Variación genética natural

Los estudios de variación natural en ratones se han centrado en la arquitectura genética

general de la aterosclerosis y las firmas moleculares asociadas con el desarrollo de lesiones
(
Hsu y Smith, 2013
,
Kayashima et al., 2015
,
Rodríguez et al., 2013
,
Welch, 2012
). Por ejemplo, un gran cruce entre las cepas C3H / HeJ y C57BL / 6J en un fondo Apoe - /
-
identificó numerosos loci significativamente asociados con aterosclerosis, calcificación
vascular y rasgos como la obesidad, los niveles de insulina y los lípidos plasmáticos. El
análisis de las vías usando ingenio reveló una serie de vías fuertemente asociadas con la
aterosclerosis, como el metabolismo del colesterol, la fosforilación oxidativa mitocondrial y
la inflamación (
Wang et al., 2007
).
Debido a la mala resolución del análisis de ligamiento en ratones (y humanos), muy pocos
genes nuevos que contribuyen a formas complejas de susceptibilidad a la aterosclerosis se
identificaron en base a cruces genéticos (
Broeckel et al., 2002
,
Erdmann et al., 2013
). Sin embargo, con el desarrollo de tecnologías para la genotipificación de alta densidad, el
mapeo de asociación de rasgos complejos de resolución relativamente alta se ha hecho
posible en ratones y en humanos. Dichos análisis de asociación pueden realizarse utilizando
poblaciones de ratones criados o utilizando poblaciones de ratones criados después de la
corrección de la estructura de la población (
Bennett et al., 2010
,
Valdar et al., 2006
). Una ventaja del uso de ratones consanguíneos para tales análisis es que se pueden
examinar muchos fenotipos diferentes en los mismos antecedentes genéticos (
Bennett et al., 2015
,
Orozco et al., 2012
,
Parks et al., 2013
).
Los estudios de variación natural en ratones han revelado que la aterosclerosis es un rasgo
altamente complejo, que involucra a muchos genes que contribuyen a una variedad de
factores de riesgo. Un estudio reciente de un gran conjunto de cepas puras conocidas como
el Hybrid Mouse Diversity Panel (HMDP) reveló una fuerte evidencia de asociación con
inflamación, señalización de óxido nítrico y niveles de trimetilamina-N-óxido (TMAO), así
como factores de riesgo tradicionales tales como los niveles de lípidos en plasma. Además,
el estudio proporcionó pruebas sólidas de las interacciones gen por gen así como las
interacciones gen por ambiente (
Bennett et al., 2015
).
Modelos de ingeniería y estudios de drogas
Para investigar los mecanismos que contribuyen a la susceptibilidad de la aterosclerosis, se
han examinado cientos de "genes candidatos" por sus efectos sobre la aterosclerosis en
ratones. Dichos genes candidatos fueron elegidos en base a hipótesis generadas a partir de
la comprensión de la aterosclerosis humana y, por lo tanto, están sesgados de forma
inherente. Al relacionar los resultados de dichos estudios con la genética de la
aterosclerosis humana, se deben tener en cuenta una serie de otras advertencias, incluidas
las diferencias en el tamaño del efecto, el problema de los "genes pasajeros" y algunas
consideraciones estadísticas. Tales factores de confusión se discuten en una sección
posterior.
Revisamos exhaustivamente más de 9,000 publicaciones de PubMed que examinaron genes
que contribuyen a la aterosclerosis en ratones. Estos incluyeron un total de 827 genes de
aterosclerosis de ratón, según lo definido por un efecto significativo en el tamaño o la
composición de la lesión aterosclerótica cuando se perturba en un modelo de ratón. A
nuestro entender, esto representa la colección más completa de genes de ratón que tienen
efectos significativos en la aterosclerosis en modelos de ratón. Las citas para todos los
genes incluidos se proporcionan en la Tabla S1 , disponible en línea. Los genes de ratón se
clasificaron en tres grupos:

 (1)

Modelos diseñados de expresión génica reducida (knockdown o knockout)

 (2)

Modelos diseñados de sobreexpresión de genes (principalmente ratones

transgénicos)

 (3)

Modelos de tratamiento farmacológico.

Las comparaciones de datos de ratón y humanos a nivel genético deben considerar las
diferencias genéticas. Para evaluar la superposición de genes entre las especies, se
consideraron los homólogos más recientes de ENSEMBL (
Kersey et al., 2016
). Después de los ajustes específicos de la especie, 19,583 genes humanos codificantes de
proteínas podrían combinarse con 20,738 genes de ratón. Por lo tanto, aproximadamente el
98,8% (19,583 de 19,815) de los genes humanos están representados en el genoma del
ratón y el 94,5% (20,738 de 21,936) de los genes del ratón están representados en el
genoma humano (
Harrow et al., 2012
,
Mudge y Harrow, 2015
).
Siguiendo la clasificación de los modelos de ratón, nuestra investigación reveló un total de
827 genes de ratón, de los cuales 535 (64.5%) fueron modelos de expresión génica
reducida, 48 (5.8%) fueron modelos de genes sobreexpresados y 244 (29.5%) fueron
modelos de tratamiento farmacológico. Se consideró que los genes que mostraron
alteraciones significativas en el tamaño de la lesión (808 genes) o la estabilidad de la placa
(19) tienen un efecto sobre la aterosclerosis. En total, 805 de nuestros 827 genes de ratones
derivados de la literatura tienen un ortólogo humano (97.3%). Estos 805 genes de ratón se
combinaron con 797 genes únicos en humanos. Diez genes de ratón
( Ang , Ang2 , Ang4 , Ang5 , Ang6 , Bglap , Bglap2 , Bglap3 ,Ces3a y Ces3b ) estaban
representados por tres genes humanos (ANG, BGLAP y CES). Los ratones con eliminación
de Apoe (68.6% de los estudios) o Ldlr (27.2%) sirvieron con mayor frecuencia como
modelos para los estudios de aterosclerosis. Por lo tanto, la gran mayoría de todos los
modelos genéticos de ratones se exploraron en el contexto de hipercolesterolemia excesiva,
una condición que es similar a la hipercolesterolemia familiar en el hombre. De los 827
genes, el 58.6% (485) de los genes se describió para mediar los efectos pro-aterogénicos y
el 41.2% (341) de los efectos anti-aterogénicos; Pecam1 es un gen que afecta a la
aterosclerosis de una manera específica del sitio, ya sea positiva o negativamente (
Goel et al., 2008
).
Usando la herramienta de enriquecimiento de genes DAVID, observamos que las categorías
principales de enfermedades correspondientes a los 827 genes de ratones estaban
fuertemente asociadas con la aterosclerosis. Entre las diez principales enfermedades
asociadas con los humanos, seis están relacionadas directamente con CAD o aterosclerosis
en humanos y dos representan factores de riesgo conocidos de CAD. Las dos condiciones
restantes son la enfermedad de Alzheimer y la longevidad ( Tabla 1 ).
Se enumeran los diez principales términos de DAVID asociados con 827
genes de aterosclerosis de ratones derivados de la literatura. El "cambio
en el pliegue" es el grado de enriquecimiento de los genes de
aterosclerosis de ratón dentro de cada categoría de genes, y "genes de
ratón" es el número de dichos genes. FDR, tasa de descubrimiento falso.

Factores de riesgo: concordancia de ratón y estudios humanos

Los estudios epidemiológicos de poblaciones humanas han identificado varios factores de "riesgo"
genéticos o ambientales que se asocian significativamente con la prevalencia de EAC ( Tabla 2 ).
Aquí hemos evaluado exhaustivamente la consistencia de los hallazgos en ratones y humanos en
términos de los efectos de estos factores de riesgo en la aterosclerosis.

Dislipidemia
Los niveles altos de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), VLDL-C y triglicéridos y
los niveles bajos de colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) están fuertemente
relacionados con el CAD humano (

Panel de expertos sobre detección, evaluación y tratamiento del colesterol alto en la sangre en
adultos, 2001

Grundy et al., 2004

). Para imitar la hipercolesterolemia humana en modelos de ratón, se necesitaron adaptaciones

genéticas y dietéticas, ya que el colesterol circulante se basa predominantemente en HDL en
ratones y LDL en humanos. Además, la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP),
que transfiere los ésteres de colesterol y los triglicéridos entre las lipoproteínas, no está presente
en los ratones. Por otra parte, la absorción de colesterol en la dieta es baja en ratones. Al resumir
los resultados de varios modelos de ratones modificados genéticamente que abordan el
metabolismo de los lípidos y las lipoproteínas, los datos son más consistentes con un aumento de
la aterosclerosis en ratones con hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y elevaciones singulares
de los niveles plasmáticos de LDL o VLDL (

Huszar et al., 2000

Knouff et al., 2004

Plump et al., 1992

Powell-Braxton y otros, 1998

van Ree et al., 1994

VanderLaan et al., 2009

Voyiaziakis et al., 1998

). Los niveles elevados de HDL, por otro lado, redujeron la progresión de la aterosclerosis (

Bérard et al., 1997

), y en las lesiones ateroscleróticas sin calcificación, los niveles elevados de HDL incluso llevaron a
una regresión parcial del tamaño de la lesión (

Feig et al., 2014

).

Alta presion sanguinea

La presión arterial alta es un factor de riesgo bien conocido de CAD humana (

Stamler y otros, 1993

). La inducción de la presión arterial alta en modelos de ratón se inició por una ingesta excesiva de
sal, la regulación positiva del sistema renina-angiotensina-aldosterona, perturbaciones genéticas o
constricción mecanicista de las arterias renales. Aunque las causas de la hipertensión en esos
modelos son diferentes, la aceleración de la aterosclerosis fue un hallazgo consistente (

Leong et al., 2015

Weiss et al., 2001

Wiesel et al., 1997

).

Trastornos inflamatorios sistémicos

Los trastornos inflamatorios sistémicos humanos, como la artritis reumatoide, el lupus y la
psoriasis, están fuertemente asociados con la CAD humana, aunque los fundamentos genéticos de
los dos trastornos pueden ser diferentes (

del Rincón et al., 2001

Jansen et al., 2015

Wang et al., 2012

Westerweel et al., 2007

). De acuerdo, los modelos de ratón de la artritis reumatoide humana, el lupus y la psoriasis
también mostraron un aumento de las lesiones ateroscleróticas en los modelos de ratón (

Cao et al., 2013

Karbach et al., 2014

Ma et al., 2008

Rose et al., 2013

).

De fumar
Fumar acelera el desarrollo de CAD en humanos (

Kannel et al., 1968

). En los modelos de ratón, la exposición al humo del cigarrillo convencional provocó

perturbaciones del metabolismo de los lípidos, la función de las células endoteliales arteriales y el
desarrollo de lesiones ateroescleróticas (

Boué et al., 2012

). El cese de la exposición al humo condujo a una desaceleración de la progresión de la placa y

disminuyó la acumulación de lípidos pro-aterogénicos (

Lietz et al., 2013

).

La contaminación del aire

La contaminación del aire es un factor de riesgo para la aterosclerosis humana acelerada (

Araujo, 2010

). Los modelos de ratones expuestos a partículas ambientales concentradas a largo plazo menores
de 2,5 μm (que simulan el aire contaminado) mostraron una aceleración de la aterosclerosis y la
inflamación vascular (

Sun et al., 2005

).

Diabetes tipo 1
La diabetes tipo 1 (T1D) promueve la progresión de la CAD humana (
Schnell et al., 2013

). La T1D en modelos de ratón fue inducida por estreptozotocina o por infección viral. Ambos
métodos resultaron en la formación acelerada de la lesión (

Shen y Bornfeldt, 2007

).

Diabetes tipo 2
La diabetes tipo 2 (T2D) es un factor de riesgo de la CAD humana (

Reaven, 2003

). La mayoría de los modelos T2D de ratón se basan en un modelo deficiente en leptina,

alimentación con grasa o carbohidratos o disfunción de las células beta inducida genéticamente, y
la mayoría mostró que la T2D acelera la aterosclerosis (

Jun et al., 2011

Rey, 2012

Renard et al., 2004

Schreyer et al., 1998

). Hubo algunos resultados contradictorios, posiblemente debido a la participación del sistema

inmunológico (

Taleb et al., 2007

) o efectos ateroprotectores de la deficiencia de leptina en sí ( Lep ob / ob ) (

Chiba et al., 2008

).

Angustia
La angustia, aguda y crónica, es un factor de riesgo para el desarrollo y la progresión de la CAD
humana (

Holmes et al., 2006

). En un modelo de estrés crónico en ratones, los ratones fueron expuestos repetidamente a agua
helada. Los animales desarrollaron lesiones ateroscleróticas más avanzadas y complejas (

Heidt et al., 2014

,

Najafi et al., 2013

).

Trimetilamina-N-óxido
El TMAO, derivado de la colina o la carnitina en la dieta a través de la acción de la microbiota
intestinal, ha demostrado recientemente ser un factor de riesgo para la EAC y la insuficiencia
cardíaca (

Koeth et al., 2013

). Las cepas puras de ratones exhiben variaciones en los niveles de TMAO cuando se mantienen en
una dieta occidental, y estas se asocian significativamente con la aterosclerosis (

Bennett et al., 2015

). Los modelos de ratones experimentales revelaron que la suplementación dietética con colina
(que puede procesarse a TMAO) o TMAO en sí promovió la aterosclerosis (

Wang et al., 2011

).

Trombosis
La trombosis está significativamente relacionada con la CAD humana (

Davies, 1996

). Una investigación del inhibidor de la activación del plasminógeno 1 ( Pai1 ) en un modelo de

ratón mostró un fenotipo protrombótico con formación acelerada de lesiones (

Schafer et al., 2003

).

Falta de actividad física

La falta de actividad física es un factor de riesgo bien conocido de la CAD humana (

Warburton et al., 2006

). Los estudios en modelos de ratones revelaron un desarrollo desacelerado de la aterosclerosis en

ratones sometidos a ejercicio (

Meissner et al., 2011

).

Bacteriemia indebida
La bacteriemia indebida se asocia con la EAC. La enfermedad periodontal proporciona la entrada
más común para tales patógenos (

Beck et al., 1996

). Los modelos de infección oral con patógenos periodontales mostraron aterosclerosis acelerada
en ratones (

Lalla et al., 2003

).

Insuficiencia renal
La insuficiencia renal acelera la progresión de la CAD humana, especialmente cuando la carga de
calcificación es alta (

Yerkey et al., 2004

). Los modelos genéticamente modificados de ratón de insuficiencia renal ( Fgf23 - / - o Klotho - / - ) o

ratones en los que se inició la inducción con toxinas urémicas, como el indoxil sulfato, mostraron
aterosclerosis acelerada y lesiones altamente calcificadas (

Neven y D'Haese, 2011

).

Síndrome metabólico
El síndrome metabólico, caracterizado por resistencia a la insulina, obesidad, presión arterial
elevada y dislipidemia, es un factor de riesgo para el desarrollo de la CAD humana (

Isomaa et al., 2001.

). Varios modelos de ratones con síndrome metabólico muestran una formación acelerada de
lesiones (

Kennedy et al., 2010

).

Obesidad
La obesidad es un factor de riesgo establecido para la EAC en humanos. La obesidad también se
asocia positivamente con la aterosclerosis en ratones con dietas altas en grasa y colesterol (

Kennedy et al., 2010

). Los ratones con deficiencia de leptina ( Lep ob / ob ) tienen un fenotipo obeso distinto, pero están
protegidos contra la aterosclerosis (

Chiba et al., 2008

,
Nishina et al., 1994

Plummer y Hasty, 2008

). Este efecto puede estar relacionado con el aumento de tamaño de las lipoproteínas en ratones
obesos Lep ob / ob , lo que lleva a una menor penetración de las paredes arteriales (

Nishina et al., 1994

) y la regulación de la presión arterial (

Huby et al., 2016

). La deficiencia del receptor de leptina ( Lep db / db ), en contraste con la deficiencia de leptina,

condujo a un aumento de los niveles plasmáticos de leptina y aterosclerosis pronunciada, lo que
sugiere que la leptina en sí promueve la aterosclerosis (

Wu et al., 2005

).

Diferencias de sexo
En los seres humanos, los hombres muestran un inicio más temprano de CAD en comparación con
las mujeres. En los ratones, por otro lado, la aterosclerosis es generalmente más prominente en
las hembras, aunque esto depende del modelo de ratón y la dieta utilizada. La mayor
susceptibilidad a la aterosclerosis en ratones hembras se ha atribuido en parte a los genes
codificados por los cromosomas sexuales (

Arnold et al., 2016

Link et al., 2015

) y también a las diferencias en el metabolismo de TMAO, un factor de riesgo potente para la

aterosclerosis (

Bennett et al., 2013

). El TMAO se produce por oxidación de la trimetilamina circulante, catalizada por la enzima flavina
monooxigenasa 3 (FMO3). En ratones, la expresión de FMO se suprime dramáticamente por la
testosterona y, por lo tanto, los niveles de TMAO son mucho más bajos en los machos en
comparación con las hembras (

Bennett et al., 2013

Kloss et al., 1982

). En contraste, los niveles de expresión de FMO3 hepáticos son similares o solo ligeramente más
bajos en hombres que en mujeres, y los niveles de TMAO en circulación son similares en hombres
y mujeres (

Tang et al., 2013

).

Resultados de la Asociación del Genoma Humano: Superposición con estudios en ratones

Durante la última década, los GWAS han mapeado de manera robusta miles de loci para varias
enfermedades comunes. En general, los loci identificados exhiben individualmente un tamaño de
efecto muy modesto, y juntos explican una pequeña fracción del componente genético
(heredabilidad) de la enfermedad, aunque algunos loci muestran series alélicas que van desde
alelos comunes, genómicamente significativos asociados a mutaciones raras. elevarse a rasgos
mendelianos, por ejemplo, deficiencia de LDLR o GUCY1A3 (

Erdmann et al., 2013

Goldstein y Brown, 2015

). En el caso de la aterosclerosis, los grandes metanálisis han identificado un total de 57 loci que
cumplen con un nivel de umbral ajustado de Bonferroni, y aproximadamente 100 loci adicionales
muestran una asociación sugestiva (

Deloukas et al., 2013

Consorcio Genético de Enfermedades de las Arterias Coronarias (C4D), 2011

McPherson y Tybjaerg-Hansen, 2016

Nikpay et al., 2015

Schunkert et al., 2011

). En contraste con los rasgos mendelianos (en los que aproximadamente el 85% de las variantes
causales afectan a las secuencias de codificación), los rasgos de enfermedades complejas comunes
parecen deberse principalmente a variaciones en las regiones no codificantes que afectan la
expresión génica (

Nikpay et al., 2015

,
Seifert et al., 2016

). En general, dentro de la región de desequilibrio de ligamiento (LD), los loci contienen múltiples
genes. El gen causal puede incluso estar fuera de la región de LD si está regulado por un
potenciador dentro de la región asociada con la enfermedad. Por lo tanto, un desafío en la
actualidad es identificar las variantes genéticas causales y los genes causales en cada locus. Para
nuestra comparación con los ratones, hemos utilizado dos conjuntos de genes GWAS humanos
diferentes, que se describen a continuación ( Tabla S2).

El primer conjunto de genes (244 genes GWAS) se basa en anotaciones de 169 loci GWAS
significativos y sugerentes conocidos, que incorporan conocimiento y enfoques basados en datos (

Brænne et al., 2015

Deloukas et al., 2013

Nikpay et al., 2015

Schunkert et al., 2011

). Esta lista de genes es un conjunto de genes curados de forma conservadora que probablemente
proporcione los genes CAD humanos más confiables basados en el enfoque GWAS.

El segundo conjunto de genes (880 genes GWAS extendidos) también se basa en los loci GWAS (

Deloukas et al., 2013

Nikpay et al., 2015

) pero además incorpora aspectos funcionales que utilizan loci de rasgos cuantitativos de
expresión (eQTLs) y anotaciones ENCODE, de manera que se incorporan genes adicionales que no
cumplen con un nivel de significación de todo el genoma (p <5E − 8). La extensión de los genes
aumenta la probabilidad de incluir genes falsos positivos, pero ofrece una mejor oportunidad para
inferir mecanismos biológicos y vías que contribuyen a la CAD (

Zhao et al., 2016

).

Perturbación experimental en ratones

Los 797 ortólogos humanos ( Tabla S2 ) de los genes de ratón identificados en modelos de ratón
diseñados se superponen significativamente con los conjuntos de genes CAD humanos descritos
anteriormente. Por lo tanto, 45 (18.4%) de los genes GWAS de CAD (p = 1.13E-17) y 72 (8.2%) de
los genes GWAS extendidos (p = 1.27E-8) se superponen con la lista de 797 ortólogos de ratón. La
cantidad de genes que se superponen es necesariamente pequeña porque solo se ha identificado
una pequeña fracción de los genes humanos (como se juzga a la fracción de heredabilidad) y
algunos de ellos probablemente sean falsos positivos.

Quizás un análisis más significativo es preguntar qué fracción de los genes GWAS humanos que se
han estudiado en modelos de ratón producen un resultado consistente. Dado que los resultados
del GWAS humano se publicaron muy recientemente, solo una fracción de los candidatos
humanos se ha estudiado en ratones. Además, debemos tener en cuenta que un resultado
negativo en el mouse puede no ser publicado. Sin embargo, encontramos que de los 244 genes
GWAS humanos significativamente o sugestivos, 46 ya se han estudiado por su efecto sobre el
tamaño de la lesión en ratones y 45 de estos afectaron significativamente la aterosclerosis en
modelos de ratones ( Figuras 1 y 2 ), dejando alrededor de 190 candidatos humanos. Genes que
aún no han sido estudiados ( Figura S1 ). La información detallada se proporciona en la Tabla
S2.. Dado que es poco probable que muchos de los genes GWAS humanos en nuestra lista sean
causales, tal grado de superposición parece sorprendente. Sin embargo, la mayoría de los genes
superpuestos se consideraron previamente (antes de GWAS) como fuertes candidatos en función
de sus funciones en el metabolismo de los lípidos, la presión arterial o la inflamación y, por lo
tanto, se estudiaron en ratones ( Figura 1 ).

Variación natural a través de cepas de ratones consanguíneos

Hay algunos problemas potenciales con el uso de genes knockouts en
ratones para modelar la aterosclerosis humana. Es importante destacar
que estos estudios están sesgados por la elección del gen. Además, el
efecto puede depender de los antecedentes genéticos, y la mayoría de
los nocauts estudiados hasta la fecha pueden verse comprometidos por
un efecto del "gen pasajero" (ver más abajo) (
Lusis et al., 2007
). Finalmente, los knockouts tienen un tamaño de efecto mucho mayor
que las sutiles variaciones genéticas cuantitativas o estructurales de la
mayoría de los genes GWAS. Estos problemas con los knockouts se
pueden evitar comparando los resultados de GWAS humanos con los
resultados de estudios de variaciones naturales en ratones. El estudio
más completo de aterosclerosis entre cepas de ratones consanguíneos
se realizó en un conjunto de aproximadamente 100 cepas
consanguíneas de ratones altamente diversas, disponibles
comercialmente, conocido como el Panel de Diversidad de Ratones
Híbridos (HMDP) (
Bennett et al., 2015
). En total, se estudiaron unos 1.000 ratones en el fondo de los
transgenes combinados de ApoE-Leiden y CETP humanos. La
susceptibilidad a la aterosclerosis varió varias veces en 100 veces entre
las cepas (
Bennett et al., 2015
).
Primero preguntamos si los ortólogos de ratón de los genes GWAS
humanos exhibían una correlación significativa (p <0,05) con
aterosclerosis en todo el HMDP. De los 244 genes GWAS, 66 (27,0%)
mostraron una correlación significativa (en forma de expresión) con el
tamaño de la lesión en la aorta. Además, los niveles de expresión de 27
(11,1%) genes en el hígado se correlacionaron significativamente con el
aumento del tamaño de la lesión en la aorta de ratón ( Tabla 3 ). Además
de los GWAS CAD, ha habido grandes GWAS de lípidos en la sangre,
con un total de 274 genes candidatos identificados (
Goodarzi, 2016
,
Welter et al., 2014
). Se probó si los ortólogos de ratones de estos genes mostraron una
correlación significativa (p <0,05) en la expresión en hígados o tejido
adiposo con lípidos plasmáticos en ratones. En general, el 55,1% (151 de
274) de estos genes mostró una correlación significativa con los lípidos
plasmáticos en el HMDP ( Tabla 3 ). Los resultados de ambas
comparaciones se presentan en la Tabla S3 . Llegamos a la conclusión
de que los genes GWAS para la aterosclerosis y los lípidos plasmáticos
muestran variaciones muy consistentes cuando se estudian a través de
diferentes cepas de ratones consanguíneos.
Tabla 3 Correlación de conjuntos de genes con el tamaño de la
lesión y los lípidos en la sangre en ratones HMDP
El nombre y el tamaño de cada conjunto de genes, el tejido en el que se
midió la expresión génica y el número de genes correlacionados
significativamente con el tamaño de la lesión en la aorta y el hígado y con
los lípidos en el tejido adiposo y el hígado. Los cálculos se basaron en
los niveles de expresión de genes de ratón.
a Calculado utilizando la prueba exacta de Fisher.

Modelado de la ruta: concordancia de los estudios en humanos y ratones

Tres estudios independientes han modelado rutas de CAD basadas en

datos del Consorcio de replicación y metanálisis del genoma de la
enfermedad coronaria (CARDIoGRAM) (
Ghosh et al., 2015
,
Mäkinen et al., 2014
,
Zhao et al., 2016
). Mäkinen et al. utilizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de
SNP (SSEA) que primero cartografió los GWAS de CARDIoGRAM con
los genes basados en eQTL, y luego evaluó el enriquecimiento de las
señales CAD en redes de coexpresión específicas de tejido y vías
canónicas de las bases de datos Biocarta, KEGG y Reactome. El estudio
reveló 79 vías significativas para la CAD humana (
Mäkinen et al., 2014
). Gosh et al. usó una estrategia alternativa de mapeo de genes que se
basaba en la distancia cromosómica entre los SNP y los genes y un
análisis alternativo de enriquecimiento de conjuntos de genes para
identificar 32 vías CAD significativas derivadas de la base de datos
Reactome (
Ghosh et al., 2015
). Zhao et al. curaron diferentes listas de genes candidatos basadas en
SNP pico de GWAS e implementaron redes reguladoras de genes y
patrones de expresión para identificar 93 vías relevantes de CAD
basadas en rutas canónicas de Biocarta, KEGG y Reactome (
Zhao et al., 2016
). Cuando se combinaron, estos tres estudios identificaron un total de 178
vías únicas asociadas con CAD GWAS humanas ( Tabla S4 ).
Para examinar la concordancia de las vías humanas y de ratón ( Figura
3 ), modelamos las vías de aterosclerosis en ratones utilizando métodos
similares basados en el conjunto de 827 genes que se ha demostrado
que contribuyen a la aterosclerosis utilizando perturbación experimental
(ver arriba). Aplicamos vías canónicas basadas en el conocimiento de las
bases de datos KEGG, Reactome y Biocarta para definir conjuntos de
genes representados en exceso. Utilizamos la prueba exacta de Fisher y
definimos el significado de la representación excesiva como p <0.01
después de la corrección de Bonferroni. Nos centramos en 263 vías que
muestran una representación excesiva significativa de genes de ratones
ateroscleróticos. Las vías para el metabolismo de los lípidos, el sistema
inmunológico, la cascada de receptores tipo peaje, la adhesión focal, la
hemostasia, la señalización de activación de las plaquetas y la
agregación fueron altamente sobre representadas.

De las 178 vías CAD humanas, 72 (40.2%) vías fueron idénticas a nuestras vías de ratón. Un factor
limitante es la diferente nomenclatura de Biocarta, KEGG y Reactome, que hace imposible una
comparación directa. Para abordar esta limitación, analizamos la superposición de genes incluidos
en estas vías y consideramos aquellas vías altamente significativas que compartían mutuamente
más del 50% de sus genes o que incluían al menos el 90% de sus genes en una ruta de las otras
especies. Al utilizar estos criterios, observamos que el 55,1% (98 vías únicas) de las vías asociadas
con la CAD humana se superponen con las vías de aterosclerosis del ratón y el 53,2% (140) de las
vías del ratón se superponen con las vías asociadas con el GWAS humano de la CAD.

Para las rutas basadas en datos del mouse, solo cinco se superponen menos del 30% con las rutas
humanas. Estas vías específicas para ratones incluían diabetes, biología del desarrollo y regulación
de la expresión génica en células beta. La última ruta, por ejemplo, consta de 20 genes y
comparte Akt1 , Akt2 , Akt3 , Foxo1 , Hnf4a , Hnf4g e insulina con rutas asociadas con CAD
humanas conocidas, mientras que los genes Foxa2 , Foxa3 , Gck , Iapp , Mafa , Neurod1 , Nkx2-
2 , Nkx6-1 , Pax6 ,Pdx1 , Pklr , y Slc2a2No estaban presentes en las vías humanas. En total, 37 vías
humanas mostraron una superposición de menos del 30%. Estos incluyeron el metabolismo de las
poliaminas, el transporte de zwitterión de anión de catión orgánico, la biosíntesis de pantotenato
y CoA, el metabolismo de fenilalanina, el metabolismo de aminoácidos de azufre y la
aminoacilación de ARNt. Dos vías inesperadas, la vía de interacción del receptor de ligando
neuroactivo y la vía de señalización de la neurotrofina, mostraron una superposición de alrededor
del 50% entre ratones y humanos. Dado que la mayoría de los modelos de ratón no desarrollan
infartos de miocardio, fue interesante examinar si las especies diferían en vías relevantes como la
coagulación o la degradación del colágeno. Sin embargo, no se observaron tales diferencias
significativas. En general, estos hallazgos destacan una alta consistencia biológica entre las
especies, por solo 42 (11.

Una forma de visualizar la concordancia de las vías asociadas a la aterosclerosis entre el humano y
el ratón es resumirlas en grupos. Utilizamos un análisis de componentes principales para reducir la
alta dimensionalidad de los datos para agrupar las vías según la superposición de sus genes
constituyentes ( Figura S2 ). En esta representación, cuanto más cerca estén las vías, mayor será el
porcentaje de genes compartidos. Dividimos los grupos de acuerdo con las funciones de sus genes,
con las siguientes categorías: antígeno, apoptosis, cáncer, ciclo celular, adhesión focal, sistema
inmunológico, inflamación, metabolismo de lípidos y lipoproteínas, función y proliferación de las
plaquetas y transcripción.
Problemas de confusión
Al evaluar la relevancia de los estudios en ratones para la CAD humana, hay una serie de posibles
factores de confusión que deben considerarse. A continuación, discutimos brevemente los más
significativos.

Perturbaciones genéticas de tamaño grande contra efecto pequeño

Mientras que las formas comunes de EAC resultan de interacciones de muchos factores genéticos
y ambientales diferentes, la mayoría de los estudios con ratones se llevan a cabo utilizando
grandes perturbaciones genéticas o ambientales, como ratones knockout o dietas
extremadamente ricas en colesterol. Dichas perturbaciones extremas pueden afectar muchas vías
y cientos o miles de genes, posiblemente influyendo en la aterosclerosis de una manera pasajera y
no directamente. Los genes identificados en los GWAS, por otro lado, generalmente exhiben una
variación funcional muy modesta.

El problema de los genes del pasajero

Hasta hace varios años, la mayoría de los ratones dirigidos por genes se generaban en un fondo
genético de la cepa 129 / J y luego se transferían a la cepa C57BL / 6J mediante una serie de
retrocruzamientos. Mientras que de cinco a diez generaciones de retrocruzamiento eliminarán con
éxito la mayoría de la contribución genética 129 / J, las regiones que flanquean inmediatamente el
gen objetivo permanecerán, ya que se requerirán eventos de recombinación poco frecuentes para
sustituir los alelos C57BL / 6J. Por lo tanto, cientos de genes 129 / J, incluyendo muchos con
diferencias funcionales, contaminarán típicamente tales estudios. Dado que muchas vías
biológicas diferentes convergen en la aterosclerosis, la posibilidad de un efecto del gen pasajero es
significativa. De manera similar, los ratones transgénicos a menudo se generan en fondos distintos
de C57BL / 6J (

Lusis et al., 2007

). Estudios recientes han examinado la cuestión del gen pasajero en estudios de funciones
inmunes y metabolismo óseo (

Ackert-Bicknell y Rosen, 2016

Vanden Berghe et al., 2015

).

El enfoque del gen candidato es intrínsecamente parcial

Los genes candidatos generalmente se seleccionan para un estudio en base a lo que se conoce de
estudios en humanos sobre aterosclerosis o de otros datos biológicos. Por ejemplo, algunos
estudios están dirigidos a investigar mecanismos que contribuyan a factores de riesgo como la
hipertensión arterial o hipercolesterolemia. Claramente, esto podría resultar en una superposición
artificial de los resultados en las comparaciones entre humanos y ratones. Los estudios de
variaciones naturales en ratones, por otro lado, no sufren este sesgo y es más probable que
reflejen una superposición significativa.

Consideraciones estadísticas
Fenómenos como "maldición del ganador", el concepto de que el primer informe probablemente
tendrá un tamaño de efecto mayor que los estudios posteriores, y el "sesgo de publicación", el
concepto de que la literatura estará sesgada porque es más probable que se publiquen resultados
positivos resultados negativos, indudablemente han sesgado los resultados de los estudios de
genes candidatos. Por ejemplo, a partir de la década de 1980 con el desarrollo de métodos para
examinar la variación genética a nivel de ADN, muchos estudios de un número relativamente
pequeño de pacientes y controles (típicamente cientos) informaron asociaciones "significativas"
de variantes de ADN con enfermedades comunes. Pocos de los muchos cientos de hallazgos
reportados podrían replicarse en los GWAS más grandes e imparciales (

Altshuler et al., 2008

). Una situación similar puede aplicarse a las investigaciones de genes candidatos en ratones que
utilizan tecnologías knockout o transgénicas, particularmente dada la gran variación no genética
de los ensayos de lesiones de aterosclerosis en ratones (

Daugherty y Rateri, 2012

). De hecho, hay numerosos ejemplos de la falla en replicar los hallazgos de dichos estudios, como
los que involucran Abcg1, SRA y CD36 (

Moore et al., 2005

Witztum, 2005

).

Análisis de lesiones en ratones y humanos

Las comparaciones de diferentes estudios en ratones son difíciles debido a la falta de un protocolo
estandarizado. Las variables entre los estudios incluyen el modelo, el método (en la cara, las
secciones congeladas y el contenido de colesterol), el procedimiento de tinción (lípidos e
inmunitarios), la dieta, la duración del estudio, la edad de los ratones, las condiciones del vivario y
la cantidad de ratones estudiados. Debido al pequeño tamaño de las lesiones del ratón, los análisis
cuantitativos de la composición celular y la expresión génica son difíciles (

Erbilgin et al., 2013

Zhao et al., 2007

). Por otro lado, la mayoría de los estudios en humanos utilizaron definiciones clínicas para la
aterosclerosis.
Discusión
La mayor parte de nuestra comprensión actual de los mecanismos subyacentes a la aterosclerosis
se deriva de estudios con modelos de ratón. Un tema importante se relaciona con la relevancia de
los modelos de ratón para la patobiología humana, particularmente porque los datos de ratón se
están utilizando para desarrollar objetivos farmacológicos, y los modelos de ratón también se usan
para probar compuestos terapéuticos en estudios preclínicos. La reciente identificación de loci
humanos asociados con CAD o lípidos plasmáticos en GWAS grandes (

Consorcio Genético de Enfermedades de las Arterias Coronarias (C4D), 2011

Deloukas et al., 2013

Goodarzi, 2016

Nikpay et al., 2015

Samani et al., 2007

Schunkert et al., 2011

Welter et al., 2014

) brindó la oportunidad de realizar comparaciones genéticas sistemáticas entre las dos

especies. Primero realizamos un estudio exhaustivo de los genes que se han asociado
significativamente con la aterosclerosis en ratones mediante perturbación experimental,
identificando un total de 827 genes que se ha informado que influyen en el desarrollo de la
lesión. También examinamos los resultados de estudios de variación genética natural que afectan
a la aterosclerosis en ratones. Luego realizamos tres análisis comparativos diferentes. El primero
abordó la consistencia de los factores de riesgo de aterosclerosis entre las especies. El segundo
abordó la superposición de los genes GWAS CAD humanos con los resultados de estudios con
ratones. El tercero examinó la superposición de 178 vías CAD humanas y 263 vías de aterosclerosis
de ratón. Observamos una fuerte superposición en los tres análisis. En particular, casi todos los
genes GWAS humanos que se han estudiado en ratones (45 de 46) muestran efectos consistentes
en la aterosclerosis. Esto incluye la lipoproteína (a), que se estudió como un transgénico pero no
tiene un homólogo en el ratón.

Nuestras conclusiones difieren de un estudio reciente realizado por Pasterkamp y colegas en el

que los investigadores concluyeron que, con la excepción del metabolismo de las lipoproteínas, es
probable que los estudios con ratones tengan un valor muy limitado para comprender la
enfermedad humana (

Pasterkamp et al., 2016

). Estos investigadores realizaron una encuesta exhaustiva de estudios en ratones de genes

candidatos (en total 659) y se centraron en la superposición con genes GWAS
humanos. Confirmamos aproximadamente el 75% de sus genes candidatos de ratón en nuestra
búsqueda bibliográfica, pero no encontramos pruebas claras del 25% restante en la literatura. Esto
puede haber sido causado por la selección de los nombres de los ortólogos humanos, los
diferentes criterios de búsqueda y la inclusión más estricta de genes en nuestro estudio (por
ejemplo, varios de sus genes mostraron solo un efecto sugestivo sobre la aterosclerosis en
ratones). Sin embargo, además del número y la interpretación de los genes de ratón identificados
en la literatura, hubo diferencias significativas adicionales entre los estudios. Primero, nuestro
análisis incluyó factores de riesgo de aterosclerosis adicionales, mientras que los suyos se
enfocaron solo en los lípidos. Segundo, utilizamos un conjunto más refinado de genes humanos
basados no solo en la distancia al pico de SNP, sino también en información funcional,
particularmente datos de eQTL. Usando datos de GWAS, realizamos comparaciones adicionales,
como el examen de los genes GWAS que se han probado en modelos de ratón para determinar su
consistencia. En tercer lugar, no restringimos nuestra comparación con los genes de modelos de
ratones diseñados, pero incluimos datos de estudios de variaciones que ocurren naturalmente en
ratones. Esta es quizás la línea de evidencia más sólida que respalda la relevancia de los modelos
de mouse porque evita algunos de los sesgos inherentes en las otras comparaciones. Finalmente,
las bases de datos de las vías utilizadas en los dos estudios son diferentes: el estudio anterior usó
Ingenuity, una compilación de datos de literatura amplia de múltiples especies y tejidos, mientras
que usamos las bases de datos Biocarta, KEGG y Reactome. En contraste con el informe anterior,
concluimos que los genes y las vías descubiertas en los estudios de aterosclerosis en ratones
reflejan una biología altamente superpuesta con la revelada por los GWAS humanos de CAD. Esto
no significa que no haya diferencias significativas. Por ejemplo, el locus GWAS humano más
impactante, en el cromosoma 9p21, probablemente esté mediado por cambios en la expresión de
un ARN largo no codificante, ANRIL, que no se conserva en el ratón (

Holdt et al., 2013

). Además, si bien la conservación de las vías de la enfermedad entre ratones y humanos es

altamente significativa, está lejos de ser completa.

La relevancia de los modelos animales para los trastornos humanos comunes ha sido cuestionada,
en gran medida por el hecho de que las dianas farmacológicas desarrolladas en modelos animales
no muestren eficacia en los ensayos en humanos (

Griego y Hansen, 2013

Mak et al., 2014

,
Perrin, 2014

Richmond y Su, 2008

). Una explicación, por supuesto, es que hay diferencias significativas entre las especies. Otra
explicación plausible es que hay falsos positivos en los datos del mouse, como se explicó
anteriormente. Un tercero se refiere al diseño experimental. En particular, no está claro que los
ratones knockout sean apropiados para modelar las variaciones genéticas sutiles que subyacen a
las formas comunes de aterosclerosis. Finalmente, la mayoría de los estudios con ratones se
realizaron en un solo fondo genético (generalmente, la cepa C57BL / 6J), lo que puede limitar
gravemente la amplitud de las conclusiones que se pueden extraer (

Gasch et al., 2016

). A pesar de estas limitaciones en los estudios con ratones, nuestra comparación entre especies
reveló muchas vías convergentes y apoya el valor de los modelos de ratones en la revelación de
procesos mecanicistas críticos de la aterogénesis.

Es probable que centrarse en las rutas patógenas en lugar de los genes individuales sea una forma
más productiva de traducir la información de modelos animales a estudios humanos. De interés
inmediato es determinar con más detalle los factores que regulan estas vías e identificar los
tejidos en los que contribuyen a la aterosclerosis. Además, las rutas convergentes y divergentes
entre las especies reveladas en nuestra revisión comparativa pueden ayudar a guiar la selección de
los modelos apropiados en futuros estudios preclínicos. Además de la progresión de la lesión,
algunos estudios han sugerido una superposición de genes que controlan la regresión de la lesión
en ratones y humanos, lo que sugiere una posible vía para la investigación terapéutica (

Ramsey et al., 2014

). Dadas las muchas ventajas de los ratones para estudiar la aterosclerosis, incluido el acceso a los
tejidos y la capacidad de controlar el medio ambiente, los estudios en ratones probablemente
continuarán abriendo el camino hacia la comprensión mecanicista.

Contribuciones de autor

MVS realizó la búsqueda bibliográfica de genes de ratón. Todos los autores participaron en los
análisis de los datos y revisaron críticamente el manuscrito, que fue escrito por MVS, HS y AJL.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fondation Leducq ( CADgenomics :

Understanding CAD Genes, 12CVD02), el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación
(BMBF) en el marco o el concepto de investigación y financiamiento e: Med ( e: AtheroSysMed ,
subvención 01ZX1313A -2014), el Séptimo Programa Marco de la Unión Europea FP7 / 2007-2013
en virtud del acuerdo de subvención n. HEALTH-F2-2013-601456 ( CVgenes -at-target), la DFG
como parte de Sonderforschungsbereich CRC 1123 (B2), y NIH otorga HL28481 y HL30568.