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Análisis Instrumental:
Electroforesis en Gel de poliacrilamida, en gel de agarosa
y diferencia entre éstas dos.
Profesor: Julio Armando Alpuche Pérez
Carrera: Ingeniería en Biotecnología Grupo: 3ª
Integrantes:
• Diana Lizbeth Buenfil León
• Nayla Berenice Muñoz Euan
• Miguel Ángel Dzib Miss
• Daniela Pérez Yáñez
• Geovanni Edimir Hernández García
• Roberto Carlos Ventura Vázquez
• Jessica Sharlin Landeros Juárez
• Abraham Gustavo Yam Colli
• Ricardo José Lara Castellanos
Electroforesis en gel de
poliacrilamida.
Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE,
PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis en inglés)
técnica más ampliamente
utilizada para separar
moléculas biológicas
especialmente ADN, ARN
y proteínas.
Es un método conveniente,
rápido y económico a nivel de
muestra, pues se requieren
sólo cantidades del orden de
microgramos de proteína.
La poliacrilamida es un
soporte empleado
frecuentemente en
electroforesis en gel, es
químicamente inerte, de
propiedades uniformes,
capaz de ser preparado
de forma rápida y
reproducible.
Ventajas
Son químicamente inertes,
transparentes y estables en
un amplio rango de pHs,
temperatura y fuerza iónica.
Para el estudio de ácidos
nucleicos, el gel de
poliacrilamida se suele
emplear en situaciones donde
se dispone de fragmentos de
bajo tamaño molecular (de
menos de 1000 pares de
bases).
En la tecnica de SDS-PAGE,
se mezclan las
proteínas con el detergente
aniónico SDS para formar
complejos desnaturalizados,
cargados negativamente.
La electroforesis en geles de acrilamida se puede
realizar empleando sistemas de uno o más
tampones, en estos casos se habla de sistemas
tampón continuos o discontinuos. En los sistemas
discontinuos el primer tampón asegura la migración
de todas las proteínas en el frente de migración,
provocándose la acumulación de todas las que se
han cargado en el pocillo. La separación realmente
comienza a partir del momento en el que el frente
de migración alcanza la frontera del segundo
tampón.
¿Qué es la agarosa?
es un agente fuertemente gelificante, neutral, no
iónico considerado como un polímero lineal cuya
unidad básica es un disacárido.
Separar proteínas
Determinar peso molecular de una proteína SDS-PAGE
Separar proteínas oligoméricas
+ -
…TAACGT…
DNA
…ATTGCA… interés
Sonda
de DNA 32P
…TAACGT…
RNA
…AUUGCA… interés
* Mezcla de diferentes
proteínas pre-teñidas de las que
conocemos el peso molecular.
* Por comparación y
extrapolación podemos
averiguar el PM de nuestra
proteína.
- El peso molecular del DNA puede ser determinado utilizando la
electroforesis en geles de agarosa.
-Los fragmentos de DNA es necesario correr junto a las muestras
un marcador molecular estándar.
- El marcador molecular estándar posee de 5 a 10 fragmentos de
DNA a los cuales se le conoce el peso molecular.
- Existe una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular
de las moléculas y la distancia recorrida en el gel.
-Esta relación permite crear una curva estándar de la distancia
de migración versus el log10 del peso molecular de los
fragmento de DNA que se encuentran en el marcador molecular
estándar.
-Esta curva estándar es utilizada para extrapolar el peso
molecular de aquellos fragmentos de DNA en estudio.
Para crear la curva estándar es necesario:
8. Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a colocar las
muestras en el gel.
9. Coloque el gel de agarosa dentro del tanque de electroforesis.
19. Utilizando una regla mida las distancias entre las fosas y las
diferentes bandas observadas.