ACTIVIDAD INDIVIDUAL

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA

PRESENTADO POR:

MILEIDYS JUDITH TORRES PINEDA

CODIGO: 1.063483276

PRESENTADO A

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA “UNAD”

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

INGENIERIA DE ALIMENTOS

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA

2018
 INTRODUCCIÓN

La biotecnología es una ciencia que implica la manipulación deliberada

del material genético (ADN) de los organismos vivos con el fin de
fabricar o modificar un producto, mejorar animales, plantas o
desarrollar microorganismos con capacidad de especificar los como
tales.
La micropropagación es una de las aplicaciones de mayor impacto
dentro del cultivo de tejidos vegetales
y se tiene como la multiplicación asexual, basada en la totipotencia
vegetal, realizada en condiciones in vitro.

La obtención de plantas mediante micropropagación involucra una

serie de etapas o fases que abarcan Desde los procedimientos previos
al establecimiento de los cultivos en forma aséptica, los que se
encargan de la selección y manejo de la planta madre, el
establecimiento mismo, la proliferación o multiplicación a Través de
subcultivos periódicos, el enraizamiento, que puede realizar in vitro o
ex vitro (fuera del tubo de cultivo), hasta la aclimatación del material
obtenido y su trasplante a condiciones de campo.

La aplicación de la técnica de micropropagación se enfrenta a una

serie de limitantes que discutan la realización de algunas de sus fases
o etapas. Entre éstas sobresale el enraizamiento, ya que algunas
especies no presentan una respuesta consistente a la aplicación de
hormonas que lo estimulan, y la aclimatación del material. La
aclimatación involucra aspectos relativos a la anatomía, siología y
prácticas de manejo del material, que deben conocerse para aplicar
procedimientos que permitan aclimatar el material vegetal y lograr su
supervivencia, lo que constituye uno de los factores más limitantes de
esta técnica.
 MEDIDAS DE SEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGÍA

OBJETIVO Establecer las normas básicas para hacer uso de las

instalaciones del Laboratorio de Biotecnología de manera segura
para evitar accidentes y por en lesione.

1. se utilizan guantes gorro tapa boca, polaina, bata

2. El NO uso de los elementos de protección personal se considera

una falta grave y los facilitadores deberán impedir que se realicen las
prácticas sino se cuenta con los elementos de protección primaria que
las requieran

3. Las batas blancas, batas anti fluidos desechables cerradas y

abotonadas.

4. No se debe deambular con los elementos de protección

contaminados, ni utilizarlos en áreas diferentes como vestieres, baños,
áreas de descanso o cafeterías

5. En caso que se requiera trasvasar sustancias químicas o

infecciosas, se deben usar los elementos de protección primaria
necesarios.

6. No está permitido en el laboratorio: Tener o consumir algún tipo de

alimento o bebida, fumar, mantener o aplicarse cosméticos.

7. No se pueden mantener elementos personales en las áreas de

trabajo.

8. No se podrán utilizar prendas de vestir diferentes a las definidas

para el uniforme y elementos de protección personal (Ej. Sacos,
chaquetas, chalecos, etc.)
9. Los estudiantes deben guardar sus bolsos, maletas, prendas de
vestir y elementos personales en los casilleros asignados antes de
ingresar al CMAPS.

10. No se pueden utilizar joyas por debajo de los guantes ni uñas

artificiales.

11. Se deben mantener las uñas limpias y con una longitud menor de
1/4 de pulgada.

12. Los mesones de trabajo siempre debe estar en perfecto orden,

evitando al máximo la presencia de objetos que no sean de trabajo
(plantas o adornos).

13. Los reactivos se deben mantener en los sitios destinados.

La biotecnología se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice

sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación
o modificación de productos o procesos para usos específicos

CONCEPTOS Y APLICACIONES BÁSICAS EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS VEGETALES IN VITRO

1.- MICROPROPAGACIÓN

El cultivo in vitro permite el crecimiento y desarrollo de material vegetal

en recipientes que lo separan del ambiente exterior y lo mantienen en
condiciones controladas y asépticas. Entre las diversas técnicas de
cultivo in vitro, la micropropagación consiste en la producción clonal de
vegetales a partir, generalmente, de ápices o explantos nodales de
una planta madre. La gran producción de nuevas plantas se ve
favorecida gracias al rápido crecimiento del material vegetal in vitro y a
la proliferación de tallos durante los subcultivos.

Dentro del proceso de micropropagación diferenciamos varias

fases o etapas:

• 0: Selección y Preparación de la planta madre

• 1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de

semillas

• 2: introducción del material seleccionado in vitro

• 3: Multiplicación de brotes

• 4: Enraizamiento

• 5: Aclimatación

Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación

de plantas in

vitro ; puede ser aplicada a diferentes especies vegetales, en cada

caso se podrán

incluir simplificaciones o cambios de acuerdo a las características de

las plantas,

pero en términos generales son comunes al proceso de propagación in

vitro .
FASE 0:

PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben

obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo
adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a
las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un
período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios
meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese
ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con
un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un
crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

FASE 1:

DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir

de los cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser
yemas, trozos de hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de
extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de
planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los
contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que
habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el
material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A
efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas
de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal.
Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo
medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad,
luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio
(agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15
minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.
FASE 2:

INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas

dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo
estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el
proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales,
iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

FASE 3:

MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la

FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con
varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se
desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo.
Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo
medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros
recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de
flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las
condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas
en cada repique o división de las plantas.

El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal

y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se
obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar
incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que
afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

FASE 4:

ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS

EXPLANTOS

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines

individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes
obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio
libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del
tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta
etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde
desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y
enraizamiento transcurren en forma simultánea.

FASE 5:

ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios

ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso
depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán
cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas
a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los
explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados
a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y
crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y
generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la
transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son
completamente funcionales frente a descensos de la humedad
relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del
explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también
suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que
representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de
toda la superficie de la planta.

La siguiente lista presenta una comparación de las características de

una planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una
planta en condiciones naturales (in vivo): In vitro.

• No realiza fotosíntesis

• Crecimiento en condiciones controladas

• Crecimiento en condiciones de asepsia

• Alta humedad relativa

• Estomas no funcionales

• Ausencia de pelos radiculares

• Ausencia de cera en la cutícula.

• Realiza fotosíntesis

• Crecimiento en condiciones no controladas

• Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente

• Humedad relativa variable

• Estomas funcionales

• Presencia de pelos radiculares

• Presencia de cera en la cutícula.

Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de

humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad
relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos
plantines se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por
un plástico, para mantener la humedad relativa elevada.
- MEDIOS DE CULTIVO

Antes de realizar la asepsia del material vegetal que se va a introducir

in vitro, es necesario disponer de Medios de Cultivo esterilizados y
dosificados en recipientes adecuados. Una parte importante del cultivo
in vitro son los Medios de Cultivo ya que en ellos se encuentran las
sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo de los tejidos
vegetales. Un medio de cultivo es una solución acuosa en donde se
encuentran disueltas sales minerales que aportan los elementos
esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes
(Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una
fuente de carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa
actividad fotosintética de los tejido in vitro. Además, el medio puede
ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del
Crecimiento.

Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas

10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la solución madre se
pueden mezclar varias sales minerales siempre que no se produzcan
problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan
en forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el
cultivo. Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma líquida o con
un agente gelificante como el agar.
- ESTABLECIMIENTO IN VITRO

Para introducir in vitro un material vegetal que se ha desarrollado en el

exterior es imprescindible tomar una serie de medidas encaminadas a
eliminar los posibles microorganismos que puedan estar establecidos
sobre él. En primer lugar hay que seleccionar material vegetal en un
adecuado estado de nutrición y libre de enfermedades y plagas. Si el
material presentase algún problema habría que descartarlo o realizar
los tratamientos adecuados.

Una vez seleccionado el material vegetal, y previamente a la

introducción in vitro, es conveniente someterle a una serie de
tratamientos para reducir al máximo los microorganismos superficiales.
Por ejemplo se pueden realizar aplicaciones periódicas de fungicidas y
bactericidas sistémicos. Algunos microorganismos pueden tener una
alta capacidad saprofítica que les permite colonizar rápidamente el
medio de cultico e imposibilitar el desarrollo del material vegetal.

El paso previo a la instalación in vitro de un material vegetal es la

asepsia superficial. El protocolo de este proceso dependerá de las
características del tejido empleado. Para trabajar en condiciones
asépticas, es recomendable realizar este proceso en una cámara de
flujo laminar y emplear material estéril. El ambiente debe mantenerse
limpio con la superficie de trabajo desinfectada con etanol al 70%
antes y después de usarla. Se debe usar bata de laboratorio y lavarse
bien las manos.

- ASEPSIA SUPERFICIAL DE MATERIAL VEGETAL

Se pueden considerar dos situaciones dependiendo que el explanto

que se va a emplear esté protegido en el interior de un órgano, como
el embrión, o esté en contacto con el exterior, como brotes y yemas.
 Para los explantos en el interior de órganos hay que realizar los
siguientes pasos:

⁻ Realizar una asepsia superficial del órgano con etanol al 70 %.

⁻ Eliminar el tejido del órgano hasta alcanzar el explanto.

⁻ Colocar el explanto en el medio de cultivo MS-O Dentro de este

grupo de explantos podemos considerar a numerosas semillas y a los

Embriones. Como se citó anteriormente, los explantos en contacto con

el ambiente exterior han de estar en óptimas condiciones sanitarias
gracias a la aplicación regular de productos fitosanitarios. Por ejemplo,
para introducir in vitro plantas de patata se colocan tubérculos en una
bandeja con papel de filtro humedecido con acaricida, fungicida y
bactericida, hasta que se desarrollen pequeños brotes. Con un
material vegetal saneado se puede seguir el siguiente protocolo:

⁻ Cortar segmentos nodales o apicales de crecimiento activo y de un

tamaño ligeramente superior al deseado. Eliminar las hojas, si las hay,
y colocarlos en un recipiente con agua destilada.

⁻ Esterilización de los explantos en un recipiente estéril con lejía

comercial al 20%, durante 15 minutos.

⁻ Lavar los explantos con abundante agua estéril y depositarlos sobre

papel de filtro para eliminar el exceso de agua.

⁻ Cortar una pequeña porción del extremo del explanto (por donde se
cortó inicialmente) y clavar verticalmente la parte basal (inferior) en el
medio de cultivo.

⁻ Etiquetar los recipientes con un código adecuado que identifique el

medio de cultico, el vegetal y la fecha

⁻ Colocar los explantos en una cámara de crecimiento en oscuridad o

a 25 ºC y 16 h de fotoperiodo.
Una ver establecido in vitro, es necesario hacer un seguimiento del
material vegetal para detectar las posibles contaminaciones y sacar de
la cámara de cultivo los recipientes contaminados.

- DESARROLLO DEL MATERIAL VEGETAL IN VITRO

Los explantos establecidos en el medio de cultivo que no presentaban

síntomas de contaminación se subcultivan posteriormente en el mismo
medio o en otro diferente. En algunas ocasiones, el primer medio de
cultivo que se emplea es el MS-O (medio sin reguladores del
crecimiento) y posteriormente, los que no estén contaminados, se
subcultivan a otros medios más específicos, con diversas
combinaciones hormonales que desentenderán del tipo de material
vegetal y del fin que se pretenda.

ENRAIZAMIENTO IN VITRO

La siguiente fase de un proceso de Micropropagación (etapa III)

consiste en inducir el enraizamiento de microtallos obtenidos en el
apartado 1.3. Para inducir el enraizamiento se suele emplear el medio
de cultivo MS sin citoquininas y con auxinas. Por ejemplo un medio
MS con 1 mg/L de AIB.
ACLIMATACIÓN

La última fase de una cadena de Micropropagación consiste en la

aclimatación a condiciones ambientales de las plantas obtenidas in
vitro. Las microplantas enraizadas in vitro se siembran en un sustrato
humedecido de turba/vermiculita y se colocan en una cámara de
aclimatación con una humedad relativa del 90 %. Durante dos
semanas la humedad relativa va disminuyendo hasta alcanzar los
valores del ambiente exterior.
CULTIVO DE MERISTEMOS

El cultivo del meristemo apical de un tallo se emplea para la obtención

de plantas libres de virus ya que estos patógenos tienen dificultades
para alcanzar esta zona cuando la planta está creciendo activamente
Para obtener un meristemo apical es necesario tomar segmentos
apicales de tallos obtenidos in vitro o procedentes de plantas crecidas
en condiciones en el exterior. Si se utiliza la segunda posibilidad será
necesario realizar una apepsia previa del tejido. Posteriormente se
eliminan los primordios foliares que rodean al meristemo hasta dejar al
descubierto el domo meristemático. Finalmente con un bisturí se
realiza un corte transversal, de 0.2 a 1.0 mm, debajo del meristemo,
con uno o dos pares de primordios foliares y se coloca sobre un medio
de cultivo adecuado, procurando colocar la zona de corte hacia abajo.
Una vez que empiece a desarrollarse el meristemo en el medio de
cultivo se actúa como en una cadena multiplicativa en un proceso de
micropropagación. Con los meristemos escindidos también se pueden
realizar microinjertos y encapsulaciones en gel de alginato.

El proceso de micropropagación: se realiza en varias fases:

establecimiento, multiplicación, enraizamiento y adaptación, con
personal especializado en cada una de las cuatro etapas
EQUIPO DE LABORATORIO

Estufa

Nevera
 Conclusión

La biotecnología vegetal permite la transferencia selectiva de una

mayor variedad de información genética de una forma precisa y
controlada mediante la utilización de técnicas que permiten desarrollar
variedades con caracteres específicos deseables y sin incorporar los
que no lo son.

Las características desarrolladas en las nuevas variedades protegen a

las plantas de insectos, enfermedades, malas hierbas, etc.; e
incorporar mejoras en la calidad, aumento del valor nutritivo, lo que
conlleva a producir en abundancia, saludable y proteger el medio
ambiente.

En el cultivo de tejidos las separaciones de explante y las operaciones

relacionadas con su incubación in vitro, depende en gran medida del
tipo de explante y del sistema de cultivo empleada; por lo cual las
técnicas que se empleen, no son exactamente las mismas para
meristemos. Los cultivos en vitro requieren técnicas heterogéneas
donde los explante requieren condiciones contraladas y asépticas.

Las técnicas de la manipulación genética son importantes en el

contexto general de la agricultura moderna; donde la biotecnología
agrícola conecta aéreas como: Biología Molecular y Celular con
prácticas agrícolas tradicionales produciendo nuevas variedades de
plantas y técnicas de multiplicación que se utilizaran a futuro.
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Evaluación morfológica e histológica del proceso de formación de

yemas múltiples de Musa (AAB) cv. Canchignia, F. y Ramos, L.
(2004). Micro propagación de plátano variedad barraganete.
Laboratorio de biotecnología vegetal. Universidad Propagación de
plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace
mucho tiempo. Disponible en 4/ad_382.pdf. Colmenares, M. y
Giménez C., (2003). Multiplicación in vitro Musa spp., mediante
sistema de inmersión temporal. Revista Facultad de
Agronomía..(2002). Bananos (Musáceas de fruto comestible) notas de
apoyo sobre el tema. Universidad del Táchira. 21 pp. Hurtado, D y
Merino, M. (1987). Cultivo de tejidos vegetales. Editorial Trillas.
Primera Edición. Ciudad de México D.F. pp. 231. Jiménez, E.(1998).
Cultivo de ápices y meristemos. Citado por Pérez, J. (1998).
Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. Instituto
de Biotecnología de las Plantas, Volumen 1, Capítulo 3. Pág. 45-56.