Núñez et al., 2002).
Teniendo en consideración la gran contaminación de sedimentos por
hidrocarburos que existe en el estado, la importancia ecológica de estos
ambientes y la necesidad de solucionar este problema, el presente trabajo
propone evaluar la biorremediación a nivel microcosmos, empleando la técnica de
bioaumentación, en sedimentos contaminados por hidrocarburos, colectados de
un estero con cercanía a instalaciones petroleras ubicado en el Ejido Emiliano
Zapata, Tuxpan, Veracruz.
2
II. ANTECEDENTES
2.1.- Industria petrolera en México y generación de residuos peligrosos
En el último siglo, el petróleo se ha convertido en la fuente de energía más
importante, y en México, la industria refinadora de crudo ha crecido
aceleradamente para satisfacer un mercado en constante evolución (Barrera-
Roldan et al., 2004). El consumo energético de México está constituido por los
combustibles fósiles, principalmente, tan solo en el 2008 el uso de estas fuentes
de energía fue de un 87%, la estructura de consumo de los combustibles fósiles se
determinó por cuatro de ellos, principalmente de esta manera: el 30.2% provino de
gas natural, el 27.3% de la gasolina, el 14% de diesel y el 10% de otros
combustibles (Sheimbaum- Pardo et al., 2012).
Todo este desarrollo petrolero y el crecimiento de una sociedad consumista ha
provocado una fuerte degradación del ambiente costero por emisiones de humos,
polvos, gases y aguas residuales, originadas durante la operaciones de
extracción, refinación, transporte y almacenamiento, sin tomar en cuenta otras
fuentes como son el transporte atmosférico, la quema de hulla y la combustión de
automotores (Botello, 2005).
El 50% de los residuos peligrosos que se generan en la república mexicana son
producidos por la industria petrolera, de acuerdo a petróleos mexicanos (PEMEX)
durante los procesos de explotación y producción de crudo y gas natural, los
derrames de hidrocarburos ocupan un volumen de 82%, en el cual se encuentran
3
tomas clandestinas y derrames ocasionados por actos de vandalismo. Sin
embargo las tendencias de fugas y derrames en ductos de PEMEX se han
incrementado, en el 2003 este incremento fue de un 2% en comparación al 2012,
y las principales causas de este evento se debe a corrosiones, falla de material y
nuevamente a derrames ocasionados por actos de vandalismo (PEMEX, 2001;
PEMEX, 2013).
2.2.- Hidrocarburos derivados del petróleo
Los hidrocarburos son compuestos formados por átomos de carbono e hidrogeno,
de gran abundancia en la naturaleza principalmente en el petróleo. El petróleo
tiene una proporción de 76 a 86% de carbono y de 10 a 14% de hidrogeno, es una
mezcla compleja de componentes no acuosos e hidrofóbicos como n- alcanos,
aromáticos, resinas y asfáltenos (Rahman et al., 2007).
Los hidrocarburos son clasificados de la siguiente manera: hidrocarburos
biogenicos e hidrocarburos antropogenicos, los primeros son sintetizados por casi
todas las plantas, animales y microbiota (Al- Saad, 1992) y los antropogenicos que
son introducidos al ambiente como resultado de la actividad humana, esta
introducción puede ser de dos tipos, como resultado de derrames accidentales y
como descargas intencionales (Bidleman et al., 1990).
Los hidrocarburos que componen al petróleo pueden agruparse en cuatro
categorías: alifáticos, aromáticos, polares o resinas y asfáltenos, la proporción de
estos dependerá de factores como la zona geográfica, historia geológica, edad,
4
migración y la alteración del petróleo crudo. Aunque entre los compuestos más
abundantes en la mezcla de hidrocarburos totales del petróleo (HTPs), se
encuentran los hidrocarburos alifáticos (HA) y los aromáticos policiclicos (HAP)
(Chow, 1987).
Cuando estos productos se liberan al ambiente, participan en una amplia variedad
de descomposición y degradación, los cuales alteran las propiedades físicas y
químicas del petróleo un ejemplo son los compuestos alifáticos lineales los cuales
sufren una degradación más rápida que los compuestos ramificados (Méndez et
al., 2011).
Otro estudio de degradación de hidrocarburos aromáticos policiclicos, demuestra
que de una mezcla de hidrocarburos, los compuestos que se biodegradan primero
son los alcanos lineales y los hidrocarburos más solubles en agua como el
naftaleno, los compuestos ciclo alifáticos son los más persistentes, seguidos de
los compuestos alifáticos ramificados y después los aromáticos, los aromáticos
son considerados de baja biodegradación debido a su alto peso molecular
(Oberbremer y Mueller, 1989; Atlas, 1995).
Los hidrocarburos aromáticos policiclicos (HAP) consisten de una clase de
producto químico con dos o más anillos de benceno fusionados en forma lineal,
angular o arreglos de racimos. Entre los contaminantes ambientales más
abundantes, los compuestos aromáticos son motivos de gran preocupación debido
a su persistencia y toxicidad. Los HAP son ubicados en la naturaleza y distribuidos
en todo el entorno, en el aire, suelo y agua, se producen durante la combustión de
5
combustibles fósiles, incineración de residuos o como subproductos de procesos
industriales como la gasificación del carbón y la refinación de petróleo y con
frecuencia se liberan en grandes cantidades al medio ambiente (Labana et al.,
2007).
Hay más de 100 HAP diferentes, que se producen como mezclas complejas y no
como un solo compuesto. No obstante, 16 de ellos son considerados como
contaminantes prioritarios por la Agencia de Protección Ambiental de Estados
Unidos (EPA, por sus siglas en ingles), la Organización Mundial de la Salud (OMS)
y la Comunidad Económica Europea (CEE), debido a sus efectos tóxicos,
mutagénicos o cancerígenos. Se sabe que estos efectos se deben a su alto peso
molecular, ya que están constituidos por cuatro o más anillos condensados
(Menzie et al., 1992 y Goldman et al., 2001).
A la cuantificación de hidrocarburos provenientes del petróleo y que están
presentes en el ambiente se les conoce como hidrocarburos totales del petróleo
(HTP), su medición es una indicación bastante aceptable del grado de
contaminación en suelos que han sido afectados de alguna manera por fugas o
derrames, el análisis de HTP incluye: 1) compuestos de hidrocarburos parafinicos,
naftenicos y aromáticos; 2) la mayoría de productos líquidos de petróleo y 3)
compuestos oxigenados (Méndez et al., 2011).
6
2.3.- El impacto de los hidrocarburos en el ambiente
El uso de petróleo y sus derivados como fuente de energía ha generado
numerosos problemas ambientales (INE, 2007). Desde hace varios años el
hombre ha causado un desequilibrio en los ciclos naturales de regulación, la
combustión de combustibles fósiles es un ejemplo de actividad humana en
detrimento de dicho equilibrio natural. En México las emisiones nocivas generadas
por los hidrocarburos emiten a la atmosfera niveles de 0.24 ppm, causando daños
a la vegetación y contribuyendo con el efecto invernadero. Los mantos
subterráneos, los ríos y los cuerpos de agua también se han visto afectados por
productos derivados del petróleo, esta contaminación genera la muerte de
numerosos organismos, además de generar serios problemas de salud y defectos
genéticos en los seres humanos (Zarur, 1999).
Los derrames de hidrocarburos afectan a tres elementos del ambiente que son
abióticos, bióticos y socioeconómicos. Los abióticos son cuando se afecta el suelo,
se forman relieves y existe geomorfología. Los bióticos se ven afectados cuando
se daña la flora y fauna y los socioeconómicos se ven afectados al dañar zonas
donde el ser humano desarrolla sus actividades diarias (Loya, 2013).
7
2.4.- Impacto de los hidrocarburos en sedimentos costeros
Los sedimentos generalmente están compuestos por partículas de grava, arena,
limo y arcilla en proporciones variables, juegan un papel preponderante en los
procesos de erosión y/o deposición, estos procesos van a depender de su
composición, si el sedimento está conformado principalmente por arenas y gravas,
se vuelve más susceptible a ser arrastrado por la corriente, en cambio si el
sedimento está compuesto por partículas de limo-arcilla más sedimento se
integrará a la masa sedimentada (Bolívar, 2006).
Por eso la mayoría de los contaminantes de interés tienden a adsorberse a las
partículas suspendidas y eventualmente depositarse en los sedimentos. El rol de
los sedimentos en la retención de los componentes del petróleo, es muy
importante, ya que al sedimentarse estos son almacenados por periodos de
tiempos largos, convirtiéndose en fuentes de contaminación para los ecosistemas
(Díaz et al., 1994; FAO, 1997; Ponce - Vélez y Botello, 2005).
Cuando el petróleo se acumula en los sedimentos se genera un deterioro
biológico, que causa la reducción o inhibición del desarrollo de la cobertura vegetal
en el lugar, cambia la dinámica poblacional de la fauna y la biota microbiana. Otra
consecuencia de la contaminación de sedimentos por derivados del petróleo es la
contaminación del agua y del suelo que están en contacto con ellos (Gallegos-
Martínez et al., 2000; Alemán, 2009; Ñustez-Cuartas, 2012; Riesco, 2012).
Por tal motivo la contaminación de los sedimentos costeros por hidrocarburos se
ha convertido en uno de los principales problemas ambientales que representa
8
una preocupación mundial debido a las consecuencias potenciales sobre los
ecosistemas y la salud humana (Onwura et al., 2007; Palermo et al., 2011).
2.5.- Tecnologías de remediación de sedimentos contaminados
Las tecnologías de remediación de sitios contaminados implican cualquier
operación que alteren la composición de una sustancia peligrosa o contaminante,
a través de acciones químicas, físicas y biológicas; estas tecnologías se pueden
clasificar de diferentes maneras, con base en los siguientes principios: a)
Estrategia de remediación, b) Lugar del proceso de remediación (in situ, ex situ) y
c) Tipo de tratamiento (fisicoquímicos, biológicos y térmicos) (Espinoza y
Dendooven, 2007).
a) Estrategia de remediación: son tres estrategias básicas que pueden usarse
separadas o en conjunto.
1.- Destrucción o modificación: altera la estructura química del
contaminante.
2.- Extracción o separación: se extraen los contaminantes y/o se separan
del medio contaminado, aprovechando sus propiedades físicas o químicas.
3.- Aislamiento o inmovilización del contaminante: los contaminantes son
estabilizados, solidificados.
b) Lugar del proceso de remediación: se distinguen dos tipos de tecnologías in
situ y ex situ.
9
1.- In situ: Son las aplicaciones en las que el suelo contaminado es tratado,
o bien, los contaminantes son removidos del suelo contaminado, sin
necesidad de excavar el sitio.
2.- Ex situ: La realización de este tipo de tecnologías, requiere de
excavación, dragado o cualquier otro proceso para remover el suelo
contaminado antes de su tratamiento, el tratamiento puede ser:
On site: el tratamiento se lleva a cabo en el mismo sitio.
Off site: el tratamiento se lleva a cabo fuera del área afectada.
c) Tipo de tratamiento: esta clasificación se divide en tres tipos fisicoquímicos,
térmicos y biológicos.
1.- Tratamiento fisicoquímico: utiliza las propiedades físicas y/o químicas
de los contaminantes o del medio contaminado para destruir, separar o
contener la contaminación.
2.- Tratamiento térmico: utiliza la temperatura para incrementar la
volatilidad (separación), quemado, descomposición (destrucción) o
fundición de los contaminantes (inmovilización).
3.- Tratamiento biológico “biorremediación”: Utilizan las actividades
metabólicas de ciertos organismos (plantas, hongos, bacterias) para
degradar (destrucción), transformar o remover los contaminantes a
productos metabólicos inocuos (Volke y Velasco, 2002).
10
2.6.- Tecnologías de biorremediación
El término biorremediación se utiliza para describir una variedad de sistemas que
utilizan organismos vivos (plantas, hongos, bacterias, etc.) para degradar,
transformar o remover compuestos orgánicos tóxicos a productos metabólicos
inocuos o menos tóxicos. Esta estrategia biológica depende de las actividades
catabólicas de los organismos, y por consiguiente de su capacidad para utilizar los
contaminantes como fuente de alimento y energía (Van Deuren et al., 1997).
La biorremediación es utilizada como una intervención biotecnológica para limpiar
los efectos residuales de las actividades humanas previas en un sitio, se considera
un método factible para el tratamiento de suelos contaminados con hidrocarburos
del petróleo ya que es una tecnología eficaz, económica y respetuosa con el
ambiente, sin embargo está limitada al nivel de concentración y tipo de estructura
química del contaminante (Evans y Furlong, 2011; Patiño, 2013).
La biorremediación puede emplear organismos propios del sitio contaminado
(autóctonos) o de otros sitios (exógenos), puede realizarse in situ o ex situ, en
condiciones aerobias o anaerobias.
Tecnologías in situ
Las técnicas in situ buscan estimular y crear un ambiente favorable para el
crecimiento microbiano a partir de los contaminantes.
1.- Bioventeo: es una tecnología relativamente nueva, cuyo objetivo es estimular la
biodegradación natural de cualquier compuesto biodegradable en condiciones
11
aerobias, suministrando aire en el sitio contaminado a través de pozos de
extracción (Volke y Velasco, 2002).
2.- Bioestimulación: se refiere a la adición de nutrientes para estimular el
crecimiento de microorganismos indígenas situados dentro de un entorno y
mejorar así la biodegradación de contaminantes orgánicos o bien, la inmovilización
de contaminantes inorgánicos (James et al., 2000).
3.- Bioaumentación: es utilizada cuando se requiere un tratamiento inmediato de
un sitio contaminado o cuando los organismos indígenas son insuficientes en
número y capacidad para degradar el compuesto existente, consiste en la adición
de microorganismos vivos (Baud- Grasset y Vogel. 1995).
4.- Biolabranza: esta técnica consiste en airear el suelo almacenado en montones
y ahí mismo agregar agua y fertilizantes, la aireación se realiza con equipos
mecánicos (Iturbide-Argüelles, 2010).
5.- Fitorremediación: aprovecha la capacidad de ciertas plantas para absorber,
acumular, metabolizar, volatilizar o estabilizar contaminantes presentes en el
suelo, aire, agua o sedimentos (Delgadillo-López et al., 2011).
Tecnologías ex situ
Los procesos de biorremediación ex situ, incluyen dos tipos de técnicas: el
composteo y los biorreactores.
1.- Composteo: es un proceso en el cual el material contaminado se mezcla con
sustancias orgánicas sólidas biodegradables.
12
2.- Biorreactores: en esta técnica es posible combinar controlada y eficientemente,
procesos químicos, físicos y biológicos, que mejoren y aceleren la biorremediación
(Reiser-Roberts, 1998).
2.7.- Bioaumentación
Tras muchos años de investigación en el desarrollo de tecnologías para tratar
sustratos contaminados con hidrocarburos, la biorremediación, que aprovecha la
actividad metabólica de bacterias para eliminar y/o modificar contaminantes, es la
más aceptada, por los bajos costos relativos asociados y por su sustentabilidad
ambiental. Aun cuando la biorremediación se da de forma natural, en ocasiones es
necesario acelerar el proceso, para lo cual desde 1968 se ha aplicado la técnica
de bioaumentación, en la que se inoculan cultivos de microorganismos autóctonos
o exógenos con alta capacidad de oxidación y degradación de contaminantes,
esta técnica ha demostrado en muchos casos tener un efecto muy positivo
(Shmaefsky, 1999; Fantroussi y Agathos, 2005; Olguín, 2007 y Windevoxhel et al.,
2011).
Para que la técnica de bioaumentación se utilice deben existir cuatro condiciones
principales:
1.- Baja cantidad de microorganismos: cuando el número de microorganismos
capaces de degradar el contaminante problema es menor a 1x105 UFC/por gramo
de suelo o por mililitro de agua subterránea.
2.- Residuos complejos: cuando el sitio contiene altos niveles de residuos no
biodegradables o compuestos inhibidores. En este caso se requiere un control
13
muy sofisticado de los microorganismos y las condiciones ambientales y el
aumento de bacterias se vuelve necesario para evitar más acumulación de
intermedios toxico o nocivos.
3.- Cuando el tiempo es dinero: cuando la velocidad de descontaminación es un
factor primordial, la bioaumentación puede acelerar el proceso de biorremediación
a mitad de tiempo o más, reduciendo los costos del proceso.
4.- Garantías: cuando se requiere seguridad de que los microorganismos
adecuados en número suficiente harán el trabajo (Forsyth et al., 1995).
Aun cuando la biorremediación es una técnica eficiente, existen factores que la
limitan, tal es el caso de:
- La baja concentración de compuestos en el suelo, por lo que no se genera
la producción de biomasa de las bacterias inoculadas.
- La presencia de sustancias que inhiben el crecimiento de los organismos
adicionados.
- La competencia y depredación por parte de otros protozoos (Vidali, 2001).
En cuanto a las condiciones químicas y físicas existen varios factores que limitan
esta técnica de biorremediación. Entre las químicas se encuentran, la estructura
molecular del contaminante, su concentración y la presencia de una población
microbiana potencialmente activa. Entre las físicas se encuentran los factores
ambientales como el pH, temperatura, concentración de minerales, humedad,
respiración y nutrientes disponibles (Gómez-Romero et al., 2008).
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La temperatura es un factor crítico, debido a la gran cantidad de calor metabólico
producido por los microorganismos, la óptima en este proceso de biorremediación
ocurre entre los 18 y 30 °C (Frankenberger, 1992; San Martín et al., 2011 y 2012).
El pH afecta significativamente la actividad microbiana, se considera que un
intervalo entre 6 y 8 favorece el crecimiento de la mayoría de los microorganismos
(Maroto y Rogel, 2001). El contenido de humedad afecta la biodegradación,
debido a que influye en la movilidad de los microorganismos, aun cuando se ha
reportado que los microorganismos requieren unas condiciones mínimas de
humedad para su crecimiento, algunos autores demuestran que la actividad
bacteriana es inhibida cuando el contenido de humedad cae por debajo del 40%.
(Maroto y Rogel, 2001; Dueñas y Santos, 2006; Máncer, 2007).
15
2.8.- Importancia de la biorremediación en microcosmos
Todas las actividades de remediación requieren pruebas de laboratorio como un
enfoque hacia el éxito, estas pruebas se conocen como microcosmos y son
necesarias ya que cumplen una serie de funciones como la evaluación de
organismos o tecnologías de biorremediación, así como también proporcionan
información valiosa de las condiciones del sitio y determinan los factores que
pueden impedir el proceso de Biorremediación. Además sirven como base para
estimar los costos y garantías de un proyecto.
Lamentablemente las pruebas en microcosmos son erróneamente consideradas
innecesarias en un proyecto, estas ideas basadas en la ignorancia y la indiferencia
hacia la práctica de remediación aceptable son falsas, ya que el diseño y la
realización de un estudio de calidad en laboratorio, puede ahorrar tiempo valioso
en un proyecto y reducir significativamente el costo final.
Aunque en ocasiones los microcosmos no siempre predicen la biodegradación de
petróleo crudo en un entorno natural, se sabe que con el tamaño de simulación de
un tratamiento, se pueden predecir de una mejor manera los resultados de
biotratamientos en un entorno natural (Eve–Riser, 1992; Ishihora et al., 1995;
Barry –King et al., 1997).
16
2.9.- Bacterias utilizadas en procesos de biorremediación
Los microorganismos son los principales responsables del reciclaje de carbono en
la naturaleza, más de 200 especies de microbios presentes en el suelo, han sido
identificados, por su capacidad para degradar compuestos derivados del petróleo,
a estos microorganismos que utilizan los hidrocarburos como fuente de carbono y
energía, se les conoce como degradadores de hidrocarburos. Por su habilidad
para degradar una amplia variedad de hidrocarburos, las bacterias
hidrocarburolíticas son los organismos más empleados en procesos de
biorremediación, varios autores han demostrado que los géneros de:
Pseudomonas spp., Sphingomonas spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp.,
Mycobacterium spp., Brevibacterium spp., Flavobacterium spp., Corynebacterium
spp., Cyanobacterium spp., Arthobacter spp., Acinotebacter spp., Halobacter spp.,
Achromobacter spp. y Vibrio spp. son los más eficaces en la remoción de
hidrocarburos (Eve –Riser, 1992; Aamand et al., 1995; Barry –King, 1997). Sin
embargo, el género Sphingomonas spp. presenta mayor eficacia y velocidad al
degradar hidrocarburos aromáticos polinucleares y el género Micrococcus spp.
reporta mayor capacidad en la degradación de hidrocarburos aromáticos
policiclicos (Altamirano y Pozzo –Ardizzi, 2000).
17
2.10.- Antecedentes de biorremediación por bioaumentación en
microcosmos
En el 2002 un estudio de biorremediación en sedimentos, comparo la técnica de
bioestimulación y bioaumentación con el bioproducto BIOIL-FC, demostrando que
con la técnica de bioaumentación se logra un mayor porcentaje de remoción en 28
días, alcanzando un valor de 75%, mientras que con la bioestimulación solo se
logró un 22% de remoción de los hidrocarburos presente en los sedimentos
(Núñez et al., 2002)
En el 2003 al aplicar la técnica de bioaumentación en matraces Erlen Meyer de
500 ml, los cuales contenían 220 g de suelo contaminado, fertilizante y
enriquecimiento de organismos, se consiguió eliminar el 49.2% de HTP en 60
días, durante los primeros 15 días se obtuvo más del 79% de la eliminación total
de HTP. Esta eliminación se logró agitando manualmente todo los días los
matraces y manteniendo el experimento a 10°C (Yerushalmi et al., 2003).
En el 2003, al realizar un estudio a nivel de microcosmos, donde suelos
contaminados con HPA, fueron bioestimulados y bioaumentados con bacterias
capaces de degradar hidrocarburos, se demostró que el microcosmos que recibió
ambos tratamientos logró una remoción del 87% de HPA, en comparación al que
recibió solo bioestimulación que presentó una remoción de 86% (Straube et al.,
2003).
En el 2009 se realizó un estudio en el cual se comparó el porcentaje de
remediación en charolas y en matraces, demostrando que el tratamiento que se
efectuó en matraces alcanzó un mayor porcentaje de remediación con un valor de
18
72%, este resultado se obtuvo al mantener un pH de 7, una agitación y aireación
constante (Cisneros, 2009).
En el 2010 se realizó un estudio de biorremediación en matraces de 250 ml los
cuales contenían 20 g de sedimento y 100 ml de agua de mar prefiltrada. El
proceso tuvo una duración de 5 semanas. Durante este tiempo los matraces se
incubaron a una temperatura de 30°C en una incubadora de agitación a una
velocidad de 180 rpm. Al termino del proceso la adición simultánea de nutrientes
inorgánicos y arena proporcionó la biodegradación de hidrocarburos más alta con
un valor mayor al 70 %. Este resultado sugiere que el desarrollo de bio-
tratamientos eficaces para la remediación de sedimentos contaminados debe
orientarse no sólo para aumentar la biomasa y actividad de las bacterias que
degradan hidrocarburos, sino también para aumentar el área de superficie
disponible para el ataque microbiano (Beolchini et al., 2010).
En el 2012 se aplicó un proceso de biorremediación a sedimentos contaminados
con hidrocarburos, que consistió en bioaumentar bacterias autóctonas y
adicionarlas a un sistema de tratamiento en matraces de 500 ml, los cuales
contenían 300 g de sedimento y 100 ml de Caldo de soya tripticaseína. Los
matraces se mantuvieron en un Shaking Wáter Bath a 100 rpm, diariamente
durante 8 horas. Después de 3 meses la remoción de hidrocarburos totales del
petróleo fue de un 72 %, logrando un mayor porcentaje de remoción de HTP a los
60 días (San Martin et al., 2012).
En este mismo año un estudio comparo la eficacia de tres tratamiento:
landfarming, bioestimulación y bioestimulación más bioaumentación los resultados
19
en la remoción de hidrocarburos fue de un 87 % para el tratamiento de
landfarming, 89 % para la bioestimulación y 87 % en el tratamiento de
bioestimulación mas bioaumentación. El pH en el proceso de biorremediación de
bioestimulación mas bioaumentación fue de 6.5 (Chagas –Spinelli et al., 2013).
20
III.OBJETIVOS
A) Objetivo general
• Evaluar la biorremediación de HTP a nivel de microcosmos en
sedimentos contaminados por hidrocarburos de un estero de la localidad
Emiliano Zapata, Tuxpan, Veracruz.
B) Objetivos particulares
• Determinar la composición física y química del sedimento del área de
estudio.
• Obtener cepas bacterianas con capacidad para degradar hidrocarburos
a partir del medio Bushnell – Hass.
• Aplicar cepas bacterianas con capacidad para remover hidrocarburos a
un sistema de biorremediación por bioaumentación a nivel de
microcosmo.
• Comparar la cantidad de hidrocarburos totales del petróleo a los 0,30,
60 y 90 días del proceso de biorremediación en microcosmos.
21
IV. ÁREA DE ESTUDIO
4.1.- Localización del punto de muestreo
Las muestras de sedimento contaminado con hidrocarburos se obtuvieron de un
estero ubicado en el Ejido Emiliano Zapata del Municipio de Tuxpán, Veracruz
que se encuentra en las coordenadas: 20°48´32.88”N y 97°13´30.02”O, tiene una
altura de 10 metros sobre el nivel del mar, limita al norte con playa de chile frio y al
sur con Cazones de Herrera y las actividades principales de esta zona pertenecen
a la agricultura, ganadería, pesca, apicultura y exploración de petróleo y gas
natural (INEGI, 2013). La localización del punto de muestreo se puede observar en
la Figura 1
4.2.- Fase experimental del proceso de biorremediación
La fase experimental se llevó a cabo en el laboratorio de Biotecnología Ambiental,
ubicado en la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad
Veracruzana campus Poza Rica - Tuxpan, Veracruz.
22
Figura 1. Localización geográfica del Ejido Emiliano Zapata, el punto de muestreo se resalta
en el rectángulo negro
23
V. MATERIALES Y METODOS
5.1.- Elección y prospección del área de estudio
El área para la obtención de muestras fue en el estero localizado en el Ejido
Emiliano Zapata del municipio de Tuxpan, Veracruz; que a simple vista presentó
contaminación por hidrocarburos derivados del petróleo en sedimentos y agua, lo
cual fue el punto a considerar en el proceso de biorremediación.
5.2.-Toma de muestras
Se realizó un recorrido de prospección y se situó un punto estratégico donde se
tomaron muestras al azar de sedimentos contaminados, cada muestra fue
aproximadamente de 2 kg, las cuales fueron colocadas en frascos de vidrio
estériles. Posteriormente estas muestras se trasladaron al laboratorio de
biotecnología ambiental de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias,
lugar donde se efectuó una separación del sedimento en dos fracciones, la
primera fracción fue para iniciar el análisis bacteriológico y la segunda para
ejecutar los análisis físico-químicos del sedimento.
24
5.3.- Análisis físicos y químicos del sedimento
El primer paso del análisis físico-químico del sedimento fue secar un kg de
muestra a temperatura ambiente hasta que perdió toda la humedad, cuando la
muestra estuvo completamente seca se tamizó y se realizaron los siguientes
análisis:
Físicos.- clase textural (hidrómetro de Bouyoucos), densidad aparente (método de
la probeta), salinidad, temperatura y conductividad eléctrica.
Químicos.- pH (potenciómetro), Nitrógeno Amoniacal, Fosforo y Potasio (técnica
colorimétrica, del kit HANNA), Calcio, Magnesio, Hierro, Aluminio, Cloruros,
Sulfatos y CIC del kit LAMOTTE y Materia Orgánica (Walkley Black, 1932).
5.4.- Determinación de Hidrocarburos Totales del Petróleo
La determinación de hidrocarburos totales del petróleo (HTP) del sedimento, se
realizó mediante el método de reflujo empleando el equipo Soxhlet de acuerdo a
Fernández et al., (2006).
25
5.5.-Preparación del sedimento para la extracción de hidrocarburos
La extracción de hidrocarburos totales de petróleo consistió en varios pasos y el
primero fue preparar la muestra de sedimento, con la finalidad de determinar la
humedad, se tomó una muestra de 16 gramos la cual se colocó en un recipiente a
peso constante (se registró el peso inicial, 16 gramos de sedimento + peso de la
lata) y se introdujó a una estufa marca Equipar a 30°C por un periodo de 48 horas.
Al concluir las 48 horas la muestra se sacó de la estufa y se colocó en un
desecador por un tiempo de dos horas para que adquiriera la temperatura
ambiente. Después la muestra fue pesada nuevamente en el recipiente y se
registró el peso final, cuando se tuvieron ambos pesos se determinó el porcentaje
de humedad usando la diferencia de pesos de acuerdo a Fernández et al., (2006)
aplicando la siguiente formula:
% Humedad= (peso inicial – peso final) / (peso inicial) (100)
26
5.6.- Extracción de hidrocarburos
Este paso se efectuó con el método de reflujo en el equipo Soxhlet, tomando como
referencia los métodos, D5369-93 de la (ASTM, 2003) y 3540 C de la (US EPA,
1996,1994), que consistió en triturar finamente con ayuda de un mortero 5 g de
sedimento seco, cantidad que se envolvió sobre papel filtro y luego se colocó en
un cartucho de celulosa, el cual se introdujo en la columna extractora del equipo
Soxhlet.
Para la diferenciación se utilizó un matraz bola de 500 ml a peso constante, se
registró su peso inicial, se le adicionaron 400 ml de hexano A.C.S. (marca CTR
SCIENTIFIC) y luego se ensambló con el resto del equipo, donde se inició el
calentamiento. Cuando se obtuvo el punto de ebullición, se comenzaron a contar 8
horas, durante cada hora se efectuaron de 6 a 8 reflujos. Al concluir las 8 horas se
extrajo el matraz sin hexano y se metió en una estufa por un periodo de 12 horas,
al pasar este tiempo se sacó de la estufa y se colocó en un desecador para
finalizar el proceso de evaporación del extracto orgánico. Finalmente el matraz fue
pesado nuevamente, al obtener el peso final se llevó a cabo la cuantificación de
los hidrocarburos utilizando la siguiente formula:
HTPs= (RB-RA) (FC) / (P) (FH)
27
Dónde:
HTPs (mg kg-1 de s.s.) = hidrocarburos totales del petróleo en mg/kg de suelo
seco.
Ra = Peso (mg) del recipiente con el extracto orgánico concentrado.
P = cantidad de suelo extraído (g).
FH = factor de corrección de humedad (1-(% humedad/100)).
FC = factor de corrección para transformar a kg de s.s. = 1000.
La determinación de HTP se realizó al inicio del experimento, a los 30, 60 y 90
días para el posterior análisis de datos.
28
5.7.- Aislamiento de bacterias
El proceso de aislamiento de bacterias se realizó utilizando sedimento
contaminado, obtenido del área de estudio, con el fin de determinar el tipo de
bacterias presentes en el sitio de colecta.
Al iniciar el aislamiento se esterilizaron dos frascos de vidrio con una capacidad de
1 litro y también se esterilizó en autoclave medio de cultivo Bushnell- Hass a 15
libras de presión por un lapso de 15 minutos, cuando los frascos y el medio
estuvieron a temperatura ambiente se realizó el siguiente paso: en cada uno de
los frascos se colocaron 500 g de sedimento, 100 ml de medio B-H y un ml de
petróleo puro como única fuente de energía, los frascos fueron etiquetados e
incubados en una estufa Equipar a 30°C por 72 horas (San Martin et al., 2012).
Cuadro 1. Composición química del medio B-H.
Reactivo Formula c. b. p. 1ooo ml

Sulfato de magnesio (MgSO4) 0.2 g/l
Cloruro de calcio (CaCl2) 0.029 g/l
Monofosfato de potasio (K3PO4) 1 g/l
Nitrato de amonio (NH4NO3) 1 g/l
Cloruro férrico (FeCl3) 0.05 g/l
29
5.8.- Cultivo bacteriano
Después del aislamiento y tras obtener visiblemente bacterias, se procedió a
realizar el cultivo bacteriano, proceso para el cual se utilizaron 80 ml de medio de
cultivo agar soya tripticaseína previamente esterilizado en autoclave a 15 libras de
presión por 15 minutos, 4 cajas Petri y 4 asadas de bacterias. En cada una de las
cajas se vertieron 20 ml de medio de cultivo agar soya tripticaseína, una asada de
bacterias y se incubaron a 35°C por un lapso de 48 horas. Después de la
incubación se realizó la tinción de Gram para determinar el tipo de bacterias
presentes.
5.9.- Purificación de las cepas bacterianas
La purificación de cepas bacterianas fue un proceso donde se realizaron
resiembras sucesivas hasta que se alcanzó el máximo grado de pureza, en este
paso también se usó como medio de cultivo agar soya tripticaseína. Las cepas
bacterianas purificadas se mantuvieron bajo condiciones de refrigeración a 1°C
con el fin de preservar su viabilidad (San Martin et al., op cit. 2012).
30
5.10.- Prueba de degradación y selección de cepas bacterianas
Para confirmar y determinar la efectividad de las bacterias en la exclusión de
hidrocarburos se realizó una prueba de degradación en la cual se utilizaron ocho
frascos de vidrio de 100 ml, en cada frasco se vertieron 50 ml de medio B-H,
bacterias purificadas y 0.5 ml de petróleo. Posteriormente los frascos se incubaron
por un lapso de 168 horas a 35 °C, monitoreando cada 24 horas el avance de la
degradación en cada frasco. Después de este tiempo las cepas que mostraron
mayor evidencia visual en la transformación de hidrocarburos fueron consideradas
como las más aptas para el proceso de biorremediación.
31
5.12.- Incremento de la biomasa bacteriana
El proceso de incrementación bacteriana se efectuó en 3 tubos de ensaye con
tapa de rosca, cada tubo contenía 20 ml de caldo de soya tripticaseína como
medio de cultivo y cepas bacterianas purificadas. Los tubos se incubaron a 35°C
durante 48 horas hasta que se observó turbidez. Las bacterias resultantes se
vertieron a un matraz con 100 ml de caldo soya tripticaseína y se repitió el proceso
de incubación.
Tras otras 48 horas de incubación se obtuvo la concentración de masa bacteriana
deseada, a continuación las bacterias se vertieron en tubos Falcon con capacidad
de 15 ml y se separaron del medio de cultivo por medio de centrifugación para lo
cual se utilizó una centrifuga PLC series, a 2000 revoluciones por minuto, durante
10 minutos de acuerdo a Fletcher, (2000).
Después de centrifugar, las bacterias se aplicaron a una concentración de 4.5 x
1014 células por libra al sedimento contaminado y de esta manera se comenzó el
proceso de biorremediación.
32
5.13.- Implementación del sistema de biorremediación en microcosmos por
bioaumentación
En esta prueba se ocuparon matraces de 500 ml previamente estériles, a los
cuales se les adicionó 300 g de sedimento contaminado y estéril, 100 ml de caldo
de soya tripticaseína y bacterias resultantes del proceso de aumentación.
Así como también se usaron matraces de 500 ml, que contenían 300 g de
sedimento contaminado y estéril y 100 ml de caldo de soya tripticaseína, estos
matraces se utilizaron como testigos ya que no contenían bacterias.
Posteriormente los 6 matraces fueron colocados a baño maría empleando un
shaking wáter baht, marca GCA precisión, a 30°C y a 100 oscilaciones por minuto
durante 8 horas diariamente, por un periodo de 90 días, el constante movimiento
favoreció el contacto de las bacterias hidrocarburoliticas con el sedimento
contaminado y por consiguiente también al proceso de biorremediación. Durante
los 90 días de experimento se controló la temperatura externa del sistema de
biorremediación a 27°C.
33
5.14.- Monitoreo de parámetros fisicoquímicos en el proceso de
biorremediación
Durante el proceso de biorremediación fue necesario monitorear los factores de
temperatura y pH, en el tratamiento que contenía bacterias así como también en el
tratamiento testigo, la medición de temperatura y pH se realizó semanalmente.
Mientras que la humedad se determinó cada 30 días debido al tamaño de los
microcosmos. Para conocer el nivel de pH en los 6 matraces se utilizaron tiras
indicadoras de color fijo de la marca Machery-Nagel. La temperatura fue tomada
con un termómetro de mercurio de igual manera en los 6 matraces y la humedad
se determinó por diferencia de peso de acuerdo a Fernández et al., (2006). De
esta manera se llevó un control de estos parámetros en los microcosmos.
34
VI. RESULTADOS
6.1.- Análisis fisicoquímico del sedimento contaminado
Al realizar la caracterización física y química, el sedimento contaminado con
hidrocarburos presentó una densidad aparente de 1.08 g/cm3 lo cual indica que su
densidad es baja, la conductividad eléctrica fue de 26.129 µS, lo cual indica que
es muy fuertemente salino, de acuerdo a su conductividad eléctrica el sedimento
se considera con un 66% de peligro y por lo tanto si el sedimento, se fuera a
utilizar para un cultivo de plantas se requiere de un lavado. Por lo que se refiere a
la salinidad, mostró muy alta salinidad con un porcentaje de 16.2%, estos
resultados se muestran en el cuadro 2.

Cuadro 2. Resultados del análisis físico del sedimento
Análisis físicos Resultados Clasificación agronómica, en

base al manual de técnicas de
suelos de la facultad de ciencias
biológicas y agropecuarias de la
universidad veracruzana
Arena 60.04% Mayor concentración
Arcilla 15.24%
Limo 24.72%
Clase textural Franco- Arenoso Franco- Arenoso
Densidad aparente 1.08 g/cm3 Baja
Conductividad eléctrica 26.129 µS Muy fuertemente salino

66% de peligro Peligroso
Salinidad 16.2% Muy alta salinidad
35
Como indica el análisis físico la clase textural del sedimento está compuesta de la
siguiente manera: de arena contiene 60.4%, de limo 24.72% mientras que de
arcilla solo 15.24%. Este sedimento contiene más porcentajes de arena y de limo
por lo que se clasifica como Franco-Arenoso, como se aprecia en la figura 2.
clase textural: Franco-Arenoso
25%
Arena
15% 60% Arcilla
Limo
Figura 2. Composición textural del sedimento contaminado
36
El análisis químico del sedimento, se presenta en el cuadro 3. En él se indica que
el sedimento es ligeramente alcalino ya que presentó un valor de pH de 7.71, por
lo que se refiere a minerales, el valor de carbonatos se considera normal con
12.49%, la caliza activa es considerada como media con 6.25% y en materia
orgánica con 13.40% se considera extremadamente rico.
La técnica colorimétrica llevada a cabo por el kit HANNA muestra que el fosforo
presente en el sedimento es bajo ya que su concentración fue de 18.5 ppm,
mientras que el nitrógeno presentó una concentración media con 25 ppm y para el
potasio se consideró alta con 200 ppm.
El análisis realizado por medio del kit LAMOTTE indica que el sedimento es muy
rico en calcio ya que presento 6192 ppm, así como también se considera muy alto
el magnesio con 1312.70 ppm, los cloruros con 8360 ppm y el CIC (capacidad de
intercambio catiónico) con 94.47 eq/100g. Los valores bajos se presentaron en
manganeso con 5 ppm y en hierro con 2.5 ppm lo que lo clasifica como marginal.
En sulfatos la clasificación fue media con 250 ppm.
37
Cuadro 3. Resultados del análisis químico
Análisis químico Resultados Clasificación
Nitrógeno 25 ppm Medio
Fosforo 18.5 ppm Bajo
Potasio 200 ppm Alto
Calcio 6192 ppm Muy rico
Magnesio 1312.70 ppm Muy alto
Manganeso 5 ppm Bajo
Hierro 2.5 ppm Bajo (marginal)
Aluminio 80 ppm Alto
Cloruros 8360 ppm Muy alto
Sulfatos 250 ppm Medio
CIC 94.47 eq/100g Muy alta
38
6.2.- Aislamiento de bacterias
Las cepas bacterianas extraídas del lugar de muestreo, aisladas en medio B-H y
adicionadas con 1ml de petróleo puro, crecieron a las 48 horas de incubación y
después de realizar el cultivo, la purificación y la prueba de degradación, estas
cepas nativas demostraron no ser aptas en el proceso de remoción de
hidrocarburos.
Por lo que nuevamente se aislaron cepas bacterianas procedentes de un
sedimento de la laguna de San Jerónimo, después de incubarlas por un periodo
de 48 horas, estas bacterias mostraron cambios visibles en la consistencia de la
mezcla, comprobando de esta manera el crecimiento de bacterias. (Figura 3)
Figura 3. Aislamiento bacteriano que demuestra el crecimiento de cepas.
39
6.3.- Cultivo de Bacterias
Del cultivo en agar soya tripticaseína y tras una incubación de 24 horas, se notó la
presencia de colonias bacterianas, las cuales tenían una consistencia cremosa y
un color amarillento. A partir de estos resultados se realizó una tinción de Gram y
los resultados fueron Bacilos Gram negativos por lo que su coloración fue rosa.
(Figura 4)
Figura 4. Bacterias Gram negativas, observadas a 100x.
40
6.4.- Purificación de bacterias
En el cultivo de bacterias solo se obtuvieron bacilos Gram negativos, se realizaron
cuatro resiembras (cuatro cajas por resiembra), en la primera resiembra se
obtuvieron colonias bacterianas muy aglomeradas y a partir de la tercera
resiembra se comenzaron a observar colonias aisladas en la mayoría de las cajas,
solo para verificar su aislamiento se realizó la cuarta resiembra. (Cuadro 4)
Cuadro 4. Avance de las resiembras en el aislamiento de las colonias bacterianas
Caja Petri 1 Muy aglomeradas

1° Resiembra Caja Petri 2 Muy aglomeradas
Caja Petri 3 Aglomeradas
Caja Petri 4 Muy aglomeradas
2° Resiembra Caja Petri 2 Aglomeradas
Caja Petri 3 Aisladas
3° Resiembra Caja Petri 2 Aisladas
4° Resiembra Caja Petri 2 Aisladas
41
Después de efectuar la última resiembra y de incubarla por un periodo de 48
horas, se realizaron nuevamente una tinción de Gram, la cual confirmo la
presencia de un solo morfotipo, bacilos Gram negativos en las cuatro cajas Petri,
como se muestra en la Figura 5.
Figura 5. Confirmación de un solo morfotipo bacteriano
42
6.5.- Prueba de degradación
La prueba de degradación de hidrocarburos tuvo una duración de 168 horas,
durante este periodo se observó una degradación visible en los 8 frascos, sin
embargo en los frascos 2, 3, 6, 7 y 8 se presentó la mayor degradación a partir del
tercer día, en el quinto día los frascos 6, 7 y 8 mostraron aún una mayor
degradación, y para el séptimo día la remoción fue mayor en comparación con los
frascos 1, 2, 3, 4 y 5. Como se muestra en la figura 6.
A B C
Figura 6. Frascos (A, B, C) con mayor remoción de hidrocarburos
6.6.- Aumentación de masa bacteriana
Después de que la prueba de degradación mostró cuales eran las bacterias más
eficaces para la biorremediación, se procedió a la aumentación de bacterias en
caldo de soya tripticaseína, las cuales se obtuvieron después de un periodo de 96
horas, la concentración de masa bacteriana fue de 45 ml, 15ml por cada tubo
Falcon.
43
6.7.- Monitoreo de factores químicos y físicos durante la prueba de
biorremediación
El proceso de biorremediación tuvo una duración de 90 días, durante este tiempo
se monitoreó cada 30 días la humedad y semanalmente el pH y la temperatura de
los sedimentos sometidos a biorremediación, así como también se verificó el
sedimento testigo el cual no contenía bacterias.
El promedio de pH del sedimento sometido a biorremediación fue de 7.03, con un
valor máximo de 8 en las dos primeras semanas, lo cual indica que el experimento
en la semana 1 y 2 fue ligeramente alcalino, mientras que en el resto de las
semanas el experimento mantuvo un pH neutro. En cambio el sedimento que no
contenía bacterias mostro siempre un pH neutro. La figura 7 muestra el promedio
de pH en ambos tratamientos.
7,035
7,03
7,025
7,02
7,015
promedio de
7,01
pH
7,005
7
6,995
6,99
6,985
microcosmos bioaumentado microcosmos sin bacterias
Figura 7. Promedio de pH en ambos tratamientos
44
La temperatura durante el experimento de biorremediación se mantuvo entre los
35°C y los 29°C, con un promedio de 30.9°C, la máxima temperatura se registró
en las semanas 1 y 2 con un valor de 35°C, mientras que la menor se presentó en
las semanas 5 y 7 con un valor de 29°C.
La temperatura del sedimento sin bacterias vario entre los 31°C y los 29°C, con un
promedio de 30.3°C, la temperatura más alta se registró en la primera semana con
31°C y la más baja en las semanas 5 y 7 con 29°C. En la figura 8 se puede
observar el promedio de temperatura en ambos tratamientos.
31
30,9
30,8
30,7
30,6
promedio de
30,5
temperatura en °C
30,4
30,3
30,2
30,1
30
Figura 8. Temperatura promedio en °C del tratamiento de biorremediación y el

tratamiento testigo
45
La humedad de los sedimentos utilizados en los microcosmos bioaumentados con
bacterias tuvo en promedio de 16.46%, el porcentaje de humedad más alto se
registró a los 90 días con un valor de 17.20% y el porcentaje mínimo fue a los 30
días con un valor de 15.66%.
Para los microcosmos testigos el promedio de humedad fue de 14.73%,
presentando en la tercer semana el valor máximo con un porcentaje de 14.94%,
mientras que el mínimo porcentaje de humedad, se obtuvo en la primer semana
con un valor de 14.35%. Figura 9 presenta el promedio de la humedad en ambos
tratamientos.
17,00%
16,50%
16,00%
promedio de 15,50%
humedad %
15,00%
14,50%
14,00%
13,50%
Figura 9. Promedio del porcentaje de humedad en ambos tratamientos
46
6.8.- Concentración inicial de HTPs en sedimento
Después de realizar una determinación inicial de hidrocarburos totales del petróleo
(HTPs) mediante el método de reflujo, el sedimento presentó una concentración
de 60.2 mg de HTPs /kg de sedimento, lo que indica que el nivel de concentración
de HTP es menor a los límites establecidos en la Norma Oficial Mexicana (NOM-
138-SEMARNAT/SS-2003) para propósitos de biorremediación, ya que dicha
norma establece un valor permisible de 1000 mg de HTPs/kg de sedimento.
Este valor inicial se obtuvo después de realizar los cálculos de humedad, factor de
corrección y determinación de HTPs, que se muestran a continuación.
Determinación de humedad:
Peso inicial de la muestra= 40 g, Peso final de la muestra= 30.1 g
% Humedad= (pi-pf)/ (pi) (100)
% H= (40 g – 30.1 g) / (40 g) (100)
%H= 24.75 g
Factor de corrección humedad:
FH= (1- (%H / 100))
FH= (1- (24.75 /100))
FH= .7525
Determinación inicial de hidrocarburos totales del petróleo en el sedimento:
Peso inicial de la muestra= 168.2 g, peso final de la muestra= 167.8 g
HTPs= (RB –RA) (FC) / (P) (FH)
HTPs= (168.2 – 167.8) (1000) / (5) (.7525)
HTPs= 60.2 mg de HTP/kg de sedimento
47
6.9.- Hidrocarburos totales del petróleo a los 30,60 y 90 días
Los bacilos Gram negativos inoculados al sedimento contaminado para propósito
de biorremediación de HTPs por bioaumentación, mostraron una gran habilidad
para remover hidrocarburos, ya que los resultados de los análisis de HTPs a los
30,60 y 90 días presentaron porcentajes de remoción significativos como lo
muestran los cuadros 5, 6 y 7.
Cuadro 5. Cuantificación de hidrocarburos a los 30

30 días Sin bacterias Con bacterias
mg/kg de HTP mg/kg de HTPs
Microcosmos 1 36.325 25.575
Cuadro 6. Cuantificación de hidrocarburos a los 60 días.

Cuadro 7. Cuantificación de hidrocarburos a los 90 días.

48
En los primeros 30 días del proceso de biorremediación, el sedimento
contaminado con hidrocarburos sometido a tratamiento con bacterias mostró una
reducción de 57.52%, en comparación con el valor inicial, el cual fue de 60.2 mg
de HTP/ kg de sedimento
A los 60 días de tratamiento el porcentaje de degradación fue de 66.94%, respecto
al valor inicial.
A los 90 días cuando finalizo el proceso, el valor de los HTPs en los sedimentos
contaminados fue de 11.71 mg de HTP/kg de sedimento, lo cual equivale a un
porcentaje de degradación de 80.54%
En cambio al sedimento que no se le aplicó bacterias, mostro prácticamente el
mismo contenido de HTPs durante los 90 días, manteniendo un promedio de
40.62 mg de HTP/ kg de sedimento. (Figura 10)
65
60
55
mg/kg de HTP
50
45 60.2 60.2
40 microcosmos
35 s/bacterias
30 36,81 36,58 36,05
25 microcosmos
20 26,13 c/bacterias
15 19,07
10 12,41
5
0
0 días 30 días 60 días 90 días
Figura 10. Degradación de HTPs a los 0, 30, 60 y 90 días.
49
Estadísticamente el microcosmo con bioaumentación bacteriana es diferente al
microcosmo sin bacterias, ya que los sedimentos contaminados y tratados
mostraron valores de HTPs de 80.54%, significativamente mayor a los valores de
HTPs de los sedimentos sin tratar, el cual presento un porcentaje de 41.69%.
(Figura 11).
100%
90%
80%
porcentaje de degradacion
70%
60% porcentaje ideal de

biorremediacion
50% porcentaje final
40%
30%
20%
10%
0%
prueba de prueba testigo
biorremediacion
Figura 11. Diferencia estadística de los valores finales en ambas pruebas
50
VII. DISCUSIÓN
La composición textural de los sedimentos desempeña un papel preponderante en
los procesos de erosión y/o deposición y por consiguiente en las técnicas de
biorremediación, se ha demostrado que los sedimentos que presentan una clase
textural Franco- Arenoso, tienen una respuesta favorable en prácticas de
biorremediación (Araujo, 2004; Araujo, 2006; Bolívar, 2006 y San Martin et al.,
2012), esto se puede comprobar en este trabajo, ya que la clase textural del
sedimento en este experimento se clasificó como Franco- Arenoso.
En cuanto a los parámetros físicos y químicos del sedimento se considera que el
pH, la temperatura y la humedad influyen significativamente en el crecimiento y
comportamiento de las bacterias frente a la degradación de hidrocarburos (Maroto
y Rogel, 2001: Dueñas y Santos, 2006; Máncer, 2007; Gómez –Romero et al.,
2008).
El pH en los sedimentos monitoreado en este experimento se consideró
ligeramente alcalino con un valor de 7.71, este valor se encuentra dentro del rango
optimo el cual va de 6.0 a 8.0 de acuerdo a Ríos, (2005), ya que el pH influye en la
asimilación de nutrientes, diferentes autores como Fantroussi y Agahatos, (2005;
Ñustez, (2012) concluyen que este rango de pH es adecuado para el crecimiento
de bacterias.
51
La temperatura del sedimento registrada en este estudio fue de 30.9°C, de
acuerdo a Gómez –Romero et al., (2008) se considera ideal, pues se encuentra
dentro del rango optimo el cual va de 18 a 30°C (Fantroussi y Agahatos, 2005).
Por lo tanto en este estudio se decidió mantener estos niveles de temperatura y
pH con el fin de realizar una biorremediación eficiente.
De acuerdo a Maroto y Rogel, (2001); Dueñas y Santos, (2006) y Máncer, (2007)
el porcentaje de humedad idóneo en sedimentos utilizados para fines de
biorremediación va del 40 al 60%, sin embargo en este estudio el porcentaje de
humedad fue de 16.46%, demostrando que al menos en este trabajo este factor no
tuvo gran influencia en el proceso de biorremediación.
El aislamiento de bacterias en este estudio se realizó exitosamente en medio
Bushnell-Hass adicionado con petróleo crudo de acuerdo a Fletcher, (2000) ya
que de esta manera se garantizó únicamente el crecimiento de bacterias
hidrocarburoliticas. Aun cuando otros autores utilizan medios de cultivos más
eficaces tal es el caso de Altamirano y Pozzo, (2000) que empleó medio mínimo
para microorganismos hidrocarburolíticos, que consiste básicamente en una
solución salina mineral con el agregado de micronutrientes, o como lo señala
Mancera-López et al., (2007) que utilizó medio mineral. San Martín et al., (2011);
San Martin et al., (2012) y Chagas –Spinelli, (2013) demostraron que el medio
Bushnell-Has es muy eficiente cuando solo se utiliza en la etapa de aislamiento.
52
En este estudio el cultivo, purificación y aumentación de bacterias, en este estudio
se efectuó con medios de agar y caldo de soya tripticaseína, ya que Fletcher,
(2000) recomienda estos medios, como excelentes soportes de crecimiento, para
organismos aerobios y anaerobios. Al igual que en este trabajo, Araujo, (2004) y
San Martin et al., (2012) comprobaron la eficacia de dichos medios. A pesar de
que estos medios brindan condiciones favorables durante el crecimiento
bacteriano. Se ha notado que en otras investigaciones se utilizan medios como
agar de Sabouraud maltosa, agar de Czapek, infusión cerebro-corazón BHI o agar
nutritivo inclinado (Araujo, 2004 y Llado et al., 2013) esto se debe a que dichos
medios son más específicos y tienen una constitución rica en nutrientes.
El tiempo de la prueba de degradación en este trabajo coincide con el de
Fantroussi y Agahatos, (2005) quien demuestra que las bacterias son capaces de
remover visiblemente hidrocarburos a los 7 días, aun así Araujo, (2004) postergó
esta prueba hasta los 20 días.
Las bacterias bioaumentadas e inoculadas al sedimento en microcosmos
resultaron ser de un solo morfotipo, bacilos Gran negativos, por lo que estos
resultados se pueden comparar con los obtenidos por San Martin et al., (2012) ya
que en su trabajo reportó remoción de hidrocarburos al utilizar bacterias Gram
negativas en forma de bastón. En el presente trabajo el resultado de bacilos Gram
negativos coincide con Altamirano, (2000); Araujo, (2004) y Araujo, (2006),
quienes al aislar y caracterizar bacterias hidrocarburoliticas, encontraron bacilos
rectos o curvos Gram negativos pertenecientes al género de las Pseudomonas.
53
Numerosos estudios hacen referencia al género Pseudomonas por su capacidad
para sobrevivir y degradar una amplia gama de hidrocarburos derivados del
petróleo (Aamand et al., 1995; Barry –King, 1997; Riser –Roberts, 1998;
Altamirano, 2000; Fantroussi y Agahatos, 2005 y Gómez –Romero et al., 2008),
sin embargo los géneros de Arthobacter, Mycobacterium, Rhodococcus,
Acinotebacter, Chromobacterium y Stenotrophomonas también han sido
reportados como eficientes en la degradación de hidrocarburos (Riser –Roberts,
1998 y Fantroussi y Agahatos, 2005).
La NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 que establece los límites máximos permisibles
de contaminación en suelos afectados por hidrocarburos, la caracterización del
sitio y procedimiento para la restauración en suelos de uso agrícola, forestal,
recreativo y de conservación; indica que el valor permisible es de 1,000.00 mg de
hidrocarburos /kg de suelo, por lo que el contenido de HTP determinado en el
sedimento contaminado del presente estudio al inicio y final del proceso de
biorremediación se encuentra por debajo del valor establecido en la norma
referida, ya que al inicio del experimento la concentración de hidrocarburos fue de
60.2 mg de HTPs /kg de sedimento y al final del proceso la concentración fue de
11.72 mg de HTPs/kg de sedimento, al comparar estas concentraciones, los
valores indican que el porcentaje de remoción supera el 80%
Resultó evidente que los valores de HTP de los sedimentos tratados con bacterias
fueron siempre menores a los 30, 60 y 90 días y que en los sedimentos sin tratar,
los valores se mantuvieron con cambios insignificantes durante toda la duración
del experimento, estos resultados son muy similares a los obtenidos en el trabajo
54
de San Martin et al., (2011) y San Martin et al., (2012). Al finalizar los 90 días del
experimento el porcentaje de remoción de hidrocarburos totales del petróleo fue
de 80.54%, este resultado coincide con los resultados obtenidos por San Martin et
al., (2012), quien a los 90 días consiguió un porcentaje de remoción de 72%. A
diferencia de Yerushalmi et al., (2003) quien logro un 49.2% de remoción total de
hidrocarburos a los 60 días.
La mayor remoción de HTP en este estudio se alcanzó en los primeros 30 días al
obtener un 57.52%, mientras que la menor remoción fue durante el periodo de los
31 a los 60 días con un porcentaje de 9.2%, en comparación a la remoción total.
A diferencia de San Martin et al., (2012) que obtuvo en el periodo de 31 a 60 días
la mayor remoción con un porcentaje de 32%, y la menor remoción la alcanzó en
el periodo de 61 a 90 días con un porcentaje de 13%. Al respecto Máncer –López,
(2007) menciona que esta desaceleración en el proceso de remoción a partir del
día 30, puede ser por la baja disponibilidad de HAP, aletargación del crecimiento
bacteriano o disminución del metabolismo bacteriano.
Aun cuando el porcentaje de remoción de hidrocarburos en este estudio se
considera alto, se debe mencionar que se emplearon bacterias exógenas.
Núñez et al., (2002) también demuestra que la aplicación de bacterias exógenas
es muy factible al obtener un porcentaje de degradación de 75%, estos resultados
contrastan con Yerushalmi et al., (2003); Araujo, (2004); Cisneros, (2009); San
Martin et al., (2011); San Martin et al., (2012) y Chagas –Spinelli et al., (2013)
55
quienes lograron buenos resultados en la degradación de hidrocarburos al aplicar
bacterias autóctonas.
Relativo a esto Volke y Velasco, (2002) mencionan que la aplicación de biomasa
bacteriana al sitio contaminado se utiliza cuando se requiere un tratamiento
inmediato o cuando la microflora autóctona es insuficiente en número o capacidad
degradadora y que tanto bacterias autóctonas como exógenas son empleadas con
el fin de promover la biodegradación o biotransformación del contaminante.
56
VIII. CONCLUSIONES
El presente trabajo considera exitoso el proceso de biorremediación ya que las
bacterias exógenas utilizadas degradaron en más de 80 % el contenido de HTP en
los sedimentos. Esta remoción se vio condicionada por dos factores: inoculación
de bacterias y parámetros físicos y químicos de los microcosmos durante el
experimento.
El tratamiento de los microcosmos con bacterias mostró siempre una tendencia a
disminuir el contenido de HTP de los sedimentos, alcanzando respectivamente
valores promedio de 26.13, 19.07 y 12.4 mg de HTP/kg a los 30, 60 y 90 días.
En el caso de los microcosmos sin bacterias, los valores de HTP monitoreados a
los 30, 60 y 90 días se mantuvieron constantes y sin cambios importantes
registrando valores alrededor de 36.4 mg de HTP/kg de sedimento.
Este trabajo constituye en relación a la biorremediación de sedimentos
contaminados con hidrocarburos, un avance en este tipo de investigación, para
generar tecnologías de restauración acordes a la problemática ambiental con
miras a la preservación de los ecosistemas costeros.
57
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71

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UNIVERDIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y

ZONA: Poza Rica - Tuxpan

“Biorremediación en microcosmos de sedimentos

Que para obtener el titulo de:

Tuxpan, Ver. Diciembre de 2013

más en mi vida y por haber puesto en mi camino personas ejemplares que me

ayudaron en todo momento.

agradezco su ayuda y dedicación en todo momento, también les agradezco que

hayan compartido conmigo conocimientos, consejos y anécdotas.

También le agradezco a la M.V.Z. Diana Laura Díaz Inocencio quien me permitió y

análisis fisicoquímicos del sedimento.

A la beca de servicio social otorgada por el Desarrollo Académico e Innovación

educativa de la Universidad Veracruzana.

La conclusión de este trabajo ha requerido de apoyo, confianza, motivos, aliento y

dedico infinitamente a mis padres y a mis hermanos, quienes están conmigo en

Este trabajo también es dedicado a mis abuelitos que me acompañaron en

conmigo en esta etapa y por no abandonarme nunca a pesar de todo, logrando

con sus aventuras que estos años fueran fabulosos.

Y como especial dedicatoria a Ernesto quien con sus consejos y regaños me ha

I.- INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….. 1-2

2.1. Industria petrolera en México y generación de residuos peligrosos…. 3-4

2.2. Hidrocarburos derivados del petróleo …………………………………… 4-6

IV.- AREA DE ESTUDIO……………………………………………………….. 22-23

V.- MATERIALES Y METODOS………………………………………………. 24

5.1. Elección y prospección del área de estudio……………………………... 24

6.1.- Análisis fisicoquímico del sedimento contaminado……………………. 35-38

IX.- BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………... 58-71

Figura 1. Localización geográfica del ejido Emiliano Zapata 23

Figura 2. Composición textural del sedimento contaminado 36

Figura 3. Aislamiento bacteriano que demuestra el crecimiento de cepas 39

Figura 4. Bacterias Gram negativas, observadas a 100x 40

Figura 5. Confirmación de un solo morfotipo bacteriano 42

Figura 6. Frascos con mayor degradación de hidrocarburos 46

Figura 7. Promedio de pH en ambos tratamientos 47

Figura 8. Temperatura promedio del tratamiento de biorremediación y el 48

Figura 9. Promedio del porcentaje de humedad en ambos tratamientos 49

Figura 10. Porcentajes de degradación de HTPs a los 30, 60 y 90 días 52

Figura 11. Diferencia estadística de los valores finales en ambas pruebas 53

Cuadro 2. Resultados del análisis físico del sedimento 35

Cuadro 3. Resultado del análisis químico del sedimento 38

Cuadro 4. Avance de las resiembras en el aislamiento de las 41

Cuadro 5. Cuantificación de hidrocarburos a los 30 días 51

Cuadro 6. Cuantificación de hidrocarburos a los 60 días 51

Cuadro 7. Cuantificación de hidrocarburos a los 90 días 51

En este trabajo se aplicó un sistema de biorremediación por bioaumentación en

microcosmos, con la finalidad de evaluar la remoción de hidrocarburos totales del

petróleo (HTP) presentes en sedimentos obtenidos de un estero de la localidad de

Emiliano Zapata, Tuxpan, Ver. Para la realización de este trabajo se aislaron en

medio Bushnell-Hass, bacterias hidrocarburoliticas exógenas, las cuales se

cultivaron y purificaron en agar soya tripticaseína (AST). La capacidad de las

bacterias para remover HTP, se confirmó mediante una prueba de degradación. Al

biomasa bacteriana en caldo de soya tripticaseína (CST). La biomasa obtenida se

aplicó a 6 microcosmos los cuales estaban compuestos por 300 g de sedimento,

microcosmos se incubaron en un Shaking Water Bath, durante 90 días a una

temperatura de 30°C y a 100 rpm. La constante agitación permitió mayor contacto

entre las bacterias y el contaminante. Al concluir el experimento se logró una

remoción de HTP de 80.54%. La mayor remoción de HTP se logró en los primeros

30 días al obtener un valor de 57.52%. Mientras que la menor remoción fue

durante el periodo de 31 a 60 días con un porcentaje de 9.2% en comparación a la

Palabras clave: Biorremediación, Bioaumentación, Microcosmos y Determinación

deltas, lagunas, estuarios, humedales, suelos y sedimentos (Caso et al., 2004),

un gran valor industrial basado en actividades como la explotación, refinación y